中华鳖源奇异变形杆菌的分离鉴定与致病性研究

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1、第３３卷第１２期水产科学Ｖｏｌ．３３Ｎｏ．１２２０１４年１２月ＦＩＳＨＥＲＩＥＳＳＣＩＥＮＣＥＤｅｃ２０１４中华鳖源奇异变形杆菌的分离鉴定与致病性研究林亚歌１，叶键２，石婷婷１，宋阳１，王玉凤１，章晓栋１（１．绍兴文理学院生命科学学院，浙江绍兴３１２０００；２．杭州市水产技术推广总站，浙江杭州３１００００）摘要：从患典型鳃腺炎病中华鳖肝脏和腹水处进行细菌接种，分离获得一株细菌。综合梅里埃细菌生化鉴定系统和１６ＳｒＲＮＡ序列进化分析，判断所分离菌株为奇异变形杆菌（ＳＸ３７）。动物回归试验显示，该分离菌株能够引起幼鳖发病死亡，并且能够从试验幼鳖体内再次分离到相同的病

2、原菌。但临床症状与病理解剖结果与自然发病症状不一致，显示该菌株不是中华鳖鳃腺炎病病原，而是继发病原。分离株对小鼠的半数致死量为１０７．８３，显示该菌株具有较强的致病性。关键词：中华鳖；奇异变形杆菌；１６ＳｒＲＮＡ中图分类号：Ｓ９４７．１文献标识码：Ａ文章编号：１００３－１１１１（２０１４）１２－０８００－０４奇异变形杆菌（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）是革兰氏阴ＴａＫａＲａ公司；ＡｘｙＰｒｅｐＰＣＲ清洁试剂盒、ＡｘｙＰｒｅｐ性菌，属肠杆菌科、变形杆菌属。同属的其他成员细菌基因组ＤＮＡ小量制备试剂盒购自Ｃｏｒｎｉｎｇ公还包括豪氏变形杆菌（Ｐ．ｈａｕｓｅｒｉ），

3、黏液变形菌（Ｐ．司。健康鳖来自绍兴市绿源中华鳖养殖场，规格为ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓ），彭氏变形杆菌（Ｐ．ｐｅｎｎｅｒｉ），普通变１５０ｇ，在水产基地养殖一周后，确认健康后用于致形杆菌（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）。其中奇异变形杆菌、彭氏变病性试验。ＳＰＦ级ＢＡＬＢ／ｃ雌性小鼠，４０日龄，购形杆菌，普通变形杆菌是机会致病菌。奇异变形杆自浙江中医药大学实验动物中心。［１］菌为该属中的模式种，能够引起宿主的尿路感染１．２细菌分离培鉴定［２］与人类食物中毒。在动物方面，已有文献报道了从濒死中华鳖的肝脏和腹水挑取样本，接种于该菌能引起菲牛蛭（Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａｍａｎｉｌｌｅ

4、ｎｓｉｓ）、大ＬＢ琼脂培养基上，３７℃培养３６ｈ。挑取单菌落，进黄鱼（Ｐｓｅｕｄｏｓｃｉａｅｎａｃｒｏｃｅａ）、棘胸蛙（Ｑｕａｓｉｐａａ行纯化培养。首先通过观察菌落形态学特征，而后［３－５］ｓｐｉｎｏｓａ）等多种动物的感染。挑取形态一致，直径约２ｍｍ的菌落进行革兰氏染中华鳖（Ｐｅｌｏｄｉｓｃｕｓｓｉｎｅｎｓｉｓ）是我国淡水养殖色镜检。用生物梅里埃公司ＡＰＩＩＤ３２Ｅ系统对菌名优产品，具有较高的营养价值。２０１３年，我国中株进行生化鉴定。华鳖养殖产量达３３１４２４ｔ，是我国南方十分重要的１．３１６ＳｒＤＮＡ的ＰＣＲ扩增、测序和分析［６］经济水产动物。本文报道从浙江

5、绍兴地区生态提取细菌基因组ＤＮＡ为模板进行１６ＳｒＤＮＡ养殖患疑似鳃腺炎病的中华鳖内脏中中分离鉴定的扩增，ＰＣＲ引物分别为８ｆ：５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣ－出的１株新病原菌—奇异变形杆菌，采用１６ＳＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３′；１４９２ｒ：５′－ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣ－ｒＲＮＡ序列进化分析和梅里埃ＡＰＩ细菌生化鉴定ＣＡＧＣＣＧＣＡ－３′。ＰＣＲ产物纯化回收后，交Ｉｎ－系统判定为布氏柠檬酸杆菌（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｂｒａａｋｉ），ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测序。将测序所得到菌株１６ＳｒＲＮＡ并命名为ＳＸ３７，致病性试验表明分离株毒力较强。序列通过美国国立生物技术信息中

6、心的Ｂｌａｓｔ检索系统进行序列同源性分析。检索出相似较高的序１材料与方法列采用ＭＥＧＡ４．０软件构建系统发育树。１．１材料１．４动物试验ＬＢ培养基购自青岛海博生物有限公司；取纯化的菌株接种于ＬＢ液体培养中，３０℃下ＴＭ培养１８ｈ。取１ｍＬ作倍比稀释，用倾注平板法测ＰｒｅｍｉｘＴａｑＶｅｒｓｉｏｎ２．０、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ购自收稿日期：２０１４－０１－０７；修回日期：２０１４－０５－２２．基金项目：绍兴市重点科技计划项目（Ｎｏ：２０１１Ａ２２００８）．作者简介：林亚歌（１９９１－），女；本科生．Ｅ－ｍａｉｌ：６７５６８１６５３＠ｑｑ．ｃｏｍ．通讯作者：章晓栋（１９

7、８２－），男，讲师；研究方向：病原微生物．Ｅ－ｍａｉｌ：ａｌｌｅｎ＿ｂｂｄｏｇ＠１６３．ｃｏｍ．第１２期林亚歌等：中华鳖源奇异变形杆菌的分离鉴定与致病性研究８０１定每毫升中的细菌数，其余于４℃下保存。翌日用革兰氏染色显示是革兰氏阴性菌。生化鉴定结果无菌生理盐水将上述菌液稀释成特定密度的细菌表明（表１），ＳＸ３７是奇异变形杆菌，与梅里埃数据悬液，用于感染试验。库奇异变形杆菌生化指标符合率为９９．７％。１．５．１细菌回归试验２．２分离菌株的１６ＳｒＲＮＡ基因序列测定与分析用无菌生理盐水制成菌悬液，密度为１．０×１０８将测序所得序列输入到美国国家生物技术信ｃｆｕ／ｍＬ

8、。每只中华鳖腹腔注射０．