高效液相色谱法测定共轭亚油酸甘油酯

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1、高效液相色谱法测定共轭亚油酸甘油酯刘珍珠张辉珍孙云飞邱阿敏梁小芳王晓滨青岛大学公共卫生学院青岛市食品药品检验研宄院青岛澳海生物有限公司卫生部2009年第12号公告批准其作为新资源食品，可以直接服用或者添加到脂肪、食用油和乳化脂肪制品中。目前，W内外对井轭亚油酸甘油酯的研宄大多集中在制备、萃取和合成方面边1。而共轭亚油酸付油酯的检测方法一直是制约其生产工艺和产品质量的一个难题，S前国内外没冇共轭亚油酸甘油酯的检测方法标准。脂肪酸甘油酯的测定方法冇薄层层析法（TLC）［6-8］、气相色谱法（GC）［9-11］、高温气相色谱（1ITGC）直接进样法［9-10］和高效液相

2、色谱法（HPLC）［12-14］。TLC精度不高，GC无法确定脂肪酸的酯型，HTGC的灵敏度低、重现性差。用HPLC测定时，由于脂肪酸廿油酯的紫外吸收是羧基的末端吸收，吸收强度很弱，紫外检测器灵敏度低用示差折光检测器（RTD）检测时，由于RTD对流动相的稳定性要求苛刻，无法用梯度洗脱，不适合用于极性差别大的甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯的检测。有报道利用HPLC在233nm处测定牛奶脂肪中共轭亚油酸甘油酯的含量但由于没有商品化的共轭亚油酸甘油酯的标准品，对其定量只能用归一化法，而不同共轭亚油酸酯型的紫外吸收强度有很大差别，归一化法定量的结果误差很大。文献［18-19

3、］报道了采用HPLC-蒸法光散射检测器（ELSD）测定了单脂、二酯和三脂化合物，但国内对共轭亚油酸甘油酯的测定未见报道。本工作采用反相高效液相色谱梯度分离，ELSD检测，通过优化流动相和检测器参数，使共轭亚油酸甘油三酯、二酯和一酯得到很好的分离和测定。1试验部分1.1仪器与试剂Agilent1200型高效液和色谱仪，配ELSD。单标准储备熔液：10.00g*L，分别称取亚油酸甘油三酯、1，3-亚油酸甘油二酯、1,2-亚油酸甘油二酯和1-亚油酸甘油一酯对照品各0.1000g于10mL容量瓶中,用正己烷-异丙醇（9+1）溶液溶解并定容。混合标准溶液:移取亚油酸甘汕三酯

4、标准储备溶液3.OOmL、1，3-亚油酸甘油二酯标准储备溶液0.40mL、1，2-亚油酸甘油二酯标准储备溶液0.30mL、1-亚油酸甘油一酯标准储备熔液0.10mL于10mL容量瓶中，用正己烷-异丙醇（9+1）溶液稀释并定容，此溶液中亚油酸甘油三酯、1,3-亚油酸甘油二酯、1,2-亚油酸甘油二酯、1-亚汕酸甘汕一酯的质量浓度分别为3.00,0.40,0.30,0.10g*L。亚油酸三甘酯、1，3-亚油酸二甘酯、1，2-亚汕酸二甘酯、H亚汕酸一甘酯对照品，纯度不小于99.0%。正己烷、异丙醇、乙酸乙酯、甲酸均为色谱纯。1.2仪器工作条件ZORBAXRX-SIL色谱柱

5、（4.6mmX150mm，5um）;流动相A为正己烷，流动相B为正己烷-异丙醇-乙酸乙酯-甲酸（80+10+10+0.1）混合液;流量ImL*min;进样量10uL。梯度洗脱程序:0〜2min时，A为98%;2〜8mir^、jA*98%降为65%;8〜8.5min时，A由65%降为2%;8.5〜15min时，A保持为2%;15〜15.1min时,A由2%升至98%;15.1〜19min时,A保持为98%。氮气流量1.5mL•min;漂移管温度40°C。1.3试验方法称取样品0.1000g罝于100mL容量瓶中，用正己烷-异丙醇（9+1）溶液溶解并定容，充分混匀后

6、，在仪器工作条件下进行测定。2结果与讨论2.1色谱行为在仪器工作条件下，混合标准溶液和样品溶液的色谱图见图1。1-亚油酸廿油三酯;2-1，3-亚油酸廿油二酯;3-1，2-亚油酸廿油二酯;4-1-亚油酸甘汕一酯2.2流动相的选择甘油酯的极性较弱，易溶于正己烷等非极性溶剂，在甲醇等极性溶剂屮溶解度小，所以试验选用非极性的硅胶柱分离。甘汕一酯、甘油二酯、甘油三酯的极性和差较大，廿油三酯由于没有暴露的羟基，所以极性最弱，在正和色谱分离中最先流出。甘油一酯有两个未结合的羟基，所以有一定的极性，在正己烷中的溶解度低，流动相中正己烷体积分数高于95%时出峰时间很晚。在等度洗脱条

7、件下,无法很好地分离样品屮存在的甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯。试验选用正己烷作为流动相之一，通过梯度添加不同比例的异丙醇、乙酸乙酯、甲酸来调节流动和的极性，使廿油一酯、廿油二酯、廿油三酯得到有效分离，梯度洗脱条件见1.2节。2.3检测器参数的选择漂移管温度和载气流量是ELSD的两个重要参数。漂移管的温度会影响到雾化时溶质颗粒的大小、均匀程度，进而影响测定结果的准确性。试验将漂移管的温度分别设为70，60，50，40°C,结果表明，当漂移管的温度为40°C时，响应值最大且噪声较小、基线平稳。载气流量大小决定基线稳定性和响应值，在一定范围内，载3流量越大，基线越平稳但

8、响疲值越小