过氧化物酶的分离与测定

《过氧化物酶的分离与测定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、廊坊师范学院生物大分子的分离与纯化题目：过氧化物酶同工酶的分离及活性测定姓名：赵翔宇指导教师：侯志敏系别：生物专业：生物技术年级：2008级生物技术完成日期2010年12月22日11过氧化物酶同工酶的分离及活性测定摘要：以大豆、绿豆为原料，通过不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳将其中的过氧化物酶分离，并通过分光光度计测定其活力。关键词：大豆、绿豆过氧化物酶聚丙烯酰胺凝胶分光光度计11目录1前言………………………………………………………………………………………41.1电泳………………………………………………………………………………………41.2聚丙烯酰胺凝胶………

2、…………………………………………………………………41.3过氧化物酶………………………………………………………………………………51.4研究目的及意义…………………………………………………………………………52材料与方法………………………………………………………………………………62.1实验材料…………………………………………………………………………………62.2主要仪器设备……………………………………………………………………………62.3试剂配方…………………………………………………………………………………62.4实验设计………………………………………

3、…………………………………………82.4.1实验实施步骤…………………………………………………………………………82.4.1.1.过氧化物酶的粗提取………………………………………………………………82.4.1.2聚丙烯酰胺凝胶的制备………………………………………………………………82.4.1.3聚丙烯酰胺凝胶电泳………………………………………………………………92.4.2过氧化物酶活力的测定………………………………………………………………93结果分析…………………………………………………………………………………104致谢……………………………………………

4、…………………………………………115参考文献…………………………………………………………………………………11111前言1.1电泳带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变，都会对迁移率产生影响。因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。并选用一定pH的缓冲液。同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。迁移率与粒

5、子的大小（r）有关，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。另外，迁移率还受电渗现象的影响。所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。最后，要考虑选用离子强度适宜的溶液。一般低离子强度比较合适，因为此时导电性低，产生的热量较少。同时可使被分离的带电离子对电流贡献最大从而加快电泳速度。但也不能过低，它必

6、须可以缓冲被分离样品中带电离子对凝胶pH的影响，且过低的离子强度易导致蛋白质凝聚。一般最适的离子强度在0.01～0.1mol/L之间。最常见的为0.05。1.2聚丙烯酰胺凝胶这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（N,N’-MethylenaBisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。但在具有自由基团体系时，它们聚合，聚合后无毒。化学聚合的引发剂是过硫酸铵（NH4）2S2O3（Ammo

7、niumpersulfate，简写为Ap），催化剂是N，N，N’,N’-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，简写为TEMED）。在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵（Ap）形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。冷却可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制。11聚丙烯酰胺的基本结构，为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起。链的纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性质。网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。

8、此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶