碱裂解法提取dna的方法

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1、碱裂解法提取质粒DNA实验目的1、掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法；2、了解制备原理及各种试剂的作用。实验原理碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂

2、传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在

3、溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。一、材料含pUC19质粒的大肠杆菌，1.5ml塑料离心管，离心管架，枪头及盒、卫生纸。二、设备微量移液器(20μl，200μl，1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱等。三、试剂准备1、LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加

4、去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。2.氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。3.溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0）。1MTris-HCl(pH8.0）12.5ml，0.5MEDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高压灭菌15min，贮存于4℃。4.溶液Ⅱ：0.2MNaOH，1%SDS。2MNaOH1ml，10%SDS1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。5.溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc

5、）缓冲液，pH4.8。5MKAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。6.TE：10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)。1MTris-HCl（pH8.0）1ml，0.5MEDTA（pH8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。121高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。1MTrisCl（Tris(三羟甲基)氨基甲烷）：800mlH2O中溶解121gTris碱，用浓盐酸调pH值，混匀后加水到1L；0.5MEDTA（乙二胺四乙酸）：700mlH2O中溶解186.1gNa2EDTA-2H2O，用10M

6、NaOH调pH8.0(需约50ml)，补H2O到1L。7.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。8.无水乙醇；9.70%乙醇；10.RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/LTris・Cl(pH7.5)，5mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20℃。11灭菌双蒸水ddH2O四、操作步骤1.挑取LB固体培养基上生长的单菌落

7、，接种于20mlLB（含Amp100ug/ml）液体培养基中，37℃、250rmp振荡培养过夜（约12-14hr）。2.取1.5ml培养液倒入1.5mleppendorf管中，12000rmp离心1-2min。弃上清，将离心管倒置于卫生纸上几分钟，使液体尽可能流尽。3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡，使菌体分散混匀。),室温下放置5-10min。4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，冰浴5min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。5、加入150μl预冷

8、的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管