ctl前体频率对cd8+ctl应答类型的影响

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1、CTL前体频率对CD8+CTL应答类型的影响【摘要】目的:探讨CTL前体的频率对CTL应答类型的影响。方法:用重组鼠IL4和GMCSF诱导小鼠骨髓DC发育成熟,卵清蛋白Ⅰ（OVAⅠ）多肽激活DC,流式细胞术（FCM）分析DCOVA表型;用OVA特异CD8+T细胞和DCOVA接种Iab-/-C57BL/6小鼠,FCM检测小鼠体内OVA特异性CTL及特异性CTL对OVA特异性脾细胞的体内细胞毒作用,并观察DCOVA免疫后小鼠肺肿瘤的生长情况。结果:经OVAⅠ多肽刺激后,DC表面有高水平CD11c、CD80、CD54、Iab、Kb分子及pMHCⅠ复

2、合体表达;注射不同剂量（0×106、0.25×106、0.5×106、1×106、5×106）OVA特异性CD8+T细胞后,小鼠外周血OVA特异CTL占CD8+T细胞的百分比分别为0.01%、1.31%±0.21%、2.34%±0.17%、3.11%±0.25%、4.23%±0.32%,注射CD8+T细胞组OVA特异CTL百分比均较对照组明显增高（P<0.05）,未接种CD8+T细胞的野生型C57BL/6小鼠外周血OVA特异CTL为2.45%±0.22%;各剂量组CFSEloin,OVA）特异的CD8+T细胞,探讨CTL前体频率对CTL免疫应答的

3、Th细胞依赖性的影响。　　1材料和方法　　1.1材料OVAⅠ多肽为SIINFEKL公司产品。FITC标记的抗鼠CD11c、CD40、CD80、CD54、Iab、Kb和H2Kb/OVAⅠ复合物（pMHCⅠ）抗体为Pharmingen公司产品。PE标记的抗鼠H2Kb/OVA257264抗体购自BeckmanCoulter公司。重组鼠IL4和GMCSF为R＆D公司产品。荧光染料CFSE为MolecularProbes公司产品。MO4为转OVA基因的黑色素瘤细胞,具有高度肺转移特性,由本室保存。OVA特异的TCR转基因OTⅠ小鼠和野生型C57B

4、L/6小鼠（B6;CD45.2+）、Iab缺陷型（Iab-/-）C57BL/6小鼠（雌性,体质量23～30g,6～8周龄）由Jackson实验室引进。　　1.2方法　　1.2.1小鼠骨髓DC的培养及激活CO2窒息法处死小鼠,无菌条件下取小鼠股骨、胫骨,PBS冲洗骨髓至髓腔变白,收集冲洗液,1500g离心5min,收集细胞用PBS洗2次。TrisNH4Cl裂解红细胞,用含20μg/LGMCSF、1μg/LIL4的DMEM培养基重悬细胞至2×109/L,按每孔4mL加入24孔板,置37℃、50mL/LCO2培养。第3天更换培养液,轻轻晃动培养板,弃去

5、上清,补入含细胞因子的DMEM完全培养液。第6天细胞换液,用吸管轻轻冲洗,收集上清,1500g离心5min,用含20μg/LGMCSF、1μg/LIL4和15μg/LTNF的DMEM培养液重悬细胞,继续培养24h后收集细胞,换无血清的AIMV培养液,加入OVAⅠ多肽（0.3g/L）,置37℃、50mL/LCO2培养过夜,次日收集细胞进行表型鉴定。　　1.2.2OVA特异性CD8+T细胞的分离CO2窒息法处死OTⅠ小鼠,无菌分离脾脏,置于盛有适量无菌PBS的小平皿中,经200目钢网研磨,制成单个细胞悬液。PBS洗2次。用RPMI1640培养液重悬

6、细胞,加入尼龙毛柱中,常规培养1h,收集流出的T淋巴细胞,PBS洗2次,然后将细胞悬浮于PBS中,采用免疫磁珠结合的抗CD4单克隆抗体（mAb）阴性选择法（按说明书进行操作）去除CD4+T细胞,富集CD8+T细胞。　　1.2.3DC表型分析收集经OVAⅠ刺激的骨髓细胞,用PBS悬浮为1×109/L,加入流式细胞术（FCM）测定管,每管1mL,PBS洗2次,离心去上清后加入PBS100μL,分别加入FITC标记的抗鼠CD11c、CD40、CD80、CD54、Iab、Kb和pMHCⅠ抗体1μL。混匀后于4℃避光孵育30min,PBS洗2次,FCM分析。

7、　　1.2.4CD8+T细胞接种小鼠OVA特异CD8+T细胞以不同剂量（0×106、0.25×106、0.5×106、1×106、5×106）经尾静脉接种Iab-/-C57BL/6小鼠,每个剂量组10只,野生型C57BL/6小鼠作为对照未接种CD8+T细胞,第2天野生型及Iab-/-C57BL/6小鼠均尾静脉接种DCOVA（0.5×106/只）,第7天采血检测OVA特异性CTL,次日尾静脉注射MO4细胞（1×106/只）,每个剂量组注射5只小鼠（另外5只用于体内细胞毒实验）,21d后杀死小鼠肉眼观察小鼠肺肿瘤生长情况,计数肿瘤数目。　　1.2.5小鼠体

8、内OVA特异CTL的检测小鼠断尾取血50μL,加入10μLPE标记的H2Kb/OVA257