灵芝孢子对体外培养人卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响

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1、灵芝孢子对体外培养人卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响　　卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一，其治疗以手术和化疗为主。随着治疗手段的提高，患者的生存率和生活质量也得到了一定程度的提高，但由于治疗效果仍不十分理想，其病死率仍居妇科恶性肿瘤之首。因此寻求有效的治疗方法仍然是卵巢癌的研究焦点。目前中药作为卵巢癌辅助治疗手段之一越来越受到重视。灵芝孢子在我国及其他亚洲国家已被公认为治疗多种疾病的中药，并且已有大量应用灵芝孢子治疗各种肿瘤的研究报道［1－3］。本研究观察了在不同药物浓度下灵芝孢子对体外培养人卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响，探讨其对人卵

2、巢癌OV2008细胞生长抑制作用的机制，为其在卵巢癌的临床应用提供理论依据。　　1材料与方法　　1．1材料　　1．1．1仪器:NU2600E型CO2培养箱(ESBEScientif-icMC017A1C);超净工作台(MicrozonecoinporationF40BX/SPZ41);EL340酶标仪(Bio．TEKINSTＲU-MENTSINS);倒置相差电子显微镜(ZEISSAXIOVEＲT25);荧光显微镜(NIKONTE2000-U);水浴箱(FisherScientificISOTEMP210);离心机(Shel

3、tonScientificCENTＲACL2);流式细胞仪(BDFACScali-ber:BDBIOsciencesE97600092)。　　1．1．2试剂与药品:灵芝孢子粉由加拿大energene天然药品有限公司提供，批号为083668。I1640培养基为FisherScientific公司产品、新生小牛血清、Hoechst33258为Invitrogen公司产品;青链霉素(含10000U青霉素及10000微克链霉素)为Invitrogen公司产品，批号为15140-148。台盼兰(Trypanblue)EMD公司产品，

4、批号EM8721-0;Trypsin、碘化丙啶(PI)、核糖核酸酶A(ＲnaseA)多聚甲醛溶液(Paraformaldehyde)、为Sigma公司产品;Bax、bcl-2、cleaved-casepase3抗体为cellsig-nalingTechnology公司产品;p27Kip1抗体为BDBio-science产品。抗鼠及抗兔二抗购于FisherScientific公司。ECL化学发光试剂盒及感光胶片为GE公司产品。　　1．2方法　　1．2．1细胞及培养:人卵巢癌细胞系OV2008为完成该实验的加拿大york大学生

5、命科学系chunpeng实验室保存。用含10%胎牛血清(Sigma公司产品)、1%青霉素链霉素(Invitrogen公司产品)的ＲPMI1640培养基(Thermo公司产品)，在37℃，5%CO2培养箱中培养。　　1．2．2灵芝孢子粉工作液配制:灵芝孢子粉由加拿大energene天然药品有限公司提供。将灵芝孢子粉500mg溶于10mlDD-H2O中配制成50mg/ml的灵芝孢子液，高温灭菌、促溶，静置或离心后取上清，用0．20μm微孔滤膜过滤器过滤除菌，即刻用于实验或作为储存液密封置于4℃冰箱，保存2周，再次使用前7

6、0℃孵育10min。　　1．2．3illipore公司产品)上，用含有50g/L去脂奶粉的TBST(10mmol/LTris-Cl(pH值8．0)，150mmol/LNaCl，0．05%Tin。HＲP标记的抗兔IgG二抗孵育1h;T-BST漂洗3次，应用ECL-plus期细胞数目较少，且G2/M细胞随作用时间延长而减少，S期细胞数目随作用时间无明显改变。见图3。　　　　2．3灵芝孢子诱导卵巢癌细胞凋亡为明确灵芝孢子是否通过凋亡途径致卵巢癌细胞死亡，采用Hoechst-33258染色方法检测卵巢癌细胞凋亡情况。结果显示灵芝孢

7、子可致卵巢癌细胞凋亡，并呈剂量依赖性。荧光显微镜观察到典型凋亡细胞染色后表现为细胞核缩小，染色质浓缩，药物浓度越大凋亡细胞越多。见图4。　　　　4灵芝孢子对卵巢癌细胞相关蛋白的表达灵芝孢子对bcl-2和Bax蛋白表达的影响:为明确灵芝孢子引起卵巢癌细胞凋亡的信号通道，利用灵芝孢子处理后细胞的蛋白质测定了bcl-2和Bax的表达情况。结果表明随灵芝孢子浓度增加bcl-2蛋白表达水平降低，而bax蛋白水平升高灵芝孢子对P27蛋白表达的影响:为了阐明灵芝孢子对卵巢癌细胞细胞周期影响的机制，采用g/ml。通过DNA特异性结合的荧光

8、染料Hoechst33258染色观察到灵芝孢子作用于卵巢癌细胞后出现典型的凋亡细胞染色质聚集改变。提示灵芝孢子可以通过周期阻滞和诱导凋亡途径发挥增殖抑制作用。　　灵芝孢子对肿瘤细胞周期的影响有不同的报道，Zhu等［2］的研究表明灵芝孢子的酒精提取物可以使宫颈癌HeLa细胞停滞于G1/S期，Hu等［8］在