资源描述：
《模拟金黄色葡萄球菌脂磷壁酸表位的筛选研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、模拟金黄色葡萄球菌脂磷壁酸表位的筛选研究 金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus,S.aureus）是一种寄居于人体皮肤和黏膜的革兰氏阳性（G+）菌，是社区和院内感染的主要病原体之一[1],除引发皮肤和软组织感染[2],还可引发威胁生命的肺炎、骨髓炎、脑膜炎、心内膜炎和脓毒血症等[3].近年来由于抗生素滥用导致细菌耐药程度日趋严重，尤其是耐甲氧西林和耐万古霉素的超级菌株的出现，给临床治疗带来极大困难。2013年中国CHI细菌耐药性监测结果显示金黄色葡萄球菌中甲氧西林耐药株的平均检出率高达45.2%[4]. 面对上述严峻形势，针对金葡菌的疫苗和免疫学治疗研究受到关注
2、。然而目前尚无有效疫苗可预防金葡菌感染[5-7],主要原因之一是金葡菌致病因子众多，不同致病因子在感染不同阶段表达并发挥不同作用[8].因此寻找稳定表达于细菌表面的分子，以此作为构建联合疫苗的靶点成为现阶段研究方向[9]. 脂磷壁酸LTA（Lipoteichoicacid）是金葡菌上一保守性结构。由磷酸二酯键连接的磷酸甘油残基与1个膜载体共价连接的线性聚合物[10].LTA是G+菌保守结构，无种属特异性，LTA不仅表达于金葡菌表面，还广泛存在于链球菌、粪球菌等革兰氏阳性菌细胞壁表面。LTA除维持细菌细胞壁完整结构外[11,12],还是细菌表面重要黏附分子，参与细菌对宿主细胞的黏附作用
3、[7],诱发中性粒细胞及巨噬细胞产生活性氧、NO、酸性水解酶和防御素等[13].研究表明LTA在固有免疫应答中发挥起着重要作用[14-16].他们可被TLR2识别，并能与CD14分子结合，从而活化单核细胞释放大量促炎症介质，介导感染性休克和多器官功能衰竭[17],然而LTA为非胸腺依赖性抗原（TI抗原）,免疫原性弱，难以引起有效的再次抗体应答和细胞免疫应答。在本研究中以液相法筛选噬菌体肽库，获得模拟LTA表位阳性序列，为后续构建针对金葡菌保守结构LTA的肽类疫苗候选提供实验数据。 1材料与方法 1.1材料噬菌体随机12肽库（Ph.D.-12TMPhagedisplaypeptide
4、librarykit）,11013pfu/ml,购自Nea公司，抗LTA单抗购自pierce公司，HRP-链酶亲和素Streptavidin购自JacksonImmunoResearch,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷（X-gal）购自北京鼎国生物技术有限公司和广州斯佳生物技术有限公司，吐温-20（Tg/mlBSA于4℃封闭60min.5μl噬菌体线性12肽库、50μl100μg/ml抗LTA单抗及145μl0.1%TBST混匀室温孵育20min.蛋白G珠封闭后，以0.1%TBST洗涤4次，
5、将噬菌体与抗体混合物转入已洗涤的蛋白G珠中，轻柔混匀，室温继续孵育15min.0.1%TBST洗涤10次，去上清加入含1mg/mlBSA的0.2mol/LGly-HCl（pH2.2）洗脱液，室温孵育10min后低速离心，留取上清立即加入150μl1mol/LTris-HCl（pH9.1）进行中和。将第一轮洗脱产物侵染ER2738、测滴度、扩增纯化后，用于下一轮筛选。第2、3轮筛选除将洗液改为0.5%TBST以外，其余步骤同第一轮筛选。完成3轮筛选后，测定噬菌体滴度并随机挑取蓝色噬斑制备噬菌体原种用于鉴定。 1.2.2噬菌体克隆鉴定以pH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗LTA单抗至5&m
6、u;g/ml,50μl/孔，4℃过夜包被酶标板，0.25%酪蛋白37℃封闭2h,0.5%PBST洗板3次后加入50μl噬菌体原种上清或10倍系列稀释阳性噬菌体克隆No.2,37℃孵育40min.0.5%PBST洗板10次，加入HRP-抗M13单抗（应用时1∶3000稀释）,37℃孵育40min,TMB室温避光显色，2mol/L硫酸终止。以OD450nm值高于阴性对照3倍以上作为阳性噬菌体克隆。 1.2.3DNA测序及序列分析扩增阳性噬菌体克隆，按常规方法提取噬菌体单链DNA.样品送上海英潍捷基公司测序。 1.2.4选择优势序列合成模拟LTA抗原表位的线性短肽选择与抗LT
7、A单抗结合良好的No.2号所展示序列GHxDFRQxxQPS,委托深圳瀚宇有限公司合成线性肽L2（Biontin-HSGHxDFRQxxQPSGGGS）,HS、GGGS为两端起延长和支架作用的氨基酸残基。 1.2.5ELISA鉴定LTA模拟短肽与抗LTA单抗结合特异性抗LTA单抗以碳缓（pH9.6）稀释，5μg/ml包被酶标条，4℃过夜。0.25%酪蛋白37℃封闭2h后，依次加入系列稀释，生物素标记的线性肽L2（以1mg/ml起始）,3
