质粒DNA的提取（碱裂解法）

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1、质粒DNA的提取（碱裂解法）实验原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，

2、染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。提取步骤：1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬浮。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下

3、基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。4.加入150μLsolutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL离心管中6.加入6μL10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。7.等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的1.5mL离心管中8.等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新

4、的1.5mL离心管中1.加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴0.5-1h，沉淀双链DNA。2.4℃下12000rpm离心5min，吸干上清液3.加70%乙醇1mL，颠倒数次，使质粒悬浮，12000rpm离心5min。4.吸干上清液，12000rpm离心1min，吸干乙醇。室温放置或超净工作台上风干质粒DNA约10min5.加20μL灭菌ddH2O或TE缓冲液充分溶解6.用紫外分光光度计检测其纯度和浓度后置于-20℃保存备用。注意事项：1.提取过程应尽量保持低温。提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除

5、蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提2.沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA可用异丙醇(一般使用等体积),无水乙醇（2-2.5倍体积）3.6、7、8步骤是抽提蛋白的过程，根据实验要求，可以省略4.质粒DNA电泳会有三条带，最远的是线形DNA（lDNA）：质粒的两条链均断裂，线性分子；中间的是开环DNA（ocDNA）：质粒的一条链断裂，松弛的环状分子；共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂，超螺旋相关溶液的参考配方:SolutionI

6、50mmo1／L 葡萄糖5mmo1／L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl(pH8.0) 1.0mmo1／L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)SolutionII    0.4mo1／LNaOH，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合SolutionIII     5mo1／L醋酸钾 60 mL     冰乙酸         11.5mL     水             28.5mL相关溶液的作用1、溶液I的作用对于任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此选用适当浓度和适当pH值

7、的Tris-Cl溶液。加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase的活性和微生物生长。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。2、溶液II的作用NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。SDS也呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做

8、铺垫。这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。3、溶液III的作用SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完