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1、Th17细胞在食管鳞状细胞癌组织中的分布及其临床意义彭峰1郑敏惠21.湖北医药学院附属太和医院肿瘤科湖北十堰442000;2.湖北医药学院附属太和医院儿童医疗中心湖北十堰442000目的探讨食管鳞状细胞癌患者Thl7细胞水平与临床病理特征之间的关系.方法收集湖北医药学院附属太和医院食管鳞状细胞癌标木，通过流式细胞术和免疫组织化学的方法检测癌组织和癌旁组织中Th17细胞水平及分布情况，并分析其与临床病理特征的关系.结果食管鳞状细胞癌患者癌组织中Thl7细胞占淋巴细胞比例为(4.67±
2、3.86)%,癌旁组织中Th细胞为(3.37±4.22)%，癌组织中Th17细胞水平高于癌旁组织;免疫组化法检测癌组织中的Th17细胞为8.42±4.61个/HPF,癌旁组织中为5.87±2.75个/HPF癌组织高于癌旁组织;在分期晚、有淋巴结转移及肿瘤浸润较深的患者中，癌组织和癌旁组织Th17细胞水平较高.结论Thl7细胞参与了食管癌的发生、发展，高水平提示食管癌预后不良.【中图分类号】R473.7B1008—(5315(2015)12—1277—02
3、食管癌是木地区比较高发的恶性肿瘤之一，最常见的病理类型为鱗状细胞癌.近年来研究发现食管局部的慢性炎症可以引起基底膜的改变，以及食管上皮细胞的异常增生，并与食管癌的发生也有密切的关系[1,2].Th17细胞是近些年来才被发现的免疫细胞,以分泌IL一17为主要特征,其免疫表型为CD4+/IL—17+,在多种慢性炎症性疾病中都有参与，但是在肿瘤特别是食管癌中的作用还不是非常明确[3—5].木研宄以食管鳞状细胞癌患者为研究对象，通过对食管鱗状细胞癌组织及癌旁组织中的Thl7细胞进行检测，以了解Thl7细
4、胞的分布，并与其临床特征进行分析，以了解其临床意义，旨在评价Th17细胞与食管鱗状细胞癌发生、发展的关系.1材料和方法1.1材料1.1.1标本来源选取2014年2月至2014年12月在湖北省十堰市太和医院进行手术，并术后病理确诊的食管鱗状细胞癌患者共计57例，其中男性47名，女性10名，中位年龄57岁，所有患者术前未行化疗、放疗等肿瘤病因性治疗，术后根据UICC恶性肿瘤TNM分期第7版进行分期，其中I期14例,II期23例,III期20例，患者具体情况见表1.1.1.2主要试剂鼠抗人IL-17A
5、抗体购于美国eBioscience公司，即用型免疫组化超敏UltrasensitiveS—P(鼠/兔)试剂盒和DAB显色试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司,PE—Cy5标记的鼠抗人CD4抗体、PE标记的鼠抗人闩细胞介素17(IL-17)抗体购自美国eBioscience公司.1.2实验方法1.2.1食管癌组织及癌旁组织中淋巴细胞的分离收集手术切除后的新鲜食管癌组织及癌旁组织(距离肿瘤边缘1cm以上),剪除出血、坏死组织，将剩余组织剪碎后置于组织样本制备仪中，加入4mIPBS,处理5分钟，从出
6、孔中吸出细胞悬液,离心后弃上清，细胞沉淀重悬、过滤,根据梯度离心法收集100%淋巴细胞分离液界面上的细胞,即为所需淋巴细胞.1.2.2流式细胞术检测Th17细胞将收集到的淋巴细胞重悬后分别加入PMA、离子霉素及BFA,在37°C、5%二氧化碳条件下刺激孵育5小吋，取待测样品分别加入PE—Cy5标记的鼠抗人CD4抗体、100μL破膜剂以及PE标记的鼠抗人白细胞介素17(IL-17)抗体，对照管中加入相应的同型抗体对照，室温下避光孵育30分钟，加入溶血剂300μL后室温下避光孵育15分钟
7、，加入PBS离心后弃上清，细胞沉淀用300μLPBS重悬,最后上流式细胞仪进行分析检测.Th17细胞以CD4+IL-17+细胞在CD4+细胞中的比例来表示.1.2.3免疫组织化学方法检测食管癌及癌旁组织中Th17细胞收集到的食管癌及癌旁组织经10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，经二甲苯脱蜡和梯度洒精水化处理后，经柠檬酸抗原修复液高温高压抗原修复，滴加过氧化物酶阻断剂以阻断内源性过氧化物酶活性，室温孵育10分钟后PBS清洗;切片上滴加正常非免疫动物血清，室温孵育10分钟后再次PBS清洗;
8、滴加鼠抗人IL一17A抗体，室温下孵育60分钟;PBS清洗后滴加生物素标记的二抗，室温孵育10分钟后PBS清洗;每张切片滴加链霉素抗生物素一过氧化物酶溶液，室温孵育10分钟,PBS清洗;切片上滴加新鲜配制的DAB溶液，在显微镜下观察至组织显色棕色后,自来水冲洗终止显色，并苏木素复染;最后切片经梯度洒精脱水干燥，用中性树胶封固.显微镜下IL一17A表达以细胞质中棕黄色颗粒为阳性.1.2.4统计学分析所有数据运用SPSS17.0进行统计学分析,结果均以均数&plUSmn;标准差表示,方差齐性检验后两
