DB43∕T 2009-2021 香芋茎尖脱毒技术规程(湖南省)

《DB43∕T 2009-2021 香芋茎尖脱毒技术规程(湖南省)》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

ICS65.020CCSB16□B43湖南省地方标准DB43/T2009—2021香芋茎尖脱毒技术规程Regulationsforvirus-freetechnologyofTarostemtip

1

2DB43/T2009—2021目次前言························································································································Ⅲ1范围·····················································································································12规范性引用文件······································································································13术语和定义············································································································14材料选择与处理······································································································15培养基的配制·········································································································16培养·····················································································································27培养室环境调控······································································································3附录A（规范性）MS培养基母液配制表·········································································4附录B（资料性）PCR法检测病毒病··············································································5I

3DB43/T2009—2021II

4DB43/T2009—2021前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南省农业农村厅提出。本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：湖南省蔬菜研究所。本文件主要起草人：李倩、杨建国、汪端华、吴双花、皮向红、王鑫、宋志伟。III

5DB43/T2009—2021IV

6DB43/T2009—2021香芋茎尖脱毒技术规程1范围本文件规定了茎尖脱毒的术语和定义、材料选择与处理、培养基配制、培养、病毒检测的基本要求。本文件适用于香芋茎尖脱毒。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1538.1—2005培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T2964—2011植物病毒检测规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1茎尖脱毒Stemtipdetoxification利用茎尖生长点附近的分生组织病毒少或不带病毒的特点，通过取顶端生长点培养获得无病毒植株的方法。4材料选择与处理4.1材料选择选择健壮、生长旺盛、无病虫害症状的母芋为茎尖脱毒材料。4.2材料处理将取得的香芋材料种于细沙或珍珠岩中，用多菌灵800倍液处理7d～10d。5培养基的配制5.1MS培养基的配制5.1.1母液的配制直接用合成MS培养基或按照附录A的成分表配制MS大量元素母液、微量元素母液、有机母液、铁盐母液。1

7DB43/T2009—20215.1.2MS培养基配制方法先在烧杯中放入适量蒸馏水，加入琼脂粉6g～7g搅拌均匀，置于电炉上加热；依次加入上述母液或MS培养基，其中大量元素20mL，其他母液各5mL，蔗糖30g；边加热边搅拌至完全溶解；加蒸馏水定容至1L；调节pH至5.7～5.9；根据不同需要定量分装，盖好瓶盖；分装好的培养基置于灭菌锅内120℃高压灭菌20min；放置5d～7d，检验培养基灭菌效果。培养基贮存时间不超过30d。5.2初代培养基的配制在MS培养基的基础上，加入激素NAA0.15mg/L、6-BA4.0mg/L和山农1号1mL/L，再灭菌，其操作同5.1.2。5.3增殖培养基的配制在MS培养基的基础上，加入激素NAA0.4mg/L、6-BA4.0mg/L和山农1号1mL/L，再灭菌，其操作同5.1.2。6培养6.1茎尖接种6.1.1材料器械准备在接种前准备酒精灯、75％酒精、NaClO、无菌滤纸或接种盘以及接种器械、培养基、体视显微镜、外植体、无菌水等。6.1.2灭菌提前30min打开超净工作台紫外灯，紫外灭菌完后，打开风机和照明灯。6.1.3接种人员准备接种人员在准备室消毒后在更衣室更换拖鞋、穿白大褂、戴上帽、口罩后方能进入接种室。6.1.4接种前准备操作人员用75％酒精喷或擦手，在操作台内自然吹干后点酒精灯，全程操作须带手套。6.1.5外植体的消毒灭菌解剖刀切下备用的外植体，表面消毒后转入超净工作台进行操作。将芽段放入灭菌后的烧杯内，用75％酒精泡30s～45s，无菌水冲洗2次～3次，10％NaClO溶液浸泡8min～10min，最后用无菌水冲洗3次～4次。6.1.6茎尖剥离及接种将消毒灭菌后的香芋芽段放在无菌滤纸上吸干水分，在30～40倍体视显微镜下用无菌的解剖针剥取带一个叶原基的茎尖，大小0.2mm～0.5mm，将生长点迅速接入初代培养基中，分别编号登记，便于后续观察。6.2香芋茎尖的初代培养2

8DB43/T2009—202160d～80d后成苗，待苗长至2cm～3cm时，整株取出接入增殖培养基中。6.3病毒检测6.3.1主要检测对象烟草花叶病毒(TobaccoMosaicVirus，TMV)、黄瓜花叶病毒(CucumberMosaicVirus，CMV)和芋花叶病毒（Dasheenmosaicvirus,DsMV），引物按表1。表1病毒病检测引物序列病害正向引物反向引物目的片段CMVCCCACTCTTAACCACCCAACCGACGCAGCATACTGATAAACCAA323TMVTAGACCCGCTAGTCACAGCAGAGGTCCAAACCAAAC237DsMVGGGCTTGGGTGATGATGGAGCCTTTCAGTGTTCTCGCCTTG3576.3.2检测方法采用PCR法对脱毒的香芋组培苗进行病毒检测，确认不带病毒的株系，进一步进行增殖培养，对带病毒的株系进行再次脱毒或直接淘汰。各病毒病检测引物按下表1。6.4茎尖苗增殖培养组培苗接入增殖培养基后，40d～50d，发出3～6个丛生芽，切取各丛生芽转入增殖培养基进行增殖培养，30d后，去除基部老化组织，切取各丛生芽继续进行增殖培养。增殖培养周期为25d～35d，增殖率为3～6，连续继代不超过10次。6.5病毒检测病毒检测同6.3。7培养室环境调控2培养室温度应控制在28℃±2℃；相对湿度保持在40％～60％；光照强度控制在54μmol•m•s，光照培养周期为12h/12h。3

9DB43/T2009—2021附录A（规范性）MS培养基母液配制表母液种类成分称取量（mg/L）扩大倍数母液体积（L）吸取量（mL/L）KNO31900NH4NO3165050×120大量元素MgSO4﹒7HO2370KH2PO4170CaCl2﹒2H2O44050×120MnSO4﹒4H2O2.23ZnSO4﹒7H2O860H3BO36.2微量元素KI0.83200×15NaMoO4﹒2H2O0.25CuSO4﹒5H2O0.025CoCl﹒6H2O0.025Na2-EDTA37.3铁盐200×15FeSO4﹒7H2O27.8甘氨酸2盐酸吡哆醇（B1）0.1盐酸硫胺素（B6）0.5维生素烟酸0.5200×15肌醇100IBA0.005MET0.0054

10DB43/T2009—2021附录B（资料性）PCR（PolymeraseChainReaction）法检测病毒病B1香芋病毒病检测应用PCR法检测香芋脱毒苗是否带有烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和芋花叶病毒（DsMV）等主要香芋病毒。B2仪器和设备病毒病检测主要仪器设备包括电泳仪、电泳槽、转数为3000r/min以上的离心机、1.5mL～2mL，50µL离心管、冰箱、高温水浴、微量可调进样器，需要2µL～10µL，10µL～50µL，10µL～200µL三种规格，并附有相应规格的塑料头、玻璃或白瓷制造的小研钵、PCR扩增仪、凝胶成像系统等。B3试剂主要试剂包括植物RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、5×PrimeScriptIIBuffer、dNTP、2.5units/µLTaqDNA聚合酶、10×Buffer、TAE缓冲液等。B4RNA提取取1g～2g香芋脱毒组培苗，放入液氮预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末，放入备好的离心管中，RNA提取参照试剂盒说明书进行，提取RNA后马上进行反转录或放于-80℃保存备用。B5cDNA合成参照说明书，利用反转录试剂盒合成cDNA。B6PCR扩增B6.1反应体系（总体积20L）PCR反应体系为：10×Buffer2.0µL；dNTP(2mmol/L)1.5µL；Primer(2µmol/L)1.5µL；模板DNA4.0µL；Taq(2.5units/µL)1U；加ddH2O至20µL。B6.2扩增反应程序PCR扩增反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s运行35个循环；72℃延伸5min,4℃保存。B7电泳检测与分析PCR反应完毕，短暂离心10s，取6-8µL反应产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNAMarker500-1000作参照。5