食管鳞状细胞癌差异表达基因及其临床意义

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1、郑州大学博士学位论文食管鳞状细胞癌差异表达基因及其临床意义姓名：李进东申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：李建生201203中文摘要食管鳞状细胞癌差异表达基因及临床意义研究生：李进东导师：李建生郑州大学第一临床学院消化科河南郑州4500521．目的：食管鳞状细胞癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一。由于缺乏敏感、特异的早期诊断手段，多数食管癌患者首次确诊时已属中晚期，尽管包括手术、化疗及放射治疗等在内的多学科综合治疗手段近年来取得了明显的进步，中晚期食管鳞状细胞癌患者的预后依然很差，5年生存率仅为约10％，而早期食管癌术后5年生存率超过92．6％。因此，开发能用于食管癌

2、早期诊断的分子生物学工具和方法，对于食管癌预后的根本性改善具有重要意义。近年来国内外学者对食管癌早期诊断的分子标志物做了大量有益的研究，但是食管癌发生的机制尚未阐明，食管癌特异性基因和抗原也尚未发现。癌的发生是一个复杂的多阶段的生物过程，其中就包括基因表达谱的改变。了解食管鳞状细胞癌的基因表达模式和食管鳞状细胞癌发生的重要机制将有助于我们开发能够用于食管癌诊断、预后预测以及治疗的工具，进而改善预后。目前，已开展了一些研究去发现和鉴定与其发生或转移相关的基因。然而，到目前而至，尚缺乏对这些基因表达谱进行全面的生物信息学分析，而对基因表达谱进行生物信息学分析将有助于我们洞悉

3、食管鳞状细胞的发生和转移的分子机制，也将有助于我们开发能够早期诊断食管癌、早期检测食管癌复发和转移的分子标记物。本研究首先采用DNA芯片技术对食管鳞状细胞癌组织及正常食管粘膜上皮组织全基因组基因表达情况进行分析，旨在揭示食管鳞状细胞癌患者癌组织和正常食管粘膜上皮组织间差异表达的基因谱，同时采用生物信息分析技术推断这些差异表达的基因在食管鳞状细胞癌的发生、发展中的作用；进而，我们从I中文摘要前期研究发现的在食管鳞状细胞癌中表达明显上调的基因中选取CASG3B、IL24，表达明显下调的基因中选取SPINK8和CAB39L，应用Western．blot方法和免疫组织化学SP法

4、检测它们在食管鳞状细胞癌组织中的表达，探讨它们与食管鳞状细胞癌侵袭、转移的相关性。2．资料与方法2．1患者和样品45例人食管鳞癌组织标本均来源于河南省肿瘤医院2008年7月-2008年11月手术切除的食管鳞状细胞癌患者。其中，男性31例，女性14例。年龄47．75岁，平均年龄为62．4岁。有淋巴结转移27例，无淋巴结转移18例。均在河南省肿瘤医院接受外科治疗。术前所有患者均签署知情同意书。术前均未接受放化疗。该研究计划方案经过郑州大学医学伦理学术委员会批准。所有食管鳞状细胞癌的诊断均得到至少两个有经验的病理医师出具的组织学诊断。依据UICC第7版TNM分期系统进行食管癌

5、分期。原发肿瘤组织和正常食管粘膜上皮组织(距肿瘤边缘大于5cm)，在离体后立即置入RNALater液中保存，并移入．80℃深低温冰箱中保存。2．2RNA提取和基因芯片分析首先，对其中4例患者原发肿瘤组织和正常食管粘膜上皮组织进行基因芯片分析。采用TRIzol试剂，按照厂家建议的步骤进行全RNA提取；然后，使用分光光度计进行定量；cRNA的扩增和生物素标记使用IlluminaT0talPrepRNA扩增试剂盒进行(Ambion，Austin,TX,USA)；过夜反应，使eDNA在体转录为cRNA，eRNA产物经biotin．11．dUTP标记；eRNA产量采用分光光度计定

6、量；然后，提取500rig标记的cRNA在包含48000探针的人RefV3珠链芯片(Illumina,SanDiego，CA，USA)上，550C过夜进行杂交：随后使用浓度为1“g枷的streptavidin．Cy3(AmershamBiosciences，Piscataway,NJ)染色进行显像；采用Illumina公司的theSentrixBeadChipandBeadStation芯片分析系统进行基因表达分析。杂交、标记、染色、背景噪音及每条芯片上“看家”基因表达的基础水平的质量标准均经过验证。对芯片探针扫描后采用Illumina公司的BeadStudio软Ⅱ中文

7、摘要件进行图像分析。2．3差异表达基因的生物信息学分析从BeadStudio上获得的原始丰度数据输入到GeneSpringGX11．0(AgilentTechnologies，SantaClara,CA，USA)上接受进一步分析。采用配对t检验以获得在癌组织和正常食管上皮组织差异表达水平不少于2倍的探针集合(P<0．01)。进行平均距离法分层聚类分析，基于所有基因的经Log值转换的信号强度值，采用Pearson中心距离度量作为衡量每个配对样本中基因表达模式相似性的手段。使用GeneSpringGX11．0上的基因本体分析选项检测所参与的最