NY∕T 4027-2021 I 群禽腺病毒检测方法

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ICS11.220CCSB41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T4027—2021I群禽腺病毒检测方法DiagnosticmethodsforgroupIfowladeonvirus20217275发布2022-06-01实施中华人民共和国农业农村部发布

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2NY/T4027—2021目次前言........................................................................................n引言........................................................................................ini范围......................................................................................12规范性引用文件...........................................................................13术语和定义..............................................................................14缩略语....................................................................................15临床诊断................................................................................15.1流行病学............................................................................15.2临床症状............................................................................25.3病理变化............................................................................25.4结果判定...........................................................................26PCR检测...........................................26.1仪器设备和耗材.......................................................................26.2试剂..................................................................................26.3操作方法............................................................................26.4结果判定...........................................................................37荧光PCR检测............................................................................37.1仪器设备和耗材.......................................................................37.2试剂..................................................................................37.3操作方法...........................................................................37.4结果判定...........................................................................48IFA鉴定................................................................................48.1仪器设备和耗材.......................................................................48.2试剂..................................................................................48.3操作方法...........................................................................48.4结果判定...........................................................................49病毒分离培养............................................................................59.1仪器设备和耗材.......................................................................59.2试剂................................................................................9.3细胞和鸡胚.........................................................................9-4悚加力加..............................................59.5结果判定............................................................................10综合判定................................................................................6附录A（资料性）溶液配制...................................................................7附录B（资料性）PCR检测引物及判定标准图例...............................................8附录C（资料性）阳性对照病毒................................................................9附录D（资料性）荧光PCR检测引物及判定标准图例..........................................10附录E（资料性）IFA鉴定使用单克隆抗体及判定标准图例.....................................11附录F（规范性）细胞培养..................................................................12I

3ny/t4027—2021、,—1—刖a本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本文件起草单位;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、山东农业大学、中国兽医药品监察所。本文件主要起草人:潘青、王笑梅、高玉龙、唐熠、李俊平、崔红玉、刘长军、刘爱晶、祁小乐、张艳萍、李凯、高立。II

4ny/t4027—2021引言I群禽腺病毒(groupIfowladenovirus,FAdV-I)是危害家禽养殖业的重要传染病病原.主要感染鸡、鸭、鹅等家禽，给我国家禽养殖业造成了巨大的经济损失。FAdV-T属于腺病毒科禽腺病毒属,可分为5个种(A〜E)和12个血清型(1〜7,8a〜8b,9〜U),不同血清型FAdV-I感染家禽症状不尽相同，致病毒株感染鸡可引起包涵体肝炎(inclusionbodyhepatitis,IBH)、心包积液-肝炎综合征(hydropericardium:hepatitissyndrome,HHS)等病变，非致病毒株感染无典型临床症状和病理变化。我国FAdV-1主要流行血清型为FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-ll,且致病血清型在不断增多，尤其2015年以来，我国突发流行的新型FAdV-4感染鸡引起的HHS,死亡率可达30%〜100%,给养禽业带来严重的经济损失。然而，目前尚没有FAdV-T标准化的检测方法。基于此，特制定本文件。本文件规定了FAdV-I的临床诊断、PCR检测、荧光PCR检测、IFA鉴定和病毒分离培养方法,适用于我国家禽FAdV-1检测的需求。m

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6NY/T4027—2021I群禽腺病毒检测方法1范围本文件规定了I群禽腺病毒检测的临床诊断、病毒核酸检测
PCR和荧光PCR;ஹ病毒Hexon蛋白检测=IFA;、病毒分离培养的技术要求和规范。本文件适用于I群禽腺病毒检测2规范性引用文件下列文件中的内容^跃4其中,注日期的引用文件.仅该日期对应的版本^纥&・^修改单）适用本文件。GB/T6682GB19489NY/T541jNY/T19d术语和定本文件*的术语和缩略语下列缩，DNA脱.相vxyribonEB澳化FAdV:^^BFAdV-IூGroupFAdV-1血《毒
FsFAdV-4血清FBS胎牛血清=F,•vine[orcscci^ySi^Bfelvdropen<[ium-hepyndromeIFA间接龟疫族-光(IndirectimmunofluoroRcenceassay)LMH鸡肝癌细胞系(Leghornmalehepatocellularcells)PBS磷酸盐缓冲液(Phosphate-bufferedsalinebuffer)PCR聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)5临床诊断5.1流行病学鸡、鸭、鹅等家禽对FAdV-1易感，野鸡、火鸡、鸽、鸵鸟等野鸟也可感染。FAdVI主要通过呼吸道和消化道传播.各日龄均可感染，不同血清型毒株发病率和病死率差异较大。尤其FAdV-4强毒株主要感染3周龄〜7周龄肉鸡、蛋鸡*大日龄也可感染,感染后3d〜4d出现死亡高峰，死亡率可达30%〜100%。1

7NY/T4027—2021非致病毒株呈隐性感染，无典型临床症状和病理变化。5.2临床症状FAdV-I致病毒株感染通常会出现精神沉郁，羽毛松乱，采食量下降，体重下降,排泄物呈黄色黏液状等临床症状。5.3病理变化FAdV-1致病毒株感染通常表现为肝脏肿大,边缘钝圆,表面有不同程度的出血点，部分血清型致病毒株可导致心包积液,肝细胞变性坏死，出现核内包涵体。5.4结果判定符合上述5.1.5.2,5.3基本特征的病例，可判定为FAdV-1感染疑似病例。6PCR检测6.1仪器设备和耗材6.1.1PCR扩增仪。6.1.2台式低温高速离心机。6.1.3稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。6.1.4凝胶成像仪(或紫外透射仪)。6.1.5-20℃冰箱。6.1.6微量可调移液器(0.1fzL~109Lஹ2mL-20jzL'IOjxL-100ptL和100ptL-l000jzL各1支)。6.1.7手动或电动移液装置。6.1.86孔细胞培养板。6.1.9吸头。6.1.10PCR扩增管。6.1.111.5mL离心管。6.2试剂6.2.1PBS,见附录A中的A.1஺6.2.2组织研磨液.见附录A.2。6.2.3商品化DNA提取试剂盒。6.2.4商品化PCR反应试剂盒。6.2.5引物FAdV-IF和FAdV-工R,见附录B中的B.1。6.2.6TAE缓冲液，见附录A.3஺6.2.7琼脂糖凝胶,见附录A.4。6.2.8灭菌双蒸水(ddHzO)஺6.3操作方法6.3.1样品准备取待检肝组织样品1.0g~2.0g,按照1：5(W/V)比例加入组织研磨液，制成混悬液，冻融3次。4℃12000r/min离心15min,取上清液,0.222m滤器过滤,备用。阴性对照样品为未接毒的LMH细胞或CEL细胞培养液，阳性对照样品为HLJFAdl5(见附录C)或其他背景清楚的FAdV-L毒株病毒，待检样品为疑似病例肝组织悬液上清或培养病毒样品。6.3.2DNA提取按照商品化DNA提取试剂盒说明书提取DNA,提取的DNA应立即进行PCR反应或一20匕保存。6.3.3PCR反应见表L2

8NY/T4027—2021表1PCR反应体系(25.0fiL)试剂体积/L2XExTagpremix12.5FAdV-1FC10/imol/L)1.0FAdV-1R(10p.mdl/1.)1.0DNA模板2.0ddH2O8.5将PCR扩增管放入PCR扩增仪进行扩增。反应程序为：95℃预变性5min95℃变性30s,58t退火308,72℃延伸105s,35个循环;72结束6.3.4凝胶电泳取PCR产物5mL加入匕・■冲液球行160V恒压电泳，15min20min,在凝胶成像系统6.4结果判定6.4.1成立条件＜阴性对照样例见B.3;஺p/6.4.2结果判定卜在试验成廊清检，待检样品如需确定病卷小进一步对:待检样司带.则判定7荧光PC*7.1.1荧光・呼7.1.2微后可调移*0/L各1支）。7.1.3吸头7.1.4荧光Pd7.2试剂商品化荧^^^金7.2.17.2.2引物FAV-F福7.2.3标准品质粒见D.7.2.4灭菌双蒸水=ddHz஺?7.3操作方法7.3.1样品准备样品准备与DNA提取见6.3.1。7.3.2PCR反应见表2。表2荧光PCR反应体系=20.0|iL;试剂体系小L2XSYBRqPCRMix10.0FAV-FC10/imol/L)1.0FAV-R(10Mmol/L)1.0DMA模板2.0ddH?O6.03

9NY/T4027—2021将PCR扩增管放入实时荧光定量PCR扩增仪进行扩增。反应程序为；95℃预变性5min95℃变性10s,6O℃退火30s,45个循环。试验结果用LightCycler®96SW1.1软件进行分析。7.4结果判定7.4.1成立条件阴性对照样品无扩增曲线或Ct值＞33出现扩增曲线,标准品质粒出现特征性扩增曲线且Ct值＜33,则试验成立（判定标准图例见D.3）。7.4.2结果判定在试验成立的前提下，待检样品出现特征曲线且Q值433,则判定待检样品为FAdV-I核酸阳性。待检样品无扩增曲线或Ct值＞33出现扩增曲线，则判定待检样品为FAdV-I核酸阴性。8IFA鉴定8.1仪器设备和耗材8.1.1荧光显微镜。8.1.2微量可调移液器=0.1mL-10rLஹ2mL-20MU1OmL~1OO.和100mL~1000,L各1支）。8.1.3手动或电动移液装置。8.1.46孔细胞培养板。8.1.5吸头。8.2试剂8.2.1PBS,见附录A.1。8.2.2细胞封闭液,见附录A.5。8.2.3FAdV-I群特异性单克隆抗体5F7,见附录E中的E.1。或其他FAdV-I群特异性单克隆抗体。8.2.4商品化FITC-羊抗鼠IgG抗体。8.3操作方法8.3.1样品准备阴性对照样品为未接毒的LMH细胞或CEL细胞，阳性对照样品为HLJFAdl5=见附录C;或其他背景清楚的FAdV-I病毒接种的LMH细胞或CEL细胞，待检样品为病料上清液接种的LMH细胞或CEL细胞.见6.3.1。8.3.2IFA试验8.3.2.1将细胞培养液弃去,加入无水乙醇，每孔0.5mL,室温固定20min弃去上清液，用PBS洗涤3次，每孔0.5mL,每次5min஺8.3.2.2加入1%BSA封闭液，每孔0.5mL,37（作用1h弃去上清液，用PBS洗涤3次，每孔0.5mL,每次5min஺8.3.2.3加入PBS稀释的FAdV-1特异性单克隆抗体（1：200）,每孔0.5mL,37C孵育1h弃去上清液，用PBS洗涤3次.每孔0.5mL,每次5min.8.3.2.4加入PBS稀释的FITC-羊抗鼠IgG抗体（1：200）,每孔0.5mL,37（避光孵育1h弃去上清液，用PBS洗涤3次，每孔0.5mL,每次5min஺8.3.2.5加入PBS,每孔0.5mL,在荧光显微镜下观察特异性绿色荧光。8.4结果判定8.4.1成立条件在荧光显微镜下观察.阴性对照无特异性荧光，阳性对照出现特异性荧光,则试验成立（判断标准图例见E.2;஺4

10NY/T4027—20218.4.2结果判定在试验成立的前提下，待检病毒样品出现特异性荧光，则判定待检样品为FAdV-I阳性。待检病毒样品无特异性荧光，则判定待检样品为FAdV-I阴性。9病毒分离培养9.1仪器设备和耗材9.1.1倒置显微镜。9.1.2微量组织研磨仪。9.1.3生物安全柜。9.1.4细胞培养箱。9.1.537T孵化器。9.1.642冰箱。/9.1.7-209.1.8微量可OOOfzL各1支）。9.1.9手动或9.1.106孔9.1.111.5L.离心9.1.12吸39.2试剂9.2.1PBS组H9.2.29.2.30-25.9.2.4细胞细胞.9.2.59.3细胞和鸡9.3.1LMH细9.3,26日龄9.4操作方法，9.4.1样品准备、样品准备见6.3.1。9.4.2细胞分离病毒按附录F准备LMH或CEL细庖］涤3次，弃去PBS,加入1mL6.3.1中制备的样品上清液一置37r,5%CQz培养箱中吸附1h.奔去上清液，用PBS洗涤3次，弃去PBS,加入2mL细胞维持液。每日观察是否出现细胞病变(CPE),观察至3d〜7d஺如未出现CPE,将细胞培养物冻融3次，离心，取上清液盲传3代,观察是否出现CPE஺将出现CPE的细胞培养物冻融3次，离心，收集上清液，冷冻保存。9.4.3鸡胚分离病毒画出鸡胚气室，消毒，将6.3.1中制备的样品上清液经卵黄囊途径接种鸡胚，每胚0.2mL,置37P继续孵化。每日照胚2次,24h死亡胚弃去，把1d〜7d死亡鸡胚或7d存活鸡胚置2℃〜80c冰箱过夜,无菌采集肝脏，按6.3.1制备上清液。将上清液接胚盲传3代,剖检。收集肝组织冷冻保存。9.5结果判定细胞出现形态变圆、脱落.集聚成不规则的葡萄串状等典型病变。鸡胚出现死亡或胚体发育不良,肝5

11NY/T4027—2021脏肿大、坏死。细胞或鸡胚出现上述病变可判定为FAdV-1阳性。10综合判定符合5.4感染疑似病例，经6.4PCR,7.4荧光PCR或8.4IFA任何一项检测阳性,判定为FAdV-1感染。检测结果存疑时，进行9.5病毒分离培养*做出判定。6

12NY/T4027—2021附录A（资料性）溶液配制A.1磷酸盐缓冲液=PBS;的配制称取8.0g氯化钠=NaCl;■'HPO..：21^,0.24g磷酸二氢钾=KH2PCOஹ0.2g氯化钾
KCD按次序蒸水将溶液定容至1L,高压消毒灭菌H2kPa30Ub乙.A.2组织研磨液的配制在99mL’mL.链霉素浓度为10mg/mL;,称取242gNa_El)TArH.双蒸水mL的醋酸搅拌，加双蒸水|1Lஹ配制员一-：使用时缓冲液2mL,加入98mLI£I'*ml*1八TAE:1%琼.量取10,温度降低至约50℃,加入I—替代物■A.5细胞封细胞培养液在89mLDMEMl0^中（其中，青霉素浓度为10000U/mL,链霉素浓遇、A.7细胞维持液的配制在97mLDMEM培养基中加入2K青霉素-链霉素溶液（其中，青霉素浓度为10000U/mL.链霉素浓度为10mg/ml;,混勺，保存于2七〜8七。7

13NY/T4027—2021附录B(姿料性)PCR检测引物及判定标准图例B.1FAdV-IPCR检测引物见表B.表表B.1FAdV-IPCR检测引物目的片段引物名称5'-3'的序列在HLJFAdlo毒株基因组中的位置产物大小FAdV-IFGCCACCGGAAGCTACTTTGA20473〜20492Hejcon基因1655bpFAdV-1RTTGTGATCCATGGGCATGA22109〜22127B.2引物的稀释新合成引物短暂离心(12000r/min,3Os)；用DEPC处理的灭菌双蒸水溶解，充分混匀.配置成浓度为100ptmol/L的储存液，一20七保存;使用时，将储存液用DEPC处理的双蒸水进行10倍稀释，配置成浓度为10fzmol/L的引物,-20℃保存。B3PCR检测判定标准图例见图B.1஺标引序号说明：M-----MarkerAFAdV-I阴性样品；BFAdVT阳性样品。图B.1FAdV-IPCR检测判定标准图例8

14NY/T4027—2021附录C（资料性）阳性对照病毒FAdV4阳性对照HLJFAdl5毒株,由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病创新团队于2015年从黑龙江省肇东市发病蛋鸡肝脏分离并鉴定保存，全基因组Genbank登录号为KU991797஺如有需要，可由毒株保存单位提供或惠赠。阳性对照为病毒接种LMH细胞72h后收获，冻融3次，将离心收集的上清液分装,80T保存。9

15NY/T4027—2021附录D（资料性）荧光PCR检测引物及判定标准图例D.1FAdV-I荧光PCR检测引物见表D.1஺表D.1FAdV-1荧光PCR检测引物目的片段弓I物々称5'-3'的序列产物大小FAV-FGTGAARCCBSTGAAVAACGACGGHexon基因227bpFAV-RAAATT(STCCCKRAANCCGATGTAD.2标准品质粒克隆FAdV-工hexon-Ll基因的12个阳性标准品质粒，由山东农业大学动物科技学院制备并保存,可由山东农业大学动物科技学院提供。标准品来源毒株信息见表D.2。表D.2标准品来源毒株信息毒株血清型菌株保藏编号Genbank编号FAdV-1CVCCAVIZ67970.1FAdV-2everAV72AF508946.1FAdV-3CVCCAV73HQ697592.1FAdV-4CVCCAV74AJ431719.1FAdV-5CVCCAV75KC493646.1FAdV-6CVCCAV76EU979372FAdV-7CVCCAV77EU979373FAdV-8aCVCCAV78EU979374FAdV-8bCVCCAV79EU979375FAdV-9CVCCAV80AF508958.2FAdV-10CVCCAV81EU979377FAdV-11CVCCAV82HQ697595.1D.3荧光PCR检测判定标准图例见图D.L3.300FAdV-l3.000FFAAddVV-232.7002.4002.1001.8001.5001.2000.9000.6000.3000.0002.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.0033.0032.0034.0036.0038.0040.0042.0044.00Cycle图D.1FAdV-I荧光PCR检测判定标准图例10

16NY/T4027—2021附录E（资料性）IFA鉴定使用单克隆抗体及判定标准图例E.1单克隆抗体的来源鼠源单抗5F7=浓度;200度/mLELISA效价＞1:2430；建议使用浓度：50〜1：200）,由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所制备并保存，该单抗可由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。E.2IFA鉴定判定图例见图E.lo标引序号说明：A-FAdV-1阴性样品；B-FAdV-1阳性样品。图E.1FAdV-1IFA鉴定判定标准图例11

17NY/T4027—2021附录F（规范性）细胞培养F.1鸡肝癌细胞=LMH;培养将生长状态良好的LMH棚胰酶消化为单个细胞,加入适量的细胞培养液（见A.6）,用兴:细胞培养板中（细胞传代培养则按每瓶5X106个细鲁，人y齿置于3735%CO2培养箱培养,待细胞密度鸡胚原代肝:取14日龄陛仰卧打开腹膜，取■、,再用PBS洗涤细胞培养■j,加入PBS洗涤按每^目最加入t再加入印晨见A.6：后的细胞液,孑^^1。6个细胞加入）r/minS到90%或接种。12