寡核苷酸图谱分析

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1、寡核苷酸图谱分析     寡核苷酸图谱分析是指核酸或核酸片段经T1核酸酶切割后电泳，少数较大分子量的酶切核酸片段在聚丙烯酰胺凝胶上分布特点的比较。因为它是通过少数核酸片段来了解整个核酸的特征，如同根据指纹特点判断案情一样，因此又称为指纹图分析(Analysisoffingerprintmap)。该法最大优点为比较简便，敏感性高，能显示出核酸间细小的差别，但缺点是无法对差别大的两条来源不同的核酸进行比较。目前该种方法已在病毒学研究中得到了广泛的应用，特别是对RNA病毒分类、鉴定病毒遗传变异等，在流行病学调查中具有重要意义。

2、(一)原理　提纯后的病毒核酸，通过适当的酶切，可产生大小不同的片段，经放射性同位素标记(或在病毒培养时标记)后，进行垂直双相电泳，再经放射自显影，可得到特征性的图谱，即寡核苷酸指纹图谱。所用的酶一般是T1核糖核酸酶，这种酶是一种RNA限制酶，特异性地作用于鸟嘌呤核苷酸的3’磷酸基团，切割与其邻近核苷酸相连的5’磷酯键，最终产物为带3’磷酸鸟嘌呤末端的寡核苷酸，即每断片的3’末端为鸟嘌呤并带有磷酸，而5’末端就暴露出羟基团。然后在T4多核苷酸激酶的作用下，用32P－ATP标记寡核苷酸的5’末端，最后用饱和酚和酵母RNA混合

3、液终止激酶的作用。在pH3.5条件下，从上到下进行第一相电泳，依片段所带电荷的不同将其分开，其后在pH8.2条件下，从右到左进行第二相电泳，可根据片段长短的不同将其分开，通过自显影，便可在底片上看到片段的位置和数目，借此对不同的病毒株的核酸进行分析比较。在电泳中一般采用两种指示剂：一种为溴酚蓝(BPB)，它的大小相当于8-10个核苷酸，在pH3.5时呈绿色，在pH8.2时呈蓝色；另一种为联苯胺(XyleneCyanol，简称XC)，其大小相当于25个核苷酸，在pH3.5时为蓝色，pH8.2时为绿色，它周围的点为重点观察区

4、。由于12-14个碱基以上的核苷酸片段特异性高，太短的片段特异性低，因此，图谱上部的斑点由于片段较小难以进行分析，多取图谱下端或整个图的下1/3处斑点进行比较，一般取50-70个斑点。(二)基本方法　1.病毒的增殖与核酸的提纯　用适当的组织培养细胞繁殖病毒，有些病毒也可用鸡胚进行繁殖，以饱和酚法提纯病毒核酸。2.核糖核酸酶切和同位素标记　常用的酶是T1核糖核酸酶(故该技术又称为T1－寡核苷酸指纹图谱)，将该酶与病毒RNA以一定比例混合，置37℃消化30-40分钟。经消化后的核酸变为大小不等的片段，片段的大小与鸟苷酸的含量

5、有关。消化步骤为：于Eppendorf管中加入1?l去离子水，加1?g病毒RNA，加1?l2倍浓缩的消化缓冲液(40mmol/LpH7.5Tris-HCl，2mmol/LEDTA)，置沸水中煮60-90秒，快速置冰浴中冷却，加入2?lT1酶(5IU/?l)，混合后置37℃水浴30-40分钟。标记的方法有两种：一是内标记，即在病毒培养液中加入32P－正磷酸盐或32P－ATP，使增殖的病毒中带有32P。另一种方法是外标记(又称末端标记)，在经过消化后的核酸片段中加入32P-ATP和T4多核苷酸激酶，以标记片段5’端。外标记方

6、法为：于上述酶消化溶液中加入35?l激酶缓冲液(10mmol/LTris－HCl，10mmol/LMg(OAC)2，1mmol/LDTT)，1?lT4多核苷酸激酶，10?l32P-ATP(比活性5000Ci/mmol)，混合后置37℃水浴30分钟。3.反应终止及寡核苷酸的提取　于上述反应物中加入100?lTSE饱和酚，混合，再加入中止混合物(用0.6mol/L醋酸氨配成2mg/ml的酵母RNA)终止激酶作用。pH7.8的TSE缓冲液：Tris2.42g最终浓度0.02mol/LNaCl8.77g最终浓度0.15mol/L

7、EDTA(Na2)0.74g最终浓度0.002mol/L用1NHCl(约12ml)调pH至7.8，补无离子水至1000ml，高压消毒。将上述终止后的溶液，轻摇混合后，11000r/min离心3分钟，取上层水相，加入2.5倍冷无水乙醇，混合置-20℃过夜或-70℃30分钟，用12000r/min离心15分钟，弃上清，干燥沉淀物(即核酸)。4.电泳及自显影指示染料的配制：以10ml为例溴酚兰10mg终浓度：0.1％联苯胺10mg0.1％尿 素3.6g6mol/L蔗 糖1g 10％(W/V)EDTA2mg50mmol/L酵母R

8、NA100mg10mg/ml加无离子水至10ml (1)第Ⅰ相电泳　将玻璃板(20×39cm)及梳子清洗干净，用10％丙烯酰胺，0.325％甲叉双丙烯酰胺注胶，电泳缓冲液为25mmol/L柠檬酸，6mol/L尿素，pH3.5。待凝胶凝聚后，进行垂直式电泳，方向为从上到下，在4℃预电泳30-60分钟后，将制备好的干燥核