BBR联合ADSCs移植对...疗作用与保护胰岛的机制研究_田晋明

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锦州医科大学学报２０２３Ｆｅｂ．４４（１）ＪＪｉｎｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ１５ＢＢＲ联合ＡＤＳＣｓ移植对糖尿病小鼠的治疗作用与保护胰岛的机制研究田晋明，赵宇萌，李贺，田雨，杨静娴（辽宁中医药大学药学院，辽宁大连１１６６００）摘要：目的探究黄连素（ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ，ＢＢＲ）联合脂肪间充质干细胞（ａｄｉｐｏｓｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＡＤＳＣｓ）对糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ，ＤＭ）小鼠的治疗效果以及对胰岛细胞的保护作用与机制。方法通过一次性腹腔注射链脲佐菌素（１５０ｍｇ／ｋｇ）建立ＤＭ小鼠模型。将成模的小鼠随机分为模型组、ＢＢＲ组、ＡＤＳＣｓ组、联合组（ＢＢＲ联合ＡＤＳＣｓ），另取正常小鼠做对照组，每组６只，相应治疗３０ｄ。观察血糖和糖耐量的变化，并计算糖耐量曲线下面积（ａｒｅａｕｎｄｅｒｃｕｒｖｅ，ＡＵＣ）；酶联免疫吸附实验（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）检测小鼠血清内肿瘤坏死因子－α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ－α，ＴＮＦ－α）、γ－干扰素（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ，ＩＦＮ－γ）的水平；苏木精－伊红（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎ，ＨＥ）染色检测小鼠胰岛的病理损伤情况；免疫荧光法检测小鼠胰岛β细胞凋亡；免疫组化以及ＲＴ－ｑＰＣＲ法检测小鼠胰腺组织Ｔｏｌｌ样受体４（ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ４，ＴＬＲ４）、髓样分化初反应蛋白８８（ｍｙｅｌｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ８８，ＭｙＤ８８）、核因子κＢ（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａ－Ｂ，ＮＦ－κＢ）Ｐ６５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ蛋白与ｍＲＮＡ的表达。结果与模型组、ＢＢＲ组或ＡＤＳＣｓ组比较，联合组小鼠血糖及糖耐量降低，血清ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ含量减少，胰岛病理损伤减轻，β细胞凋亡数减少，胰腺组织ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、ＮＦ－κＢＰ６５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ蛋白与ｍＲＮＡ的表达降低。结论ＢＢＲ与ＡＤＳＣｓ移植联合治疗可通过抑制ＴＬＲ４／ＭｙＤ８８／ＮＦ－κＢＰ６５信号通路减轻ＤＭ小鼠机体炎症反应与胰岛的病理损伤，对ＤＭ小鼠有一定治疗作用，且其效果好于单用ＢＢＲ或ＡＤＳＣｓ治疗。关键词：脂肪间充质干细胞；糖尿病；黄连素；胰岛中图分类号：Ｒ５８７?２文献标志码：Ａ文章编号：２０９６－３０５Ｘ（２０２３）０１－００１５－０８DOI:10.13847/j.cnki.lnmu.2023.01.022ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＥｆｆｅｃｔｏｆＢｅｒｂｅｒｉｎｅＣｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＡｄｉｐｏｓｅ－ＤｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｎＤｉａｂｅｔｉｃＭｉｃｅａｎｄｔｈｅＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＩｓｌｅｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＴｉａｎＪｉｎｍｉｎｇ，ＺｈａｏＹｕｍｅｎｇ，ＬｉＨｅ，ＴｉａｎＹｕ，ＹａｎｇＪｉｎｇｘｉａｎ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＬｉａｏｎｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｄａｌｉａｎ１１６６００Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｆｂｅｒｂｅｒｉｎｅ（ＢＢＲ）ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ＡＤＳＣｓ）ｏｎｄｉａｂｅｔｉｃ（ＤＭ）ｍｉｃｅａｎｄｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｎｉｓｌｅｔｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅＤＭｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙａｓｉｎｇｌｅｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（１５０ｍｇ／ｋｇ）．Ｔｈｅｍｏｄｅｌｍｉｃｅｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄ⁃ｅｄｉｎｔｏｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ＢＢＲｇｒｏｕｐ，ＡＤＳＣｓｇｒｏｕｐａｎｄｃｏｍｂｉｎｅｄｇｒｏｕｐ（ＢＢＲｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＡＤＳＣｓ），ａｎｄｎｏｒｍａｌｍｉｃｅｗｅｒｅｔａｋｅｎａｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，６ｍｉｃｅｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ，ａｎｄｔｒｅａｔｅｄｆｏｒ３０ｄａｙｓ．Ｂｌｏｏｄｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｍｉｃｅｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄ，ａｎｄｔｈｅａｒ⁃ｅａｕｎｄｅｒｔｈｅｇｌｕｃｏｓｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）ｗａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄ；ｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ－α（ＴＮＦ－α）ａｎｄｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ（ＩＦＮ－γ）ｉｎｓｅｒｕｍｏｆｍｉｃｅｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）；ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎａｎｄｅｏｓｉｎ（ＨＥ）ｓｔａｉｎｉｎｇｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｄａｍａｇｅｏｆｍｏｕｓｅｉｓｌｅｔｓ；ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｍｏｕｓｅｉｓｌｅｔβ－ｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＴＬＲ４，ＭｙＤ８８，ＮＦ－κＢＰ６５，ＴＮＦ－αａｎｄＩＦＮ－γｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＲＴ－ｑＰＣＲ．ＲｅｓｕｌｔｓＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ＢＢＲａｌｏｎｅｏｒＡＤＳＣｓａｌｏｎｅｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐ，ｂｌｏｏｄｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｓｅｒｕｍＴＮＦ－αａｎｄＩＦＮ－γｃｏｎｔｅｎｔｓｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｉｓｌｅｔｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｄａｍａｇｅｗａｓａｌｌｅｖｉ⁃ａｔｅｄ，ａｎｄβ－ｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｗａｓｄｅｃｒｅａｓｅｄ．ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＴＬＲ４，ＭｙＤ８８，ＮＦ－κＢＰ６５，ＴＮＦ－αａｎｄＩＦＮ－γｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＢＢＲｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＡＤＳＣｓｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｃａｎｒｅｄｕｃｅｔｈｅｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒｅｓｐｏｎｓｅａｎｄｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｊｕｒｙｏｆｉｓｌｅｔｓｉｎＤＭｍｉｃｅｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇＴＬＲ４／ＭｙＤ８８／ＮＦ－κＢＰ６５ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ，ａｎｄｈａｓａｃｅｒｔａｉｎｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｎＤＭｍｉｃｅ，基金项目：辽宁省教育厅自然科学基金委员会重点项目，项目编号：Ｌ２０１９４５。作者简介：田晋明（１９９６），男，重庆人，在读硕士研究生，主要研究方向为干细胞与糖尿病的治疗。通讯作者：杨静娴（１９６３），女，辽宁大连人，教授，博士学位，主要研究方向为干细胞与组织再生技术。

1１６锦州医科大学学报２０２３年２月，４４（１）ａｎｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｉｓｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆＢＢＲｏｒＡＤＳＣｓａｌｏｎｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｄｉｐｏｓｅｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；ｄｉａｂｅｔｅｓ；ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ；ｉｓｌｅｔ糖尿病（ＤＭ）是一种以高血糖为主要症状的食饮水。小鼠适应性饲养１ｗ后用于实验。本研究免疫和代谢性疾病，常见类型为１型糖尿病（ｔｙｐｅ经辽宁中医药大学动物伦理委员会批准后进行，许１ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｔ１ＤＭ）、２型糖尿病（ｔｙｐｅ２可证号：ＳＹＸＫ（Ｌｉａｏ）２０１９－０００４。ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｔ２ＤＭ）。胰岛细胞的自身免疫性１?２主要试剂炎症是两种类型ＤＭ的重要病理生理机制之一，胰小鼠脂肪间充质干细胞（ＡＤＳＣｓ）（赛业生物岛的长期炎症诱导胰岛β细胞损伤，将加重ＤＭ的科技有限公司，批号：ＭＵＢＭＤ－０１００１），链脲佐［１］进程。Ｔｏｌｌ样受体４（ＴＬＲ４），髓样分化初反应菌素（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ，ＳＴＺ）（北京索莱宝科技有限蛋白８８（ＭｙＤ８８）、核因子κＢ（ＮＦ－κＢ）是经典公司，批号：Ｓ８０５０），Ｌ－ＤＭＥＭ培养基（ｇｉｂｃｏ，的促炎通路，多项研究表明，在ＤＭ的发生发展过批号：８１２０３８５），胎牛血清（浙江天杭生物科技程中，该通路中的相关蛋白表达增加，在体内股份有限公司，批号：１９１１０５０５），盐酸小檗碱ＴＬＲ４和配体结合能引起ＭｙＤ８８、ＮＦ－κＢ的级联反（ＢＢＲ）（上海麦克林生化科技有限公司，批号：应，从而促使炎症因子表达与释放，引起并加重胰Ｃ１２５９２２４９），ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ酶联免疫试剂盒［２］岛β细胞损伤。（上海科兴生物科技有限公司，批号分别为：间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，Ｆ２１８２－Ａ、Ｆ２１３２－１），ＨＥ染色试剂盒，ｉｎｓｕｌｉｎ一ＭＳＣｓ）有强大的免疫调节功能，其能通过旁分泌抗（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为：免疫调节因子起到减轻炎症，促进组织修复的作ＡＦ０２０４、Ｃ０１０５Ｓ），ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、ＮＦ－κＢＰ６５、［３］用，有从根源治疗ＤＭ的潜力。但多项研究表ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ３兔抗小鼠一明，ＭＳＣｓ输注治疗ＤＭ的疗效受患者体内的高血抗，ＦＩＴＣ标记的抗兔、Ｃｙ３标记的兔抗小鼠二抗［４］糖、炎症等不良微环境影响。因此改善ＤＭ患者（沈阳万类生物技术有限公司，批号分别为：体内的不良微环境是提高ＭＳＣｓ移植治疗效果的有Ｎ０１１８０１９６、ＷＬ０２４９４、Ｎ０３１５１９８０、Ｍ０５２７１８９６、效途径。ＷＬ０２４４０、ＷＬ０２１１７、ＷＬＡ０３２），羊抗兔（ＨＲＰ）黄连素（ＢＢＲ）产自于黄连，是黄连发挥降二抗、ＤＡＢ显色试剂盒（北京索莱宝生物技术有血糖效果的主要药效成分，同样能减少ＤＭ患者机限公司，批号分别为：２０２２０３２６，２０２２０５１１），体炎症因子与终末糖基化产物的生成，改善胰岛素ＴＲＩｚｏｌ（Ａｍｎｉｏｎ公司，批号：１０８３０４），ｃＤＮＡ合抵抗和内质网应激，具有抗氧化、降血糖、保护胰成试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：［５］岛β细胞的作用。此外已有研究报道ＢＢＲ有促Ｄ７１７０Ｓ），ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲｍｉｘ（上海碧云天生进ＭＳＣｓ分泌营养因子、抑制ＭＳＣｓ凋亡的效果，物技术有限公司，批号：０４２８２１２２０４２０）。［６－８］对ＭＳＣｓ存活有积极作用。我们推测将ＢＢＲ与１?３主要仪器ＭＳＣｓ联合使用可能会提高ＭＳＣｓ对ＤＭ的治疗效ＣＯ２培养箱（北京东联哈尔仪器制造有限公果。因此本研究采用ＢＢＲ联合ＭＳＣｓ移植治疗，司，中国，型号Ｃ００Ｉ０１ＨＷ型），恒温冷冻切片机通过对ＤＭ小鼠的血糖、糖耐量检测，观察两者联（赛默飞世尔科技有限公司，美国，型号：用对ＤＭ的治疗效果，利用ＥＬＩＳＡ、病理染色、ＨＭ５２５Ｎ型），荧光显微镜（尼康公司，日本，型ｑＰＣＲ等方法探讨联合治疗对ＤＭ小鼠胰岛细胞的号：Ｔｉ－Ｓ型），血糖仪（三诺生物传感股份有限公保护作用及可能机制，阐明ＢＢＲ对ＭＳＣｓ的增效司，型号：ＧＡ－３型），酶标仪（深圳迈瑞生物医作用。疗电子股份有限公司，型号：ＭＲ－９６Ａ型），实时定量ＰＣＲ仪（美国Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司，型号：ＣＦＸｃｏｎ⁃１材料ｎｅｃｔ型）。１?１实验动物２方法ＳＰＦ级昆明种雄性小鼠，体质量（２７～３０）ｇ，购自辽宁长生生物科技有限公司；许可证号：２?１造模、分组与给药ＳＣＸＫ（Ｌｉａｏ）２０２０－０００１。饲养于指定的动物护理小鼠适应性喂养１ｗ后。禁食不禁水１２ｈ，一室，温度：（２５±２）℃；湿度：（６５±５）％，自由饮次性腹腔注射ＳＴＺ（１５０ｍｇ／ｋｇ）溶液构建ＤＭ模

2田晋明，等：ＢＢＲ联合ＡＤＳＣｓ移植对糖尿病小鼠的治疗作用与保护胰岛的机制研究１７型，造模２ｈ后恢复进食。于造模后第３、第７天２?４ＤＭ小鼠胰腺组织切片病理学分析行剪尾采血检测血糖。连续两次随机血糖＞１６?７采血后处死小鼠，取出胰腺组织，４％多聚甲ｍｍｏｌ／Ｌ，确定为ＤＭ模型。将成模的２４只ＤＭ小醛固定，蔗糖脱水，ＯＣＴ包埋，进行冰冻切片。鼠随机分为模型组、ＢＢＲ组、ＡＤＳＣｓ组、联合组，ＨＥ染色，观察小鼠胰腺组织病理损伤情况；免疫每组６只，另取６只正常小鼠作为对照组。自成模荧光（抗ｉｎｓｕｌｉｎ和抗Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ３）染色，＋＋日开始，ＢＢＲ组以及联合组，灌胃给予１００ｍｇ／ｋｇＤＡＰＩ复染，计算ｉｎｓｕｌｉｎ面积与Ｃａｓｐａｓｅ３β细胞［９］的ＢＢＲ，每日１次，连续３０ｄ，对照组、模型数；免疫组织化学（抗ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、ＮＦ－κＢ组、ＡＤＳＣｓ组分别灌胃给予等体积生理盐水；初Ｐ６５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ）染色，苏木素复染，计算次灌胃给药次日，ＡＤＳＣｓ组、联合组尾静脉注射胰岛平均光密度值（胰岛的光密度值累加起来得６［１０］２００μＬ总量为１×１０个小鼠ＡＤＳＣｓ悬液，对照到的ＩＯＤ值与胰岛的面积Ａｒｅａ的比值）。以上实验组、模型组、ＢＢＲ组小鼠尾静脉注射等量的ＰＢＳ。分别保持相同条件拍照，所得图片采用Ｉｍａｇｅｐｒｏ２?２ＤＭ小鼠的血糖和糖耐量检测ｐｌｕｓ６?０软件分析。从给予ＢＢＲ当天开始，测定给药后第３、第２?５实时荧光ＰＣＲ检测小鼠胰腺组织ＴＬＲ４、７、第１４、第２８天小鼠随机血糖，于第３０天禁食ＭｙＤ８８、ＮＦ－κＢＰ６５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γｍＲＮＡ的表１２ｈ后进行空腹糖耐量测试，即灌胃给予小鼠葡达萄糖２?０ｇ／ｋｇ，测量３０、６０、１２０ｍｉｎ血糖值，并给药结束后，收集各组小鼠胰腺组织，加入计算曲线下面积（ａｒｅａｕｎｄｅｒｔｈｅｃｕｒｖｅ，ＡＵＣ）。ＴＲＩｚｏｌ试剂提取总ＲＮＡ，检测完ＲＮＡ浓度和完整２?３ＥＬＩＳＡ法检测ＤＭ小鼠血清炎症因子的含量性后按试剂盒说明逆转录成ｃＤＮＡ，ＰＣＲ反应条件实验结束后对小鼠行眼眶取血，３０００ｒ／ｍｉｎ离为：９５℃２ｍｉｎ，９５℃１５ｓ，６０℃１５ｓ，４０个循－ΔΔＣｔ心１５ｍｉｎ获取血清，采用ＥＬＩＳＡ试剂盒测定血清环。内参基因选用ＧＡＰＤＨ，使用２法计算基因ＴＮＦ－α和ＩＦＮ－γ的含量，具体操作步骤依照试剂的相对表达量，见表１。盒说明书进行。表１ＰＣＲ引物序列基因名上游引物序列（５′→３′）下游引物序列（５′→３′）ＴＬＲ４ＡＴＧＧＣＡＴＧＧＣＴＴＡＣＡＣＣＡＣＣＧＡＧＧＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＣＡＭｙＤ８８ＴＣＡＴＧＴＴＣＴＣＣＡＴＡＣＣＣＴＴＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＧＡＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＮＦ－κＢＰ６５ＴＧＣＧＡＴＴＣＣＧＣＴＡＴＡＡＡＴＧＡＧＡＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＮＦ－αＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＣＴＡＴＧＴＣＴＣＣＧＡＴＣＡＣＣＣＣＧＡＡＧＴＴＣＡＧＴＡＧＩＦＮ－γＧＣＣＡＣＧＧＣＡＣＡＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＴＧＡＴＴＧＴＣＴＴＧＡＰＤＨＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＧＧＧＴＣＧＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡ２?６统计学方法组、ＡＤＳＣｓ组、联合组小鼠血糖明显降低（Ｐ＜实验数据以表示，结果采用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ０?０１），其中ＢＢＲ组、ＡＤＳＣｓ组小鼠血糖在第７天８?０软件进行统计分析，血糖、糖耐量数据多组间后又逐渐回升；而联合组小鼠血糖持续下降，与不同时间点比较采用重复测量双因素方差分析ＢＢＲ组或ＡＤＳＣｓ组比较有显著差异（Ｐ＜０?０１），（Ｔｗｏ－ｗａｙＡＮＯＶＡ）结合ＬＳＤ－ｔ检验，其他数据多见表２。提示ＢＢＲ联合ＡＤＳＣｓ治疗能降低ＤＭ小组间比较采用单因素方差分析（Ｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯ⁃鼠血糖，提高ＡＤＳＣｓ的降血糖效果。ＶＡ），以Ｐ＜０?０５为差异具有统计学意义。３?２ＤＭ小鼠糖耐量经过治疗后，对小鼠进行空腹糖耐量测试。结３结果果显示，模型组小鼠在灌胃葡萄糖溶液２ｈ后的血３?１ＤＭ小鼠血糖糖及ＡＵＣ较对照组明显升高（Ｐ＜０?０１）；经治疗给予ＢＢＲ联合ＡＤＳＣｓ治疗后，于第３、第７、后，与模型组比较，ＢＢＲ组、ＡＤＳＣｓ组、联合组第１４、第２８天检测小鼠随机血糖，结果发现，随小鼠在灌胃葡萄糖溶液２ｈ后的血糖及ＡＵＣ均出着病程延长，模型组小鼠血糖持续升高，与对照组现明显下降（Ｐ＜０?０５或Ｐ＜０?０１）；其中联合组小比较有显著差异（Ｐ＜０?０１）；与模型组比较，ＢＢＲ鼠灌胃葡萄糖溶液２ｈ后的血糖及ＡＵＣ降低更显

3１８锦州医科大学学报２０２３年２月，４４（１）著，２ｈ后血糖接近测试前水平，与ＢＢＲ组或ＡＤ⁃见表３。提示ＢＢＲ联合ＡＤＳＣｓ治疗能增强ＡＤＳＣｓＳＣｓ组比较有显著性差异（Ｐ＜０?０５或Ｐ＜０?０１），改善ＤＭ小鼠糖耐量的能力。表２联合治疗对ＤＭ小鼠血糖的影响（ｘ?±ｓ，ｎ＝６）血糖浓度（ｍｍｏｌ／Ｌ）组别初始第３天第７天第１４天第２８天对照组６?４８±０?６８６?２５±０?７３６?４０±０?６１６?２３±１?３１５?５３±１?１９模型组２２?８５±１?４８＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃２６?０２±２?３４２７?３８±２?３４２９?０８±１?９７２９?５０±１?２３ＢＢＲ组２２?６５±１?１２２２?４８±０?７９∗∗∗∗∗∗∗∗２３?７０±１?３６２３?８２±２?３０２３?４５±１?２３ＡＤＳＣｓ组２３?００±０?５９２１?３８±０?６３∗∗∗∗∗∗∗∗２１?８７±１?０２２２?７２±０?８７２３?２２±０?９０联合组２２?７５±１?３４２０?５２±１?４３∗∗▲∗∗■▲▲∗∗■■▲▲∗∗■■▲▲２０?１０±１?１５１９?５８±０?９０１８?８７±１?３０＃＃∗∗∗■■■▲注：与对照组比较，Ｐ＜０?０１；与模型组比较，Ｐ＜０?０５，Ｐ＜０?０１；与ＡＤＳＣｓ比较，Ｐ＜０?０５，Ｐ＜０?０１；与ＢＢＲ组比较，Ｐ＜▲▲０?０５，Ｐ＜０?０１表３联合治疗对ＤＭ小鼠糖耐量的影响（ｘ?±ｓ，ｎ＝６）血糖浓度（ｍｍｏｌ／Ｌ）组别曲线下面积（ＡＵＣ）０ｈ０?５ｈ１ｈ２ｈ对照组４?７８±０?６７１５?３８±２?１６１１?４０±３?５７５?７３±０?５６１２１８?２５±１９９?２０模型组２２?２５±１?３１＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃３１?４３±１?６５３０?１３±０?９９２９?２５±１?０１３５１０?２５±１１９?１６ＢＢＲ组１９?７８±１?３５∗２９?８２±１?６５２６?７２±２?７２∗∗∗∗∗∗２４?９５±１?０１３１４２?００±１９８?１１ＡＤＳＣｓ组１８?８５±１?８０∗∗∗∗∗∗∗∗∗２８?６０±１?３７２５?９２±１?３１２４?０３±１?３０３０２８?００±１３９?７７联合组１８?２３±２?５３∗∗∗∗▲∗∗■■▲▲∗∗■■▲▲∗∗■▲▲２７?０５±１?７８２２?９２±１?３８１９?４５±１?３０２６９９?７５±１１２?０８＃＃∗∗∗■▲▲注：与对照组比较，Ｐ＜０?０１；与模型组比较，Ｐ＜０?０５，Ｐ＜０?０１；与ＡＤＳＣｓ组比较，Ｐ＜０?０５；与ＢＢＲ组比较，Ｐ＜０?０１３?３ＤＭ小鼠血清炎症因子治疗能减轻ＤＭ小鼠胰岛的病理损伤。治疗结束后，通过ＥＬＩＳＡ实验检测ＤＭ小鼠血表４联合治疗对ＤＭ小鼠血清炎症因子清ＴＮＦ－α与ＩＦＮ－γ含量发现，与对照组比较，模的影响（ｘ?±ｓ，ｎ＝６）型组小鼠血清ＴＮＦ－α与ＩＦＮ－γ含量明显上升（Ｐ＜组别ＴＮＦ－α（ｐｇ／ｍＬ）ＩＦＮ－γ（ｐｇ／ｍＬ）０?０１）；而与模型组比较，ＢＢＲ组、ＡＤＳＣｓ组、联对照组３５６?７８±２０?００３９０?２６±１５?８２合组小鼠血清ＴＮＦ－α与ＩＦＮ－γ含量明显降低（Ｐ＜模型组６０５?５５±１８?４８＃＃７７４?２０±１７?６５＃＃０?０１）；其中联合组小鼠血清ＴＮＦ－α与ＩＦＮ－γ含ＢＢＲ组５５３?７４±２５?７４∗∗６８３?５０±３５?１９∗∗量降低更突出，与ＢＢＲ组或ＡＤＳＣｓ组比较有显著ＡＤＳＣｓ组５４６?０５±２１?６５∗∗６５２?５７±３３?０３∗∗性差异（Ｐ＜０?０１），见表４。提示ＢＢＲ联合ＡＤＳＣｓ联合组４７２?７０±２２?４２∗∗■■▲▲５５６?５１±１９?０４∗∗■■▲▲治疗能减少ＤＭ小鼠机体炎症因子的产生，增强＃＃∗∗注：与对照组比较，Ｐ＜０?０１；与模型组比较，Ｐ＜０?０１；与ＡＤＳＣｓ的免疫调节能力。ＡＤＳＣｓ组比较，■■Ｐ＜０?０１；与ＢＢＲ组比较，▲▲Ｐ＜０?０１３?４ＤＭ小鼠胰岛病理损伤３?５ＤＭ小鼠胰岛β细胞的凋亡ＨＥ染色结果发现，对照组胰岛结构正常，边Ｃａｓｐａｓｅ３是主要的细胞凋亡执行者，Ｃａｓｐａｓｅ缘清晰，为圆形细胞团，胰岛内细胞数量较多、排３表达的升高意味着细胞逐渐趋于凋亡，ｉｎｓｕｌｉｎ由列整齐，胞浆、胞核染色正常；与对照组比较，模胰岛β细胞分泌，因此我们利用免疫荧光Ｃａｓｐａｓｅ型组胰岛边缘模糊不清，普遍萎缩，胰岛内细胞数＋＋３、ｉｎｓｕｌｉｎ染色代表凋亡的胰岛β细胞。结果见目减少、排列紊乱，细胞核深染，固缩，胰岛细胞图２、图３，与对照组比较，模型组小鼠胰岛内ｉｎ⁃＋空泡化，且可见明显的炎症细胞浸润；而与模型组ｓｕｌｉｎ面积明显减少（Ｐ＜０?０１），β细胞凋亡数目比较，ＢＢＲ组、ＡＤＳＣｓ组、联合组胰岛结构基本增多（Ｐ＜０?０１）；治疗后，与模型组比较，ＢＢＲ＋正常，边缘清晰，胰岛内细胞数目增多、排列整组、ＡＤＳＣｓ组、联合组小鼠胰岛内ｉｎｓｕｌｉｎ面积增齐，细胞核、细胞质染色均匀，炎症细胞浸润减多（Ｐ＜０?５或Ｐ＜０?０１），β凋亡细胞数目减少（Ｐ少，且联合组小鼠胰岛以上病理损伤现象改善尤其＜０?５或Ｐ＜０?０１）；且与ＢＢＲ组或ＡＤＳＣｓ组比较，明显，见图１。以上结果表明，ＢＢＲ联合ＡＤＳＣｓ联合组小鼠更显著（Ｐ＜０?５或Ｐ＜０?０１）。提示

4田晋明，等：ＢＢＲ联合ＡＤＳＣｓ移植对糖尿病小鼠的治疗作用与保护胰岛的机制研究１９ＢＢＲ联合ＡＤＳＣｓ治疗能有效减少ＤＭ小鼠胰岛β细胞凋亡。图１各组小鼠胰岛的病理损伤改变（ＨＥ染色，４００×）图２各组小鼠胰岛β细胞的凋亡情况（免疫荧光，４００×）３?６ＤＭ小鼠胰岛ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、ＮＦ－κＢｐ６５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ蛋白的表达免疫组化结果见图４、图５，与对照组比较，模型组小鼠胰岛ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、ＮＦ－κＢｐ６５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ蛋白的表达明显上升（Ｐ＜０?０１）；而与模型组比较，ＢＢＲ组、ＡＤＳＣｓ组、联合组小鼠胰岛ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、ＮＦ－κＢｐ６５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ蛋白的表达明显降低（Ｐ＜０?０５或Ｐ＜０?０１）；其中与对照组比较，＃＃Ｐ＜０?０１；与模型组比较，∗Ｐ＜０?０５，∗∗Ｐ＜联合组小鼠降低更明显。表明ＢＢＲ联合ＡＤＳＣｓ治▲▲▲０?０１；与ＢＢＲ组比较，Ｐ＜０?０１；与ＡＤＳＣｓ组比较，Ｐ＜０?０５疗能通过抑制ＴＬＲ４／ＭｙＤ８８／ＮＦ－κＢｐ６５通路相关＋图３各组小鼠胰岛内ｉｎｓｕｌｉｎ面积（Ａ）与蛋白及下游炎症因子表达保护胰岛细胞。＋Ｃａｓｐａｓｅ３β细胞数统计（Ｂ）

5２０锦州医科大学学报２０２３年２月，４４（１）图４各组小鼠胰岛ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、ＮＦ－κＢｐ６５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ蛋白的表达（免疫组化，４００×）＃＃∗∗∗▲与对照组比较，Ｐ＜０?０１；与模型组比较，Ｐ＜０?０５，Ｐ＜０?０１；与ＡＤＳＣｓ组比较，Ｐ＜０?０５图５各组小鼠胰岛ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、ＮＦ－κＢＰ６５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ平均光密度

6田晋明，等：ＢＢＲ联合ＡＤＳＣｓ移植对糖尿病小鼠的治疗作用与保护胰岛的机制研究２１３?７ＤＭ小鼠胰腺组织ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、ＮＦ－κＢＡＤＳＣｓ组、联合组小鼠胰腺组织ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、Ｐ６５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γｍＲＮＡ的表达ＮＦ－κＢＰ６５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γｍＲＮＡ表达明显降低ＤＭ小鼠腺组织的ＲＴ－ｑＰＣＲ结果见图６，与对（Ｐ＜０?５或Ｐ＜０?０１），其中联合组小鼠降低更明照组比较，模型组小鼠胰腺组织ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、显，提示ＢＢＲ联合ＡＤＳＣｓ能通过抑制ＴＬＲ４、ＮＦ－κＢＰ６５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γｍＲＮＡ表达明显增加ＭｙＤ８８、ＮＦ－κＢＰ６５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γｍＲＮＡ表达（Ｐ＜０?０１）；治疗后，与模型组比较，ＢＢＲ组、减少ＤＭ的胰岛损伤。＃＃∗∗∗▲▲▲▲与对照组比较，Ｐ＜０?０１；与模型组比较，Ｐ＜０?０５，Ｐ＜０?０１；与ＢＢＲ组比较，Ｐ＜０?０５，Ｐ＜０?０５；与ＡＤＳＣｓ组比较，Ｐ＜０?０５图６各组小鼠胰岛ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、ＮＦ－κＢｐ６５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γｍＲＮＡ表达修饰则通过对ＭＳＣｓ过表达负责生存、迁移和免疫４讨论调节等特性基因，从而使ＭＳＣｓ的治疗更有针对ＳＴＺ是一种典型的ＤＭ模型诱导剂，注射ＳＴＺ性，但慢病毒转染后的ＭＳＣｓ的生物安全性与致瘤［１３］后可引起β细胞内辅酶Ｉ（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉ⁃致畸作用一直是学术界担心的问题。因此运用ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＮＡＤ）的浓度下降，ＮＡＤ依赖性能量基因修饰和多次注射的方法提高ＭＳＣｓ治疗效果的和蛋白质代谢停止，同时诱导一氧化氮（ＮＯ）的实用性还有待考证。基于多种药物协同增效的合成，导致β细胞死亡，从而引起高血糖，造成“鸡尾酒疗法”有方法简单、价格优廉的特点，在［１１］机体代谢紊乱。本研究结果发现注射ＳＴＺ后，一定程度能规避多次移植和基因修饰等方法的不与对照组比较模型组小鼠血糖持续升高，糖耐量受足，在临床疾病治疗中被广泛使用。本研究结果发损，胰岛出现病理损伤，β细胞凋亡增加，表明本现，ＢＢＲ、ＡＤＳＣｓ以及联合治疗均能在一定程度上研究采用ＳＴＺ构建了可靠的小鼠ＤＭ模型。抑制ＤＭ小鼠血糖持续升高的症状，有降血糖效ＡＤＳＣｓ与大多数ＭＳＣｓ一样，有治疗ＤＭ的潜果，但单用ＡＤＳＣｓ治疗小鼠的血糖在第７天后又力，但ＤＭ患者体内微环境的复杂性同样也导致了逐渐回升；而联合治疗组小鼠血糖持续下降、糖耐其疗效的不稳定。目前，增加ＭＳＣｓ移植次数、对量改善更明显，且ＨＥ染色提示联合治疗组小鼠的ＭＳＣｓ进行基因修饰、与药物联合等方式是研究者胰岛病理损伤最小，表明ＡＤＳＣｓ在ＤＭ的治疗中们试图增强ＭＳＣｓ移植治疗效果的常用手段。多次确实有疗效不稳定的情况存在，而将ＢＢＲ与ＡＤ⁃注射ＭＳＣｓ能在一定程度上增加其在患者体内发挥ＳＣｓ联合治疗能在一定程度上提高ＡＤＳＣｓ对ＤＭ的治疗作用的有效细胞数量，但也有栓塞的风险，而治疗作用。因此我们认为，与药物联合，是治疗［１２］这是细胞治疗导致患者死亡的原因之一。基因ＤＭ的可行方法，且ＢＲＲ是提高ＡＤＳＣｓ治疗ＤＭ

7２２锦州医科大学学报２０２３年２月，４４（１）作用的可选药物。（３）：３８－４０，４４?受损的β细胞，可作为自身抗原被巨噬细胞［２］程丹，洪泽，王琛?固有免疫信号通路紊乱对２型糖尿病胰岛功能影响的研究进展［Ｊ］?中国糖尿病杂志，２０２１，吞噬，在胰岛局部促使炎性细胞浸润，并活化释放２９（９）：７０８－７１１?ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＮＯ和ＨＯ等物质杀伤２２［３］谢俊豪，金百翰，刘婷婷，等?间充质干细胞治疗１型糖细胞，与此同时β细胞缺失所引起长期高血糖刺尿病的机制及研究进展［Ｊ］?西北国防医学杂志，２０２０，激进一步加重胰岛炎症细胞浸润，分泌更多的炎症４１（１２）：７２７－７３４?因子，诱导更多β细胞凋亡，因此胰岛细胞的炎［４］常俊杰，解强，刘亦冰，等?高糖对骨髓间充质干细胞作［１４－１５］用机制的研究进展［Ｊ］?中国骨质疏松杂志，２０２２，２８症浸润与ＤＭ的发生发展密切相关。本研究（１０）：１５５１－１５５５?结果显示模型组小鼠血清与胰岛ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ［５］贺云，杨丽霞，郭晓颖?小檗碱治疗２型糖尿病作用机制表达与对照组比较明显升高，胰岛有炎症细胞浸研究进展［Ｊ］?中医研究，２０２０，３３（１２）：６９－７３?润，β细胞凋亡增加；治疗后各组小鼠血清与胰岛［６］李琼静，罗琪?小檗碱通过激活ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ通路促进大鼠ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ含量较模型组降低，胰岛病理损伤骨髓间充质干细胞的体外迁移［Ｊ］?中国组织工程研究，２０１８，２２（２９）：４６２０－４６２４?改善，β细胞凋亡数目减少，且联合组改善最明［７］赵利华，徐兴才，杨鑫?小檗碱联合ｍｉＲ－３２８－３ｐ对骨髓间显。说明ＢＢＲ联合ＡＤＳＣｓ治疗比单用ＡＤＳＣｓ治疗充质干细胞增殖和成骨分化能力的影响［Ｊ］?中国药师，有更好的抗炎效果，能有效抑制ＤＭ小鼠机体炎症２０２１，２４（７）：２６２－２６６?因子的产生。［８］闫冬冬，兰海涛，宋国强，等?黄连素体外诱导人脐带间研究显示［２］７０８－７１１机体免疫炎性反应的激活以充质干细胞向神经样细胞定向分化的实验研究［Ｊ］?中华实验外科杂志，２０２２，３９（１）：７１－７５?及大量炎性因子的生成与ＴＬＲｓ的活化有密切联［９］黄运芳，单贺珍，张婷，等?小檗碱和黄连碱对Ｔ２ＤＭ小系。ＴＬＲ４是ＴＬＲｓ家族发现最早、研究最多的成鼠结肠和胰岛β细胞色氨酸羟化酶１的影响［Ｊ］?中南药员，通常表达于多种免疫细胞。在ＤＭ患者体内，学，２０２０，１８（５）：７６１－７６４?终末糖基化产物、氧化修饰低密度脂蛋白（ｌｏｗ［１０］刘鹏，王从容?两种脐带间充质干细胞标记方法及在１型ｄｅｎｓｉｔｈｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＬＤＬ）、游离脂肪酸等可作为内糖尿病小鼠体内示踪的研究［Ｊ］?医学研究杂志，２０２１，５０（１１）：５５－５９?源性配体与ＴＬＲ４相互作用，通过ＭＹＤ８８依赖的［１１］苏菲娅，刘伟江，张金霞，等?ＳＴＺ诱导１型糖尿病小鼠途径，进一步激活ＮＦ－κＢ，从而诱导大量炎症因早期胰腺巨噬细胞改变的实验研究［Ｊ］?军事医学，［１６］子和趋化因子的产生，加重β细胞衰竭。本研２０２１，４５（９）：６８５－６９１?究结果发现，联合治疗显著降低了ＤＭ小鼠ＴＮＦ－［１２］刘鹏，王从容?间充质干细胞治疗２型糖尿病的临床研究α与ＩＦＮ－γ水平，明显抑制胰岛ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、现状［Ｊ］?同济大学学报（医学版），２０２１，４２（２）：ＮＦ－κＢＰ６５ｍＲＮＡ与蛋白的表达，说明ＢＢＲ联合１６７－１７１?［１３］李欣悦，李倩，石桂英，等?干细胞治疗２型糖尿病及其ＡＤＳＣｓ治疗可通过抑制ＴＬＲ４／ＭｙＤ８８／ＮＦ－κＢ信号并发症的研究进展［Ｊ］?中国比较医学杂志，２０２０，３０通路减轻ＤＭ小鼠胰岛β细胞损伤。（９）：９６－１０２?综上所述，ＢＢＲ联合ＡＤＳＣｓ治疗能增加ＡＤ⁃［１４］吕承安，王若然，孟卓贤?２型糖尿病进程中胰岛β细胞ＳＣｓ对ＤＭ小鼠的治疗作用，更有效地降低ＤＭ小功能变化的分子机制［Ｊ］?遗传，２０２２，４４（１０）：８４０－鼠血糖，保护胰岛β细胞，其机制可能与两者联８５２?［１５］雷蕾，林智立，王琳琳，等?２型糖尿病发病过程中胰岛用能抑制ＴＬＲ４／ＭｙＤ８８／ＮＦ－κＢ信号通路，减少炎症的动力学机理［Ｊ］?科学通报，２０２０，６５（３５）：ＤＭ小鼠机体炎症因子的产生有关。４１３９－４１４８?［１６］王乐乐，陈小盼?Ｔｏｌｌ样受体与２型糖尿病的相关研究进参考文献：展［Ｊ］?河北医药，２０１９，４１（１５）：２３６３－２３６８?［１］左娇娇，王晓霞，张定华，等?炎症因子在糖尿病前期发收稿日期：２０２２－０９－１５病中的作用研究进展［Ｊ］?中国医药导报，２０２０，１７