纯钛不同的表面处理后与成纤维细胞的结合情况分析

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1、纯钛不同的表面处理后与成纤维细胞的结合情况分析　　种植体修复已经成为牙列缺失、缺损的常用修复方法。植入患者口内的种植体想要获得良好的稳定性，长期行使功能，不仅需要其与骨组织紧密整合，还要与软组织形成牢固的生物学封闭屏障。Puckettetal[1]通过实验证明采用不同方法处理种植体表面会影响成纤维细胞的黏附、增殖。然而，目前国内的研究基本集中在钛种植体与骨组织的结合，与软组织结合的研究较少。该实验通过对纯钛进行不同的表面处理后进行成纤维细胞与材料的共培养，研究细胞在不同处理表面的生长情况，从而探讨更有利于与软组织结合的种植体表面形态。　　1材料与

2、方法　　1.1实验材料和设备纯钛棒（TA2,宝鸡和信泰金属有限公司）；L-929小鼠成纤维细胞（南京凯基生物科技发展有限公司）；β-甘油磷酸二钠盐五水（国药集团化学试剂有限公司）；乙酸钙（南京凯基生物科技发展有限公司）；优质胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；DMEM（美国Gibco公司）；DMSO（美国Sigma公司）；微弧氧化相关设备（西安理工大学自制）；S-3400NⅡ扫描电子显微镜（日本日立公司）；超净工作台（Spa气压下将直径为200μm的Al2O3颗粒对钛片表面进行均匀的垂直喷射，距离钛片1cm;喷砂后用去离子

3、水超声清洗后浸入66%HNO3与40%HF的混合液溶液中10min,取出后去离子水清洗）、氢氟酸酸蚀喷砂组（喷砂方法与双重酸蚀喷砂组相同，试件喷砂后去离子水超声清洗后浸入质量百分比为0.5%的HF溶液中10min,取出后去离子水清洗）、微弧氧化组（以纯钛为阳极，不锈钢锅为阴极，以0.04mol/Lβ-甘油磷酸二钠盐五水和0.2mol/L乙酸钙的去离子水溶液为电解液，采用脉冲直流电源进行微弧氧化处理。所有试件在制备完成后经过高温高压消毒备用。处理参数为：电压300V,频率500Hz,占空比12%,处理时间为3min.处理好后的试件立刻用去

4、离子水冲洗、吹干）。　　1.2.2试件表面形态观察将不同处理表面的钛片置于扫描电子显微镜下观察表面形态。　　1.3成纤维细胞在不同处理表面生长情况1.3.1成纤维细胞在不同试件表面的黏附将存有L-929小鼠成纤维细胞的冻存管从液氮罐中取出，立即放入37℃恒温水浴箱中，快速晃动冻存管1~2min后，取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液，加入到含培养液的离心管中并以1000r/min离心5min后弃上清液，调整细胞密度，接种于培养瓶中培养。成纤维细胞复苏后按1∶3的比例进行传代，选取快速生长期的第4代细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞系后制成1.0105个/

5、ml浓度的单细胞悬液。　　从4组中各取5片试件分别置于24孔培养板内，接种单细胞悬液，每孔200μl;加入DMEM培养液（含10%胎牛血清）2ml,37℃、95%湿度、5%CO2条件下分别培养1、2、4h停止；PBS轻轻漂洗数次，然后每孔加入200μlMTT（5mg/ml）和800μl的DMEM培养液置于37℃条件下孵育4h后，弃掉孔内上清液；加入1ml的DMSO振荡10min,取24孔培养板内液体按原顺序转移至96孔培养板内，酶标仪在490nm光波长处测其光吸收值。计算各组吸光度均值，进行统计学分析，以x珋±s表

6、示。　　1.3.2成纤维细胞在不同试件表面的增殖效果每组分别取5个试件分别置于24孔培养板内，取第4代成纤维细胞，制成2.0105个/ml浓度的单细胞悬液，接种于试件表面，每孔200μl,加入DMEM培养液（含10%胎牛血清）2ml,37℃、95%湿度、5%CO2条件下分别培养1、3、5d停止。用MTT法检测细胞吸光度值。具体方法同1.3.1.　　1.3.3成纤维细胞在不同试件表面的铺展从4组中各取3片试件分别置于24孔培养板内，取第4代成纤维细胞，制成4.0105个/ml浓度的单细胞悬液，接种于试件表面，每孔200μl;加入DMEM

7、培养液（含10%胎牛血清）2ml,37℃、95%湿度、5%CO2条件下培养24h后取出。扫描电子显微镜观察各组试件表面细胞的铺展形态。　　1.4统计学处理使用SPSS20.0软件对数据进行单因素方差分析，SNK-q检验比较组间差异。　　2结果　　2.1扫描电子显微镜下观察各组表面形态光滑组试件表面无明显凹陷；双重酸蚀喷砂组试件表面形成不规则的微孔结构，试件表面可见Al2O3颗粒，颗粒形态不规则；氢氟酸酸蚀喷砂组表面形成不规则浅凹坑，少量Al2O3颗粒嵌于表面之中，凹坑的边缘较锐利，坑壁不规则；微弧氧化组经微弧氧化处理后，表面形成多孔样结构，形成的

8、孔隙孔径较均匀，向内凹陷，四周隆起，类似于火山口状。见图1.　　2.2MTT法检测细胞的黏附结果细胞在培养1、2、4h各时间点，经过表面