共焦距显微镜原理及应用

《共焦距显微镜原理及应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、激光共聚焦显微镜东北大学装备0801班李建军（20082193）历史�1957年，MarvinMinsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。�1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。�1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。�1984年，Biorad为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。�1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。共聚焦扫描显微

2、镜的系统组成共聚焦扫描显微镜的系统组成�硬件：激光源共聚焦显微镜步近器检测器光电倍增管计算机图象输出设备（显示器彩色打印机）。软件：显微镜自动控制和扫描系统、图像处理和分析系统显微镜成像清晰度的决定因素显微镜成像清晰度的决定因素:�分辨率光学显微镜分辨率：0.25mm共焦显微镜分辨率：0.18mm�球差是由于透镜不能把近轴光线和远轴光线在光轴上共聚焦，以至透过标本一点的光线，在通过透镜时不能聚焦成一点,而是形成一个光斑,从而使成像模糊不清。�色差是由于显微镜透镜类似于三棱镜,对不同颜色的光线具有不同的折射率。所以光线透过透镜后,不同色的光聚焦在不同点上,从而

3、使成像模糊,而且像的边缘尚带有色晕。荧光�当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。共轭聚焦原理样品入射光发射光滤光片激光器长通滤光片扩光器针孔检测器样品入射光发射光滤光片激光器长通滤光片扩光器针孔检测器样品入射光发射光滤光片激光器长通滤光片扩光器针孔检测器激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术�扫描单元在共聚焦系统中扮演着心脏的角色，担负着编排激发光线扫描并同

4、时获取标本发射光子的任务，并组合成最相遇图像。扫描单元一般包括：外部激光输入口、XY扫描振镜、共聚焦针孔和PMT检测器。�场式照明与点扫描的比较盖玻片标本载玻片场式照明（范围大）激发光束点扫描（范围小）场式显微镜的照明范围和照明深度都很大，而共聚焦显微镜的照明则集中到焦平面的一个精确的焦点上。�标本的共聚焦图像是一种重建的图像，是从PMT采集的荧光光子信号到电子装置之间的点到点的成像系统，而不是从显微镜目镜直接观察到的实际图像。激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术�共焦显微镜与传统显微镜的区别具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片confocal

5、conventional普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别ConventionalfluorescenceConfocalmicroscopemicroscope共聚焦显微镜的扫描方式及生物学应用�XY扫描：获取更清晰的单层面、多通道的细节结构，应用于多种荧光定位既共定位研究等。�XYZ扫描：获取图像三维信息，应用于标本空间实际位置信息研究。还可以进行XZ/YZ的扫描。�XYt扫描：获取图像的时间信息，研究活体标本随时间的变化，或在不同时间采集不同的处理方法观察标本的荧光变化。如FRAP（荧光漂白后恢复）、FRET（荧光能量共振转移）、FLIP（光漂白荧

6、光损失）、光转化、解笼锁、光活化、膜流动性、游离钙测定、pH值测定等。�Xt/Yt/自由曲线/点扫描：扫描线/点上荧光信号随时间变化情况，由于线扫的信号采样率为毫秒级，远远大于XY图像的获取速度，所以线扫经常用于记录神经信号。�XY-λ扫描：扫描XY平面图像在整个波段内的荧光强度变化。通过该方法可以查看标本荧光光谱，可以确定最佳荧光谱段，并且通过该方法可以拆分发射峰值极为接近的染料或从较强背景荧光中提取染料荧光。�除上述扫描方式外，还有将多种扫描方式结合在一起的扫描如：XYZt/XYZtλ等。还可以进行放大、局部和旋转等模式的扫描，另外通过程序性扫描还可以将

7、各种方式集合到一起，在不同时间段进行各种模式的自动扫描。三维数据重建高清晰成像高清晰成像牛肺动脉内皮细胞，微管高清晰成像高清晰成像鼠成纤维细胞单克隆anti–β-tubulin标记高清晰成像高清晰成像检测人类癌细胞表皮生长因子共聚焦显微镜在材料学中的应用金相球光体片层马氏体组织索氏体屈氏体珠光体和铁素体粒状贝氏体合金钛合金镁合金钢铝硅合金不锈钢应力腐蚀