适用于转录组测序的大白菜小孢子总rna提取方法筛选

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1、2014（11）：15-19中国蔬菜CHINAVEGETABLES研究论文适用于转录组测序的大白菜小孢子总RNA提取方法筛选1，211111*2林　燕　李　菲　张淑江　张　慧　章时藩　孙日飞　张振贤12（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081；中国农业大学农学与生物技术学院，北京100193）摘　要：为了找到适用于转录组测序要求的大白菜小孢子总RNA提取方法，以出胚率较高的吉红82为试材，以热激诱导处理后的小孢子为研究对象，比较分析了TRIzol法、改良CTAB法及超纯试剂盒法3种方法的RNA提取效果。结果表明：TRIzol法（磨样）和改良CTAB

2、法提取的RNA浓度较高，但完整性较差；超纯RNA提取试剂盒法提取的RNA质量最高，且完整性好，能够满足转录组测序的要求。关键词：大白菜；小孢子；RNA提取；转录组测序自Nitsch和Norreel（1973）首先成功应用游调控表达途径势在必行。离小孢子培养技术获得烟草小孢子胚和再生植株之前人利用mRNA差异显示技术（mRNA后，植物游离小孢子培养技术开始成为培育纯合双differentialdisplayreversetranscriptionPCR，DDRT-单倍体（doublehaploid，DH）的重要技术手段。目PCR）（Liang&Pa

3、rdee，1992）、抑制消减杂交技前已在甘蓝型油菜（Zaki&Dickinson，1995；Zhao术（suppressionsubstractivehybridization，SSH）etal.，1996）、大白菜（栗根义等，1993；姜立荣（Diatchenkoetal.，1996）、基因表达系列分析等，1996）、小麦（Reynold，1993；Kunzetal.，技术（serialanalysisofgeneexpression，SAGE）2000）、玉米（Pescitellietal.，1990；Massonnea

4、u（Velculescuetal.，1995）和基因芯片技术（geneetal.，2005）等作物上进行了许多游离小孢子胚胎chip）等对小孢子胚胎发生过程中的基因差异表达发生机制的研究，并利用生物技术手段鉴定出一些情况进行了研究，也取得了一定的进展。高通量测经热激诱导后在小孢子胚胎发生中特异表达的基因序平台的转录组测序技术（RNA-seq）能够在单核和蛋白质。但至今为止只有从甘蓝型油菜中提取出苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，具来的BBM基因被公认为具有胚胎发生能力（Pechan有定量更准确、可重复性更高、检测范围更广、分etal.，199

5、1；Boutilieretal.，2002）。一些在胚胎发析更可靠等优点；同时，该技术还能发现未知转生过程中特异表达的基因是否起作用，其作用机理录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及又是什么仍有待验证。在小孢子胚胎发生这一特殊cSNP，提供最全面的转录组信息（Alagnaetal.，的发育过程中还存在着许多目前研究中没有关注到2009；McCarthyetal.，2012；Dobinetal.，2013）。或没有被挖掘到的重要作用基因和信号调控途径，目前，转录组测序技术已被越来越多的应用到基因进一步加大游离小孢子胚胎发生机理的研究力度，转录水

6、平的研究中，成为基因差异表达研究最为高尽快找到胚胎发生过程中的重要功能基因并弄清其效、准确的手段之一，并大有替代之前应用范围较广的mRNA差异显示技术、抑制消减杂交技术、林燕，女，博士研究生，专业方向：大白菜遗传育种，E-mail：基因表达系列分析技术和基因芯片技术等的趋势。sdau_yan@163.com因此，应用转录组测序技术开展小孢子胚胎发生的*通讯作者（Correspondingauthor）：孙日飞，男，研究员，博士生导师，相关研究是了解胚胎发生相关基因的表达模式、弄专业方向：大白菜遗传育种，E-mail：sunrifei@caas.cn收稿日期：

7、2014-03-21；接受日期：2014-05-16清胚胎发生机制的有效手段。—15—《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLES转录组测序技术对RNA质量要求较高：植物mm培养皿，每皿2～3mL，用石蜡膜封口，33℃-1样本RNA浓度≥400ng·μL，总量＞20μg，热激诱导24h。OD260/OD280为1.8～2.2，OD260/OD230＞1.8，28S/1.2.2　RNA提取　收集33℃热激诱导处理24h后-118S≥1.5，RIN≥6.5。小孢子在早期发育的细胞的小孢子，

8、1200