HBsAg弱阳性质控血清基质液的稳定性比较_陆勤

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中国国境卫生检疫杂志2023年2月第46卷第1期ChineseFrontierHealthQuarantineFeb.2023，Vol46，No.1·57··经验交流·HBsAg弱阳性质控血清基质液的稳定性比较陆勤，苏锦坤，陈嘉，李雪明，綦佩妍，明红艳广州国际旅行卫生保健中心，广东广州510635摘要：目的选择不同基质配制乙肝表面抗原（HBsAg）室内质控血清用于ELISA试验，寻找配制HBsAg弱阳性质控血清的稳定基质液。方法收集HBsAg、抗-HIV、抗-HCV、梅毒螺旋体抗体均为阴性的血清混合液作为阴性血清（HBV-A），乙肝五项（HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，HBcAb）、抗-HIV、抗-HCV、梅毒螺旋体抗体均为阴性的血清混合液作为抗体阴性血清（HBV-B），以及人血白蛋白（HBV-C）、胎牛血清（HBV-D）共4种基质，按1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000倍比稀释HBsAg阳性血清，配制成不同基质的稀释系列，用ELISA方法检测HB-sAg，选取临界值的2~4倍作为目标S/CO值，比较4种基质稀释系列在4℃下放置1、3、5、7、9、11d、1个月和2个月，目标S/CO值对应浓度的稳定性。观察3种选定较稳定基质配制的稀释系列，4℃下放置5周和-20℃下放置6个月，目标S/CO值对应浓度的变化，比较3种选定基质配制的质控血清在-20℃下放置15个月的稳定性。结果HBV-A为基质配制的HBsAg稀释系列稳定性不佳，4℃保存1周，目标S/CO值对应浓度降低10倍。HBV-B、HBV-C和HBV-D作为基质配制的稀释系列，4℃放置5周和-20℃放置6个月，目标S/CO值对应的浓度稳定。3种选定基质配制的质控血清-20℃放置15个月，稳定性差异不显著（P>0.05），稳定性良好。结论阴性血清不适合作为配制HBsAg弱阳性质控血清基质，抗体阴性血清、人血白蛋白和胎牛血清稳定性良好，可作为基质使用。关键词：乙肝表面抗原；室内质控；基质液中图分类号：R446.61文献标识码：ADOI：10.16408/j.1004-9770.2023.01.013ComparisonofthestabilityofmatrixsolutionofHBsAgweaklypositivequalitycontrolserumLUQin，SUJinkun，CHENJia，LIXueming，QIPeiyan，MINGHongyanGuangzhouInternationalTravelHealthcareCenter，Guangzhou，Guangdong510635，ChinaAbstract：ObjectiveToselectdifferentmatricestopreparehepatitisBsurfaceantigen（HBsAg）indoorqualitycontrolserumforELISA，andtofindastablematrixsolutionforthepreparationofHBsAgweaklypositivequalitycontrolserum.MethodsAserummixtureofnegativeHBsAg，anti-HIV，anti-HCVandanti-treponemalwascollectedasnegativeserum（HBV-A），fourmatricesincludingnegativeHBVserum（HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAg，HBeAb，HBcAb）andnegativeforanti-HIV，anti-HCV，anti-treponemalwerecollectedasantibody-negativeserum（HBV-B），aswellasfourmatrices，humanalbumin（HBV-C）andfetalbovineserum（HBV-D）wereused.Accordingto1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000，1∶16000，1：32000，1：64000dilutedHBsAgpositiveserum，adilutionseriesofdifferentmatriceswerepreparedtodetectHBsAgbyELISAmethod.2-4timesofthecut-offvaluewasconfirmedasthetargetS/COvalue.Thefourmatrixdilutionseriesstoredat4°Cfor1，3，5，7，9，11d，1monthand2months，targetS/COvaluecorrespondstothestabilityoftheconcentrationwerecompared.Thedilutionseriespreparedwiththreeselectedmorestablematriceswereobservedfor5weeksat4℃and6monthsat-20℃，andthecorrespondingconcentrationoftargetS/COvalueswascompared，andthestabilityofthequalitycontrolserumpreparedwiththethreeselectedmatriceswascomparedfor15monthsat-20℃.ResultsTheHBsAgdilutionseriespreparedwithHBV-Amatrixhadpoorstability，andtheconcentrationcorrespondingtothetargetS/COvaluewasreducedby10afterwhenstoredat4℃for1week.Dilutionseriespreparedassubstrateswereplacedat4℃for5weeksand-20℃for6months，withstableconcentrationscorrespondingtotargetS/COvalues.Thequalitycontrolserumpreparedbythethreeselectedmatriceswasplacedat-20℃for15months，andthestabilitydifferencewasnotsignificant（P>0.05），thestabilitywasgood.ConclusionNegativeserumwasnotsuitableasmatrixforthepreparationofHBsAgweaklypositivequalitycontrolserum，andantibody-negativeserum，humanalbuminandfetalbovineserumhadgoodstability通信作者：陆勤，E-mail：lluqin@126.com

1·58·中国国境卫生检疫杂志2023年2月第46卷第1期ChineseFrontierHealthQuarantineFeb.2023，Vol46，No.1andcanbeusedasamatrix.Keywords：HBsAg；Internalqualitycontrol；Matrixsolution室内质量控制是实验室质量体系的重要组成部1.3.3选定基质液稳定性的比较用HBV-B、HBV-C分，是监测和评价检验工作质量的重要手段。酶联和HBV-D共3种基质液将HBsAg阳性血清稀释成免疫吸附试验（ELISA）中，实验室一般通过增加弱1：500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、阳性质控品鉴别诊断试剂的质量和控制操作误差，1∶32000、1∶64000不同稀释系列。一组保存于4℃，[1-2]防止弱阳性样品漏检，提高检测准确度。很多实每周检测1次，共检测5周；另一组保存于-20℃，每验室购买有证书的商品化弱阳性质控品，其最大的月复溶后检测1次，连续检测6个月。观察保存在[3]优点是可溯源，但使用商品化标准物质时，因所用不同温度下基质液的目标S/CO值对应浓度的稳定ELISA试剂的灵敏度、临界值不同，不能完全满足检性变化。[4]测值在临界OD值2～4倍的要求而需再次稀释，且1.3.4质控血清的配制、分装与保存选取稀释系购买质控品增加了检测成本。本实验室尝试用阴性列中ELISA检测S/CO=2～4对应的稀释度作为配制基质液稀释HBsAg阳性血清方法配制HBsAg弱阳浓度，配制1年用量（约50ml），分装成0.5ml/支，性质控血清，并比较了不同基质液配制质控血清的置-20℃长期储存。抗体阴性血清配制的质控血清用稳定性，现介绍如下。0.22μm滤菌器过滤后分装，无需加防腐剂。人血白蛋白、胎牛血清配制的质控血清直接分装。1材料与方法1.3.5稳定性试验采用倒计时方式，将检测日期1.1试剂乙肝表面抗原（HBsAg）ELISA检测试定为第0d，假如预定在某一温度下保存时间为Nd，剂盒为上海科华生物药业股份有限公司产品（批号：在0d前的第Nd从-70℃冰箱中抽取10支质控血202009231），HBsAg标准物质为北京康彻思坦生物清置于-20℃，至0d统一用ELISA检测，测定反有限公司产品（批号：202006003）。应S/CO值，计算其（平均值±标准差）（x±s）、变异系1.2基质液成分数（CV）和P值。采用t检验比较第0d检测值与3、1.2.1阳性血清本实验室保存的HBsAg阳性血6、9、12、15月检测值是否存在显著性差异。清，ELISA检测OD≥3.0。2结果1.2.2基质液有4种：（1）阴性血清（HBV-A），为HBsAg、抗-HIV、抗-HCV、梅毒螺旋体抗体检测均2.14种备选基质液的稳定性比较采用4种基质为阴性的血清，（2）抗体阴性血清（HBV-B），为乙肝液（HBV-A、HBV-B、HBV-C、HBV-D）稀释HBsAg五项（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）、抗-阳性血清，HBV-C和HBV-D稳定较好，4℃放置2HIV、抗-HCV、梅毒螺旋体抗体均为阴性的血清，个月时ELISA检测的目标S/CO值对应的稀释度分（3）HBV-C，为人血白蛋白，（4）HBV-D，为胎牛血清。别保持在1∶16000和1∶8000不变。HBV-A配制的1.3方法HBsAg阳性血清稀释系列在配制后第3d的目标S/CO1.3.1系列基质液的配制将阳性血清和4种阴性值对应稀释度由1∶8000提高到1∶1000，第5d提高血清56℃灭活60min，分别用4种基质液（HBV-A、到1∶500，随着放置时间增加HBsAg浓度变化较大，HBV-B、HBV-C和HBV-D）稀释阳性血清，配制成放弃使用。HBV-B作基质液时，第3d目标S/CO值1∶500的基质液母液，再1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、对应稀释度由1∶8000提高到1∶4000，2个月时提高1∶128稀释成1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、到1∶2000，HBsAg浓度虽然有变化，但进一步优化1∶32000、1∶64000的HBV-A、HBV-B、HBV-C、HBV-抗体阴性血清筛查条件，将收集血清HBsAb检测标D稀释系列。4℃保存。准控制到S/CO<0.8，可以保证HBV-B质控血清的1.3.2筛选基质液稳定性的比较分别在4种系列稳定性。基质液配制后的第1、3、5、7、9、11d，1个月、2个月2.23种选定基质液的稳定性比较从表1可见，3时，用ELISA检测4种基质液的S/CO值，选取S/CO=种基质液（HBV-B、HBV-C、HBV-D）配制的稀释系2～4作为目标S/CO值，观察不同时间不同系列基质列，在4℃保存5周、-20℃保存6个月后，目标S/CO液中目标S/CO值对应的浓度变化趋势，确定不同值对应的稀释度分别保持在1∶8000、1∶16000和基质液配制质控血清的稳定性。1∶8000，基本稳定。

2中国国境卫生检疫杂志2023年2月第46卷第1期ChineseFrontierHealthQuarantineFeb.2023，Vol46，No.1·59·表14℃和-20℃下放置不同时间不同基质液配制HBsAg稀释系列的S/CO值Tab.1S/COvaluesofHBsAgdilutionseriespreparedbydifferentmatrixsolutionsplacedat4℃and-20℃fordifferenttimes基质液（1∶）4℃-20℃Matrixsolution（1∶）1周2周3周4周5周1个月2个月3个月4个月5个月6个月HBV-B50035.4829.5331.0917.6619.9631.3432.2933.3233.9030.1729.47100033.9025.8630.4218.9917.2920.9723.2324.5424.4222.2120.27200024.4223.4526.3014.6212.2411.1512.6812.9413.4112.9311.08400013.4110.5413.019.077.346.176.496.545.996.265.3280003.992.294.704.354.262.883.143.052.703.162.33160002.071.601.351.322.371.611.451.451.231.590.76320001.230.130.170.881.600.470.570.340.450.660.24640000.450.010.020.610.700.210.140.110.090.190.07HBV-C50033.7731.2531.5627.8930.2533.5329.8833.7629.8732.9931.23100033.5827.6230.5520.9222.6832.5932.1633.0622.7431.9728.21200022.7410.7829.3519.0718.9925.6126.1823.3619.7525.4516.33400010.759.6019.1013.5514.6215.0814.9211.9210.0615.538.5480007.064.479.638.055.258.867.216.436.367.555.41160003.362.053.894.402.823.803.572.972.074.123.11320001.610.281.501.151.861.921.611.301.062.000.51640001.060.070.350.650.630.961.140.480.620.970.07HBV-D50031.2232.5431.1732.1531.3931.9833.1632.2531.3729.4425.46100024.1924.1920.7424.4924.2223.9025.7424.1324.0918.3417.50200013.9314.9312.1813.5913.4612.8615.5414.3613.4810.698.0240007.016.916.456.097.817.088.429.237.075.286.9780003.593.814.662.703.543.644.174.293.602.603.69160001.651.381.420.751.171.842.062.231.491.252.87320000.760.760.020.010.280.991.070.770.580.551.66640000.260.220.010.080.050.510.290.140.170.180.862.3HBsAg弱阳性质控血清的稳定性用HBV-支放置-20℃保存，0d时检测S/CO值，观察不同时B、HBV-C、HBV-D配制的HBsAg弱阳性质控血段均值间的一致性。经t检验，P>0.05，无显著性差清，检测前3、6、9、12、15个月分别从-70℃各取10异，表示各组质控血清稳定性良好。见表2。表2-20℃保存HBsAg质控血清稳定性（S/CO值）Tab.2StabilityofHBsAgqualitycontrolserumplacedat-20℃（S/COvalue）基质液（1∶）参数0月3个月6个月9个月12个月15个月Matrixsolution（1∶）Parameters0month3months6months9months12months15monthsHBV-Bx±s3.64±0.203.47±0.333.43±0.253.44±0.293.55±0.283.48±0.22CV（%）5.559.57.378.567.776.41P值0.1900.0620.0930.4160.105HBV-Cx±s3.28±0.243.17±0.273.34±0.203.43±0.313.51±0.293.50±0.29CV（%）7.358.615.898.918.418.33P值0.3740.5560.2350.0710.075HBV-Dx±s3.49±0.273.43±0.333.59±0.283.46±0.303.41±0.273.36±0.31CV（%）7.829.357.888.817.819.26P值0.9770.4140.8070.5310.356[5-6]制品，胎牛血清和人血清的pH值、渗透压相近，3讨论[7]广泛应用于生物试剂生产。本研究显示，人血白蛋人血白蛋白是从健康人血浆中提取生产的血液白和胎牛血清对HBsAg质控血清干扰小，质量可控，

3·60·中国国境卫生检疫杂志2023年2月第46卷第1期ChineseFrontierHealthQuarantineFeb.2023，Vol46，No.1可作为配制质控品的基质。substancesofhepatitisBsurfaceantigen[J].ChineseJournalofLaboratoryMedicine，2007，30（8）：858-862.（inChinese）阴性血清不推荐作为配制HBsAg质控品的稀[4]中国合格评定国家认可委员会.CNASCL02-A0042018医学实释液。一般认为，人血清基质是理想的质控血清稀释验室质量和能力认可准则在临床免疫学定性检验领域的应用[4]说明[S].北京：中国标准出版社，2018.液，可保证与检测样本反应环境的一致性。但由于血清成分复杂，大部分中国人血清中都含有HBsAb[8]，[5]郭江红，谢育媛，柯兵兵，等.人血白蛋白质量评价与研究[J].中国药学杂志，2019，54（9）：734-740.对HBsAg具有中和作用；同时血清中存在大量免疫GuoJH，XieYY，KeBB，etal.Qualityevaluationandresearch球蛋白、自身抗体、嗜异性天然抗体及补体等成分，ofhumanserumalbumin[J].ChinesePharmaceuticalJournal，可与HBsAg发生中和反应[9]。本研究用阴性血清配2019，54（9）：734-740.（inChinese）[6]王敏力，肖林，周倩，等.首批人血白蛋白国家参考品的研制[J].中制的稀释系列，目标S/CO值HBsAg滴度随时间变国药学杂志，2017，52（6）：480-487.化下降较快，一周内下降10倍以上，不适合作为配WangML，XiaoL，ZhouQ，etal.Developmentofthefirst制HBsAg质控品基质。batchofhumanserumalbuminreferenceproducts[J].ChinesePharmaceuticalJournal，2017，52（6）：480-487.（inChinese）抗体阴性血清具有良好的稳定性，备选基质液[7]邵维杰，陆银华，张健，等.动物血清替代人血清制备乙肝标志物的稳定性试验中，HBV-B配制的HBsAg阳性血清系室间质评物的初步研究[J].检验医学，2014，29（10）：1045-1048.列目标S/CO值对应浓度2个月内下降4倍，考虑是ShaoWJ，LUYH，ZhangJ，etal.Preliminarystudyonthe抗体阴性血清中混入了低浓度HBsAb，因此实际操preparationofexternalqualityassessmentmaterialsforhepatitisBmarkersusinganimalseruminsteadofhumanserum[J].作中为减少因灰区因素引起的中和反应，每次收集LaboratoryMedicine，2014，29（10）：1045-1048.（inChinese）血清HBsAb的S/CO<0.8，配制质控血清前将收集[8]崔富强，毕胜利，张勇，等.中国人群大样本调查乙型肝炎病毒感的抗体阴性血清混合液再次用ELISA检测，保证染血清学标志物检测出模式分析[J].中国疫苗和免疫，2009，15（4）：294-299.HBsAb为无反应性。使用经再次确认的抗体阴性血CuiFQ，BiSL，ZhangY，etal.Analysisofdetectionpatternsof清配制的稀释系列，4℃保存5周和-20℃保存6个月，serologicalmarkersforhepatitisBvirusinfectioninalarge目标S/CO值对应稀释度无变化。HBV-B、HBV-C、samplesurveyofChinesepopulation[J].ChineseJournalofVac-HBV-D配制的质控血清在-20℃保存15个月，稳定cinesandImmunization，2009，15（4）：294-299.（inChinese）[9]滕龙.HBsAg与HBsAb中和比的研究及应用探讨[J].医学研究性良好。在收集抗体阴性血清时，因检测人群中乙肝通讯，2005，34（6）：18-20.五项全部阴性者较少，收集用时较长，故收集用具尽TengL.StudyonneutralizationratioofHBsAgandHBsAb可能无菌，配制时无菌操作。anditsapplication[J].JournalofMedicalResearch，2005，34（6）：18-20.（inChinese）利用抗体阴性血清、人血白蛋白和胎牛血清稀[10]方裕森，翁雪芬，叶靖，等.灭活法研制乙肝表面抗原室内质控释阳性血清制备HBsAg弱阳性质控品方法简单，稳血清[J].河北医学，2009，15（4）：402-405.定性良好、经济实用，已经有不少医疗机构进行了尝FangYS，WengXF，YeJ，etal.PreparationofhepatitisBsur-[10-13]faceantigeninternalqualitycontrolserumbyinactivating试和应用。本研究通过比较，认为实验室为保证method[J].HebeiMedicine，2009，15（4）：402-405.（inChinese）工作质量，在无法获得有证标准质控品时，使用有效[11]李智华，刘超梅，丁齐虹，等.HBsAg临界值质控血清制备及临基质配制HBsAg弱阳性质控品是一个良好的补充。床应用[J].内蒙古医学杂志，2011，43（18）：91-92.LiZH，LiuCM，DingQH，etal.Preparationandclinicalappli-参考文献cationofqualitycontrolserumforHBsAgcriticalvalue[J].In-nerMongoliaMedicalJournal，2011，43（18）：91-92.（inChinese）[1]王治国.临床检验质量控制技术[M].北京：人民卫生出版社，[12]刘云，高玲娟.乙肝表面抗原室内弱阳性质控物的制备及其应用2004：207-208.评价[J].国际检验医学杂志，2015，36（14）：194-195.WangZG.Qualitycontroltechnologyofclinicallaboratory[M].LiuY，GaoLJ.Preparationandapplicationevaluationofinter-Beijing：PeoplesMedicalPublishingHouse，2004：207-208.（innalqualitycontrolmaterialsforweakpositivehepatitisBsur-Chinese）faceantigen[J].InternationalJournalofLaboratoryMedicine，[2]李金明，王露楠，徐锡霞，等.室内质量控制对乙型肝炎表面抗原2015，36（14）：194-195.（inChinese）测定准确度的影响[J].中华检验医学杂志，2001，24（4）：255.[13]杨凤英，梅霓，高晓丽.乙型肝炎病毒表面抗原室内质控血清制LiJM，WangLN，XuXX，etal.Effectofindoorqualitycontrol备及评价[J].河南预防医学杂志，2014，25（6）：446-447.ontheaccuracyofhepatitisBsurfaceantigendeterminationYangFY，MeiN，GaoXL.Preparationandevaluationofinter-[J].ChineseJournalofLaboratoryMedicine，2001，24（4）：255.nalqualitycontrolserumofhepatitisBvirussurfaceantigen（inChinese）[J].HenanJournalofPreventiveMedicine，2014，25（6）：446-447.[3]王露楠，邓巍，张瑞，等.乙型肝炎表面抗原血清标准物质的研究（inChinese）[J].中华检验医学杂志，2007，30（8）：858-862.收稿日期：2022-12-02WangLN，DengW，ZhangR，etal.Studyonserumstandard