mirna原位杂交技术的诸多影响因素分析

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1、miRNA原位杂交技术的诸多影响因素分析  MicroRNA(miRNA,miR)是广泛存在于生物个体的一类非蛋白编码小分子RNA。作为动植物体内的重要调控分子,miRNAs与细胞的基因表达、个体发育、组织分化等一系列生理、病理过程密切相[1,2]关。  因能进行定性、半定量及定位分析,在异质性明显的组织标本中,miRNA原位杂交(miRNAin-situhybridization,MISH)技术不仅具有较其他常规miRNA分析方法操作简便、费用低廉等优点,同时,由于miRNA具有不易降解而在石蜡包埋组织中长期稳定存在的特性,使得MISH技术在临床科研中的应用受到

2、越来越多的关注[3,4]。然而,常规MISH操作仍然受到多重因素的影响,包括临床标本的组织、保存时间;组织切片的厚度;蛋白酶K的浓度、孵育时间;探针的浓度、孵育时间、特异性;显色方式等。为此,对影响MISH技术操作的诸多因素进行实验探讨,有助于该方法的建立、完善并在科研工作中广泛应用。  材料和方法    1.材料原位杂交实验中的石蜡组织均于南昌大学附属感染病医院病理科。所有石蜡组织均常规4%中性甲醛固定、石蜡包埋,经HE染色证实其病理类型。  2.试剂U6和miR-375地高辛标记探针及其相关原位杂交检测试剂购自丹麦Exiqon公司,原位杂交封闭液与洗涤液购自美

3、国Roche公司;TrizolRNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司;miRNA逆转录与PCR引物购自广州市锐博生物科技有限公司;逆转录试剂盒(RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit)购自美国Thermo公司;实时定量PCR试剂盒(SYBRPremixExTaqTM)购自日本Takara公司。  3.原位杂交原位杂交使用的液体试剂均需用0.1%DEPC水配制。组织切片原位杂交步骤如下:石蜡包埋组织切片后脱蜡,于37℃蛋白酶K消化15min,漂洗后梯度乙醇脱水。  55℃恒温预杂交1h后,地高辛标记的miRNA探针5

4、5℃恒温杂交1h。碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体室温孵育1h,NBT/BCIP暗处30℃显色。爬片细胞原位杂交步骤如下:培养后的爬片细胞用37℃预温PBS漂洗三次后,4%中性甲醛固定5min。蛋白酶K消化与杂交过程与组织切片一致。  NBT/BCIP暗处30℃显色后伊红复染显示细胞基本形态。杂交过程选择U6探针以及用未添加探针的杂交液处理的组织、细胞作为阴性对照。结果判定:U6呈蓝色或蓝紫色颗粒的阳性信号定位于细胞的胞核;miR-375呈蓝色或蓝紫色颗粒的阳性信号定位于细胞胞质和核仁。  4.细胞培养三株人乳腺癌细胞株BT549、T47D和MDA-MB-231均购

5、自中国科学院上海生命科学研究院细胞库,三株细胞均选择含10%胎牛血清的DMEM培养液,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。  5.RNA提取、miRNA逆转录与实时定量PCRRNA提取按照Trizol试剂盒说明书进行。逆转录按照RevertAidTMFirstStrandcDNASynthe-sisKit说明书进行。按照SYBRPremixExTaqTM的操作说明,以U6为内参照,使用ABI7500FastReal-TimePCRSystem(AppliedBiosystems,美国)进行实时定量PCR扩增反应,每个样品3个重复孔。采用公式2-ΔCt

6、(ΔCt=CtmiR-375–CtU6)计算miR-375的相对表达量。  结果  1.不同保存时间和组织的石蜡切片U6探针的原位杂交选择1990-2013年不同时间保存的多个乳腺、肺脏、肝脏组织,分别以未添加探针、添加U6探针的杂交液行原位杂交。结果显示:于不同时间保存的三种组织均有U6显色,保存时间越短的组织显色效果越好。其中乳腺组织切片75593与肝脏组织切片5060的U6表达最高,显色最好。以乳腺组织切片75593为例,阴性对照的乳腺腺上皮胞核显红色;U6探针杂交结果为乳腺腺上皮胞核显蓝紫色(图1)。  2.不同厚度组织切片的U6探

7、针的原位杂交选择U6表达最高的乳腺组织切片75593与肝脏组织切片5060的4μm和6μm切片分别进行原位杂交分析。实验结果显示:组织标本切片越薄,杂交过程中越不易掉片,4μm和6μm厚度的组织切片原位杂交染色未见明显差异(图2)。  3.不同浓度的蛋白酶K对组织切片U6探针原位杂交的影响分别选择2、20和200μg/ml的蛋白酶K,在37℃孵育乳腺组织切片75593与肝脏组织切片5060后,行U6探针的原位杂交。结果显示,在乳腺组织切片75593中,20μg/ml的蛋白酶K作用组较其他组的原位杂交显色更深,效果最好;在肝脏组织

8、切片506

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1、miRNA原位杂交技术的诸多影响因素分析  MicroRNA(miRNA,miR)是广泛存在于生物个体的一类非蛋白编码小分子RNA。作为动植物体内的重要调控分子,miRNAs与细胞的基因表达、个体发育、组织分化等一系列生理、病理过程密切相[1,2]关。  因能进行定性、半定量及定位分析,在异质性明显的组织标本中,miRNA原位杂交(miRNAin-situhybridization,MISH)技术不仅具有较其他常规miRNA分析方法操作简便、费用低廉等优点,同时,由于miRNA具有不易降解而在石蜡包埋组织中长期稳定存在的特性,使得MISH技术在临床科研中的应用受到

2、越来越多的关注[3,4]。然而,常规MISH操作仍然受到多重因素的影响,包括临床标本的组织、保存时间;组织切片的厚度;蛋白酶K的浓度、孵育时间;探针的浓度、孵育时间、特异性;显色方式等。为此,对影响MISH技术操作的诸多因素进行实验探讨,有助于该方法的建立、完善并在科研工作中广泛应用。  材料和方法    1.材料原位杂交实验中的石蜡组织均于南昌大学附属感染病医院病理科。所有石蜡组织均常规4%中性甲醛固定、石蜡包埋,经HE染色证实其病理类型。  2.试剂U6和miR-375地高辛标记探针及其相关原位杂交检测试剂购自丹麦Exiqon公司,原位杂交封闭液与洗涤液购自美

3、国Roche公司;TrizolRNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司;miRNA逆转录与PCR引物购自广州市锐博生物科技有限公司;逆转录试剂盒(RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit)购自美国Thermo公司;实时定量PCR试剂盒(SYBRPremixExTaqTM)购自日本Takara公司。  3.原位杂交原位杂交使用的液体试剂均需用0.1%DEPC水配制。组织切片原位杂交步骤如下:石蜡包埋组织切片后脱蜡,于37℃蛋白酶K消化15min,漂洗后梯度乙醇脱水。  55℃恒温预杂交1h后,地高辛标记的miRNA探针5

4、5℃恒温杂交1h。碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体室温孵育1h,NBT/BCIP暗处30℃显色。爬片细胞原位杂交步骤如下:培养后的爬片细胞用37℃预温PBS漂洗三次后,4%中性甲醛固定5min。蛋白酶K消化与杂交过程与组织切片一致。  NBT/BCIP暗处30℃显色后伊红复染显示细胞基本形态。杂交过程选择U6探针以及用未添加探针的杂交液处理的组织、细胞作为阴性对照。结果判定:U6呈蓝色或蓝紫色颗粒的阳性信号定位于细胞的胞核;miR-375呈蓝色或蓝紫色颗粒的阳性信号定位于细胞胞质和核仁。  4.细胞培养三株人乳腺癌细胞株BT549、T47D和MDA-MB-231均购

5、自中国科学院上海生命科学研究院细胞库,三株细胞均选择含10%胎牛血清的DMEM培养液,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。  5.RNA提取、miRNA逆转录与实时定量PCRRNA提取按照Trizol试剂盒说明书进行。逆转录按照RevertAidTMFirstStrandcDNASynthe-sisKit说明书进行。按照SYBRPremixExTaqTM的操作说明,以U6为内参照,使用ABI7500FastReal-TimePCRSystem(AppliedBiosystems,美国)进行实时定量PCR扩增反应,每个样品3个重复孔。采用公式2-ΔCt

6、(ΔCt=CtmiR-375–CtU6)计算miR-375的相对表达量。  结果  1.不同保存时间和组织的石蜡切片U6探针的原位杂交选择1990-2013年不同时间保存的多个乳腺、肺脏、肝脏组织,分别以未添加探针、添加U6探针的杂交液行原位杂交。结果显示:于不同时间保存的三种组织均有U6显色,保存时间越短的组织显色效果越好。其中乳腺组织切片75593与肝脏组织切片5060的U6表达最高,显色最好。以乳腺组织切片75593为例,阴性对照的乳腺腺上皮胞核显红色;U6探针杂交结果为乳腺腺上皮胞核显蓝紫色(图1)。  2.不同厚度组织切片的U6探

7、针的原位杂交选择U6表达最高的乳腺组织切片75593与肝脏组织切片5060的4μm和6μm切片分别进行原位杂交分析。实验结果显示:组织标本切片越薄,杂交过程中越不易掉片,4μm和6μm厚度的组织切片原位杂交染色未见明显差异(图2)。  3.不同浓度的蛋白酶K对组织切片U6探针原位杂交的影响分别选择2、20和200μg/ml的蛋白酶K,在37℃孵育乳腺组织切片75593与肝脏组织切片5060后,行U6探针的原位杂交。结果显示,在乳腺组织切片75593中,20μg/ml的蛋白酶K作用组较其他组的原位杂交显色更深,效果最好;在肝脏组织

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