13 细胞增殖和细胞凋亡检测技术

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1、Lecture-13细胞生物学实验方法与原理第十三讲细胞增殖和细胞凋亡检测技术江维12‐13‐2012ContactEmail：ustcjw@ustc.edu.cnSchoolofLifeSciences,USTC细胞增殖检测技术1.直接计数32.胸腺嘧啶核苷(H‐TdR)渗入法3.MTT检测法4.羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)检测法5.5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测法6.CCK87.Ki671.直接计数利用计数板或计数仪得出细胞的数目，然后对数目进行比较。优点：简单：不需要特定的试剂和仪器准确缺点：不适合样品数量多的情况不适合评估特定的亚群2.胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗

2、入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DNA合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况。①无菌取细胞，培养液调整细胞浓度至1×106/l/ml②将细胞悬液加入96孔细胞培养板内，每孔100ul,分对照组和实验组（实验组加入相应的刺激原，对照组加入等体积的培养基），置于细胞培养箱内孵育。③在终止培养前16‐24小时每孔加入3H-TdR20ul④将每孔培养物分别吸收于直径24mm的玻璃纤维滤纸上，抽气过滤并用蒸馏水充分洗涤。⑤将滤纸片放在烘箱内烘干。⑥将滤纸片浸于加了

3、10ml脂溶性闪烁液的闪烁杯中，置于-液体闪烁计数器中测定每个样品的每分钟脉冲数（cpm值）3H-TdR掺入法：结果判定以液体闪烁计数器测定每分的脉冲数cpm。取各管测定读数的平均值，即为0.1ml细胞的脉冲数。再按淋巴细胞计数结果，校正成每百万淋巴细胞的脉冲数（cpm/106淋巴细胞）。也可以刺激指数（SI）表示试验结果，试验管脉冲数与对照管脉冲数之比，即为刺激指数。试验孔A均值570nmSI对照孔A均值570nm优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。3.53.5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测法Brdu是胸

4、腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用Brdu专一性抗体，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。BrdU有一大缺点，就是需要变性DNA后才能与抗体结合，但这就破坏了DNA双链结构，影响了其他染料的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问题。优点：不仅能用于体外实验，还能用于活体实验EdU（5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷）也是一种胸腺嘧啶核苷类似物。它也能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，

5、通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。BrdU与EdU检测原理示意图BrdU与EdU检测优缺点比较4.羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标记物。CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋

6、白质上。当细胞分裂时，CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。5.MTT检测法MTT检测法主要反映细胞的能量代谢，是检测细胞增殖活力的一种简便准确的方法。其原理是在活细胞生长和增殖过程中，线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT分解成兰紫色的水不溶性的甲瓒(Formazan)，并沉积在细胞中，死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT

7、结晶形成的量与细胞数和细胞活力成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。6.CCK8检测法是是种于一种基于WST‐8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测方法。CCK‐8细胞活性检测试剂中含有WST‐8：2‐(2‐甲氧基‐4‐硝基苯基)‐3‐(4‐硝基苯基)‐5‐(2,4‐二磺酸苯)‐2H‐四唑单钠盐]。WST‐