降低粒径对雄黄的抑瘤活性提升作用分析

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1、降低粒径对雄黄的抑瘤活性提升作用分析　　雄黄在医学上的应用，最早记载见于《神农本草经》，具有解毒、杀虫、燥湿、祛痰、截疟的功效。《中国药典》记载：雄黄，辛温有毒，入肝胃经；具有解毒杀虫、化痰消积、燥湿祛风的功效，内服每次０．５～２．０ｇ，外用适量［１］。２０世纪８０年代，有人以含雄黄的方剂治疗慢性粒细胞白血病，取得一定疗效［２］，但雄黄毒副作用较大，临床应用受到限制。　　２０世纪９０年代，砷制剂在肿瘤中的疗效重新引起人们的注意，寻找高效低毒的砷制剂成为肿瘤研究的一个方向。本研究制备了３种粒径的雄黄，对其进行了粒度和外型的

2、观察，并通过细胞培养和体内移植肿瘤的方法，研究雄黄体内外的抑瘤作用，探讨降低粒径对雄黄的抑瘤活性是否有提高作用。　　１材料与方法　　１．１瘤种与实验动物　　肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１由南京八一医院肝癌研究所提供，Ｈｅｐ肿瘤腹水小鼠购自南京市肿瘤医院。雄性ＩＣＲ小鼠６０只，体质量（２０±２）ｇ，等级ＳＰＦ，供货单位：北京维通利华实验动物有限公司。合格证号：ＳＣＸＫＳ（京）２０１２－０００１。南京中医药大学实验动物中心许可证号：ＳＹＸＫ（苏）２０１２－００４２。　　１．２药物与试剂　　雄黄购于江苏省药材公司，经

3、南京中医药大学中药鉴定教研室鉴定为硫化物类矿物药雄黄族雄黄（Ｒｅａｌｇａｒ）。亚砷酸注射液（Ａｓ２Ｏ３）为哈尔滨伊达药业有限公司生产，批号：２０１２０８０１，浓度为１ｇ／Ｌ，使用时稀释１０倍。ＲＰＭＩ１６４０培养液和０．２５％胰蛋白酶购自美国ＭＥＲＣＫ公司，四甲基氮唑盐（ＭＴＴ）购自瑞士ＦＬＵＫＡ公司，二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）购自美国ＭＥＲ－ＣＫ公司。　　１．３仪器设备　　ＺＨＷＹ－１型气流粉碎机购自江阴市宏达粉体设备有限公司，Ｍ－１１０ＥＨ型微射流制粒机购自上海鲤跃精密机械贸易有限公司，ＭＡＬＶＥＲＮ　ＭＡＳＴＥＲＳＩ－

4、ＺＥＲ激光粒度测试仪购自英国ＭＡＬＶＥＲＮ公司，ＮＡＰＣＯ６５００培养箱购自美国ＮＡＰＣＯ公司，ＩＸ５１Ｏ－ｌｙｍｐｕｓ倒置显微镜和ＳＺＸ７体视镜购自日本Ｏｌｙｍ－ｐｕｓ公司，ＤＧ３０２２Ａ型酶联免疫检测仪购自南京华东电子集团医疗装备有限责任公司，北航Ｃｍｉａｓ９８Ａ图象分析系统购自北京航空航天大学，Ｘ－６５０扫描电子显微镜购自日立公司，Ｄ／ＭＡＸ－ｒＡ　Ｘ射线衍射仪购自日本理学制作所。　　１．４方法　　１．４．１雄黄药品的制备１）水飞雄黄（Ⅰ）：按药典方法制备。２）气流粉碎雄黄（Ⅱ）：以ＺＨＷＹ－１型气流粉碎机制备，气

5、压为１．０ＭＰａ，进样速度约０．２ｍＬ／ｓ。３）微射流雄黄（Ⅲ）：以Ｍ－１１０ＥＨ型微射流制粒机制备，２５　０００ｐｓｉ，１０ｐａｓｓ，最后１次５　０００ｐｓｉ，得到微射流雄黄样品。　　１．４．２粒径测定雄黄以水混旋，超声分散，ＭＡＬＶ－ＥＲＮ　ＭＡＳＴＥＲＳＩＺＥＲ激光粒度测试仪测定粒径。　　１．４．３雄黄颗粒的电子显微镜测定条件加速电压２０ｋＶ，喷金，纯铝样品托。　　１．４．４雄黄颗粒的Ｘ射线衍射测定Ｃｕ靶，管压４０ｋＶ，管流１５０ｍＡ，扫描角度１０°～８０°，扫描速度１０°／ｍｉｎ，狭缝系统

6、１、１、０．３和０．３。　　１．４．５细胞形态观察ＲＰＭＩ１６４０完全培养液培养ＳＭＭＣ７７２１细胞，加入浓度为２２．５ｍｇ／Ｌ的不同粒径的雄黄，２４ｈ后观察细胞生长状况。　　１．４．６细胞增殖力测定将１００μＬ（１～５）１０５ｍＬ－１ＳＭＭＣ７７２１细胞植入９６孔培养板内（１００μＬ／孔），待细胞贴壁后加入不同粒径的药物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ１０μＬ，使得雄黄终浓度为２２．５ｍｇ／Ｌ，重复１０孔。培养１２ｈ后ＭＴＴ法测定４９０ｎｍ处的吸光度（Ａ）值。　　增殖抑制率（％）＝阴性对照组Ａ值－用药组Ａ值╱阴性对照组Ａ值

7、１．４．７对动物接种移植瘤的抑瘤作用无菌条件下抽出肿瘤小鼠的腹水，１∶４生理盐水稀释。分别给６０只雄性ＩＣＲ小鼠右前肢腋下接种０．２ｍＬ稀释后的腹水液，３ｄ后１５只一组随机分为４组。其中３组每日分别以３种粒径的雄黄灌胃０．３ｍＬ（２．２５ｇ／ｋｇ），另１组每日灌以生理盐水０．３ｍＬ作为对照。连续灌胃１０ｄ，最后一次灌胃后２４ｈ处死，剥取瘤块，称质量后以ＨＥ染色法染色，光镜下观察，图像分析仪统计分析。　　１．５统计学方法　　采用ＳＰＳＳ　１５．０进行统计学分析。计量资料用ｘ－±ｓ表示，数据符合正态分布，方差齐

8、，多组间均数比较用单因素方差分析，多组间两两比较采用ＬＳＤ法。检验水准α＝０．０５。　　２结果　　２．１粒径与粒度分布　　在累积百分率曲线上占颗粒总量为１０％、５０％和９０％所对应的粒子直径表示为ｄ１０、ｄ５０和ｄ９０，粒度分布用分布宽度（ＳＰＡＮ）表示。ＳＰＡＮ＝（ｄ９０－ｄ１０）／ｄ５０。３种雄黄颗粒