高通量药物筛选利器——htrf,在抗体药物开发(bioprocess)中的应用

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1、HTRF技术介绍快速、稳定、不需洗涤、操作简单、易于自动化和微型化。上述优势使得Cisbio的HTRF技术一直是药物研发领域的领先技术之一，并广泛用于免疫检测。该技术已经在知名医药公司、生物技术公司和学术研究机构应用了15年以上。HTRF（均相时间分辨荧光，HomogeneousTime-ResolvedFluorescence）是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法。该技术结合了荧光共振能量转移（FRET，FluorescenceResonanceEnergyTransfer）和时间分辨荧光（TRF,Time-ResolvedFluorescence

2、)）两种技术。这种结合将TRF的低背景特点和FRET的均相实验方式融合在一起，使得HTRF技术拥有如下优势：实验方式灵活，具有很高的灵敏度和通量，实验数据稳定可靠，假阳性率较低。虽然HTRF也是基于TR-FRET的化学技术，但它的许多特点把它与其它TR-FRET产品区分开来。这些特点包括使用了镧系元素（铕和铽），从而具有非3+常长的半衰期，很大的Stroke'sshift（如右图所示，EuStroke’sshift>300nm）；同时，镧系元素与络合的穴相结合，这种结合的穴状物与其它所有TR-FRET产品使用的螯合物相比，显著增加了稳定性（可耐受低pH值、

3、金属离子、DMSO、EDTA等）；专利的比值测量能矫正淬灭和样品带来的干扰。FRET技术简介FRET技术利用了两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为（能量）供体和（能量）受体。供体被外来能源激发（例如闪光灯或激光），如果它与受体在足够近的距离之内，可以将能量共振转移到受体上。受体受到激发，发出特定波长的发射光。将供体和受体分别与相互作用的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将受体和供体拉到足够近的距离，产生能量转移。由于受体分子的发射光来自于能量转移，所以在实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。这种均相的实验方式操作简单，而且减

4、少了实验时间和花费。一般地，在FRET实验中使用的供体和受体是快速荧光基团，半衰期非常短，其背景荧光较强。背景荧光主要来自于样品成分，包括缓冲液、蛋白质、化合物和细胞裂解液。检测到的荧光强度必须对这些自发荧光进行校正，极大地影响了实验灵敏度，并使数据分析变得复杂。背景荧光非常短暂（寿命为纳秒级），可以利用时间分辨荧光方法将其去除。1TRF技术简介如前所述，在生物溶液或血清中的很多化合物和蛋白质是自发荧光的，利用传统的快速荧光基团进行检测极大限制了实验灵敏度。使用长寿命的荧光基团结合时间分辨的检测方式（在荧光激发和发射检测之间有一个时间延迟）可将快速荧光的干

5、扰降到最低。时间分辨荧光（TRF）利用稀土元素中镧系元素的独特性质。在TRF中常用的镧系元素是钐（Sm）、铕（Eu）、铽（Tb）和镝（Dy）。与传统荧光基团相比，它们具有大的Stoke'sshifts和非常长的发射半衰期（从微秒到毫秒），这使它们在生物学荧光应用领域中日益重要。通过直接激发使镧系元素离子产生荧光是不容易的，因为这些离子很难吸收光子。镧系元素必须首先与有机分子形成复合物，有机分子收集光子并通过分子内非放射过程转移到镧系元素上。稀土元素螯合物和穴状化合物是能量收集装置的典型代表，它们收集能量并转移到镧系元素离子上，后者则发出其特征性的长寿命的荧

6、光。为了能够成功应用于生物学检测中，稀土元素复合物应该具有特定的性质，包括稳定性、较高的发射光产率，并且能够与生物分子连接。除此之外，当直接在生物溶液中反应时，能够耐受荧光淬灭就显得尤为重要。稀土元素螯合物稳定性较差，而且有的化合物可竞争螯合物活性基团，当与FRET技术结合在一起时其灵敏度也受到限制。如果稀土元素与穴状化合物结合，许多限制因素都可去除。2HTRF技术的能量供体（Donor）和能量受体（Acceptor）HTRF的供体是铕穴状化合物（Eu3+cryptate）或Lumi4™铽穴状化合物（Tb2+cryptate），后者是近年与Lumiphor

7、e公司合作的结果，激发效率更高。两者的能量受体（Acceptor）均可为XL665和d2。XL665和d2激发波长为620nm，发射波长为665nm，位于红外光区，进一步降低了生物溶液对实验的影响（生物学成分很少在红外光区有自发荧光）。对于铽穴状化合物来说，其受体也可以是Fluorescin、GFP等发绿色荧光的分子，所以可以进行双标记测量。XL665是改良过的别藻蓝蛋白（APC），将APC的亚基偶联，增加了稳定性。d2是第二代受体，光谱学特征与XL665相同，但是分子量较小，约为1KD，可减少空间位阻对实验的影响。当由于生物分子相互作用导致两个荧光基团接

8、近时，在激发时被穴状化合物捕获的部分能量释放，发射波长为620nm