海南珠母贝属pinctada6个种的分类鉴定

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1、第5卷第1期热带生物学报Vol．5No．12014年3月JOUＲNALOFTＲOPICALBIOLOGYMar.2014文章编号:1674－7054(2014)01－0001－07海南珠母贝属Pinctada6个种的分类鉴定1，21，21，21，21，2温海洋，石耀华，顾志峰，战欣，王爱民(1．海南大学热带生物资源教育部重点实验室，海南海口570228;2．海南大学海洋学院/海南省热带水生生物技术重点实验室，海南海口570228)摘要:通过测试海南省珠母贝属Pinctada6个种的45个个体的16S和H3基因序

2、列，并与GenBank数据库中相同物种进行比对，构建系统发育树对其进行分类，同时根据简单、明确的贝壳形态学特征予以最终确认。此分类法不仅可以较准确、快速地进行珠母贝属的分类鉴定，而且分类结果不易受被测试贝类生活环境的影响，不易受分类鉴定人员水平的限制，有利于发现杂交种和隐存种。关键词:珠母贝属;16S;H3;形态特征;分类鉴定中图分类号:Q179．4文献标志码:A珠母贝属Pinctada分为白珠母贝(P．albina)、黑珠母贝(P．nigra)、马氏珠母贝(P．fucatamarten-sii)、解氏珠母贝(

3、P．chemnitzi)、斑珠母贝(P．maculata)、珠母贝(P．margaritifera)、拟金蛤珠母贝(P．［1］anomioides)、大珠母贝(P．maxima)和射肋珠母贝(P．radiata)等9个种。其中，马氏珠母贝、大珠母贝和珠母贝等是培育海水珍珠的主要母贝，也是研究生物矿化和珍珠质形成的常用种类。珠母贝属分类鉴定的主要依据包括贝壳大小和厚度、内壳珍珠层颜色，以及壳表的放射带、生长纹、棘和壳表颜色等形态学特征。但是，这种分类方法存在不容忽视的问题:首先，这些形态特征如贝类的壳色、壳形等性

4、状易受周围环境影响，变化较大;其次，形态学特征相似，鉴定指标少，描述模糊易混淆，存在一定的局限性和主观性，很难准确的区分形态相似的种类;另外，对于个体较小的稚贝来说，其形态学特征没有成贝明显;加［2－5］之珠母贝属贝类的贝壳，薄而易碎，常影响形态分类结果的准确性。因此，很多学者增加分子标记的［6］［7］测序信息，为珠母贝属的分类提供了更多的参考依据。王小玉等和王嫣等利用ＲAPD标记对珠母贝［8］［9］属常见种进行初步鉴定和系统发育分析;CUNHA等和TMKIN等学者则采用相对保守的ITS，18SrＲNA多态性

5、分析等分子标记，进行珠母贝属的系统发育和进化模式的分析。但是，上述研究并未明确提出珠母贝属的分类鉴定方法。在本研究中，笔者期望通过线粒体16S基因和核H3基因片段的测序结果，结合简单、明确的贝壳特征描述，对海南省珠母贝属中采集的6个常见种进行分类鉴定研究，旨在为建立起一套珠母贝属6个常见种的鉴定体系奠定基础。1材料与方法1．1样品收集珠母贝属样品均于2012年6月采自海南省三亚海区，共收集样品45个，保存样品的贝壳用于形态学分类鉴定，将样品的闭壳肌组织保存于φ=95%的酒精中，用于DNA提取。［10－11］1．

6、2DNA提取和PCＲ扩增基因组DNA提取采取高盐法，提取的DNA保存于－20℃备用。选取16S和H32个标记对收集的45个样品进行PCＲ扩增，16S基因正向引物序列为:CGCCTGTTTAT-［12］CAAAAACAT，反向引物序列为:CCGGTCTGAACTCAGATCACGT，目的片段长度为460bp。H3基因的收稿日期:2014－02－16基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)(2010CB126405);海南省青年基金项目(313033);海南大学科研启动基金资助项目(kyqd1216);海南

7、大学青年基金资助项目(qnjj1227)作者简介:温海洋(1987－)，男，海南大学海洋学院2011级硕士研究生．通信作者:王爱民．E-mail:aimwang@163．com;战欣．E-mail:zhanxin@hainu．edu．cn2热带生物学报2014年［13］正向引物为:ATGGCTCGTACCAAGCAGACVGC，反向引物为:ATATCCTTＲGGCATＲGTGAC，目的片段长度为350bp。PCＲ程序为:94℃变性4min后进入循环程序，每个循环包括94℃变性45s，46℃(16S引物的退火温度

8、)或54℃(H3引物的退火温度)退火30s，72℃延伸45s，共进行30个循环，最后72℃延伸10min。PCＲ反应总体积为50μL，包括模板DNA100ng，1×PCＲBuffer，0．8μLdNTPs(25mmol·－1－1L)，1μL正反向引物(10mmol·L)，ExTaq酶4U。PCＲ产物经w=1%的琼脂糖凝胶检测合格后，送到上海生工进行测序。1．3数据分析利用MEGA4．0