db22t 2341-2015 鸭传染性浆膜炎诊断技术规程

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1、ICS11.220B41备案号：48354-2016DB22吉林省地方标准DB22/T2341—2015鸭传染性浆膜炎诊断技术规程ProtocolofdiagnosisforRiemerellaanatipestiferinfection2015-11-25发布2015-12-25实施吉林省质量技术监督局发布DB22/T2341—2015前言本标准按照GB/T1.1—2009和GB/T20001.4—2001中给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位:吉林大学。本标准主要起草人:郭娜、刘宗慧、张燕、卜秀娟、赵星辰、史册。IDB22/T2341—2015鸭传染性

2、浆膜炎诊断技术规程1范围本标准规定了鸭传染性浆膜炎病原鸭疫里默氏杆菌的分离及聚合酶链式反应（PCR）鉴定技术。本标准适用于鸭传染性浆膜炎诊断。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541动物疫病实验室检验采样方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1鸭传染性浆膜炎infectiousserositis鸭传染性浆膜炎又名鸭疫里氏杆菌病，原名鸭疫巴氏杆菌病，是家鸭

3、、家鹅、火鸡和多种家禽和野禽的急性或慢性传染病。3.2鸭疫里默氏杆菌Riemerellaanatipestifer鸭疫里默氏杆菌是革兰氏阴性小杆菌，是鸭传染性浆膜炎的病原菌。4仪器与设备4.1PCR扩增仪4.2电泳仪4.3凝胶成像分析仪4.45%二氧化碳培养箱5试剂与材料5.1水：符合GB/T6682中二级水规定。5.2对照品：鸭疫里默氏杆菌标准菌株（ATCC11845）DNA提取物作为阳性对照，大肠杆菌和沙门氏菌提取物作为阴性对照，双蒸水作为空白对照。1DB22/T2341—20155.3引物：上游引物5’-GATTAGATAGTTGGTGAG-3’,下游引物5’-GGTGTTCTGA

4、GTAATATC-3’，参考鸭疫里默氏菌16srRNA基因序列设计的引物，扩增长度为473bp，稀释成20μmol/L使用。5.4琼脂糖（电泳纯）。5.5溴化乙锭：10mg/mL。5.6TAE电泳缓冲液：参照附录A配制。5.7DNA相对分子质量标准物Marker：DL2000。5.8DNA提取和PCR扩增试剂盒。6鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定6.1样品采集应按照NY/T541规定的方法采集濒死鸭（火鸡、鹅）或死亡后不久鸭的（火鸡、鹅）肝脏或脑。6.2细菌的分离6.2.1将样品研磨并划线接种在血液琼脂平板上，置于5%二氧化碳培养箱（4.4）中，37℃±1℃下培养，24h～48h后观察结果。6

5、.2.2菌落呈圆形，表面光滑有光泽，微凸起，并且呈奶油状，直径约为1mm～2mm，可以判为可疑菌落，挑取可疑菌落进一步鉴定。6.2.3挑取单个菌落接种于血清肉汤当中，置于5%二氧化碳培养箱（4.4）中，37℃±1℃下培养，24h～48h，备用。96.2.4将6.2.3培养液计数调整至浓度为1×10CFU/mL，取0.2mL接种7日龄雏鸭。动物接种试验应按照GB19489的规定执行。取24～120h死亡雏鸭的脑和肝脏，进行细菌分离。6.3PCR鉴定6.3.1扩增引物上游引物5’-GATTAGATAGTTGGTGAG-3’下游引物5’-GGTGTTCTGAGTAATATC-3’6.3.2模板

6、DNA制备取6.2.4分离的菌落，采用商品化DNA提取试剂盒进行DNA模板的制备，按照说明书要求进行操作。6.3.3DNA扩增在PCR反应体系中加入10×PCR缓冲液2.5μL、5U/μLTaqDNA聚合酶1μL、20μmol/L的上、下游引物各1μL、10mmol/LdNTPs1μL、5μL的模板DNA，补充灭菌水至50μL。94℃预变性5min；之后94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；72℃补充延伸10min，4℃保存（4.1）。以鸭疫里默氏杆菌标准株作为阳性对照，以沙门氏菌和大肠杆菌作为阴性对照，用水作为空白对照。6.3.4琼脂糖凝胶电泳用TA

7、E电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶，微波炉加热充分溶解后加入溴化乙锭使其浓度为1μg/mL。将凝固好的琼脂糖凝胶放入水平电泳槽，倒入电泳液使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6μL样品和上样缓冲2DB22/T2341—2015液按比例混匀后匀速加入样品孔。电泳时使用DNA相对分子质量标准物Marker作对照。设置电泳仪（4.2）电压为160V，时间为20min。使用凝胶成像分析仪拍照（4.3）。7结果判定电泳结果与阳性对照出现相同条带，且阴性对