生物制药大学讲义

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生物制药第一章生物药物概述生物药物——是利用生物体、生物组织或其成分，综合应用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法进行加工、制造而成的一大类预防、诊断、治疗制品。生物技术药物——是指采用DNA重组技术、单克隆抗体技术或其他生物技术研制的蛋白质、抗体或核酸类药物。生物技术药物可以是在药理上有高度活性的，也可以是在免疫或其他生理系统上有活性的。生物技术药物可以分为三大类，即重组蛋白质、治疗性抗体和核酸。生物制品——用微生物及微生物代谢产物或动物血清制成的用于预防、诊断和治疗的制品。第一节生物药物的研究范围一、什么是生物制药工艺学生物制药工艺学一是从事各种生物药物的研究、生产和制剂的综合性应用技术科学。研究内容包括生化制药工艺、生物制品制造与相关的生物医药产品的生产工艺。主要讨论各类生物药物的来源、结构、性质、制造原理、工艺过程、生产技术操作和质量控制。二、生物制药工艺学具体主要任务1）生物药物的来源及其原料药物生产的主要途径和工艺过程。2）生物药物的一般提取、分离、纯化、制造原理与生产方法。3）各类生物药物的结构、性质、用途及其工艺过程和质量控制。

1三、生物制药行业特点（一）行业进入壁垒高:1、高技术：主要表现在高知识层次人才和高新技术方面。生物制药是一种知识密集，技术含量高，多学科高度综合互相渗透的新兴产业。以基因工程药物为例，上游技术（即工程菌的构建）涉及到目的基因的合成、纯化、测序；基因的克隆、导入；工程菌的培养及筛选；下游技术涉及到目标蛋白的纯化及工艺放大，产品质量的检测及保证；药物的申报要求极为严格，包括临床实验及申报文件的编制等。2、高投入：生物制药是一个投入相当大的产业，主要用于新产品的研究开发及医药厂房和设备仪器方面。美国93年对生物工程业的开发投资约40亿美元，94年达到77亿美元，96年研究经费为79亿美元，并从股市增资45亿美元，97年风险资本投资者又向美国新的生物技术公司投入10亿美元以上。通常，一个新药的开发生产，有55%的工时用于研发，10%用于销售，19%用于生产还有其它。一个基因工程新药的开发费用平均需要『3亿美元，并随新药开发难度的增加而增加（目前有的还高达6亿美元）。显然，雄厚的资金是生物制药开发成功的必要保障。另外，生物制药对医药厂房和设备仪器要求很高，且属于一次性投入,这又需一大笔资金。在中国国内，由于大多生物药物都属仿制，因此研发费用就很低。3、政府直接干预：药品作为一类直接涉及人民健康的特殊商品，其开发、生产、定价、销售、进出口等均受到严格的特殊法律的规范、控制和管理，没有药证和生产许可证、GMP等规范认证的药品和企业不能合法进入医药市场。

2（二）长周期：生物药品从开始研制到最终转化为产品要经过很多环节：试验室研究阶段、中试生产阶段、临床试验阶段（I、H、HI期）、规模化生产阶段、市场商品化阶段以及监督每个环节的严格复杂的药政审批程序，而且产品培养和市场培养较难；所以开发一种新药周期较长，一般需要8T0年、甚至10-12年的时间。（三）高风险：生物医药产品的开发孕育着较大的不确定风险。产品开发风险：研制开发的任何一个环节都很关键，一节败下将前功尽弃，并且某些药物具有“两重性”,可能会在使用过程中出现不良反应而需要评价；一般来讲，一个生物工程药品的成功率仅有5〜10%。市场竞争风险：“抢注新药证书、抢占市场占有率”是开发技术转化为产品时的关键，也是不同开发商激烈竞争的目标，若被别人优先拿到药证或抢占市场，则全盘落空，尤其是国外产品的冲击长期来看在所难免。（四）高收益：生物工程药物的利润回报率很高。一种新生物药品一般上市后2〜3年即可收回所有投资，尤其是拥有新产品、专利产品的企业，一旦开发成功便会形成技术垄断优势，利润回报能高达10倍以上。美国Amgen公司1989年推出的促红细胞生成素（EP0）和1991年推出的粒细胞集落刺激因子（G-CSF）在1997年的销售额已分别超过和接近20亿美元。仅仅是一个人体肥胖相关基因的克隆，便可以2千万美元的身价卖给Amgen公司，且随该基因的临床应用，Amgen将为之继续投资8千万美元；一旦开发成功投放市场，将获暴利。第二节生物药物的性质和分类一、生物药物的特点生物药物的有效成分在生物材料中浓度都很低，杂质的含量相对比较高。它们分子大，组成、结构复杂，而且具有严格的空间构象，以维持其特定的生

3理功能。对热、酸、碱、重金属及pH变化和各种理化因素都较敏感。二、生物药物的分类（一）生化药物1、氨基酸类药物全世界的氨基酸总产量已逾百万吨/年。年产值达几十亿美元，应用于医药、食品、饲料工业，还供合成高效无残毒农药及甜味剂。主要品种有谷氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、精氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和色氨酸等。氨基酸类药物有个别氨基酸制剂和复方氨基酸制剂两类。个别氨基酸，如胱氨酸：抗过敏、肝炎、白细胞减少症；蛋氨酸：防治肝炎、肝坏死、脂肪肝；复方氨基酸：1）水解蛋白注射液、2）复方氨基酸注射液、3）要素膳（营养液）氨基酸衍生物：N一乙酰半胱氨酸（全新粘液溶解剂）、L—多巴（帕金森病）、S一甲基半胱氨酸（降血脂）、S一氨基甲酰半胱氨酸（抗癌）。2、多肽和蛋白质类药物活性多肽是由多种氨基酸按一定顺序连接起来的多肽链化合物，分子量一般较小，多数无特定空间构象。多肽在生物体内浓度很低，但活性很强，在调节生理功能时起着非常重要的作用。临床上肽类药物有20中以上，催产素（9肽），加压素（9肽），ACTH（39肽）、胰高血糖素（29肽），降钙素（32肽），胸腺五肽等下丘脑激素；消化道激素；舒缓激肽；松果肽。蛋白质类药物有单纯蛋白与结合蛋白。单纯蛋白类药物：人白蛋白、丙种球蛋白、血纤维蛋白、胰岛素、催乳素、

4明胶等。糖蛋白类药物：干扰素、催黄体激素、胃膜素等。特异免疫球蛋白制剂的发展十分引人注目，如丙种球蛋白A、丙种球蛋白M、抗淋巴细胞球蛋白、人抗RHO球蛋白等。植物凝集素属于糖蛋白类，是一类非特异免疫刺激剂。如天花粉蛋白等。3、酶与辅酶类药物酶制剂也广泛用于疾病的诊断和治疗。在制药工业、轻工食品和农业方面大量使用酶制剂。酶类药物有：1）助消化酶类：胃蛋白酶、胰酶、凝乳酶等2）消炎酶类：溶菌酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶，用于消炎、消肿、清疮、排脓等。3）心血管疾病治疗酶：弹性蛋白酶能降低血脂，用于防治动脉粥样硬化。尿激酶、链激酶、纤溶酶及蛇毒溶栓酶。4）抗肿瘤酶类：L一门冬酰胺酶用于治疗淋巴肉瘤和白血病。5）其它酶类：超氧化物歧化酶（SOD）用于治疗类风湿性关节炎。6）辅酶类药物：NADNADPFMN辅酶Q.）增强疗效。4、核酸及其降解物和衍生物1）核酸类从猪、牛肝提取得RNA制品对治疗慢性肝炎，肝硬化和改善肝癌症状有一定疗效。免疫RNA（iRNA）,可用于肿瘤免疫治疗。2）多聚核甘酸多聚胞甘酸、多聚次黄昔酸、双链聚肌胞（polyl：C）,等干扰素诱导剂，具有刺激吞噬作用，调节免疫功能的作用，用于抗病毒、抗肿瘤。

53）核甘、核甘酸及衍生物混合核甘酸、混合脱氧核甘酸、ATP、CTP、cATPo5-氟尿喘咤，2-脱氧核甘、阿糖胞甘等5、多糖类药物多糖类药物的药物的来源有动物、植物、微生物、和海洋生物，它们在抗凝、降血脂、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫功能和抗衰老方面有较强的药理作用。肝素有很强的抗凝作用硫酸软骨素A降血脂、防治冠心病方面有一定疗效；透明质酸具有健肤、抗皱、美容作用；壳聚糖有降血脂作用；某些真菌多糖具有显著的抗肿瘤作用，如香菇多糖、蘑菇多糖、灵芝多糖、灰树花多糖等。6、脂类药物1）磷脂类：脑磷脂、卵磷脂多用于肝病、冠心病、和神经衰弱。2）多价不饱和脂肪酸和前列腺素：亚麻酸、亚油酸、花生四烯酸（AA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）。3-33-6前列腺素是一大类含五元环的不饱和脂肪酸，重要的天然前列腺素有PGE1、PGE2、PGF2a、PGI23）胆酸类：去氧胆酸、猪去氧胆酸，鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸4）固醇类：主要有胆固醇、麦角固醇和谷留醇。

65）咋琳类：血红素、胆红素、血口卜琳。（红桃K）7、细胞生长因子与组织制剂细胞生长因子是在体内对动物细胞的生长有调节作用，并在靶细胞上具有特异性受体的一类物质。它们不是细胞生长的营养成分。神经生长因子（NGF）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（PGF）、血小板生长因子（PDGF）、红细胞生成素（EPO）、淋巴细胞生长因子：白介素-l（IL-l）,白介素-2QL-2）,白介素-3（IL-3）动植物组织，经加工处理，制成符合药品标准并具有一定疗效的制剂称为组织制剂。如胎盘组织液。（二）生物制品生物制品有预防用制品、治疗用制品和诊断用制品。预防用制品可分为菌苗（如卡介苗等）、疫苗（如乙肝疫苗等）及类毒素等（如白喉类毒素等）。治疗用制品有特异性治疗用品（狂犬病免疫球蛋白）和非特异性治疗用品（白蛋白）。诊断用制品主要指免疫诊断用品，各种诊断用单克隆抗体等。三、生物药物的用途（一）作为治疗药物按药理作用主要有以下：（1）内分泌障碍治疗剂：胰岛素、生长素、甲状腺素等。（2）维生素类药物：主要起营养作用，用于维生素缺乏症。（3）中枢神经系统药物：L-多巴，人工牛黄、脑啡肽。

7（4）血液及造血系统药物：常见的有抗贫血药（血红素）、抗凝药（肝素）、纤溶剂一抗血栓药（尿激酶）等。（5）呼吸系统药物：平喘药（PGE、肾上腺素）、祛痰剂（乙酰半胱氨酸）、镇咳药（蛇胆、鸡胆）。（6）心血管系统药物：抗高血压药（激肽释放酶）、降血脂药（弹性蛋白酶，猪去氧胆酸）、冠心病防治药（硫酸软骨素A）（7）消化系统药物：助消化药（多酶片）、溃疡抑制剂（胃膜素、维生素U）、止泻药（糅酸蛋白）。（8）抗病毒药物：①抑制病毒核酸的合成，如碘昔②抑制病毒合成酶，如阿糖腺首③调节免疫功能，如干扰素（9）抗肿瘤药物：主要有核酸类抗代谢物（阿糖胞甘，5-氟尿喘咤）、抗癌天然大分子（天冬酰胺酶，香菇多糖PSK,灰树花多糖）、提高免疫力抗癌剂（白介素-2,干扰素）（10）抗辐射药物：如超氧歧化酶（SOD）（11）计划生育用药：口服避孕药（复方快诺酮）（12）生物制品类治疗药：各种免疫蛋白、抗毒素、抗血清（蛇毒抗血清）。（二）作为预防药物常见的预防药物有菌苗、疫苗、类毒素及冠心病防治药物。（三）作为诊断药物（1）免疫诊断试剂利用高度特异性和敏感性的抗原机体反应，检测样品中有无相应的抗原或

8抗体，可作为临床诊断的依据。主要有诊断抗原和诊断血清。诊断抗原：1）细菌类，如伤寒；2）病毒类，如SARS,乙肝病毒；3）毒素类,如链球菌溶血素。诊断血清：1）细菌类；2）病毒类；3）肿瘤类；4）抗毒素类；5）激素类；6）血型及人类白细胞抗原诊断血清；7）其它（2）酶诊断试剂利用酶反应的专一性和快速灵敏的特点，定量测定体液内的某一成分变化作为病情诊断的参考。目前有40余种酶诊断试剂盒。（3）器官功能诊断药物利用某些药物对器官功能的刺激作用，排泄速度等已检查器官的功能损害程度。如甘露醇等。（4）放射性核素诊断药物放射性核素诊断药物有聚集于不同组织或器官的特性，故加入体内后，可检测其在体内的吸收、分布、转运、利用及排泄等情况，从而显示器官功能及其形态，以供疾病的诊断。（5）诊断用单克隆抗体（McAb）McAb的特点之一是专一性强，一个B细胞所产生的抗体只针对抗原分子上的一个特定抗原决定族。（四）用作其它生物医药用品（1）生化试剂：如细胞培养基、电泳试剂等（2）生物医学材料：手术缝合线、人造骨头等。（3）营养保健品和美容化妆品

9第三节生物药物的研究发展趋势一、资源的综合利用与扩大开发（一）脏器综合利用动物脏器如胰脏、心脏、肝脏、大脑、垂体等都含多种激素、酶类、多糖、脂类等生理活性物质。应用现代生化技术可以由同一脏器生产若干生化产品。如由胰脏可以生产胰岛素和胰酶，胰岛素和胰高血糖素，胰酶、弹性蛋白酶和激肽释放酶等（二）血液综合利用人血含有性质和功能不同的多种成分.大多数病人只需要一种成分。从血液分离出各种成分，对症使用，既可提高疗效减少副作用，又可充分利用宝贵血源。血制剂可分为细胞成分（有形成分）和血浆蛋白成分。前者包括红细胞、白细胞和血小板，后者包括白蛋白、免疫球蛋白、各种凝血因子、纤维蛋白酶原和其他蛋白制剂。（三）人尿综合利用人尿是来源丰富的宝贵生物资源。由人尿制取的药物与人体成分同源，不存在异种蛋白抗原性问题。不同生理时期的尿液，所含活性成分有较大不同。如妊娠妇女与绝经期妇女尿液可分别制备HCG和HMG,健康男性尿液可以制备尿激酶、激肽释放酶、尿抑胃素、蛋白酶抑制剂、睡眠因子等。（四）扩大开发新资源（海洋药物）发掘新的海洋生物资源海洋生物资源是一个十分巨大的有待深入开发的生物资源，环境的多样性决定了生物的多样性，同时也决定了化合物的多样性。发掘新的海洋生物资源已成为海洋药物研究的一个重要发展趋势。

101、海洋微生物资源海洋微生物种类高达100万种以上，其次生代谢产物的多样性也是陆生微生物无法比拟的。但能人工培养的海洋微生物只有几千种，不到总数的1%;目前为止，以分离代谢产物为目的而被分离培养的海洋微生物就更少。由于微生物可以经发酵工程大量获得发酵产物，药源得到保障。此外，海洋共生微生物有可能是其宿主中天然活性物质的真正产生者，具有重要的研究价值。2、海洋罕见的生物资源生长在深海、极地以及人迹罕至的海岛上的海洋动植物，含有某些特殊的化学成分和功能基因。在水深6000米以下的海底，曾发现具有特殊的生理功能的大型海洋蠕虫。在水温90摄氏度的海水中仍有细菌存活。对这些生物的研究将成为一个新的方向。3、海洋生物基因资源海洋生物活性代谢产物是由单个基因或基因组编码、调控和表达获得的。获得这些基因预示可获得这些化合物。开展海洋药用基因资源的研究对研究开发新的海洋药物将有着十分重大的意义。(1)海洋动植物基因资源：活性物质的功能基因，如活性肽、活性蛋白等。(2)海洋微生物基因资源：海洋环境微生物基因及海洋共生微生物基因。4、海洋天然产物资源海洋天然产物历经数十年的研究，已经积累了相当丰富的研究资料，为海洋药物的开发提供了科学依据。（1）对已获得的上万种海洋天然产物进行多靶点和新模型的筛选，发现新的活性。

11（2）对已获得的海洋天然产物进行结构修饰或结构改造。（3）采用组合化学或生物合成技术，衍生更多的新的化合物，从中筛选出新的活性成分。5、海洋中药资源海洋中药是我国中药宝库的重要组成部分，是一种民间长期用药经验的总结。历代本草中经现代临床实践证明疗效确切的海洋药物有110多种，是寻找先导化合物和开发海洋药物的重要资源。从海洋中药中开发新药具有针对性强、见效快、周期短等特点。二、大力发展现代生物技术医药产品主要研究开发：1）生理活性物质；2）干扰素；3）抗体；4）疫苗；5）抗生素；6）维生素；7）医疗诊断用品；8）其它药品重点研究方向：1）应用DNA重组技术，细胞工程技术，酶工程技术，研究和开发心血管疾病、糖尿病、肝炎、肿瘤、抗感染及抗衰老和计划生育方面的新型药物。2）应用现代生物技术改造传统制药工业。主要产品：1）生理活性多肽和蛋白质类药物；2）疫苗；3）单克隆抗体及诊断试剂；4）酶诊断试剂；5）导向药物；6）抗生素三、依靠生化理论从天然存在的生理活性物质寻找新药已发现的作为药用的生理活性物质仅是机体存在的活性物质的一小部分,许多新的活性物质正待人们去开发，所以进一步研究尚未发现的新物质和过去不认识的生理作用是寻找新药的一个重要方向。四、发展化学合成和蛋白质工程创制新结构药物

12许多结构较为简单或分子量不太大的天然活性物质已可以通过化学合成生产或结构改造形成新化合物。如PGE2或PGF20在其15位甲基化即可提高其稳定性许多倍；一些活性多肽的某一氨基酸残基组成当从L-型改为D-型之后就可以成为有效的口服药物。蛋白质工程是“从头设计”以获得人工蛋白质的新技术。它包括蛋白质的化学修饰、合成以及在第一代基因工程基础上发展起来的第二代基因工程。第二代基因工程是根据蛋白质的结构与功能的研究结果，通过修饰或改造编码目的蛋白的DNA序列，与基因克隆技术相结合，从而获得自然界不存在的新型蛋白质分子。诸如“抗体工程”和“导向药物”就是蛋白质工程技术的具体应用。五、中西结合创制新型生物药物我国在发掘中医中药，创制具有我国特点的生物药物方面已取得可喜成果，如人工牛黄，人工麝香，天花粉蛋白，骨宁注射液，复方干扰素，药用菌和食用菌及植物多糖等都是应用生物化学等方法整理和发掘祖国医药遗产及民间验方开发研制成功的。中医药学具有丰富的实践经验，结合现代生物科学，一定可以创制一批具有中西结合特色的新型药物，如应用分子工程技术将抗体和毒素（如天花粉蛋白、鹿麻毒蛋白、相思豆蛋白等）相偶联，所构成的导向药物（免疫毒素）是一类很有希望的抗癌药物，已开始在骨髓移植上做临床试验。六、人类基因组计划（Humangenomeproject）1、人类基因组计划基因(gene):是在染色体上占有一定位置的遗传单位，从分子水平看，基因是DNA分子的一个片段。人类每个体细胞的23对染色体中约有32亿个(原认为30

13亿个)碱基对，组成约3万5千个(原认为5〜10万个)结构基因。人体的一切遗传性状都受基因控制。基因组(genome):人类基因组是指人体所有遗传信息的总和，即人体每个体细胞中的全套基因构成基因组。人体所有体细胞的核基因组完全相同，所以人类只有一个核基因组，约含3万5千个基因。2、HGP将给人类社会带来的好处人类基因组图谱的绘制完成，将带动一场新的医学革命。医学家将可以从基因组图谱中分析出人体全部基因的组成、位置与功能，通过基因检测能准确了解人体的疾病与健康状况，为人类征服多种疑难病症铺平道路。届时危害人类健康的5000多种遗传病及与遗传密切相关的癌症、心脑血管疾病、消化道溃疡、糖尿病、风湿病、精神分裂症等将可得到早期诊断和有效治疗。人类基因组图谱的完成，显示分子医学的新时代已经开始。这个时代的特点不是治疗疾病的症状，而是揭示导致各种疾病的基因变异机理，以便从根本上采取治疗措施。不久的将来，人们将会得到描述自身的说明书，患者也许会带着“基因卡”去医院就诊。人类基因组图谱绘制完成，就等于破译了人类的生命密码，获得了操纵生命的工具。通过基因工程技术控制生命的孕育，根据自己的意愿设计后代，选择后代的性别，塑造后代的个性、相貌、智商等，从而提高全人类的素质和健康水平。通过控制导致人体衰老的基因，即可修复人体细胞和器官的功能，使人的寿命得以延长。中国人类基因组项目负责人杨焕明教授说:要不了多少年，人们便可以根据基因图调整自己的生活方式，使自己处于最佳的生命环境中，这样我们活到150岁将不成问题。现在科学家已经可以拨动人体的“生物钟”，如果“生物钟”问题攻克了，人可以活到500岁。人类基因组工程对于生物考古学和人类进化等方面的研究将起重要的促进

14作用。并在法医学的应用中具有广阔的前景，如随着DNA测序技术的进一步发展,超大片段DNA（甚至有可能是整个基因组）鉴定技术将变得切实可行，从而使我们能够进行精确的个体鉴定。由于我们掌握了人体全部基因的排列顺序与机能，因此可以对人体各器官有个全面、深入的了解，也就可以利用基因培植新器官，建立器官工厂，解决移植器官短缺问题。据日本《诸君》月刊报道，除了软骨以外，皮肤、骨骼、血管、肌肉、神经以及其他各种器官的研究都在迅速发展，皮肤等已经实现了商品化，正得到广泛使用。同样对生物制药产业的快速发展将会有极大促进作用。如利用转基因技术可以用鸡来生产人的血清白蛋白，用鸡、牛、羊、猪来生产人的红细胞生成素等等。如今，转基因技术已用在植物上，把植物作为“生物反应器”，从而可以长出含维生素A.C的小麦，含动物蛋白的蔬菜，抗感冒的苹果，防肝炎的梨等。美国能源部预测人类基因组研究成果将给美国有关产业带来众多的机遇，以DNA为基础的产品和有关的生物技术行业的年销售额预计到2009年将达到450亿美元。3、可能给人类社会带来的隐患人类基因组图谱的完成所带来的忧虑似乎比喜悦还多。它可能在法律、伦理以及国家安全等许多方面产生负面影响，甚至可能给人类自身带来灾难。从事基因医学研究的基因联盟执行总裁玛丽•戴维森（M.Davis）说：“与任何新技术一样，基因研究必将引起多种新的潜在问题，许多问题我们甚至还未发现”。如何保护隐私权是基因研究在法律方面遇到的最大难题。假如医生掌握了一个20岁的人的遗传密码，确诊他在50多岁时会患一种致命的疾病，那么这件事应该让谁知道呢？他本人?他的亲属?还是他的老板或是他的保险公司?雇主在决定雇用前如果知道了这个消息，那么雇主是否有权取消他的应聘资格?保险公

15司该不该因为知道了这个情况而拒绝为其保险？如果他本人知道若干年后会患某种致命疾病时，他将怎样渡过剩下的日子呢？国际人类基因组伦理学会委员邱仁宗教授说，生命奥秘这本“天书”，打开后，人们首先面对的是“基因歧视二有些人会看不起天生携带“坏”基因的人。他认为，基因没有好坏之分，如霍金（Hodge,当代最伟大的残疾人物理学家）携带可怕的肌肉萎缩基因，但这并不影响他成为当代最伟大的科学家。设想他的父母在他出生前先知道了这种可怕的基因而采取堕胎，人类就会少一位天才。同时还会涉及到错综复杂的伦理问题。再一个令人担心的问题是基因知识是否会被人滥用，是否会被用来制造具有超常潜能的“超人工一家国外组织声称要用人和猿的基因造出智能猿，用作科技时代的奴隶。虽然这项计划已被禁止，但专家们担心仍会有人欲扮演“上帝”，造人的角色，用基因造出魔怪。有人认为基因争夺将使世界更加动荡不安。现在“基因殖民主义”正悄悄而又极其激烈地进行着。第三世界国家在技术、资金、设备落后的情况下，即使拥有丰富的基因资源，也只好眼睁睁地看着这些本属于本国人民的宝贵财富被掠夺。发展中国家可能成为基因廉价供应国，成为发达国家掠夺的新对象。一位发展中国家的科学家愤怒地说：“你们已经抢走了我们的黄金和钻石，现在又来抢我们的基因!”我国有56个民族，具有丰富的基因资源，因此目前已有些外国公司公开表示想来华设厂，进行基因“开发”。所以，如何打好这场基因战，如何保护利用、开发自己丰富的基因资源，如何接受21世纪生物技术的挑战等，是每一个发展中国家都必须考虑的问题。塞莱拉基因组公司文特尔教授警告说：“人类在掌握能够对自身进行重新设计的基因组草图以后，也就走到了自身命运的最后边缘,使人类自身的生存面临着巨大的威胁。正如许多高技术成果很快被应用于军事领域一样，基因工程刚一问世，一些军

16事大国（美、俄、英、德等）竞相投入大量人力和经费开始研究基因武器。基因武器是生物武器中的新成员，其具有成本低，便于大规模研制,使用非常方便，杀伤力极强，而且难以防治等特点。据估算，用5000万美元建造的基因武器库，其杀伤力将远远超过用50亿美元建造的核武库。据悉，美国利用细胞中DNA的生物催化作用，把一种病毒的DNA分离出来，再与另一种病毒的DNA结合，拼接成一种剧毒的“热毒素”基因毒剂，只需要20克这种毒剂，就可使全球60亿人口死于一旦。俄罗斯早就着手研究剧毒的眼镜蛇毒素基因与流感病毒基因的拼接，试图培育出具有眼镜蛇毒素的新流感病毒，它能使人既出现流感症状，又出现蛇毒中毒症状，导致患者瘫痪和死亡。以色列也正在依据阿拉伯人的基因构成加紧研制一种专门对付阿拉伯人，但对犹太人没有危害的基因武器一“人种炸弹”，以对付伊拉克人。一位前克林顿政府生物伦理学顾问警告说:使用以特定种族基因为目标的生物武器可能在许多年内不被察觉，直到减少了整个一族人口的数量。如它能够影响某一种族的出生率和婴儿成活率或者增加其发病率。因此，研究和保护种族特异性和易感性基因已成为一个民族能否繁衍和生存的生死攸关的重大问题。4、HGP对医学的冲击巴德年院士作了题为“21世纪医学科学研究展望”的综述报告。他指出基因与医学有着密切关系，表现在：（1）基因异常可导致疾病，识别基因异常可指导诊断和治疗；（2）基因蛋白产物是生命运动的基础；（3）基因倾向导致疾病易感性；（4）转基因动物可用于脏器移植、生物反应器、基因调节：（5）基因表达与机体状态（身高、智力、衰老）有关。随着社会、经济和科学的发展，将带动整个医学（包括生物医学、预防医学、医疗）的进步，从而带来人类生命、生活质量的提高，社会的变革。中国的医疗卫生费用目前仅占国民生产总值的2.7,到2000年将达到5%,但与发达国家相比仍有很大差距，故应强调预防为主。当今社会人口老龄化现象十分严重，而肿瘤、心脑血管疾病的死亡率已占70%,因此必须重视对老年性痴呆症、骨质疏松症和肿瘤、心脑血管疾病的防治。在治疗技术方面的多种创新，例如微型机器人在PTCA中的应用、胎儿外科、脏器移植、人工脏器的应用等.证明医学问题的解决更取决于科学技术的进步。同时，诊断技术也从平面走向立体，由定性转向定量。提出了对未来医学人才的培养必须

17具备三维知识，即不仅要具有自然科学、生命科学、医学知识，还要具有人文科学、社会科学知识，更要具有卫生资源、卫生经济、社会与医疗保障的知识,这样才符合21世纪医学科学发展的需要。曾溢滔院士就“HGP对中国医药产业的推动”为题作了专题发言。他指出医学的目标有3方面，即延年益寿、优化环境、丰衣足食.医药生物学对延年益寿将起重要作用。药物产业可分为天然药物、合成药物和基因药物.基因药物又包括细菌基因工程、细胞基因工程、乳腺生物反应器。转基因家畜药物具有很多优点，其成功的关键有3方面：（1）HGP是基础；（2）基因表达调控；（3）基因组工程是保证。王汝宽教授指出科学研究的对象是自然界、人类社会、人类思维，其内容包括物质、能量、信息及其规律.对“脑、基因、癌症”这3方面的研究，将揭开生物学的三大奥秘。他又从21世纪将是“信息时代”和“纳米时代”的观点出发，强调医学发展应尽可能吸收其它学科的革命性成果。专家学者认为，从HGP受益最大和最直接的、最可能给人类带来经济和社会效益的领域看，将是生物医学。首先，对人类10万个基因的结构及其染色体位置的阐明，将为多种单基因遗传病和严重危害人民生命健康的多基因病（肿瘤,心脑血管病，糖尿病，神经、精神疾病，自身免疫病）致病基因的识别提供前所未有的便利。其次，HGP所提供的信息将极大地促进致病基因功能的研究:对于已确定的疾病基因，不仅可能阐明其在机体发育过程以及细胞、组织、器官和整体生命活动中的确切功能，还可进一步明确其在发病原理中的作用，如单基因病中基因蛋白产物与病理过程上、下游环节中诸多分子间的相互作用关系，多基因病中多基因蛋白产物的相互间作用，基因功能的丧失（（lossofftinction）或功能的获得（gainofftinction）对正常生理功能的直接和间接的影响等。第三，在上述致病基因结构、功能研究的基础上，将进一步研究对疾病的诊断和防治策略，尤其是针对特异致病基因的产物或相关病理、生理过程中关键调控基因的产物，筛选和设计具有选择性作用的药物，实现疾病的“靶向治疗二5、HGP与疾病预防

18吴吴院士作了题为“人类基因组计划与疾病预防”的综述报告。他指出人类疾病（无论是单基因病或多基因病）的发生都与遗传和环境这两个因素有着密切的关系.生物医学大目标的实现有赖于预防医学的大发展。中国古代“黄帝内经”中就已有了“上医治未病”的观点，而我国医疗卫生工作的四大方针中更有“预防为主”这一条，这一切都体现了预防工作的重要性.以肿瘤的预防为例,目前已有一批生物标志可以检测环境致癌物。随着HGP的进展，肿瘤易感性相关基因逐步发现，已获得一批遗传易感性标志，使得肿瘤的流行病学调查，已发展到了分子流行病学调查的水平。此外，也有可能对获得性易感性标志进行检测。阮力教授在“人类基因组与预防医学”为题的专题发言中指出，未来的21世纪，传染病仍是主要问题，非传染病将占更重要的位置，人类基因组研究将对疾病的诊断、治疗、预防产生深远影响。目前，国际上又提出了“基因预防”的概念，即从基因水平分析、诊断、监测疾病，其核心内容是基因功能与疾病的关系。6、人类基因组研究对生物制药的影响(1)人类基因组研究为生物制药提供了明确的目标：对人类基因组的研究最终将阐明疾病的发生机理和遗传基础，而这些问题一旦明确，生物制药就有了明确的目标，从而极大地减少了药物研究的盲目性例如有些疾病就是由于体内遗传物质突变而导致维持人体正常生理代谢、抵御疾病的发生发展的功能蛋白质(包括某些酶类)缺失所致，而弄清了缺失的功能蛋自及控制其合成的基因，就可以通过基因工程大量地生产这种功能蛋白，从而达到治疗这种疾病的目的)通过转基因羊生产人类凝血因子IX治疗血友病乙即是其中一例。(2)人类基因组研究推动了基因工程药物的发展：通过人类基因组研究，许多致病基因将被明确，无论在疾病的诊断还是防治方面，都为基因工程药物提供

19了广阔的研究领域。通过正常基因和致病基因的比较，将发现征服疾病的途径,这些途径可能相当一部分是基因工程药物，因此，为生物制药提供了难得的发展机遇。可以相信，随着人类基因组研究的进展，通过转基因工程或克隆技术生产的试剂盒或治疗药品将逐渐增多，同时，基因工程药物的发展也使治疗成本大幅降低。如正在研制中的人生长激素，若从牛脑提取牛生长激素来治疗由于其缺乏而导致的生长障碍，一个病人每疗程的用药需要数万头牛脑，而且不仅疗效差，还可能引起某种脑死亡疾病，而通过分离克隆人生长激素的基因，构建出高表达基因工程菌，从50立升的发酵罐生产的一批菌体中即可获得纯度高达98%的重组人生长激素10余克，可满足近百个病人的临床用药。总之，人类基因组的研究，既为生物制药提供了准确的研究目标，又为生物制药提供了许多发展机遇，同时又可使治疗费用大幅降低。因此，人类基因组研究必将推动生物制药快速的发展，包括癌症在内的许多疾病最终将被征服。第四节新型生物药物研制的理论和方法一、新药研究和开发的主要过程1、确定研究计划：综合考虑医疗、市场、化学的评估，文献状况，专利的检索，结构的选择,合成的前景等因素。2、准备化合物：文献研究，合成或分离，结果鉴定，标准化，专利申请，对研究目标的复核等。上两环节需1〜2年，需准备6000~8000个化合物供筛选。3、药理筛选4、化学实验：活性成分的分析

205、临床前I期：进一步药理研究包括毒性（2种动物）及活性成分的稳定性。6、临床前II期：进一步药理研究包括亚急性毒性（2种动物）、畸胎学研究、药物动力学、动物体内的吸收和排泄、剂型的研究与开发、包装与保存期的研究。（5000种进入临床前研究的化合物中只有5种进行人体试验，这5种只有1种获得批准上市。）7、I期临床：继续进行更细致的动物药理实验，包括亚急性毒性（不同种动物）、畸胎学研究、药物动力学、动物体内的吸收、分布、代谢、排泄；药物的分析检定，保存期，临床样品的制备；进行I期临床实验。8、II期临床：进一步的动物药理实验，包括计划并开始慢性毒性实验，致癌性和生殖与后代的影响，药物动力学（不同种动物）；药物的分析检定、保存期、临床样品的制备；进行II期临床实验。9、III期临床：进一步的动物药理实验并完成和提供文件；完成亚急性试验；致癌性和对生殖与后代的影响；完成并提供药物动力学文件；提供分析总结文件；完成制剂的开发和生产方法的开发；进行III期临床试验。三期临床试验需要进行3〜5年，化合物逐步递减为4〜5个、2〜3个和1〜2个。10.注册申请上市（2-3年）11.售后监测一种新药从研究开发到投放市场，平均耗资2.5亿美圆，开发周期长达12年之久。其中临床期时间最长，约占药物开发时间的一半。一般进入临床试验的新药只有23%有望进入未来市场。但近儿年的资料表明，基因药物与传统药物相比其平均研究、开发费用较小，开发周期短而回报率较高。二、先导化合物的寻找

21开发新药的物质来源可以是天然资源（微生物、动植物和海洋生物）与合成的化合物［化学库和与受体结构设计（合理新药设计）］,从众多候选化合物中发现具有进一步研究和开发意义的物质，也即先导化合物，是研究新药的起始步骤。一旦发现新的先导化合物，再对其分子进行简化、改造、修饰或优化，即可发现与创制具有新型结构及特殊药理作用的新药。发展先导化合物一般有两种方法•即先导结构的优化和先导物的展开。以前在医药的创制研究种进行先导化合物的结构改良时采用的一般是随机筛选，因而，不可避免地带有较大的盲目性和随意性。为了减少这些不足，近些年来出现了一些行之有效的构效关系研究方法，如经典的QSAR方法［QSAR(QuantitativeStudiesonStructure—ActivityRelationships)定量结构与活性关系］。但这些方法在优化先导化合物的结构时只能对其进行取代基级别上的改良，而不能对其主体结构进行改造；也就是说，用这些方法优化改良得到的高活性物质逃脱不了原来的结构框架，在实际应用中往往就会使所得到的活性化合物摆脱不了别人专利的覆盖。近十年来应用于先导展开的一些方法得到了重视和发展，“生物等排取代“就是其中很有效的方法。这种方法就是用生物等排体去取代先导化合物中的某部分结构，在保留原有的生物性质的同时使先导物的母体结构发生改变；并且通过这种取代可以使先导物的一些缺点得到改进，如活性增强、选择性增强、毒性降低，等等，还可以使复杂的活性化合物结构简单化，提高实际应用价值。如在合成多巴胺激动剂中生物等排取代就得到了很好的应用。化合物(3)是一个多巴胺激动剂，由于其中的0H基存在较强的水溶性，使得(3)很难越过血脑(blood-brain)屏障，从而存在很小的药理效应；而通过研究发现经基(0H)对活性是必不可少的，它的氢键能力对活性起着决定作用。为了改进结构，制造新

22的多巴胺激动剂，选用毗咯环来取代经基，得到新化合物(4)。化合物(4)与(3)相比虽在结构上发生了很大变化，但它们具有相似的活性，而且(4)比(3)更优越，药理效应比⑶强、作用时间也比(3)长。这主要是因为毗咯环不仅保持了氢键能力，而且水溶性比0H基小得多。在这里具有相似氢键能力的毗咯环与苯酚上经基就是一对很好的生物等排体。HO.㈤（4）三、新药筛选基本方法（一）、随机筛选是最经典的药物筛选方式，在50〜60年代较为通用。它用一个或多种生物试验手段评筛化合物或自然资源。现在应用的许多有效治疗药物都是通过随机筛选得到的。随机筛选典型代表，如利用细菌培养法从自然资源中筛选抗菌素,利用瘤株细胞培养法从多种来源的化学物质中筛选抗癌药物。随机筛选发现新药的机率较低，据统计，筛选800个化合物可发现一个有活性化合物，一个投放市场的药物，常需筛选上万个化合物，例如美国国家肿瘤研究所（NCD每年筛选一万个化合物，连续9年，只有一个成为上市药物。尤其早期（50〜60年代）随机筛选常用整体动物试验方法，不但速度慢、所获信息少、耗资巨大，且不能有效地利用化合物资源。因此，随机筛选遭到冷落，新药研制部门，特别是药物产业部门很少依靠随机筛选做为发现新药的主要手段。（二）、经验式重复筛选是使用最为广泛的传统的筛选方法，这种筛选主要特点是合成筛选紧密配

23合，经重复性（trialanderror）试验过程，根据构效关系（SAR）,不断对化合物进行结构修饰（structuralmodification）,找到选择性导向或候选化合物。它属于定向合成与筛选，成败的关键在于确定适当的筛选目标和范围，选好靶标(target)和筛选指标。60年代以来，特别是70年代以后，这种筛选在新药发现研究中占主导地位。80年代以来这种筛选方式更强调靶标的选择，提出了基于机制的筛选(mechanism-basedscreening),即根据疾病性病的分子机制，选择关键靶标，建立相应筛选方法，进行靶向筛选(targetedscreening)0(三)、药物合理设计与筛选也称基于结构的药物设计与筛选(structure-baseddrugdesignandscreening)或称理性发现(rationaldiscovery)o这种筛选的策略是将基于机制的筛选与药物合理设计融合为一体，为了进行药物合理设计，必须获得靶标大分子的结构，特别是三维结构的信息。因此，该种筛选策略的第一步是靶标的分子结构分析。在实施中也可取已知三维结构的靶标，直接进行药物合理设计，做为工作的起始点。如果大分子一级结构已知，三维结构尚未阐明者，可根据同源蛋白模建等方法预测其三维结构。大分子一级结构不清，只有配体结构信息的，根据其配体推导药效基因(bparmacophore)模型，或提出假想受体，间接设计化合物。(四)、高通量筛选高通量筛选(high-throughputscreening,HTS)是近来发展起来的筛选技术,微量、快速、灵敏、准确，在短时间内可以测试大量化合物。主要特点是：分子水平和细胞水平的筛选模型1、以酶、受体等为基础的分子水平筛选模型。2、以动物细胞和转染的动物细胞为基础的，能反映化合物穿透性和细胞信号传

24导过程的细胞水平筛选模型。高通量筛选技术1、以溶液、矩阵板为基础的，样品储存、样品分配、生物活性测试自动化操作系统。2、以计算机为基础的，样品管理、样品跟踪、生物活性数据收集与分析的信息管理系统。主要由五个主要部分组成：1.自动化操作系统。2.高灵敏度检测系统。3.分子、细胞水平的高特异性体外筛选模型。4.被筛样品管理库（即样品库）。5.数据采集传输处理系统。四、发现新药的途径（一）经验积累古代，人类在寻找新药的漫长历史中，最常用的方法是靠“尝试”，通过“尝试”积累各种药物知识。这就是“神农尝百草”的办法。“神农氏”是中国的神话人物，他代表着当时从事新药评价工作的若干代人。这样的代表人物不仅中国有，外国也有。不仅史前时代，寻找新药靠经验积累；即使在有文字记载的历史年代里，相当长久的时期中，寻找新药的主要途径也仍然是靠经验的积累。我国从汉朝的《神农本草经》到明朝李时珍的《本草纲目》，其中收载的药物，绝大多数都是广大劳动人民通过对天然物品的亲身尝试而取得的经验。国外，从古希腊的Asklepios到晚近，也无不都是总结了当时广大劳动人民由亲身尝试所取得的经验而积累着药物知识。这种手段虽然原始，但是它曾经为人类找到过不少有用的药物。这种手段即使在今后，也仍然可以帮助我们寻找和发现新药。但是这种手段毕竟不是一种效率较高的手段。通过这种手段来评价新药毕竟要花出很大的代价，要走不少弯路，要花漫长的时间积累。据估计，我国现在临床常用药物中，大约不到20%是过去几千年人类靠经验积累下来的药物。而80%以上都是近50年来研究出

25来的新药。而国外的比例更高。可见，现代的科学的手段拥有巨大的潜力，而古老的经验的手段显得非常有限。（二）偶然机遇很多科学发现带有偶然性。这种偶然性在新药研究中尤为常见。1928年英国年轻的细菌学家弗来明一次在研究葡萄球菌的实验中偶而发现那次培养的细菌有一些菌落没有生长。他没有轻易放过这一现象，而立即进行分析研究。很快他发现，在这次实验中培养基被一种霉菌污染了。正是这种霉菌，消灭了培养基中的葡萄球菌。这种霉菌属于青霉菌属，因而将由它所产生的能杀灭细菌的物质称为青霉素。这一偶然的发现，不仅为人类提供了青霉素这一良药，而且首次写下了抗生素这一光辉篇章。这是在实验室研究中偶然发现新药的例子。吩曝嗪类安定药氯丙嗪的发现同样有很多偶然的因素。吩嚷嗪类化合物在40年代是作为抗组胺药合成的。1949〜1952年间在实验动物身上见到异丙嗪有延长巴比妥类药物睡眠的作用，并在法国首先将它在临床上作为麻醉强化剂应用，1949〜1950年Charpentier合成了氯丙嗪。很快发现它能加强麻醉药的作用，并能产生人工冬眠。1952年，当法国的一些临床医师在将氯丙嗪作为冬眠合剂应用于有躁狂症的精神病人身上时，意外的见到了氯丙嗪有明显的精神病治疗作用。这就大大地开辟了氯丙嗪的临床适应证，也从此揭开了精神药理学的序幕。这是在临床应用中偶然发现新药的例子。新药被偶然发现的例子太多了。有很多途径会促使新药被偶然发现。这里仅作为一般的举例，不准备再展开了。在本节的第二点中我们将就偶然性与新药发现的基本事实再作专门的评述。（三）药物普筛本世纪初，特别是30年代以来，各国开始了在特定模型上有针对性的大规模药物筛选工作。进展很快，取得的成果很显著。今天临床上常用的抗微生物

26和抗寄生虫药物、抗高血压、抗心律失常、抗心绞痛、降血脂药物、利尿药、流基解毒剂、螫合剂。抗肿瘤药等药物大都是通过大规模过筛找到的。这种在特定模型上的药物普筛工作是半个多世纪以来世界各国广泛采用行之有效的寻找新药的方法。我国建国以来，寻找新药的主要途径也是这个方法。这方法的主要优点是目标清楚、方法简捷、指标明确、标准统一，能够在短时期内集中成千上万个化合物来试验它们的疗效，从中较快地发现有效的新药。但是这种方法也有它的局限性。通过各国大半个世纪以来的广泛过筛，到如今，筛出阳性药物的机遇越来越少了。第二次世界大战前后过筛阳性率一般约为二百分之一至三百分之一。1907年德国欧立希经过605次失败，合成了“606”，作为坚韧不拔，百折不挠的例子，在医药界传为佳话。而现在，如果谁合成了六百多个化合物就获得一个好药，那就算是非常幸运的事了。现在的过筛阳性率一般认为是万分之一。也就是要过筛上万个化合物才能出现一个值得推荐到临床试验的新化合物。而这个化合物经过临床进一步评选，最后能够批准上市的可能性一般不到百分之十。也就是说，最后正式批准上市的新药一般是从几万、甚至儿十万个化合物中筛选出来的。这是因为目前的过筛对象都是长期没有攻克的防治问题，难度较大。有的对象已经有一些有效的药物，新药要能够通过，必须比它有明显的优点，要求就更高了。由此可见，采用单项指标有针对性地筛选这种方法，今后虽然仍不失为一个有效的途径，但预计已不大容易再出现象第二次大战前后十多年间新药大量涌现的那种局面了。（四）综合筛选上面所说的有目的地筛选是先明确对象，建立模型，然后普筛药物。阳性,是指对所筛对象有效。阴性，是指对所筛对象无效。但是阴性的药物并不是指没有药理活性，很多药物往往不是在他的原来设计方向出现作用，而是在其他方面出现较好的作用。甚至在某些方面出现新的突破。如上海药物研究所在抗疟效果较差的

27常山乙素的衍生物中找到抗心律失常药常咯琳。有些药物在一种药理作用被肯定后，又发现了其他有应用价值的新的作用，如普条洛尔是作为抗心律失常药应用的，不久又发现了它的抗高血压作用而被用于临床。越来越多的老药发现了新用途，说明药物作用的选择性是相对的，只要掌握得好，一个药物往往可以有不止一个适应证。大量事实说明，在新药寻找工作中往往是“有意栽花花不发，无心插柳柳成荫”。如果仅用单项指标过筛这一种手段找药，势必将很多有各种药理活性的化合物漏掉。化学家辛辛苦苦设计并合成出来的药物往往在一项指标，几只动物身上一次性的筛选中被淘汰。这是非常大的浪费，也是非常可惜的事情。现在很多国家都设法建立简便而快速的综合性评价药物和毒物作用的方法，或称综合筛选法，即一药多筛的意思，而且发展非常迅速。早期的如美国Irwinl964年提出了一种药物筛选的设计方案，只要用三个实验标本就可以初步预测72种药理作用。这三个标本是整体小鼠的行为活动观察，大鼠的血压和呼吸及豚鼠肠肌等离体器官。日本高木敬次郎1981年前应用这个设计进行筛选的结果与进一步详细的药理学研究结果相当一致。美国艾齐乌特兵工厂毒性筛选组利用小鼠整体反应作筛选方法，可以同时观察三十多项指标。该实验室认为对于一个有经验的研究人员来说，用这种方法获得的详细资料不比其他生物试验准确性差。只要剂量选择适当，在常规筛选中即可产生半定量资料，可以用来初步比较各种未知化合物的作用强度和安全范围，再结合其他各种筛选指标一起对一个化合物作出评价。法国有的制药厂对合成的有代表性的新类型化合物普遍进行45项药理指标的观察，从而决定取舍。前苏联全苏化学药物研究所、瑞士毒理研究所、美国肿瘤研究所等很多研究机构和药厂都有系统药理作用过筛的实验室。这种机构对迅速作出药物作用的综合评价，充分发挥药物潜力，做到药尽其用，还是很见成效的。90年代以来随着组合化学的高效合成和各种过筛手段的进步，综合筛选取

28得了前所未有的发展。国际上很多著名药厂都建立了High-ThroughputScreening体系，以提高新药发现的机率，从而提高在国际竞争中的优势。（五）天然产品提取在古代，儿乎全部药物都是天然产品，其中绝大多数是植物，少数是动物或矿物。这些天然产品，经过人们长期尝试的经验积累，通过偶然机会，或通过近代药理方法筛选和评价，发现并肯定它们的药用价值后，成为新药的重要来源。但长期以来，天然产品都以一般制剂加工后的粗制品入药，并没有提出有效活性物质的纯品。直至19世纪，从吗啡、奎宁、阿托品等提纯以后才以从天然产品中提纯的单体作为新药的来源。近20多年来，随着植物化学提纯手段、分析技术和制药工艺的发展，这一途径更成为新药开发的重要手段。目前约有一半的临床用药是天然产品及其衍生物，其中包括象抗生素这样一大类作用显著、品种繁多的药物。天然产品提纯的工作，在技术上，一般要经过几个主要步骤。首先要测定生物活性成份，建立生物检定方法，并以这方法作为“眼睛”来监测各个分离组分。然后采用最合适的化学方法将生药逐步分离。鉴定所得的各个组分，保留有效组分，弃去无效组分。将有效组分再作进一步分离，直到获得纯的结晶,或称单体。最后测定该纯结晶的化学结构。结构测定过去曾是一项十分复杂的技术工作。1803年从阿片生物碱中提得吗啡后，到1925年仅提出了一个结构设想的草案，又经过了40年后才确定了它的空间结构。前后共经过166年之久。而在本世纪60年代研究抗癌药长春花生物碱时，仅花了3年时间就完成了分离和测定30种以上长春花碱结构的工作。这些生物碱的结构远比吗啡复杂，而且彼此之间还非常相似。当时作为结构测定的主要手段是红外线分光光度法、核磁共振法及质谱法等先进技术，并结合降解试验和元素分析等经典方法。60年代后期以来，应用X-线衍射等分析技术，对测定结晶物质整个分子结构的立体化学能够作出决定性的结论。目前在一个装备比较完善的实验室，在比较有经

29验的专家手中，天然产品的一个新的有效成份，一般在几个星期内就可以完成全套分离和测定工作。这是多么了不起的成就呀！。(六)定向合成定向合成是近代寻找新药的重要手段，是近代新药研究工作中的一个重大进展。通过其他各种途径首先发现的新药不一定是这类化合物中最理想的药物，但却提出了一个新的化学结构，可以以它为先导化合物(LeadCompound)o在先导化合物的分子结构上进行各种化学修饰，研究化学结构与生物效应的关系，通过药理实验与数学计算，确定最佳结构，选定药物，这已经成为近代寻找新药的一种基本手段，而且取得了显著成绩。走向合成可以是基本母核近旁结构的修饰，也可以是在保留活性基团下基本骨架的改造。通过定向合成进行结构改造的目的可以是不同的。有的是为了增强活性，有的是为了增加选择性，有的则是为了降低毒性，为了改变体内代谢命运以达到不同的用药目的，为了改善理化特性以满足药用要求，为了降低成本等。如镇痛药从吗啡发展到哌替定、芬太尼、二氢埃托啡，作用强度增加了数十、数百，乃至上千倍。筑基解毒剂从BAL发展到二筑丙醇、二流基丁二酸钠，作用强度增加了十多倍。这些都是通过定向合成增强药物活性的例子。如解胆碱能药既有中枢作用，也有外周作用，因此在达到某一治疗目的的同时常伴有较广泛的副作用，因此需要合成选择性更好的药物，如为治疗帕金森病，需要中枢作用选择性更强的药物，合成了安坦、新托品等。又如B受体阻断药普蔡洛尔对仇和B2受体都有作用，选择性很低，因此在支气管哮喘病人身上忌用，而普拉洛尔对历受体的作用较弱，因此在哮喘病人身上并不忌用。这是通过走向合成以增强药物选择性的例子。局部麻醉药从可卡因合成了普鲁卡因，这是通过

30走向合成降低药物毒性的例子。普鲁卡因体内应用有抗心律失常作用，但它在体内很快被酯酶水解。如果将普鲁卡因酰胺化，则水解速度大大降低，有效时间大大延长，可较好地作为抗心律失常药。这是通过结构改造改变药物体内代谢命运以达到不同用药目的的例子。很多药物改进了溶解度促进了由胃肠道中吸收，有些离子型化合物结构改造后可以增强它们透过血脑屏障的能力。这是通过结构改造改善药物的理化特性以满足用药要求的例子。降低成本也往往是药物定向合成进行结构改造的目的之一。因为药物能否满足大量市场应用的要求将影响药物本身的经济效益和发展前景。如天然雌激素来源有限，价格昂贵。1938年己烯雌酚人工合成以后，为雌激素类化合物的应用开辟了道路。通过定向合成寻找新药的例子太多了，不胜枚举，也不必枚举了。在药物合成工作中还应注意药物的多晶型现象，因为药物的不同晶型会影响药物的活性。本世纪60年代以后，药物晶型的研究发展很快，使人们对于药物微观结构、构效关系等方面的认识更加深入。人们开始运用药物晶型的有关规律来能动地改造药物及指导新药及新制剂的寻找，以期实现提高疗效，减轻毒、副作用的目的。由于发现新药的机率很低，因此要求大规模合成筛选药物。于是叨年代以来国外发展了组合化学和群集筛选，很多劳动量大的筛选工作，可以由机器人来承担。通过定向合成，修饰已知化合物的分子结构，以期获得有理想作用的新药,这是令人鼓舞的一条途径。但事实表明，并不是这样的努力都能成功的。有时虽然进行了大量投资，但只能得到缓慢而有限的进展，而且常常顾此失彼，总的评价还不一定比最初的先导化合物好。因此，什么时候继续合成，什么时候选定药物，这就要有一个科学的预测和全面的综合衡量。（七）代谢研究新药评价工作中需要做药物代谢研究。药物代谢研究的结果又往往为设计和发现新药提供新的信息。随着化学分离、分析、结构测定等技术的提高，30

31多年来，药物代谢动力学的研究进展很快。很多药物的体内转化过程往往在较快的时间内即能取得基本的认识。有些药物是它的原型起作用，有些药物是转化后的代谢产物活性更高，有些药物则在体内经代谢失活。这样，就可以尽量利用药物代谢的知识来设计新药，从而能合成各种有新的作用特点的药物以满足不同的需要。上海药物研究所黄知恒收集过很多材料归纳了四个途径。首先是合成有效代谢物供临床试用。如早期的三价碎剂肿凡纳明。对氨苯磺酰胺及后来的羟保泰松、酮保泰松、氧化震颤素等都是从研究它们的相应前驱化合物中观察到的活性代谢物。化学家合成了这些活性代谢物，并成功地应用于临床。其次，可以模拟有效代谢物的结构，以获得新的化合物。成功的例子如高效、低毒的广谱驱虫药四咪哇、左旋咪哇、去甲丙咪嗪及仲胺型抗抑郁剂等。此外,还可以对药物的代谢物进行化学改造，使它的毒性、吸收、药效等方面都发生显著改善，最终成为有用的药物。这方面大家比较熟悉的例子是环氯胭的双蔡水杨酸盐。环氯胭是氯胭的活性型代谢物，由于排泄过快，所以作用不持久，作预防用需每周给药数次。比较了环氯服的各种低溶性盐，发现了环氯胭的双蔡水杨酸盐，即双蔡羟酸环氯胭，是一种长效的疟疾预防药。一次肌内注射，作用可维持数月。最后，还可以通过防止药物的代谢失活以获得作用较好的药物。因为大多数药物到体内经转化后，活力减弱以至消失。对药物分子进行化学修饰，防止它的失活，就可以增加药物的作用。如抗白血病药6-疏基喋吟在体内可被氧化脱硫，在保护6-SH基后，找到了免疫抑制剂硫唾喋吟。目前，设法增加药物分子对代谢的相对稳定性，已成为强化药效，改善吸收、延长作用，以及解决细菌和昆虫的抗药性问题等的重要手段。诚然，需要进行代谢研究的新药一般都是已经明确有一定生物活性的药物,因此通过代谢研究发现的新药大多不是完全新类型的先导化合物，而是某些有利作用的加强或某些不利作用的克服和改善。但这在新药开发工作中也是一种不可忽视的努力。有时新药某些缺点的能否克服，往往会成为该药能否成为一

32个有实用价值的药物的关键。此外，通过代谢研究，了解到药物的吸收、分布、排泄等方面的规律并设法掌握它，也往往可以成为设计新的剂型的基础。如设计各种缓释剂型、肠溶剂型、微囊剂型。皮肤剂型、控释剂型等。而具有新的作用特点的新剂型本身,从广义来说，也是新药。还有，通过代谢研究，了解到药物的吸收、分布、排泄等方面的规律并设法掌握它，也往往可以成为设计新的复方配伍的基础。而具有新的作用特点的复方制剂本身，从广义来说，同样也是新药。（A）药理机制研究固然很多新药并不是做清楚了它的药理作用机制才被发现的，但药理机制的研究确能为新药的发现提供又一条重要的途径。近半个世纪来新药研究进展很快，原因之一就是药物作用机制的研究开展得比较及时，效率比较高。譬如对于高血压，40年前几乎没有什么药物，至多只是用些镇静剂。而今天，我们已拥有不少具有不同作用机理和作用于各种不同部位的新药，可以分别作用在血管壁、肾上腺素能神经末梢、B受体、神经节和中枢神经的不同部位。还可以作用在离子通道和血管紧张素转移酶等。药物的种类多了，大夫手头灵活了，回旋的余地大了，用药的针对性也就更强了。如果不是从作用机制上弄清楚那么多作用环节，只是凭降压强度和作用时间来评选，那就不会出现现在那样防治药物品种繁多的局面。利尿药的研究也一样。如果只用尿量的多少来筛药，就势必使一些作用温和的药物落选。只有很好地开展作用机制的研究，才能明确各种药物分别作用在肾小管的不同部位，找出不同类型的利尿药供不同的临床水肿病例选用。药物作用机制研究有时还能决定药物寻找的方向。如50年代中期以后，各国为治疗冠心病大量筛选冠脉扩张药。当时的指导思想是冠脉狭窄造成的供血

33不足是心绞痛的原因，因此要扩张冠脉。但是进一步研究发现，冠心病时冠脉已硬化了，硬化了的冠脉对冠脉扩张药的反应很弱。而且心绞痛病人心肌已严重缺氧，缺氧本身已经使冠脉极度扩张。已极度扩张了的冠脉对冠脉扩张药基本上是不反应了。所以，很多冠脉扩张作用很强的药物，如凯林、氨茶碱、罂粟碱等，他们的临床效果都被否定。即使象双喀达莫（潘生丁）、普尼拉明（心可定）、卡波罗孟（延痛心）等在临床上已经应用多年的药物，它们的作用也至今没有肯定，而且不断有人提出异议，认为它们对冠心病的临床效价是不确定的。双喀达莫目前在冠心病人上的应用已公认不是为了扩张冠脉，而是它所具有的防止血栓形成的作用。现在认为，即使亚硝酸盐等的作用也不是通过它们的冠脉扩张，而是外周扩血管作用造成的血压下降，使心肌负担减轻，因而减轻了缺氧。由此，抗心绞痛药物的寻找方向不应该是冠脉扩张药，而应该是减轻心肌负担的药物。事实也证明，象8受体阻断剂普蔡洛尔（心得安）等，根本没有冠脉扩张作用，相反大剂量下还有一些冠脉收缩作用，但是它们的临床效果是确实的。它们的作用机制主要是降低心肌氧耗量。可见通过药物作用机制的研究对寻找新药是有重大意义的。近年来由于已受体研究深入而开发成功的西咪替丁，由于5—HT3受体研究深入而开发成功的曲匹西隆都是典型的例子。（九）利用毒、副作用药物的作用往往是多方面的。针对某一特定目的的应用常被视为药物的治疗作用；不是用药目的而出现的其他作用，特别是伴有不良反应的作用，则常被视为药物的毒。副作用。其实，药物的治疗作用和毒、副作用都是相对的。阿托品用于制止腺体分泌时，由于松弛内脏平滑肌而引起的肠气胀和排尿困难是它的副作用；当用于解除平滑肌痉挛时，由于制止腺体分泌而引起的口干就是它的副作用。因此，可以将某些药物的毒、副作用用于新的治疗目的。目前,利用毒、副作用来寻找新药这一方法本身也已逐渐积累了一些经验，取得了一些规律性的认识。

34有些药物的毒、副作用可以在临床上直接应用。如长春花碱和长春新碱类化合物最早是作为降血糖药物来研究的。在实验室研究时已见到试验用的动物经常遭到致命的暴发性感染。后来在临床上也见到了这种现象。研究证明是由于出现了严重的白细胞减少症，从而导致致命的败血症。然后再按抗癌药物的研究方法进行评选，发现它对小鼠移植淋巴白血病有效。在临床试用中也表明它对白血病和霍奇金病有显著的疗效。这样就逐渐确立了它作为抗白血病药物的地位。除某些药物的毒、副作用可以在临床上直接应用外，更多的是根据药物的毒、副作用将药物加以结构改造，发展成新型药物。如孕激素类化合物有多方面的生理作用。当将孕激素用于维持妊娠时，其他广泛的生理作用都成了毒、副作用。通过结构改造，保留某些药理作用，排除一定程度的激素作用，结果发展了一系列有实用价值的药物，如醛固酮对抗剂像内酯、自体静脉麻醉剂Althesin（CT-1431）.偏头痛治疗药Demigran等。吗啡类镇痛剂的结构改造主要目的是为了寻找非成瘾性的强效镇痛剂，但也同时发展了儿类新药，并取得了一系列可喜的成绩。其中比较有特点的药物，如非麻醉性镇咳剂右美沙芬、止泻剂Diphenoxylate和Leperamide、苯丁酮类强效安定剂氟哌咤酮衍生物和具有镇痛作用的麻醉对抗剂烯丙吗啡和纳洛酮等。强效镇痛剂本身，从吗啡结构出发，合成了奥列巴文类化合物，镇痛作用加强，而身体依赖性相对减轻。部分激动剂Buprenophine的作用剂量比吗啡小25〜50倍，有效时间也较长，成瘾性比吗啡轻，是强效镇痛剂研究中可喜的进展。磺胺类药物的演变，始而是以寻找新的抗菌药物为目的，但逐渐从中发现某些与抗菌作用无关的未预料到的药理作用，其中有许多开始时是作为毒、副作用出现的。如口服降血糖药及接着发现的用于治疗尿崩症的磺胺胭素，具有碳酸酎酶抑制作用的曝嗪类利尿剂，具有降压作用的二氮嗪等药物都是成功的例子。（十）老药新用

35老药新用，等于发现新药。譬如，60年代初上海钱潮等人发现大剂量阿托品可以治疗中毒性休克，作用机制可能是对抗小动脉痉挛，从而改善微循环。毒扁豆碱（依色林）是一个有典型作用的老药，长期以来只是用在青光眼等很个别的疾病治疗中。直到70年代初期，国内外几乎同时发现有中枢催醒作用，先是用在中枢解胆碱能药东葭着碱等麻醉的对抗，后来又用在安定类、吩曝嗪类和三环化合物类药物中毒时的催醒。这一作用的发现使毒扁豆碱类化合物的临床应用价值大为提高，使毒扁豆碱的应用前途又变得广阔起来。又如雌激素正常剂量下作用在子宫粘膜，为受精提供条件。但大剂量连续应用时通过反馈作用，反而抑制脑垂体分泌卵泡刺激素，抑制排卵，从而达到避孕的目的。近年来又发现雌激素有升高白细胞的作用。这种老药新用的例子是比较常见的。是因为老药是临床常用药，用的病例多，发现新的药理作用的机会也多。因此只要善于观察，善于探索，那么，即使很古老的药物也还有潜力可挖。1993年李世文等编了一本《老药新用途》，收集了139种西药和86种中成药，介绍了它们的新的药理作用。新的用途和临床评价、用法、剂量和副作用等，有实用参考价值。同时也说明老药新用的前景还很广阔，很多老药的新用途还有待开发。药物的复方配制，从广义上来说，也是一种老药新用。通过复方配制，或者产生新的药理作用，或者加强了某种药理作用，或者产生合并用药后的综合效应，或者降低了某种毒性或副作用。由于药物种类的众多，自然可以形成多种多样的复方配伍，产生多种多样的新的效果。这方面的努力无疑是积极有效的，通过这种努力为新药宝库提供的新药也将是无法限量的。因此，同样应该把药物的复方配制看作是寻找新药的一种途径。药物制剂及剂型的研究，从广义来说，同样也是提供新药的途径。可以根据医疗需要。药物性质和生物制剂学的要求来设计剂型以提高疗效，减少毒、

36副作用，达到较佳的治疗目的，制剂学的研究近年来在国外进展很快。既为发展新药提供了很好的技术，同时也有巨大的经济效益。

37第五节生物制药的发展历史和概况一、生物制药的发展历史二、生物技术药物的发展现状1、生物技术是生命科学发展的重要组成部分氨邦总试剂洗旗用*限制性建2、各国生物技术市场发展状况（1）世界医药品和生物技术医药品市场表1世界生物技术专利分布地区或国家生物技术专利/%药物专利1%人DNA序列专利1%美国（USA）595140欧洲（Europe）193324.日本（Japan）171233其它(Other)543总计(Total)100100100截至至2004年6月销售额最大的10种生物技术药物（亿美元）

38撇他帆M瞰20H膻髓调越跋Em141,135IIJ334.0JBa曲跚EPOCEN2M3026司EPO-g加揶RU3口为XII36.71晒麻协前建ENMELjo.ro1616972.38W-Fc汴@V5阚KM0-现燃一就皿/619抑17刃M.I0哧⑩麟麹就Mitrn115.M12.313•PECUCSF拄确8㈣14.15?-0.05G-CSF煽髓崛91?刖11,71413)W娜Eherco101加7.18)5IW研ECFRO协翻翘全球生物制药的年销售额的增长曲线生物技术药物的市场在制药领域中的比重

390987654321S蟀*解时等的、等*等时«幽长脚等邮m▼S9c86O*'O'O\O'年份（2）各国生物技术市场预测rsigz表22000年世界上具有I。亿-35亿美元年销售额的基因工程药物药物适应症（瞿急-EPO贫血35~GH生长障碍30G-CSF中性粒细胞减少症，白血病，艾滋病16.5人胰岛素糖尿病I5TFN-o癌症，丙肝10-20全球2002年生物制药市场份额年份布B北美因欧盟■日本口其他（3）各国风险性生物企业状况

40表2各国风险性生物企业状况美国欧洲日本参与企业数13DD7DD8DD公开企业数3DD5064直接雇佣人数118DDD275DD1DDDD（4）美日有关生物产业政府开发投资预算有关生物产业政府开发投资预算，美国相当于20800亿日元，日本5140亿日元。三、生物技术药物的研究开发1、正在开发和临床研究的生物技术药物1）、美国正在研制的生物技术药物在美国有369种生物技术药物正在临床研究，除重点用于肿瘤治疗外，39种用于感染性疾病，28种用于神经脊髓疾病，26种用于心脏疾病，22种用于呼吸疾病，19种用于AIDS/HIV感染及相关疾病，19种用于自身免疫性疾病，19种用于皮肤病，13种用于移植术，11种用于消化性疾病，11种用于遗传病，9种用于血液病，7种用于糖尿病和相关疾病，5种用于不育症，3种用于眼病，3种用于生长障碍，2种用于骨质疏松症，2种用于避孕药。此外，还有一些生物技术药物具有某些独特的治疗范围如:肥胖病，尿频，急慢性肝衰竭，体克等。用以治疗超过200种的疾病，其中包括治疗癌症和癌症相关的175种药物和疫苗。2）、美国已进入临床研究阶段的革命性生物技术药物Anti-VEGF（抗内皮细胞生长因子），治疗结肠直肠癌和非小细胞肺癌（II期临床）；Dendriticcellvaccine（树突细胞疫苗）,治疗前列腺癌（IH期临床），治疗乳腺癌（I期临床），黑瘤（I/II期临床）；ONYX-015（肿瘤抑制治疗基因）,治疗头颈癌（II期临床）；Anti-IgEhumanisedmonoclonalantibody（人源化抗-IgE单克隆抗体），治疗哮喘（III期临床结束）；PRO542（PRO542抗体），预防HIVo3)、我国正在研制的创新性基因工程药物

41肿瘤坏死因子(TNF)、神经营养因子、激素、酶、其他基因重组蛋白质多肽、重组毒素及蛇毒成分、单克隆抗体及受体。2、我国生物制药应重视和加强的领域1)在天然生化药物研究中筛选出可供基因重组的药物品种2)已知基因的部分功能蛋白质分子3)关于抗体药物的研究4)关于受体药物的研究3、生物医药优先发展领域(1)以治疗用重组细胞因子为主的基因工程多肽药物；(2)单克隆抗体系列产品和诊断药物；(3)生物技术疫苗：(4)生物医学材料及体内植入物和人造器官；(5)海洋活性物质产品；(6)生物反应及分离技术与成套设备：(7)发酵工程关键技术及重大产品；(8)现代中药；(9)创新药物：(10)重大疾病防治药物：(11)医药新剂型；(12)中药制剂先进生产工艺及成套设备；(13)新型医用精密诊断及治疗仪器：（14）计划生育药具。

42四、下一个10年的生物技术与生物制药1、未来10年的生物技术药物生物药物已广泛用于治疗癌症、爱滋病、冠心病、多发性硬化症、贫血、发育不良、糖尿病、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传疾病。重点是应用DNA重组技术生产的蛋白、多肽、酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等。目前已有723种生物技术药物正在进行通过FDA审批（包括I-HI期临床及FDA评估），有200种药物在早期研究阶段（研究与临床前），有200种以上产品已到最后批准阶段（III期临床与FDA评估）。在284种开发的生物技术药物中有2/5用于多种肿瘤的治疗，如脑瘤、直肠癌和乳腺癌。GerakdJMossinghof预言，再过10年，生物技术将使许多老年性疾病得到治疗，是新药“黄金时代”的新开端。2、今后10年生物技术将对当代重大疾病治疗剂创造更多的有效药物，并在所有前沿性的医学领域形成新领域。主要涉及下列医疗领域。・肿瘤在全世界肿瘤死亡率居首位，美国每年诊断为肿瘤的患者为100万，死于肿瘤者达54.7万。用于肿瘤的治疗费用1020亿美元。肿瘤是多机制的复杂疾病,目前仍用早期诊断、放疗、化疗等综合手段治疗。今后10年抗肿瘤生物药物会急剧增加。如应用基因工程抗体抑制肿瘤，应用导向IL-2受体的融合毒素治疗CTCL肿瘤，应用基因治疗法治疗肿瘤（如应用V-干扰素基因治疗骨髓瘤）。基质金属蛋白酶抑制剂（TNMPs）可抑制肿瘤血管生长，阻止肿瘤生长与转移。这类抑制剂有可能成为广谱抗肿瘤治疗剂，已有3种化合物进入临床试验。•神经退化性疾病

43老年痴呆症、帕金森氏病、脑中风及脊椎外伤的生物技术药物治疗，胰岛素生长因子rhIGF-1已进入III期临床。神经生长因子（NGF）和BDNF（脑源神经营养因子）用于治疗末稍神经炎，肌萎缩硬化症，均已进入HI期临床。美国每年有中风患者60万，死于中风的人数达15万。中风症的有效防治药物不多，尤其是可治疗不可逆脑损伤的药物更少，Cerestal已证明对中风患者的脑力能有明显改善和稳定作用，现已进入山期临床。Genentech的溶栓活性酶（Activase重组tPA）用于中风患者治疗，可以消除症状30%。・自身免疫性疾病许多炎症由自身免疫缺陷引起，如哮喘、风湿性关节炎、多发性硬化症、红斑狼疮等。风湿性关节炎患者多于4000万，每年医疗费达上千亿美元，一些制药公司正在积极攻克这类疾病。如Genentech公司研究一种人源化单克隆抗体免疫球蛋白E用于治疗哮喘，已进入II期临床；CetoFs公司研制一种TNF-a抗体用于治疗风湿性关节炎，有效率达80%。Chiron公司的干扰素用于治疗多发性硬化病。还有的公司在应用基因疗法治疗糖尿病，如将胰岛素基因导入患者的皮肤细胞，再将细胞注入人体，使工程细胞产生全程胰岛素供应。,冠心病美国有100万人死于冠心病，每年治疗费用高于1170亿美元。今后10年,防治冠心病的药物将是制药工业的重要增长点。Centocor'sReopro公司应用单克隆抗体治疗冠心病的心绞痛和恢复心脏功能取得成功，这标志着一种新型冠心病治疗药物的延生。基因组科学的建立与基因操作技术的日益成熟，使基因治疗与基因测序技术的商业化成为可能，正在达到未来治疗学的新高度。转基因技术用于构造转基因植物和转基因动物，已逐渐进入产业阶段，用转基因绵羊生产蛋白酶抑

44制剂ATT,用于治疗肺气肿和囊性纤维变性。大量的研究成果表明转基因动、植物将成为未来制药工业的另一个重要发展领域。3、下一个10年的热门药物生物技术表310大热门生物技术技术新颖性技术新颖性组合化学成熟领域前导物综合鉴定技术新生技术药学基因组科学发展领域核糖酶新生技术蛋白质工程发展领域抗体髓新生技术基因治疗发展领域药物设计与人工智能新生技术技术糖类治疗剂发展领域功能抗原新生技术正在研究开发的生物技术药物类型领域开发药物领域开发药物品种品种单克隆体78人生长激素5疫苗62组织纤溶酶4基因治疗28原激活剂凝血因子3基因治疗11集落细胞刺激因子3干扰素10促红细胞生成素2生长因子10SOD1重组可溶性受体6其他56反义药物6总数284五、我国生物技术药物发展存在的问题我国的生物技术药物研究、开发和产业整体上尚处于跟踪仿制阶段。我国

45基因工程药物上市时间比美国同品种上市时间晚3〜10年。我国生物技术产业,特别是生物制药产业规模与美国相比差距很大。我国在基因工程产品开发领域中的“上游技术''比国际技术落后3~5年，但“下游技术”至少相差15年以上。目前我国生物技术药物发展存在的问题主要有(1)生物技术的绝大部分技术创新和大部分专利来源于美国等发达国家。我国生物技术产品主要以仿制为主。(2)加入WTO以后，外国公司争夺国内市场的斗争将更加剧烈。全球十大医药公司和十大生物技术公司均已进入我国市场。(3)开发能力薄弱，源头创新产品少。(4)产业发展资金不足，我国生物技术产业的资本运作市场机制不完善。(5)我国生物技术公司或企业，虽然数量不少，但大部分是低水平重复，规模小，工艺、设备管理等相对落后，除劳动力外，生产成本高，更重要的是产品质量不稳定。(6)缺乏由技术发展到市场运作的高级经营管理人才是我国生物技术产业的一个重要制约因素。

46第二章生物制药工艺技术基础第一节生物材料与生物活性物质一、生物材料的来源供生产生物药物的生物资源主要有动物、植物、微生物的组织、器官、细胞与代谢产物。应用动植物细胞培养与微生物发酵技术也是获得生物制药原料的重要途径。基因工程技术与细胞工程技术和酶工程技术更是开发生物制药资源的新途径。（一）动物脏器（1）胰脏（激素、酶、多肽、核酸、多糖、氨基酸等）（2）脑（脑磷脂、肌醇磷脂、神经磷脂、神经肽等）（3）胃粘膜（胃蛋白酶、胶原蛋白酶、胃泌素、胃膜素）（4）肝脏（维生素、磷脂类、胆固醇）（5）脾脏（免疫器官）（6）小肠（糖蛋白、核甘酸酶、溶菌酶、胃肠道激素）（7）脑垂体（各种激素）（8）心脏（细胞色素C、辅酶QQ其它等（二）血液、分泌物和其它代谢物血液制品：人血制剂、抗凝血酶m,凝血因子viii,纤维蛋白原，免疫球蛋白、人血浆、干扰素、白介素等。尿液、胆汁、蛇毒、蜂毒也是重要的生物材料，尿激酶，表皮生长因子、HCG（三）海洋生物

47(1)海藻：(2)腔肠动物：海葵毒素(3)节肢动物：甲壳素(4)软体动物：多糖、多肽、毒素(5)棘皮动物：海星、海胆、海参海参素抗癌(6)鱼类：鱼油、多种激素、毒素，硫酸软骨素(7)爬行动物：龟滋阴养肾抗肿瘤(8)海洋哺乳动物：鲸鱼鱼肝油(四)植物生物碱、强心贰、黄酮、皂贰、挥发油、树脂、糅质等。(五)微生物1、细菌常用细菌发酵法生产乳酸、醋酸、丙酮、丁醇。主要有：(1)氨基酸：利用微生物酶可转化对应的a酮酸或羟基酸作用产生氨基酸。(2)有机酸：柠檬酸、苹果酸、乳酸(3)糖类：利用细菌可制取葡聚糖、聚果糖、聚甘露糖、脂多糖。(4)核甘酸类：用细菌可生产5'-AMP,5'一肌甘酸(5)维生素：VB1,VB2,VB6,Vc(6)酶：淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、弹性蛋白酶2、放线菌放线菌是最重要的抗生素产生菌，已有1000多种抗生素约2/3产自放线菌。(1)氨基酸发酵法、(2)核甘酸5-脱氧肌甘酸、(3)维生素、(4)酶3、真菌

48（1）酶、（2）有机酸（3）氨基酸、（4）核酸及有关物质、（5）维生素、（6）促生素、（7）多糖4、酵母菌（1）维生素、（2）蛋白质与多肽、（3）核酸（六）开发生物新资源1、动植物细胞的大规模培养2、应用基因工程技术建立工程菌或工程细胞二、生物活性物质的存在方式（一）生物活性物质的存在方式与其生物功能根据生物活性物质的生物功能推断其存在部分和分布方式。生物活性物质分为胞内与胞外两种存在部位。（二）生物分子间的作用力三、生物活性物质的存在特点（一）生物材料组成的复杂性（二）生物活性物质存在地特点生物活性物质在生物材料中含量较低，杂质含量很高，而且生理活性愈高,含量愈低。生物材料中的生化组成数量大，种类多，分离纯化比较困难。四、生物材料的准备生物材料的制造主要包括以下工艺过程：1）生物材料的选取与预处理；2）从生物材料中提取有效活性物质；3）有效成分的分离，纯化

494）后处理及制剂（一）生物材料的选取1、有效成分的含量（1）生物品种：根据目的物的分布，选择富含有效成分的生物品种是选材的关键。（催乳素，哺乳动物）（2）合适的组织器官：（胃蛋白酶，胃）（3）生物的生长期：生物的生长期对生理活性物质含量影响很大。2、杂质情况难于分离的杂质会增加工艺的复杂性，严重影响收率、质量和经济效益。3、来源应选用来源丰富的材料，尽量不与其他产品争原料，最好能一物多用，综合利用。胰脏制备弹性蛋白酶和激肽释放酶，胰岛素与胰酶等。（二）生物材料的采集与保存生理活性物质易失活与降解，采集时必须保持材料的新鲜。防止腐败、变质与微生物污染。如胰脏采摘后要立即速冻，防止胰岛素活力下降。保存生物材料的主要方法有速冻、冻干、有机溶剂脱水，制成丙酮粉，或浸存于丙酮与甘油中等。（三）动物细胞的培养与保存（四）微生物菌种的选育与保存1、菌种的分离微生物种类繁多，易于培养，是工业化生产各种生物药物的主要材料。（1）含菌样品的收集

50根据微生物的生态特点，从自然界取样，分离所需要菌种，如到堆积和腐烂纤维素的地方去取样分离纤维素酶产生菌。到温泉附近取样分离高温蛋白酶产生菌。一般可以从土壤中分离所需微生物，取样时先将表土刮去2〜3cm,在同一条件下选好2〜5点土样混在一起包好，表明采样地点及日期备用。(2)富集培养收集到的样品若含所需要的菌较多，可直接分离。如含所需要的菌很少，就需要经过富集培养，使所需要的菌大量生长，以利于筛选。再配合控制温度,pH或营养成分即可达到目的。有时用能分解的底物作为生长和诱导产生所须成分的培养基成分，以使所需要的菌种得到快速生长，有利于进一步分离。(3)菌种纯化在自然条件下，各种类型的菌混杂在一起生活，所以要进行分离，以获得纯种。菌种纯化的方法一般采用稀释分离或划线分离法。2、菌种的筛选(1)筛选对象的选择筛选前，先要考虑哪些微生物是筛选的对象。如有报道，则根据文献收集可能性最大的的微生物进行筛选。(2)培养方式的确定微生物的培养方式，有固体培养与液体培养。3、菌株的选育从自然界直接分离得到的菌种，都不能立即适应实际生产需要。只有通过诱变，选育才能使产量成倍，成百倍地提高。选育方法基本上可以分成两类：

51随机选择突变体；根据代谢的调节机制选择各种突变体。(1)随机选择法一般程序是采用诱变剂诱变处理微生物，增殖培养，经过稀释涂布，随机选择部分或全部单菌落，逐个测定它们的生物活性。最后挑选出产量或其它性能比亲代菌株优秀的突变株。(2)根据代谢的调节机理选择高产突变体根据代谢的调节机理选择高产突变体。(抗性基因)4、菌种的保藏(1)菌种的退化与防止生产菌种本来在自然环境下生长，所以在人工培养条件下，任何菌株通过一系列的转接传代都可能发生退化。退化一一般把菌株的生活力，产池子能力的衰退和特殊产物产量的下降，成为退化。菌种退化现象：①单位容积中发酵液的活性物质含量；②琼脂平皿上的单菌落形态；③不同培养时期菌体细胞的形态和主要遗传特征。如形成抱子能力;④发酵过程pH变动情况；⑤发酵液的气味、色泽。菌种退化防止措施：①防止基因突变，基因突变是菌种退化的一个主要原因，低温保藏法可以减少突变得产生。②采用双重缺陷型采用双营养缺陷标志可间接而有效地防止突变。③制定科学管理制度制作平行菌种斜面；④分离单菌落；认真进行单菌落分离工作，再多做平行的菌种斜面：⑤选择培养条件选择有利于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。(2)常用的菌种保藏方法

52斜面保存法一将菌种转接到新鲜的琼脂斜面上，待生长良好后，于4c保存。根据具体情况，间隔一定时间后转接。矿油法一在菌种斜面上覆盖矿物油以隔绝空气防止蒸发。索氏法一将小试管斜面的菌种放在大试管内，大试管内装几粒氢氧化钾，管口加橡皮套，然后用石蜡包封。干硅胶法一试管内装硅胶约半满，180℃加热灭菌1.5小时，置密封干燥器内冷却，接种菌液约1ml,塞好棉花，放入预置有色硅胶的大瓶中，蜡封瓶口，于低温处保存。砂土管法一取普通黄沙，洗净过60目筛，晒干，另取普通圆土研碎，过筛,晒干。两者以6:4混合。分装于安醋瓶或小试管中，然后在60℃干热灭菌2小时，连续灭菌三次后即可使用。装管时可吸取少许抱子悬浮液加入，待干燥后抽真空封口或用棉花塞紧后蜡封，低温保藏。冷冻干燥法：将菌种悬浮于脱脂消毒牛奶中，快速冷冻，真空干燥。甘油冷冻保存法：将对数期菌体悬浮于新鲜培养基中，加入15%消毒甘油,混匀速冻，冻存于一70〜一80℃.(五)组织与细胞的破碎组织与细胞的破碎方法有物理法、化学法与生物法。1、物理法(1)磨切法：工业上常用的有绞肉机，刨胰机，球磨机、磨粉机。实验室常用的有匀浆机，研钵，高速组织捣碎机。(2)压力法：有压榨法、高压法和减压法，渗透压法。(3)超声波法(4)反复冻融法

532、化学法用稀酸、稀碱、浓盐、有机溶剂或表面活性剂处理细胞，可破坏细胞结构释放出内容物。

543、生物法（1）组织自溶法：利用组织中自身溶解酶的作用改变、破坏细胞结构，释放出目的物称为组织自溶法。（2）酶解法：用外来酶处理生物材料，如用溶菌酶处理某些细菌，蜗牛酶等（3）噬菌体法：用噬菌体感染细胞、裂解细胞，释放出内容物。（六）细胞器的分离为获得结合在细胞器上的一些生化成分或酶系，常常要先得到细胞器再进一步分离有效成分。方法是匀浆破碎细胞，差速离心。上清网曳lOminr*上清•8500glOminr*上清（细胞质）二沉淀（微粒体）沉淀（线粒体）700gXlOmin0.34mol/L蔗精L•沉淀（细胞核、膜碎片）图9-1大鼠肝细胞差速离心分离各种细胞器流程第二节生物活性物质的提取提取是利用制备目的物的溶解特性，将目的物与细胞的固形物成分或其它结合成分分离，使其由固相转入液相或从细胞生理状态转入特定溶液环境的过程。一、物质性质与提取（一）物质的性质与提取方法的选择要取得好的提取效果，最重要的是要针对生物材料和目的物的性质选择合适的溶剂系统与提取条件。生物材料及其目的物与提取有关的一些性状包括溶解性质、分子量、等电点、存在方式、稳定性、比重、粒度、粘度，目的物含量，主要杂质种类及溶解性质，有关酶的特征等。其中最主要的是目的物与主要杂质在溶解度方面的差异以及它们的稳定性。操作者可根据文献资料及本人的试验摸索获得的有关信息，在提取过程中增加目的物的溶出度，尽可能减少杂质的溶出度。（二）活性物质的保护措施

551、采用缓冲盐系统在生物药物制备中，常用的缓冲盐有磷酸缓冲盐，柠檬酸缓冲盐，Tris缓冲液，醋酸缓冲盐，碳酸缓冲盐，硼酸缓冲盐和巴比妥缓冲盐等。2、添加保护剂防止某些生理活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏，如筑基是许多活性蛋白质和酶催化活性基团，极易被氧化，故提取时，常添加某些还原剂如半胱氨酸，a-筑基乙醇。对易受重金属影响的，可添加EDTA。3、抑制水解酶的作用4、其它保护措施（冷、热、酸、碱）二、物质的性质与溶解度（一）物质溶解度的一般规律相似相溶（二）水在生化物质提取中的作用水是提取生化物质的常用溶剂。水分子的存在可使其它生物分子之间的氢键减弱，而与水分子形成氢键，水分子还能使溶质分子的离子键解离，这就是所谓的水合作用。水合作用促使蛋白质、核酸、多糖等生物大分子与水形成了水合分子或水合离子从而促使它们溶解于水或水溶液中。三、提取效率药物药效成分分离纯化过程中，药效成分的纯度与产率之间是一对矛盾的关系。药品有效成分的纯度是衡量其质量优劣的重要指标，特别是非肠道药物,其纯度的高低直接关系用药安全性。药品药效成分的绝对纯净和100%的高纯化产率是现代生物制药领域追求但尚未能达到的目标。纯化产品产率提高往往伴

56随着纯度的下降，反之对纯度要求的提高意味着纯化工艺成本的提高和产物收率的降低。如何在纯化产物符合标注恩的前提下实现高的纯化产率，是一项纯化工艺水平的体现。应结合对药物的质量要求、加工成本、技术上的可行性和可靠性、药品价格以及市场需求等，找出纯化工艺、加工物纯度、生物化性和产量间的平衡点，实现工艺最优化。四、影响提取的因素（-）温度多数物质的溶解度随提取温度的升高而增加。另外较高的温度可以降低物料的粘度，有利于分子扩散和机械搅拌，所以对耐热成分的提取可以用加热的方法。对不耐热的生物活性物质的提取，一般在0〜10℃进行提取。（二）酸碱度多数生化物质在中性条件下较稳定，pH值一般应控制在4〜9范围内，为了增加目的物的溶解度，往往要避免目的物的等电点附近进行提取。巧妙地选择溶剂系统的pH值不但直接影响目的物与杂质溶解度，还可以抑制有害酶类的水解破坏作用，防止降解，提高收率。（三）盐浓度：盐溶作用；盐析作用。五、提取方法（-）用酸、碱、盐水溶液提取（二）表面活性剂提取表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团，分布于油水界面时，有分散、乳化和增溶作用。表面活性剂分阴离子型、阳离子型与非离子型。离子型表面活性剂作用强，但是易引起蛋白质等生物大分子的变性，非离子表面活性剂变性作用小，适合于用水、盐系统无法提取的提取的蛋白质或酶的提取。(三)有机溶剂提取

571、固一液提取丙酮从动物脑中提取胆固醇，溶剂分级提取：如先用丙酮，再用乙醇，最后用乙酸提取。石油酸，氯仿,乙酸乙酯，正丁醇，甲醇。丙酮粉2、液一液萃取液一液萃取是利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异，将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。分配系数和溶剂用量溶剂萃取的注意事项：(1)pH：在萃取操作中正确选择pH值很重要。因为在水溶液中某些酸、碱物质会解离，在萃取时改变了分配系数，直接影响提取效率。(2)盐析：加入中性盐如硫酸铁，氯化钠等可以使一些生化物质的溶解度减少,这种现象成为盐析。在提取液中加入中性盐，可以促使生化物质转入有机相从而提iWj萃取率。(3)温度：一般在室温下或低温下进行萃取操作。(4)乳化：在液液萃取时，常发生乳化作用，使有机溶剂与水相分层困难。去乳化的常用方法有：过滤与离心，轻轻搅动，改变两相的比例；加热，加电解质，加吸附剂。液液萃取时溶剂的选择：（1）选用的溶剂必须具有较高的选择性，各种溶质在所选的溶剂之间分配系数差异愈大愈好。（2）选用的溶剂，在萃取后，溶质与溶剂要容易分离与回收。（3）两种溶剂的密度相差不大时容易形成乳化，不利于萃取液的分离。

58（4）要选用无毒，不易燃烧的价廉易的溶剂。第三节生物活性物质的浓缩与干燥一、生物活性物质的浓缩（一）盐析浓缩：硫酸核沉淀蛋白质（二）有机溶剂沉淀浓缩在生物大分子的水溶液中，逐渐加入乙醇，丙酮等有机溶剂，可以使生化物质的溶解度明显降低，从溶液中沉淀出来。（三）用葡聚糖凝胶（Sephadex）浓缩（四）用聚乙二醇透析浓缩（五）超滤浓缩（六）真空减压浓缩与薄膜浓缩真空减压浓缩在药物生产中使用较为普遍，具有生产规模较大，蒸发温度较低，蒸发速度较快等优点。薄膜浓缩器的加速蒸发的原理是增加汽化表面积。使液体形成薄膜而蒸发，成膜的液体具有较大的表面积，热传播快而均匀，没有液体静压的影响，能较好地防止物料的过热现象。二、干燥干燥的目的：提高药物或药剂的稳定性，以利于保存和运输；达到规格标准；便于进一步处理。表面水，毛细管中的水，细胞内的水。（一）减压干燥；（二）喷雾干燥；（三）冷冻干燥第四节生化物质的分离纯化方法一、生物制药中分离制备方法的特点生物制药中分离、制备方法有以下特点：

59（1）生物材料组成非常复杂。一种生物材料常含成千上万成分，各种化合物的形状、大小、分子量和理化性质都各不相同。没有固定操作方法。（2）有些化合物在生物材料中含量极微，只达万分之一，甚至百万分之一。因此，分离操作步骤多，不易获得高收率。（3）生物活性物质离开生物体后，易变性，破坏，分离进程必须十分小心的保护这些化合物的生理活性。（难点）（4）生物制药的分离方法几乎都在溶液中进行，各种参数（温度，pH,离子强度）对溶液中各种组分的综合影响常常无法固定，以致许多实验设计理论性不强。（5）为了保护目的物的生理活性及结构上的完整性，生物制药中的分离方法多采用温和的逐级分离方法。亲和层析分离具有分离的专一性，高效性。（6）生物产品最后均一性的证明与化学纯度的概念不完全相同，因生物分子对环境反应十分敏感，结构与功能关系比较复杂。二、生物制药中分离制备方法的基本原理生物大分子分离纯化的主要原因：（1）根据分子形状和大小不同进行分离。如差速离心与超离心、膜分离（透析,电渗析）与超滤，凝胶过滤法。（2）根据分子电离性质的差异性进行分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。(3)根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提取法，逆流分配法，分配层析法，盐析法，等电点沉淀法，及有机溶剂分级沉淀法。(4)根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附法与吸附层析法。(5)根据配体特异性进行分离一亲和层析法。三、分离纯化的基本步骤

601、将目标药物成分从起始原材料中释放出来；2、从提取物中去除固体杂质成分；3、去除可溶性杂质成分；4、除去水或其他类别的溶剂，富集或浓缩目标药物成分；5、去除残留杂质和污染物成分，使药物成分能够达到所需的纯度；6、对目标药物成分进行必要的后加工处理(如修饰、加入稳定剂、佐剂等)以保护或提高药物活性等。四、分离纯化的基本程序和实验设计生物体内某一组分，特别是未知结构的组分的分离制备设计大致上分为五个基本阶段。(1)确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定方法。(2)制备物理化性质稳定性的预备试验。(3)材料处理及抽提方法的选择。(4)分离纯化方法的摸索。(5)产物均一性测定。(pl38)提取是分离纯化目的物的第一步，所选的溶剂应对目的物具有最大的溶解度，并尽量减少杂质进入提取液。分离纯化是生化制备的核心操作。分离策略:1、分离纯化早期使用方法的选择分离纯化的早期，由于提取液中的成分复杂，目的物浓度较稀，与目的物理化性质相似的杂质多，所以不宜选择分辨能力较高的纯化方法。早期分离纯化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法较为有利，这些方法负荷能力大,分离量多兼有分离提纯和浓缩的作用，为进一步分离纯化创造良好的基础。一个特异性方法的分辨力愈高，便意味着提纯步骤愈简化，收率愈高。

612、各种分离纯化方法的使用程序生化物质的分离都是在液相中进行，故分离方法主要依据物质的分配系数,分子量大小，离子电荷性质及数量和外加环境条件的差别等因素为基础。而每一种方法又都是在特定条件下发挥作用。因此，在相同或相似条件下连续使用同一种分离方法就不太适宜。在安排纯化方法顺序时，还要考虑到有利于减少工序，提高效率。(盐析一吸附，吸附一盐析)对于一未知物通过各种方法的交叉应用，有助于进一步了解目的物的性质。3、分离后期的保护性措施在分离操作的后期必须注意避免产品的损失，主要损失途径是器皿的吸附，操作过程样品液体的残留，空气氧化和某些事先无法了解的因素。五、分离技术(-)固相析出分离法改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术称为固相析出分离法。析出物为晶体时称为结晶；析出物为无定形固体称为沉淀法。固相析出法主要有盐析法，有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法，结晶法等。1、盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。盐析的机制：高浓度的中性盐溶液中存在着大量的带电荷的盐离子，它们能够中和生物分子表面的电荷，使之赖以稳定的双电层受损，从而破坏分子外围的水化层；另外，大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，从另一方面摧毁了水化层，使生物分子相互聚集而沉淀。盐析机理示意图

622、有机溶剂沉淀法向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。主要机理：(1)亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使得溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。(2)水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。3、等电点沉淀法两性电解质，在溶液pH处于等电点(pl)时分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。调节溶解的pH值，使两性溶质溶解度下降，析出沉淀的操作。4、结晶法改变溶液的某些条件，使其中的溶质以结晶态析出的过程称作结晶。(1)盐析结晶法这是生化制药中应用最多的结晶方法。其作用是通过向结晶溶液中引入中性盐，逐渐降低溶质的溶解度使其过饱和，经过一定时间后晶体形成并逐渐长大。（2）透析结晶（3）有机溶剂结晶（4）等电点结晶（5）温度诱导结晶

63（二）吸附法吸附是物质分子在两相界面上浓度的增加。由于界面上的分子同时受到不相等的两相分子的作用力，因此界面分子的力场是不饱和的，即存在一种固体的表面力，它能从外界吸附分子、原子或离子，并在吸附剂表面附近形成多分子层或单分子层。我们称物质从流动性（气或液相）浓缩到固体表面从而达到分离的过程称为吸附作用。把在表面上能发生吸附作用的固体称为吸附剂：将被吸附的物质称为吸附物。常用吸附剂：1）活性炭：是一种吸附能力很强的非极性吸附剂，其吸附作用在水溶液中最强，在有机溶剂中较弱，吸附能力的顺序：水〉乙醇〉甲醇〉乙酸乙酯〉丙酮〉氯仿。2）人造沸石：人造沸石是一种人工合成的无机阳离子交换剂。用于细胞色素C的分离。3）磷酸钙凝胶：在蛋白质的分离、精制中，较为常用的吸附剂为磷酸钙凝胶。（羟基磷灰石）活性部位为钙离子。4）白陶土5）氢氧化铝凝胶：用于蛋白质及酶的分离。6）氧化铝：活性氧化铝是最常用的一种吸附剂，特别适于亲脂性成分的分离，广泛地用于在醇，酚，生物碱，染料，密体化合物，甘类，氨基酸，蛋白质以及维生素等物质的分离。7）硅胶：最常用8）滑石粉：惰性助滤剂9）硅藻土：惰性助滤剂

6410）皂土11）聚酰胺粉12）大孔网格聚合物吸附树脂：极性，弱极性，非极性大孔吸附树脂强酸性，弱酸性，强碱性，弱碱性等（三）离子交换法离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作方法。带电粒子与离子交换剂间的作用力是静电力。它们结合是可逆的，在一定条件下能够结合，条件改变后也能被释放出来。离子交换剂由惰性的不溶性载体，功能基团和平衡离子组成。（四）凝胶层析它是将样品化合物通过一定孔径的凝胶固定相，用于流经体积的差异，使不同分子量的组成得以分离的层析。（五）亲和层析利用生物大分子特异性亲和力而设计的层析技术称为亲和层析。在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基（Ligand）,与配基结合的层析介质称为载体（Matrix）。

65亲和层析的设计原理和过程：1）配基固定化选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶联，或共价结合成具有特异性亲和性分离介质。2）吸附样品亲和层析介质选择性吸附酶或其它生物活性物质，杂质与层析间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤去除。3）样品洗脱选择适宜的条件使被吸附的亲和介质上的酶或其它生物活性物质洗脱。（六）离心技术沉降作用—悬浮液静置时，在重力作用下，密度大于周围溶液的固体颗粒逐渐下沉，成为沉降作用。离心技术一在离心力场作用下，加速悬浮液中固体颗粒沉降速度的方法称为离心技术。相对离心力一通常用离心力与重力的比值表示离心机的离心能力，也称分离因素，用符号Xg或g表示。RCF=^rm/3600/mS（七）膜分离技术塔攵蕊log废雪琰苣分离范围分离动力压力差&一般过滤

66透析5-100A分子扩散超级过滤5-100A压力差反渗透<5A压力差电渗析<5A电能微孔过滤0.01~1um压力差(A)制备型高效液相色谱制备型HPLC技术是利用大直径柱，分离制备大量纯物质(>0.1g)oHPLC的分离依据是样品中各组分之间带电性，极性，疏水性，分子大小，等电点，亲和性，螯合性等理化性质的差异。将样品导入柱头，流动相在高压泵的作用下，其流量被准确地控制通过色谱柱，样品中各组分在色谱柱中形成差速迁移,按时间先后流出层析柱，然后进行检测和分部收集。按固定相对样品的保留机理，HPLC大致可分为液固色谱，键合相色谱，离子交换色谱，离子对色谱，凝胶色谱，疏水色谱，亲和色谱，聚焦色谱，金属螯合亲和色谱等。色谱重要参数：分离度，分离速度，回收率，样品容量。分离度Rs理论塔板数N容量因子K，一为溶质在固定相中得总摩尔数与流动相中得总摩尔数之比。选择因子a六、分离纯化方法步骤优劣的综合评价

67每一个分离纯化步骤的好坏，除了从分辨能力和重现性两方面考虑，还要注意方法本身的回收率，特别是制备某些含量很少的物质时，回收率的高低十分重要。对每一步骤方法的优劣，体现在所得产品重量与活性平衡关系上。例如酶的分离纯化，每一步骤产物重量与活性关系，通过测定酶的比活力及溶液中蛋白质浓度的比例。七、制备物均一性的鉴定均一性是指所获得的制备物只有一种完全相同的成分。（纯度鉴定）生物分子纯度的鉴定方法很多，常用的有溶解度法、化学组成分析法，电泳法，免疫学方法，离心沉降分析法，各种色谱法，生物功能测定法，以及质谱法。第五节新药从实验室研究至中试生产新药研究的最终目的是生产出质量合格的药品，供医疗应用。新药投入大量生产以前，必须研制出一条成熟、稳定、适合于工业生产的技术工艺路线。研制过程分阶段进行，包括：实验研究阶段；小量试制剂段；中试生产阶段；最后才能过渡到工业生产。各个阶段前后衔接，相互促进，任务各不相同，研究的重点也有差异，制备的规模逐渐由小变大。新药申请注册前应完成中试生产。下面是各个阶段的主要任务。一、实验室研究阶段这是新药研究的探索阶段，目的是发现先导化合物和对先导化合物的结构修饰，找出新药苗头。其主要任务是：合理设计化合物尽快完成这些化合物的合成；利用各种手段，确证化合物的化学结构；测定化合物的主要物理参数；了解化合物的一般性质，而对化合物的合成方法不作过多的研究。为了制备少量的样品供药理筛选，不惜采用一切分离纯化手段，如反复分储，多次重结晶,各种层析技术等。显然，这样的合成方法与工业生产的距离很大。二、小量试制阶段新药苗头确定后，应立即进行小量试制（简称小试）研究，提供足够数量的

68药物供临床前评价。其主要任务是：对实验室原有的工艺路线和方法进行全面的、系统的改革。在改革的基础上通过实验室批量合成，积累数据，提出一条基本适合于中试生产的合成工艺路线。小试阶段的研究重点应紧紧绕影响工业生产的关键性问题。如缩短工艺路线，提高产率，简化操作，降低成本和安全生产等。（一）研究确定一条最佳的合成工艺路线（二）用工业级原料代替化学试剂（三）原料和溶剂的回收套用（四）安全生产和环境卫生三、中试生产阶段（一）、生物制药中试放大工艺特点中试放大是由小试转入工业化生产的过渡性研究工作，对小试工艺能否成功地进入规模生产至关重要。这些研究工作都是围绕如何提高收率，改进操作，提高质量，形成批量生产等方面进行。中试放大，验证实验室工艺路线的可行性以及在实验室阶段难以解决或尚未发现的问题。在考查工艺条件的研究阶段中，必须注意和解决：1、原辅材料规格的过渡试验在小试时，一般采用的原辅材料（如原料，试剂，溶剂，纯化载体）规格较高，目的是为了排除原料中所含杂质的不良影响，从而保证实验结果的准确性。但是当工艺路线确定之后，在进一步考察工艺条件时，应尽量改用大规模生产时容易得到的原辅材料。过渡试验2、设备选型与材质质量试验在小试阶段，大部分实验是在小型玻璃仪器中进行，但在工业生产中，物料要接触到各种设备材料，如微生物发酵罐，细胞培养罐，固定化生物反应器，

69多种层析材料以及产品后处理的过滤浓缩、结晶、干燥设备等。3、反应条件限度试验反应条件限度试验可以找到最适宜的工艺条件(如培养基种类，反应温度，压力，pH等)，一般均有一个许可范围。有些反应对工艺条件要求很严，超过一定限度后，就会造成重大损失。进行工艺条件限度试验，全面掌握反应规律。4、原辅材料、中间体及产品质量分析方法研究5、下游工艺的研究尽量简化下游工艺操作，采用新工艺，新技术，新设备等。二、中试放大方法与内容中试放大的方法有经验放大法，相似放大法和数学模型放大法。经验放大法主要凭借经验通过逐级放大(实验装置，中间装置，中型装置和大型装置)来摸索反应器的特征。中试放大程序可采用步步为营或一竿子到底策略。中试放大的研究内容主要有：(1)工艺路线与各步反应方法的最后确定(2)设备材质与型号的选择(3)反应器的规模选择及反应搅拌器型式与搅拌速度的考查。(4)生产反应条件的研究(5)工艺流程与操作方法的确定(6)物料衡算(7)安全生产与三废防治措施研究(8)原辅材料，中间体的物理性质和化工常数的测定

70(9)原辅材料、中间体质量标准的制定。(10)消耗定额，原料成本，操作工时与生产周期计算。生产工艺规程的制订四、药品的包装与标签(一)药品的包装(二)标签(1)药品的名称，包括中文名和英文名。(2)药品的规格和装量。(3)处方的组成，含量比例；若药品中含有麻醉药品、精神药品、毒性药品、放射药品要按规定有特殊明显的标志。(4)其他。包括作用与用途、用法与用量、注意事项、药品的有效期、药政管理部门批准生产的文号、生产批号、注册商标，以及制药厂的名称和地址等。如标签面积小，不够容纳上述内容，则列出主要的，并在每一单位包装内放入使用说明书。对具体药品的包装，要根据剂型类别，主药的理化性质，药品的装量，以及制剂的规格等选用质量合格，大小适宜的包装容器和密封材料。(三)其它应注意事项(1)标签要大小适中，色调鲜明，字迹清晰，叙述清楚，使人易懂。各种字体大小及位置要安排适当。(2)标签必须贴正，与容器底部平行。(3)药品为供应医疗的特殊商品，标签图案以美观大方，素雅清新为宜。不同品种和不同规格的药品，勿使用图案颜色完全相同的标签，避免混淆。(4)凡列入容器标签的内容，必须在包装外层的纸板盒和包皮上同样标明。

71五、药品质量管理规范药品是一种特殊的商品，对它的要求也就比较特殊，简言之应该是“安全、有效、稳定、均一因此对它的质量管理就应法制化、科学化和规范化，不能凭经验或普通制度进行随机的管理。《药品生产质量管理规范》(GoodManufacturePracticeGMP)是世界各国对药品生产全过程监督管理普遍采用的法定技术规范。GMP不仅要求药品的最终产品的质量要符合质量要求，而且对药品生产的全过程要求符合管理规范。GMP的内容包括：硬件(厂房、环境、布局、设备、机械、仪器、卫生、原料、辅料、生产操作)和软件(人员、制度、标准、程序)。在硬件方面要有符合要求的环境、厂房、设备；在软件方面要有可靠的生产工艺、严格的制度、完善的验证管理。GMP的基本点是：要保证生产的药品符合法定质量标准，保证药品质量的均一性，防止生产中药品混批、混杂、污染和交叉污染。

72第三章生物制药工艺技术的发展第一节生物制药工艺的发展一、生物药物类型与品种的发展(一)生化药物1＞治疗酶与诊断用酶(1)超氧化物歧化酶(SOD)：抗炎、抗辐射、抗衰老(2)凝血酶(3)L一天冬酰胺酶(4)尿激酶(5)PEG-腺甘脱氨酶(治疗免疫缺陷症)(6)8一半乳糖甘酶(用于生产无糖牛奶)2、核甘和核甘酸类药物(1)叠氮脱氧胸背(AZT)(治疗爱滋病)(2)丙氧鸟昔(DHPG)(抗病毒)3、多糖类药物(1)肝素钙与小分子量肝素(抗凝血)(2)透明质酸(化妆品，关节炎)4、蛋白质与多肽类药物(1)水蛭素(抗凝血，防血栓)(2)转移因子(如牛脾转移因子，胎盘转移因子等，免疫)

73（3）胸腺制剂（抗肝炎，免疫）（4）肝细胞生长因子（治疗肝炎）5、脂类药物（B一胡萝卜素，EPA,DHA）（二）基因工程药物1、乙肝疫苗2、人白细胞干扰素（IFN）3、基因工程人胰岛素4、人白细胞介素（IL-2）5、人生长激素（hGH）6、人组织纤溶酶原激活剂（htPA）7、人促红细胞生成素（hEPO）8、细胞集落刺激因子（CSFs）（三）细胞工程产品主要动物细胞培养产品有：a干扰素，丫干扰素，EPO,IL-2及尿激酶等;植物细胞培养产品：罗汉果，洋地黄，延胡索，人参，贝母，紫杉，紫草组织培养等。各种单克隆抗体。二、生化分离制备技术的发展（一）生物反应器生物反应器包括微生物细胞大规模培养的发酵罐和动物细胞大规模的培养罐及用于固定化酶或固定化细胞进行连续自动化转化生化物质的各种生物催化反应器。用于微生物细胞培养的生物反应器：搅拌通气的反应器气升式反应器

74喷射自吸式反应器用于多糖及脂肪酶发酵生产的离心式生物反应器用于乳酸发酵的螺旋管式连续发酵连续培养光合细胞的反应器动物细胞培养器用于固定化酶或固定化细胞生物反应器采用固定床和沸腾床。（二）生物药物下游加工技术错流超滤，高效液相色谱，亲和色谱，色层层析等。快速蛋白液相色谱系统。（三）膜分离技术超滤技术，已用于酶发酵工业的纯化和浓缩。三、生物工程技术在生物制药工业中的应用（一）酶工程技术第一代酶一酶制剂第二代酶一固定化酶第三代酶一固定化多酶（包含辅因子再生系统）1、酶的固定化方法酶的固定化方法有下述4种：吸附法，包埋法，共价键结合法，交联法（1）吸附法吸附法分为物理吸附法与离子吸附法。用物理吸附法制成固定化酶，酶活力损失很少，但吸着在载体上的酶，易于脱落，使用价值少。离子吸附法是将酶与含有离子交换剂的水不溶性载体结合，酶吸附于载体上较为牢固，在工业上用途颇广。

75离子吸附法常用的载体有：1)阴离子树脂，如DEDA-C,ECTEOLA-纤维素，TEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶，AmberliteCG-50,IRC-50,IR-120,IR-200,Dowex-50等。例：DEAE-SephadexA-25吸附氨基酰化酶(2)包埋法包埋法系将酶包埋于凝胶或高分子聚合物网格内，网格可以防止酶的渗出，底物仍能渗入网格内与酶相接触。包埋法的优点是酶分子本身不参与水不溶性网格的形成，许多酶都可用此法固定化。其操作简单，酶分子只是被保埋起来，而未受到化学反应，因此固定化酶表现活力较高。常用的报埋剂有聚丙烯酰胺，卡拉胶，淀粉凝胶，三醋酸纤维素，海藻酸,胶原，血纤维，大豆蛋白等。例：卡拉胶保埋细胞生产苹果酸(3)共价键结合法共价键结合法是通过化学反应使酶与聚合物载体共价偶联。酶与载体共价结合的功能团包括氨基，竣基，酚羟基，筑基，羟基，咪睫基。常用共价键结合法有：重氮化法，烷基化和芳基化法，戊二醛结合反应法，钛螯合法，硫醇一二硫化物的互换反应等。固定化糖化酶(4)肽键结合法该法主要将含竣基的水不溶性载体变成酰基叠氮，异氟酸盐，卤化物等衍生物，再使这些衍生物与酶的游离氨基进行反应，形成肽键。(5)交联法交联法是使用双功能或多功能试剂与酶分子之间进行分子间的交联反应的

76固定化方法。由于酶蛋白的功能基团，如氨基，酚基，筑基，和咪哇基，参与交联反应，因此可能影响酶的活性中心结构，而使酶活力显著失活。交联剂有多种，主要为戊二醛。在固定化酶的基础上，固定化细胞技术得到迅速发展，其实际应用速度已超过固定化酶。固定化细胞具有更多的优点，它省去酶的分离操作。在细胞内，酶稳定性较高，进行固定化时，活力丧失较少，且能利用天然存在的多酶体系,制造成本更低。但是反应产物与底物必须容易透过细胞膜。2、酶工程技术的应用固定化酶和固定化细胞在食品发酵工业和制药工业方面的应用，不仅可以改革现有的生产工艺，而且可以创新多酶反应工艺，还可以促使发酵工业发生根本性变革，因此在制药工业中的应用具有很大潜力。（二）细胞培养技术1、动物细胞培养技术及其应用动物细胞的培养是将来自动物体的某些组织或器官，在模拟体内生理条件下，在体外进行培养，使之存活和生长。（1）动物细胞培养条件营养条件培养基（人工合成，半人工合成）pH条件7.2〜7.4温度条件37±0.5℃气体条件。2和CO2渗透压无菌条件

77(2)培养方法体外培养细胞有原代培养与传代培养两种方法。原代培养法有单层培养法和组织块培养法。传代培养是将原代培养的细胞进行稀释分瓶继续培养。(3)动物细胞大批培养技术许多有价值得蛋白质，多肽制品都可以用动物细胞大规模培养技术进行生产，如病毒疫苗，干扰素，单克隆抗体等。因此动物细胞培养技术正向大型化,自动化和精巧化方向发展。①微载体培养系统微载体培养是细胞培养附着和生长在微载体表面。②气升式深层发酵罐法③中空纤维法④微囊法将活细胞悬浮在海藻酸钠中，滴入氯化钙溶液中，形成小珠，用长链氨基酸聚合物聚赖氨酸，形成多孔外膜，然后重新液化胶化小球，使成胶物质从多孔外膜流出，活细胞留在膜内，然后进行培养。(4)动物细胞培养技术的应用(人生长激素，乙型肝炎疫苗)2、植物细胞的培养及其应用(1)植物细胞的培养技术植物细胞培养是将植物体的某一部分经无菌处理后置于人工培养基上使其细胞增殖，进而按需要进行培养的技术。用于进行培养所需的植物部分成为外殖体。所形成的脱分化的细胞团称为愈伤组织。将愈伤组织转移到液体培养基中进行培养即为悬浮培养。

78培养基大量无机盐，植物激素等。(2)植物组织培养的应用植物细胞培养技术有着广泛应用，尤其在天然药物的生产上具有广阔前景。如长春碱、地高辛。(三)单克隆抗体技术1、单克隆抗体的制备原理B细胞群受抗原刺激后能产生针对抗原决定族的特异性抗体,一个机体可产生多达100万种特异性的抗体。但是一个B细胞却只能分泌一种特异性抗体。例如，小鼠B细胞受乙肝病毒刺激后，可产生针对乙肝病毒的7种不同标志的特异性抗体，它们分别由7种小鼠B细胞产生。这些B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后，形成7种杂交瘤细胞，稀释纯化，挑出单个杂交瘤细胞，进行无性繁殖(克隆)。同一个克隆的杂交瘤细胞基因相同，合并分泌的特异性抗体质地均一，这种抗体称之为单克隆抗体。2、单克隆抗体的工业化生产单克隆抗体的生产包括细胞培养、提纯和制剂等工艺过程。(1)杂交瘤细胞的大规模培养生物反应器：气升式发酵罐，中空纤维培养罐，微囊发酵罐培养基：牛淋巴液，血清(2)单抗的分离纯化(超滤、盐析、离子交换、HPLC等)(3)单克隆抗体的制剂技术3、单克隆抗体的应用

79(四)基因工程技术基因工程实际上包括了体外基因工程(DNA体外重组)和体内基因工程(DNA体内重组)两种方式。一般指体外基因工程。1、基因工程的基本程序基因工程操作程序包括取得目的基因，将目的基因同载体连接构建成DNA重组体，再将经过重组的DNA转化导入受体细胞(宿主细胞)，并使目的基因和载体上其它基因地形状得以表达(即基因转录和翻译为目的蛋白)见图p57(五)生物合成技术1、利用微生物代谢产物的药物(1)醇酮类药物：如乙醇，丁醇，丙醇及甘油。(2)有机酸类药物：如醋酸，柠檬酸，苹果酸，乳酸(3)维生素类药物(4)氨基酸类药物(5)生物碱类药物：麦角生物碱、托派生物碱、羟基喜树碱。(6)抗生素2、半合成药物第二节生物药物制剂工艺的发展生物药物剂型的开发主要方向为控释性，靶向性，脂质体，微囊剂等。九十年代，药物制剂的研究与开发有了相当大的进步，特别是缓、控释释药系统的发展极为迅速。同时，其他多种新型释药系统也均纷纷脱颖而出。新型释药系统的特点均具有：提高药物疗效、降低毒副作用、使用方便等特点。

80由于药物制剂的开发研究周期短、费用少、经济效益大，是医药经济主要增长点。世界各国对药物制剂的研究与开发均有较大投入。制剂基本操作：称量；粉碎、筛析与混合；提取与过滤：蒸储、蒸发与干燥：制粒单元操作1、缓、控释制剂缓释控释制剂与药物在体内浓度有关，而与给药时间无关的基本理论的基础上发展起未的。是一类采用新型药用辅料，通过膜控技术、骨架阻滞技术和包衣技术等来控制片剂、胶囊剂的释药速度，从而实现定时、定速释放，属于第3代剂型就延长有效血药浓度的持续时间和提高用药的安全度。缓释制剂和控释制剂的主要区别在于控释制剂是按零级速率释放药物，其释放量不受时间影响，释放速度是恒速或接近恒速，血药浓度平稳，峰谷波动很小。其优点是：(1)对于半衰期短或需要频繁给药的药物可以减少服药次数，提高患者服药顺应：(2)使治疗指数较低的药物血药浓度保持平稳进免过高过低的峰谷现象，减少不良反应的发生；(3)可在小剂量的情况下达到最大疗效，减少总的用药量。目前临床上应用缓释控释制剂有硝苯地平缓释控释片，主要用于抗高血压治疗。缓、控释制剂剂型：(1)固体缓、控释制剂(口服、舌下)技术产品；(2)注射缓、控释制剂技术产品；(3)混悬型缓、控释制剂(口服、注射)技术产品；(4)凝胶型缓、控释制剂(口服、粘膜、腔道)技术产品。

812、靶向给药系统采用乳化技术、脂质体制备技术、微型包囊和微型成球技术，使药物浓集于靶器官、靶组织。靶细胞的靶向给药系统属于第4代剂型，可用于恶性肿瘤等疾病的治疗。近年来受到普遍关注的口服结肠定位给药系统是一类对pH敏感的结肠定位释药制剂。口服结肠靶向给药系统中的药物在胃、十二指肠、空肠和回肠不释放，只有当药物达到人体回盲部后启结肠较高的pH环境下溶解聚合物，才能使给药系统把药物释放出未，并且在结肠部发挥局部治疗作用。其优点是：(1)在结肠释放不受消化酶影响，可以增加其生物利用度；(2)治疗发生于结肠的克罗恩病、溃疡型结肠炎及结肠直肠癌时，可以提高局部药物浓度，减少化疗药物对胃肠道的刺激，减轻恶心、呕吐等不良反应的发生：(3)用量小、胃肠吸收少就减少骨髓抑制等全身不良反应的发生；(4)对于在夜间发作的哮喘、心绞痛、关节炎的治疗，可让药物在结肠缓慢释放，将发挥长效作用。重点支持：(1)结肠靶向给药(口服)系统及产品(2)心脑靶向给药(口服、注射)系统及产品；(3)淋巴靶向给药(注射)系统及产品。3、脂质体脂质体可简单地定义为由类脂双分子层包裹水相介质构成的脂质微囊。按此定义，即使是细胞和细胞器本身也可被认为是复杂类型的脂质体，因为各种生物膜的基体结构即为类脂双分子层。这种广义脂质体的概念有助于理解细胞

82的生理学，如通透性、融合、与膜相关的酶活性等，特别是有助于理解脂质体用作疫苗佐剂和载体的作用机理及其安全性。狭义的脂质体是指人工制备的脂质微囊，由磷脂和/或其他极性两性物在水相中分散形成。磷脂分子的非极性尾部(煌链)由于疏水而需集于微囊的内侧，磷脂分子的极性头部由于亲水而与水相接触，形成微囊的表面。当用超声波处理磷脂与水的悬浮液时，即可形成脂质体、其分子量自儿千到儿万，可含单层或多层脂膜(层间为水相间隔)。这样形成的脂质体通常很稳定，且易溶于水。4、微囊释放系统利用天然或合成高分子材料将固体或液体药物包嵌而成的，其粒径为5〜250um的微型胶囊。由于制备方法的不同，某些微囊的粒径也可在500um以上。将微囊再制备成散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂或注射剂等剂型，具有延缓药物释放、提高药物稳定性、掩盖不良臭味、降低胃肠道等的副作用、减少复方药物的配伍禁忌、改进药物的物理性能，还可将液态药物制成固体制剂以及靶向作用等特点。目前国外已有30余类药物制成了微囊。我国在这方面的技术和产品相对落后，对于此项技术和项目产品将重点给予支持。微胶囊的特点：(1)使相互间易产生反应的药物相隔离；(2)控制药物释放速度；(3)使液体或气体药物在外观上转变成固体；(4)掩蔽不良的色、味、毒性等；(5)防止氧化，可长期保存；(6)表现比重发生改变，流动性增加；

83(7)缓和对粘膜的刺激性；(8)在微囊内可进行特殊的生化反应(如抗原抗体反应，酶促反应)；(9)通过对微囊表面的化学修饰，可能成为有前途的靶向性制剂。5、脉冲式/自调式给药系统通过机体外部磁性、超声波、温度和电化学的变化控制释药的脉仲式给药,根据机体内部pH敏感性，酶底物反应，竞争性结合和金属浓度等反馈信息。自动调节释药的自调式给药属于第5代剂型，又称智能给药系统。时辰生物学研究表明，人体的体温、血压、心率、血糖、激素分泌、心肾功能等，在每天的24h中有周期性变化。近年来，时辰药理学的研究也表明，某些疾病的发作，也显示出生理节奏的变化。因此，可通过与生理节律同步的脉冲式或自调式释药技术，在疾病发作的高峰时期就在体内自动释药，则疗效更好，特别适用于糖尿病患者对胰岛素的应用、恶性心率夫常患者对抗心率失常药物应用，心绞痛患者对硝酸甘油的应用，育龄期妇女对避孕药物的应用。而脉冲式和自调式给药系统的其他优点：(1)减少给药次数，提高患者的依从性；(2)药物是在疾病发作时才释放，故可避免机体因长时间处于高浓度药物中而产生耐药。6、其它新制剂(1)干粉末吸入剂：由于一般定量吸入气雾剂常常要涉及到溶解性及稳定性的问题，需加入大量附加剂，而作为动力源的氟氯烷类抛射剂己逐步被取缔，而干粉末吸入剂的含药颗粒，是被包封于单剂量硬胶囊或多剂量储库中，无需任何抛射剂，靠患者自主呼吸产生的气流使药物粉末雾化进而将药物粉末同步运送至肺部，达到治疗效果。特别是一些多肽及蛋白类药物，注射给药很不方便，而口服给药生物利用度又很低。肺部存在丰富的毛细血营，其内皮紧贴于肺泡

84上皮，因此肺部对药物吸收屏障极薄，且对药物的代谢活性也极低，生物利用度较高，因此干粉末吸入给药具有很好的前景。（2）透皮剂：透皮给药系统是指在皮肤表面给药，使药物以恒定速度（或接近恒定速度）通过皮肤各层，进入体循环产生影响全身或局部治疗作用的新剂型。其特点是：1）药物吸收不受消化道内pH、食物、药物在肠道移动时间等因素影响；2）避免药物在肝脏的首过效应；3）可持续给药；4）属于无创伤性给药途径，用药部位在体表，发生不良反应时中断给药很方便。（3）植入剂：随着医药技术的发展，人们对植入剂进行了较为广泛的研究，植入剂是一种无菌固体制剂，是由药物和赋形剂藉熔融、热压、辐射等方法制成。其特点是：1）长效作用：释药期限长达数月至数年，减少了连续用药的麻烦；2）恒释作用：由于聚合物骨架阻滞作用，系统中药物常呈恒速释药，因此可维持稳定的血药浓度，减少药物的毒副作用；3）定位作用：由于植入剂能增加特定部位的药物调节，使药物更接近于靶细胞，近年来在抗肿瘤、胰岛素给药、心血管疾病治疗、眼部用药等方面都有较深入的研究。（4）凝胶剂：凝胶剂作为外用皮肤吸收的一种剂型，它具有水溶性的特点，局部给药后皮肤吸收良好，不仅避免了口服给药存在的胃肠道反应，而且使副作用大大减少。采用PCV124为凝胶基质加入替硝哇制成凝胶，可置入牙床内，用于治疗牙周病；用卡波姆941为凝胶基质，加入高效H1受体拮抗剂特非那丁制成凝胶滴鼻剂，可有效用于过敏性鼻炎的治疗，前体药物阿昔洛韦棕桐酸酯的脂溶性较大，制成脂质体凝胶则可以提高药物在皮肤内滞留的时间，用于抗病毒治疗。7、制剂新辅料研究

85药物制剂是由主药、辅料及工艺组合而成的最终产品，辅料在制剂中是必不可缺的重要组分。辅料的质量、性能对制剂的质量至关重要，辅料的发展更是新制剂和新剂型发展的基础。在全世界，特别是发达国家，均有专业人员和企业投入大量资金和人员，根据制剂的要求，研究医药所需要的各种不同规格、不同性能的辅料。目前国外辅料的种类已达近400种。国内辅料的研究一直处于低迷徘徊中，从事辅料研究人员少，已有的产品生产规模小，品种少，规格不全，或虽有产品，而质量不稳定，对制剂的开发研究处于不利的境地，已成为新制剂开发的主要矛盾之一。重点支持：（1）固体制剂用辅料。固体制剂辅料有黏合剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂以及包合剂等。重点支持：环糊精衍生物、微晶纤维素、微粉硅胶等。（2）包衣材料。包衣材料可掩盖药物的不良口感、提高光敏药物的稳定性、减少药物对胃肠道的刺激性、使药物在指定部位释放等。重点支持：纤维素衍生物、丙稀酸树脂类衍生物等（3）注射用辅料。注射用辅料有溶剂、助剂。注射用溶剂、助剂包括非水溶媒、助溶剂、表面活性剂。支持：注射用6-环糊精衍生物、注射用卵磷脂、注射用豆磷脂。第四章抗生素生产工艺第一节抗生素概述一、基本概念抗生素是青霉素、链霉素、红霉索等一类化学物质的总称。它是生物，包括微生物、植物和动物，在其生产活动过程中所产生，并能在低微浓度下有选择性地抑制或杀灭其他微生物或肿瘤细胞的有机物质。抗生素的生产目前主要用微生物发酵法进行生物合成。很少数抗生素如氯霉素、磷霉素等亦可用化学合成法生产。此外还可将生物合成法制得的抗生素

86用化学或生化方法进行分子结构改造而制成各种衍生物，称半合成抗生素，如氨,卡青霉素(ampicillin)就是半合成青霉素的一种。随着对抗生素合成机理和微生物遗传学理论等的深入研究，了解到它是属于次级代谢产物(Secondarymetabolite)o二、抗生素的发展抗生素学科的发展是劳动人民长期来与疾病进行斗争的结果，也是随着人类对自然界中微生物的相互作用，尤其是对微生物之间的拮抗现象的研究而发展起来的。相传在2500年前我国的祖先就用长在豆腐上的霉菌来治疗疮疗等疾病。19世纪70年代，法国的Pasteur发现某些微生物对炭疽杆菌有抑制作用。他提出了利用一种微生物抑制另一种微生物现象来治疗一些由于感染而产生的疾病。1928年英国细菌学家Flemling发现污染在培养葡萄球菌的双碟上的一株霉菌能杀死周围的葡萄球菌。将此霉菌分离纯化后得到的菌株，经鉴定为点青霉(Penicilliumnotatuin),并将这菌所产生的抗生素命名为青霉素。1940年英国Florey和Chain进一步研究此菌，并从培养液中制出了干燥的青霉素制品。经实验和临床试验证明，它毒性很小，并对一些革兰氏阳性菌所引起的许多疾病有卓越的疗效。在此基础上1943〜1945年间发展了新兴的抗生素工业。以通气搅拌的深层培养法大规模发酵生产青霉素。随后链霉素、氯霉素、金霉索等品种相继被发现并投产。从50年代起许多国家还致力于农用抗生素的研究。如杀稻瘟素(BlasticidinA),春日霉素(kasugamycin),灭瘟素S、井岗霉素等高效低毒的农用抗生素相继出现。70年代以来，抗生素品种飞跃发展。到目前为止，从自然界发现和分离了4300多种抗生素，并通过化学结构的改造，共制备了约三万余种半合成抗生素。目前世界各国实际生产和应用于医疗的抗生素约120多种，连同各种半合成抗生素衍生物及盐类约350余种。其中以青霉素类、头抱菌素类、四环素类、氨基糖昔类及大环内酯类为最常用。解放前我国没有抗生素工业。解放后，在1953年建立了第一个生产青霉素的抗生素工厂以来，我国抗生素工业得到迅速发展。不仅能够基本保证国内医

87疗保健事业的需要，而且还有相当数量出口。目前国际上应用的主要抗生素，我国基本上都有生产，并研制出国外没有的抗生素一创新霉素。三、抗生素的分类(一)、根据抗生素的生物来源分类微生物是产生抗生素的主要来源。其中以放线菌产生的为最多，真菌其次细菌的又次之，而来源于动、植物的最少。(1)放线菌产生的抗生素:在所有已发现的抗生素中，由它产生的抗生素占一半以上，其中又以链霉菌属产生的抗生素为最多。诺卡氏菌属、小单孑包菌属次之。这类抗生素中主要有氨基糖昔类，如链霉素；四环类，如四环素；大环内酯类,如红霉素；多烯类，如制霉菌素；放线菌素类，如放线菌素D等。(2)真菌产生的抗生素:在真菌的四个纲中，不完全菌纲中的青霉菌属和头抱菌属等分别产生一些很重要的抗生素，如青霉素、头泡菌素。其次为担子菌纲。藻菌纲和子囊菌纲产生的抗生素很少。⑶细菌产生的抗生素:由细菌产生的抗生素的主要来源是多粘杆菌、枯草杆菌、芽泡杆菌等。属这类抗生素的有多粘菌素等。(4)植物或动物产生的抗生素例如从被子植物蒜中制得的蒜素；从动物脏器中制得的鱼素(Ekmolin)等。(二)、根据抗生素的作用分类按照抗生素的作用，可以分成以下类别：(1)广谱抗生素：如氨芾青霉素，它既能抑制革兰氏阳性菌，又能抑制革兰氏阴性菌。(2)抗革兰氏阳性菌的抗生素：如青霉素等。(3)抗革兰氏阴性菌的抗生素：如链霉素等。(4)抗真菌抗生素：如制霉菌素等。

88(5)抗病毒抗生素：如四环类抗生素对立克次体及较大病毒有一定作用。(6)抗癌抗生素：如阿霉素等。(三)、根据抗生素的化学结构分类由于化学结构决定抗生素的理化性质、作用机制和疗效，故按此法分类具有重大意义。但是，许多抗生素的结构复杂，而且有些抗生素的分子中还含有儿种结构。故按此法分类时，不仅应考虑其整个化学结构，还应着重考虑其活性部分的化学构造，现按习惯法分类如下：(5)8-内酰胺类抗生素：包括青霉素类、头泡菌素类等。它们都包含一个四元内酰胺环。这是在当前最受重视的一类抗生素。(2)氨基糖甘类抗生素：包括链霉素、庆大霉素等。它们既含有氨基糖甘，也含有氨基环醇的结构。(3)大环内酯类抗生素：如红霉素、麦迪霉素(medicamycin)。它们含有一个大环内酯作配糖体，以甘健和1〜3个分子的糖相连。(4)四环类抗生素：如四环素、土霉素等。它们以四并苯为母核。(5)多肽类抗生素：如多粘菌素、杆菌肽等。它们多由细菌、特别是由产池子的杆菌产生，并含有多种氨基酸，经肽键缩合成线状、环状或带侧链的环状多肽。(四)、根据抗生素的作用机制分类根据抗生素对致病菌作用的机制，可分成五类：(1)抑制细胞壁合成的抗生素：如青霉素、头泡菌素。(2)影响细胞膜功能的抗生素：如多烯类抗生素。(3)抑制病原菌蛋白质合成的抗生素：如四环素。(4)抑制核酸合成的抗生素：如影响DNA结构和功能的丝裂霉素Co

89(5)抑制生物能作用的抗生素：如抑制电子转移的抗霉素(antimycinl)。(五)、根据抗生素的生物合成途径分类(1)氨基酸、肽类衍生物：如青霉素、头抱菌素等寡肽抗生素。(2)糖类衍生物：如链霉素糖甘类抗生素。(3)以乙酸、丙酸为单位的衍生物：如红霉素等丙酸衍生物。四、医疗用抗生素应具备的条件(1)难使病原菌产生耐药性：近年来某些病原菌耐药现象日趋严重，它们所引起的各种感染，常成为治疗上的难题，因此一个优良的抗生素应不易使病原菌产生耐药性。(2)较大的差异毒力：所谓“差异毒力”是指药物对病原菌和宿主组织的毒力差异。如青霉素族、头泡菌素族抗生素能抑制细菌细胞壁的合成，但对人及哺乳动物，由于其细胞无细胞壁，故不产生影响。(3)最小抑菌浓度要低：抗生素的抗菌活性用最小抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)表示，单位是ug/mLo(4)抗菌谱要广：抗生素对各种微生物的抗菌活性称为抗菌谱。抗生素应能在低浓度下对多种病原菌有效。一些抗生素只对G+菌或G-菌具有抗菌活性，抗菌谱较窄；另一些称为广谱抗生素，其不但能作用于细菌，有些还能抑制霉菌的生长。第二节抗生素作用机理一、机体、抗微生物、病原菌的关系二、作用特点1、选择性作用

90一种抗生素只对一定种类的微生物有作用，即抗菌谱。青霉素一般只对革兰氏阳性菌有作用，多粘菌素只对革兰氏阴性菌有作用，它们的抗菌谱较窄。氯霉素、四环素等对多种细菌及某些病毒都有抑制作用，称为广谱抗生素。2、选择性毒力抗生素对人和动物的毒力远小于对病菌的毒力，称为选择性毒力。通常抗生素可在极低浓度下有选择地抑制或杀死微生物。选择性毒力是化学治疗的基础。3、耐药性细菌在抗生素的作用下，大批敏感菌被抑制或杀死，但也有少数菌株会调整或改变代谢途径，变成不敏感菌，致使药物疗效低或无效，产生耐药性。分固有耐药和获得耐药(1)耐药机理：A、酶促破坏：如内酰胺酶(青霉素酶)使青霉素水解，氨基环醇类抗生素常被钝化，如磷酸化、酰甘酰化、N-乙酰化等。B、细菌改变敏感部位：链霉素通过与30S亚基结合而抑制蛋白质合成，某些细菌小亚基上的蛋白发生突变，不与链霉素结合，产生耐药性。C、降低细胞膜的通透性：细菌可以合成抗生素透过的阻碍物，可以发生突变使抗生素不被转运，也可以产生将抗生素运出体外的拮抗系统。(2)产生与传播耐药性的产生是由于突变造成的，抗生素的作用是将未突变的微生物杀死,从而使突变体被选择出来。有些耐药性基因位于抗性质粒上，可以通过细菌的接合而传播。(3)对策

91除寻找新的抗生素以外，在临床上应该合理使用抗生素，避免滥用，防止耐药菌的产生。也可通过耐药机理的研究寻找对策，如用抑制剂抑制青霉素酶。三、作用机理作用机制抗生素主要作用靶位

92抑制细菌细胞壁肽聚糖生物合成B-内酰胺类抑制转肽酶活性，破坏肽聚糖相互交联和肽聚糖生物合成中的UDP-N-乙酰葡萄糖胺丙酮酰转移前结合，阻断UDP-N-乙酰葡萄糖胺向UDP-N-乙酰胞壁酸的转化糖肽类杆菌肽与D-丙氨酰-D-丙氨酸结合，抑制转糖基和转肽反应抑制焦磷酸前，阻断肽聚糖跨膜载体十一聚异戊二烯醇再生破坏微生物细胞膜功能多烯类多黏菌素B、黏杆菌素短杆菌肽S与组成真菌细胞膜的麦角固醇结合而破坏膜功能类似阳离子去污剂的作用，破坏细菌细胞膜的磷脂结构切断细菌电子传递系统与氧化磷酸化的偶联抑制蛋白质生物合成氨基糖昔类四环素类与核糖体30S亚基和50S亚基结合，抑制肽酰-tRNA转位与30S亚基结合，抑制氨基酰-tRNA与核糖体A位结合作用于50S亚基中的23s核糖体RNA(rRNA),抑制肽酰基林可霉素和转移酶大环内酯类春日霉素抑制30S亚基与甲酰蛋氨酰-tRNA复合物的形成抑制DNA生物合成磺胺类抑制细菌二氢叶酸合成酶氨甲蝶吟抑制细菌二氢叶酸还原的丝裂霉素C抑制DNA复制时的双链打开博来霉素与DNA结合，切断DNA的一条链抑制RNA生物合成丰加霉素抑制转录反应放线菌素D抑制DNA依赖性RNA聚合的蕙环类利福霉素类抑制DNA依赖性RNA聚合幅和DNA聚合的抑制细菌DNA依赖性RNA聚合酶作用于细胞内离子载体类抗生素的阳离子(莫能菌素、与细胞膜中的Na、K+、Ag+、Ca*等金属离子形成稳定的大环四内酯类、整合物，影响细胞膜的离子透过性，打乱细胞内的离子分布，使白僵菌素等肽类抗生素)细胞失去正常功能。抑制有丝分裂灰黄霉素、长春花生物碱与微管蛋白结合，干扰有丝分裂纺锤体的形成

93抑制能量代谢抗霉素A、杀稻瘟菌素S、干蠕抱菌素阻碍呼吸链的电子传递，抑制ATP合成的第三节抗生素工业生产及工艺一、抗生素工业的性质（p41）由于抗生素生物合成和自身结构稳定性的特点使抗生素的生产具有以下特性。①理论产量很难从物料衡算中计算出来，初级代谢产物是菌体进行次级代谢所产生的物质，代谢途径清楚，代谢过程较为简单，其理论产量可从化学计量式中求出。而抗生素是次级代谢产物，由于目前对次级代谢了解得不够，所以抗生素的理论产量很难从化学关系式中求出。②抗生素的产量存在着“生物学变量”，抗生素发酵产量与菌种的性能有关,也和培养条件有关。通常各批发酵所得的抗生素产量是不同的，即存在着所谓的“生物学变量，,，一般为10%。③发酵液中有效成分浓度低，某些抗生素不太稳定，加之有时会出现染菌的罐批等，这些情况对提取精制工艺提出了更高的要求。二、抗生素生产的工艺过程（一）菌种从来源于自然界土壤等，获得能产生抗生素的微生物，经过分离、选育和纯化后即称为菌种。菌种可用冷冻干燥法制备后,以超低温，即在液氮冰箱（-190C〜-196C）内保存。所谓冷冻干燥是用脱脂牛奶或葡萄糖液等和抱子混在一起，经真空冷冻、升华干燥后，在真空下保存。如条件不足时，则沿用砂土管在0℃冰箱内保存的老方法，但如需长期保存时不宜用此法。一般生产用菌株经多次移植往往会发生变异而退化，故必须经常进行菌种选育和纯化以提高其生产能力。

94（二）也子制备生产用的菌株须经纯化和生产能力的检验，若符合规定，才能用来制备种王j制备也子时，将保藏的处于休眠状态的池子，通过严格的无菌手续，将其接种到经灭菌过的固体斜面培养基上，在一定温度下培养5〜7日或7日以上，这样培养出来的池子数量还是有限的。为获得更多数量的抱子以供生产需要，必要时可进一步用扁瓶在固体培养基（如小米、大米、玉米粒或效皮）上扩大培养。（三）种子制备其目的是使抱子发芽、繁殖以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中，种子制备可用摇瓶培养后再接入种子罐进逐级扩大培养。或直接将抱子接入种子罐后逐级放大培养。种子扩大培养级数的多少,决定于菌种的性质、生产规模的大小和生产工艺的特点。扩大培养级数通常为二级。摇瓶培养是在锥形瓶内装入一定数量的液体培养基，灭菌后以无菌操作接入抱子，放在摇床上恒温培养。在种子罐中培养时,在接种前有关设备和培养基都必须经过灭菌。接种材料为抱子悬浮液或来自摇瓶的菌丝，以微孔差压法或打开接种口在火焰保护下按种。接种量视需要而定。如用菌丝，接种量一般相当于0.1%〜2%（接种量的％,系对种子罐内的培养基而P3，下Ir））O从一级种子罐接入二级种子罐接种量一般为5%〜20%,培养温度一般在25〜30℃。如菌种系细菌，则在32〜37℃培养。在罐内培养过程中，需要搅拌和通入无菌空气。控制罐温、罐压，并定时取样作无菌试验，观察菌丝形态，测定种子液中发酵单位和进行生化分析等，并观察无杂菌情况。种子质量如合格方可移种到发酵罐中。（四）培养基的配制在抗生素发酵生产中，由于各菌种的生理生化特性不一样，采用的工艺不同，所需的培养基组成亦各异。即使同一菌种，在种子培养阶段和不同发酵时期，其营养要求也不完全一■样。因此需根据其不同要求来选用培养基的成分与配比。

95其主要成分包括碳源、氮源、无机盐类（包括微量元素）和前体等。（1）碳源主要用以供给菌种生命活动所需的能量，构成菌体细胞及代谢产物。物的碳源还参与抗生素的生物合成，是培养基中主要组成之一,常用碳源包括淀粉、葡萄糖和油脂类。对有的品种，为节约成本也可用玉米粉作碳源以代淀粉。使用葡萄糖时，在必要时采用流加工艺，以有利于提高产量。油脂类往往还兼用作消沫剂。个别的抗生素发酵中也有用麦芽糖、乳糖或有机酸等作碳源的。（2）氮源主要用以构成菌体细胞物质（包括氨基酸、蛋白质、核酸核I含氮代谢物，亦包括用以生物合成含氮抗生素。氮源可分成两类:有机氮源和无机氮源。有机氮源中包括黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉（它如果经精制以去除其中的棉酚后称phamamedia）、玉米浆、蛋白陈、尿素、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉和菌丝体等。无机氮源中包括氨水（氨水既作为氮源，也用以调节pH）,硫酸镂、硝酸盐和磷酸氢二氨等。在含有机氮源培养基中菌丝生长速度较快，菌丝量也较多。(3)无机盐和微量元素抗生素产生菌和其他微生物一样，在生长、繁殖和产生生物产品的过程中,需要某些无机盐类和微量元素。如硫、磷、镁、铁、钾、钠、锌、铜、钻、镒等，其浓度与菌种的生理活性有一定影响。因此，应选择合适的配比和浓度。此外，在发酵过程中可加入碳酸钙作为缓冲剂以调节pHo(4)前体在抗生素生物合成中，菌体利用它以构成抗生素分子中的一部分而其本身乂没有显著改变的物质，称为前体(precursor)。前体除直接参与抗生素生物合成外，在一定条件下还控制菌体合成抗生素的方向并增加抗生素的产量。如苯乙

96酸或苯乙酰胺可用作为青霉素发酵的前体。丙醇或丙酸可作为红毒素发酵的前体。前体的加入量应当适度。如过量则往往前体有毒性，并增加了生产成本。如不足，则发酵单位降低。此外，有时还需要加入某种促进剂或抑制剂，如在四环素发酵中加入M-促进剂和抑制剂溟化钠，以抑制金霉索的生物合成并增加四环素的产量。(5)培养基的质量培养基的质量应予严格控制，以保证发酵水平，可以通过化学分析，并在必要时作摇瓶试验以控制其质量。培养基的储存条件对培养基质量的影响应予注意。此外，如果在培养基灭菌过程中温度过高、受热时间过长亦能引起培养基成分的降解或变质。培养基在配制时的调节其pH亦要严格按规程执行。(五)发酵发酵过程的目的是使微生物大量分泌抗生素。在发酵开始前，有关设备和培养基也必须先经过灭菌后再接入种子。接种量一般为10%或10%以上，发酵期视抗生素品种和发酵工艺而定，在整个发酵过程中，需不断通无菌空气和搅拌，以维持一定罐压或溶氧，在罐的夹层或蛇管中需通冷却水以维持一定罐温。此外，还要加入消沫剂以控制泡沫，必要时还加入酸、碱以调节发酵液的PH。对有的品种在发酵过程中还需加入葡萄糖、镂盐或前体，以促进抗生素的产生。对其中一些主要发酵参数可以用电子计算机进行反馈控制。在发酵期间每隔一定时间应取样进行生化分析、镜检和无菌试验。分析或控制的参数有菌丝形态和浓度、残糖量、氨基氮、抗生素含量、溶解氧、pH、通气量、搅拌转速和液面控制等。其中有些项目可以通过在线控制。（在线即。nline,指不需取样而直接在罐内测定，然后予以控制）。（六）发酵液的过滤和预处理发酵液的过滤和预处理其目的不仅在于分离菌丝，还需将一些杂质除去。尽管对多数抗生素品种在生产过程中，当发酵结束时，抗生素存在于发酵液中，

97但也有个别品种当发酵结束时抗生素大量残存在菌丝之中，在此情况下，发酵液的预处理应当包括使抗生素从菌丝中析出，使其转入发酵液。（1）发酵液的预处理发酵液中的杂质如高价无机离子（Ca2+、Mg2\Fe3+）和蛋白质在离子交换的过程中对提炼影响甚大，不利于树脂对抗生素的吸附。如用溶媒萃取法提炼时，蛋白质的存在会产出乳化，使溶媒和水相分层困难。对高价离子的去除,可采用草酸或磷酸。如加草酸则它与钙离子生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固以提高发酵滤液质量。如加磷酸（或磷酸盐），则既能降低钙离子浓度，也易于去处镁离子ONa5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+如加黄血盐及硫酸锌，则前者有利于去除铁离子，后者有利于凝固蛋白质。此外，这二者还有协同作用。它们所产生的复盐对蛋白质有吸附作用。2K4Fe(CN)6+3ZnSO4^K2Zn3[Fe(CN)6]2I+3K2sO4对于蛋白质，还可利用其在等电点时凝聚的特点而将其去除。蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中，胶体粒子的稳定性和其所带的电荷有关。它属于两性物质，在酸性溶液中带正电电荷，在碱性溶液中带负电荷，而在某一pH下,净电荷为零，溶解度最小，称为等电点；因其竣基的电离度比氨基大，故很多蛋白质的等电点在酸性(pH4.0〜5.5)范围内。某些对热稳定的抗生素发酵液还可用加热达。使蛋白质变性而降低其溶解度。蛋白质从有规律的排列变成不规则结构的过程称为变性。加热还能使发酵液粘度降低、加快滤速。例如在链霉素生产中就可用加入草酸或磷酸将发酵液调至pH3.0左右，加热至70℃,维持约半小时，用此方法来去除蛋白质，这样滤速可增大10〜100倍。滤液粘度可降低至1/6。如抗生素对热不稳定，则不应采用此法。

98为了更有效地去除发酵液中的蛋白质，还可以加入絮凝剂。它是一种能溶于水的高分子化合物。含有很多离子化基团，如-NH2、-COOH,-OH等。如上所述，胶体粒子的稳定性和它所带电荷有关。由于同性电荷间的静电斥力而使胶体粒子不发生凝聚。絮凝剂分子中电荷密度很高，它的加入使胶体溶液电荷性质改变从而使溶液中蛋白质絮凝。对絮凝剂的化学结构一般有下列儿种要求:1)其分子中必须有相当多的活性基团，能和悬浮颗粒表面相结合。2)必须具有长链线性结构，但其相对分子质量(分子量)不能超过一定限度，以使其有较好的溶解度。在发酵滤液中多数胶体粒子带负电荷，因而用阳离子絮凝剂功效较高。例如可用含有季胺基团的聚苯乙烯衍生物，分子量在26000〜55000范围内。加入絮凝剂后析出的杂质再经过滤除去，以利于以后的提取。（2）发酵液的过滤发酵液为非牛顿型液体，很难过滤。过滤的难易与发酵培养基和工艺条件，以及是否染菌等因素有关。过滤如用板框压滤则劳动强度大,影响卫生，菌丝流入下水道时还影响污水处理。故以选用鼓式真空过滤机为宜,并在必要时在转鼓表层涂以助滤剂硅藻土。当转数旋转时，以刮刀将助滤剂连同菌体薄薄刮去一层，以使过滤面不断更新。另一种设备是自动出渣离心机,但所排出的菌丝滤渣中尚含有较大量的发酵液，因此如要提高过滤收率，可将此滤渣以水洗后再次用同样型号离心机分离。第一次和第二次离心分离液体合并后进入下一工序。再一种设备称倾析器（Decanter）。它既可用于固、液相的分离，也可用于固相、有机溶媒相和水相三者的混合和分离，从而将过滤菌丝和溶媒萃取这两步合并在这一设备中完成。这就简化了发酵液后处理工艺，提高了收率，并缩短了生产周期，也节约了劳力、动力、厂房和成本。（七）抗生素的提取提取时目的是在于从发酵液中制取高纯度的符合药典规定的抗生素成品。

99在发酵滤液中抗生素浓度很低，而杂质的浓度相对地较高。杂质中有无机盐、残糖、脂肪、各种蛋白质及其降解物、色素、热原质、或有毒性物质等。此外，还可能有一些杂质其性质和抗生素很相似，这就增加了提取和精制的困难。由于多数抗生素不很稳定，且发酵液易被污染，故整个提取过程要求：1）时间短；2）温度低；3）pH宜选择对抗生素较稳定的范围；4）勤清洗消毒（包括厂房、设备、管路并注意消灭死角）。常用的抗生素提取方法包括有溶媒萃取法、离子交换法和沉淀法等。1、溶媒萃取法：这是利用抗生素在不同pH条件下以不同的化学状态（游离酸、碱或成盐）存在时，在水及与水互不相溶的溶媒中其溶解度不同的特性，使抗生素从一种液相（如发酵滤液）转移到另一种液相（如有机溶媒）中去，以达到浓缩和提纯的目的。利用此原理就可藉助于调节pH的办法使抗生素从一个液相中被提取到另一液相中去。所选用的溶媒与水应是互不相溶或仅很小部分互溶，同时所选溶媒在一定的pH下对于抗生素应有较大的溶解度和选择性，方能用较少量的溶媒使提取完全，并在一定程度上分离掉杂质。目前一些重要的抗生素，如青霉素、红霉素和林可霉素等均采用此法进行提取。2、离子交换法这是利用某些抗生素能解离为阳离子或阴离子的特性，使其与离子交换树脂进行交换，将抗生素吸附在树脂上，然后再以适当的条件将抗生素从树脂上洗脱下来，以达到浓缩和提纯的目的。应选用对抗生素有特殊选择性的树脂，使抗生素的纯度通过离子交换有较

100大的提高。由于此法具有成本低、设备简单、操作方便，已成为提取抗生素的重要方法之一。如链霉菌素、庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素等均可采用离子交换法。此法也有其缺点，如生产周期长，对某些产品质量不够理想。此外，在生产过程中PH变化较大，故不适用于在PH大幅度变化时，稳定性较差的抗生素3、其他提取方法由于近年来许多抗生素发酵单位已大幅度提高，提取方法亦相应适当简化。如直接沉淀法就是提取抗生素的方法中最简单的一种。例如四环类抗生素的提取即可用此法。发酵液在用草酸酸化后，加黄血盐、硫酸锌，过滤后得滤液，然后以脱色树脂脱色后，直接将其PH调至等电点后使其游离碱折出。必要时将此碱转化成盐酸盐。（A）抗生素的精制这是抗生素生产最后工序。对产品进行精制、烘干和包装的阶段要符合“药品生产管理规范”（即GMP）的规定。例如其中规定产品质量检验应合格、技术文件应齐全、生产和检验人员应具有一定素质；设备材质不应能与药品起反应、并易清洗，空调应按规定的级别要求，各项原始记录、批报和留样应妥为保存，对注射品应严格按无菌操作的要求等。1、脱色和去热原质脱色和去热原质是精制注射用抗生素中不可缺少的一步。它关系到成品的色级及热原试验等质量指标。色素往往是在发酵过程中所产生的代谢产物，它与菌种和发酵条件有关。热原质是在生产过程中由于被污染后由杂菌所产生的一种内毒素。各种杂菌所产生的热原反应有所不同。革兰氏阴性菌产生的热原反应一般比革兰氏阳性菌的为强。热原注入体内引起恶寒高热，严重的引起休克。它是多糖类脂质和蛋白质的结合体，为大分子有机物质，能溶于水。在280c加热4h它能被破坏90%；180〜

101200℃加热半小时或150C加热2h能被彻底破坏。它亦能被强酸、强碱、氧化剂（如高镒酸酸钾）等破坏。它能通过一般滤器，但能被活性炭、石棉滤材等所吸附。生产中常用活性炭脱色去除热原，但须注意脱色时pH,温度、炭用量及脱色时间等因素，还应考虑它对抗生素的吸附问题，此外，也可用脱色树脂去除色素(如酚醛树指，即122树脂)。对某些产品可用超微过滤办法去除热源，此外还应加强在生产过程中的环境卫生以防止热原。2、结品和重结晶抗生素精制常用此法来制得高纯度成品。(1)改变温度结晶：利用抗生素在溶剂中的溶解度随温度变化而显著变化的这一特性来进行结晶。例如制霉菌素的浓缩液在5℃条件下保持4〜6h后即结晶完全。分离掉母液、洗涤、干燥、磨粉后即得到制霉菌素成品。(2)利用等电点结晶：当将某一抗生素溶液的pH调到等电点时，它在水溶液中溶解度最小，则沉淀析出。如6-氨基青霉烷酸(6-APA)水溶液当PH调至等电点(4.3)时，6-APA即从水溶液中沉淀析出。(3)加成盐剂结晶：在抗生素溶液中加成盐剂(酸、碱或盐类)使抗生素以盐的形式从溶液中沉淀结品。例如在青霉素G或头泡菌素C的浓缩浓中加入醋酸钾、即生成钾盐析出。(4)加入不同溶剂结晶：利用抗生素在不同溶剂中溶解度大小的不同，在抗生素某一溶剂的溶液中加入另一溶剂使抗生素析出。如巴龙霉素具有易溶于水而不溶于乙醇的性质。在其浓缩液中加入10〜12倍体积的95%乙醇，并调PH至7.2〜7.3使其结晶析出。重结晶是进一步精制以获高纯度抗生素的有效方法。3、其他精制方法(1)共沸蒸镭法：如青霉素可用丁醇或醋酸丁酯以共沸蒸镭进行精制。(2)柱层析法：如丝裂霉素A、B、C三种组分可以通过氧化铝层析来分离。

102(3)盐析法：如在头也曝吩水溶液中加入氯化钠使其饱和，其粗晶即被析出后进一步精制。(4)中间盐转移法：如四环素碱与尿素能形成复盐沉淀后再将其分解，使四环素碱析出。用此法以除去4-差向四环素等异物，以提高四环素质量和纯度，又如红霉素能与草酸或乳酸盐或复盐沉淀等。(5)分子筛：如青霉素粗品中常含聚合物等高分子杂质，可用葡聚糖凝胶G-25(粒度20〜80Hm)将杂质分离掉。此法仅用于小试验。第四节B-内酰胺类抗生素一、概述(-)6-内酰胺类抗生素特性和作用机制1、结构特性这类抗生素都含有一个四元内酰胺环，并通过氮原子和相邻的碳原子和另一个杂环相稠合，这两个杂环可以是五元环也可以是六元环。它们结构上的共同特点是：①与内酰胺环中氮原子相邻的碳原子上有一竣基；②与内酰胺环中氮原子相对的碳原子上有一竣基。按一种简化的方法可将未取代的两个稠环系统，分别称为青核(penam)与头核(cepham),于是青霉素可称为6-酰胺-2-二甲基青核-3-竣酸。头也菌素可称为3-乙酰氧甲基-7-酰胺头核-4-竣酸。2、物理性质3、化学性质B-内酰胺类抗生素通常很活泼，它们的化学性质大都和B-内酰胺环有关，由于为稠环系统，故环的应力增加，因而反应性能更强。在很多情况下，内酰胺环中埃基的反应性能和竣酸酎相似，很易被亲核试剂和亲电试剂作用，使内酰胺环打开而失去活性。与青霉素相比头顶菌素较不易发生开环反应，如醇能很快和青霉素的B-内酰胺环起作用，但头抱菌素较稳定，故可以把甲醇作为重结晶的溶剂。头孑包菌素对酸也较稳定。

1034、作用机制B-内酰胺类抗生素的作用机制是通过抑制肽聚糖转肽酶及D-丙氨酸竣肽酶的活性抑制肽聚糖合成，从而干扰细胞壁合成。这种干扰是不可逆的，且杀菌浓度和抑菌浓度很接近。由于动物细胞没有细胞壁，更不含肽聚糖结构，因而对动物细胞的合成没有影响。这种优良的选择性毒性，使内酰胺类抗生素成为一类高效、安全的抗细菌感染药物。（二卜发展概况1929年，英国的Fleming发现了青霉素；1940年，Florey和Chain等提取得到青霉素结晶；1945年，意大利的Brotzu发现一株顶头抱霉，并证明它的代谢产物具有广谱抗细菌作用。1953年，Abraham从这一霉菌的发酵液中分离得到头抱菌素C；1958年青霉素母核6-氨基青霉烷酸（6-APA）和1960年头抱菌素C母核7-氨基头抱霉烷酸（7-ACA）的发现，使青霉素和头泡菌素的侧链改造成为可能。发现头泡菌素20多年之后，又先后发现了头霉素、克拉维酸、硫霉素、单环B-内酰胺等一系列具有不同于青霉素和头顶菌素母核的新型8-内酰胺抗生素（见表4-2）o（三）、临床应用的主要8-内酰胺抗生素及其生物活性1、青霉素：芾青霉素（青霉素G）和青霉素V（苯氧甲基青霉素）是仅有的直接用于临床的天然8-内酰胺抗生素。它们对革兰阳性细菌有很强的抗菌活性，而对革兰阴性细菌无活性，容易受B-内酰胺酶作用失活而对耐药菌无效。通过侧链的化学改造，可获得一系列广谱、甚至对绿脓杆菌有效或耐B-内酰胺酶的半合成青霉素。2、头泡菌素：典型的天然头顶菌素为头抱菌素C和7a-甲氧头抱菌素C（头霉素C）。它们都具有广谱抗细菌作用，且对青霉素酶稳定；后者还能耐受头抱菌素酶。由于天然物的抗菌活性不高，或抗菌谱不够理想，故临床上应用的都是

104它们的半合成衍生物。（头也力行、头也他咤）3、新型B-内酰胺：碳青霉烯对革兰阳性和阴性细菌有广谱抗菌活性，并对不B-内酰胺酶高度稳定；单菌胺它对革兰阴性细菌有很强的活性，对B-内酰胺酶高度稳定，但对革兰阳性细菌和厌氧菌的活性较弱。克拉维酸它本身的抗菌活性很弱，但有很强的B-内酰胺酶抑制活性，与对B-内酰胺酶敏感的B-内酰胺抗生素合用有很好的协同作用。二、青霉素（一）、天然存在的青霉素青霉素是一族抗生素的总称，当发酵培养基中不加侧链前体时，会产生多种N-酰基取代的青霉素混合物，它们合称为青霉素族抗菌素。其中以革青霉素（青霉素G）疗效最好，应用最广。如不特别注明，通常所谓青霉素即指苇青霉素。青霉素V对酸稳定，在胃酸中不会被破坏，可口服给药。青霉素是一种杀菌力强、毒性小、应用广的抗生素，一般剂量使用一年以上或者一天静脉滴注1亿单位时皆无明显毒性反应；肾功能不全者按常用剂量使用也不致引起蓄积中毒。（二）、青霉素的理化性质1.稳定性干燥纯净的青霉素盐很稳定，国产青霉素钾盐和普鲁卡因盐的有效期都规定在三年以上。并且对热稳定，如结晶的青霉素钾盐在150c加热1.5h,效价也不降低。因此，利用此性质，结晶青霉素可进行干热灭菌。但青霉素的水溶液则很不稳定，受pH值和温度的影响很大。2.溶解度青霉素游离酸在水中溶解度很小，易溶于有机溶剂如醋酸乙酯、苯、氯仿、丙酮和酸中。而青霉素钾、钠盐易溶于水和甲醇，可溶于乙醇，在丙醇、丁醇、丙酮、醋酸乙酯、毗咤中难溶或不溶。

1051.降解反应2.紫外吸收光谱青霉素G钠盐的紫外吸收光谱见图4-7,在252nm,257nm,264nm有弱的吸收峰，这三个吸收峰由苯乙酰基所引起。钠盐水溶液在室温放置，由于分解生成青霉烯酸，在320nm呈吸收峰。而对羟基苇青霉素和青霉素的降解产物青霉嚷咏酸的同分异构体——青霉胺缩醛酸，在280nm呈吸收峰。所以规定青霉素G钾（钠）盐的优级品在280nm和320nm处的消光系数E0.188%1cm不能高于0.05o3.过敏反应青霉素过敏反应的过敏原是制剂中高分子杂质。青霉素乃是由B-内酰胺和曝理二个环组成的小分子药物，它本身没有抗原性，不能直接引发过敏反应。青霉素过敏原主要是青霉素与蛋白质、多肽等的结合物，其分子上含有二个以上青霉曝哇基团，就可以引发过敏休克反应。研究表明杂质平均在21.44ug/g时，过敏反应率为0.2%；杂质平均在51.24ug/g时，过敏反应率为0.43%；杂质平均在76.7ug/g时，过敏反应率为0.74%0口服青霉素的高分子杂质经过胃肠道时，吸收极少，而注射用青霉素是直接进入血液之中的，所以口服青霉素过敏的反应率远低于注射用青霉素，比较容易达到免皮试的标准。在英国、美国，注射用青霉素和口服青霉素在临床使用中都不作皮试。其原因有两点：一是国外医药学专家对皮试效果存在争论。皮试中可能出现的假阳性结果会令患者不敢使用青霉素，从而耽误治疗，而且假阳性发生率与未作皮试的过敏发生率大体相当。二是这些国家的制药工艺和技术要求高，生产时高分子杂质含量的实际控制已经达到免皮试水平。减少青霉素过敏反应的关键是提高产品纯度。(三)、青霉素的发酵生产

1061、菌种及菌种保藏菌种：常用菌种为产黄青霉素chrysogenuin)o当前生产能力可达30000〜60000u/mLo按其在深层培养中菌丝的形态，可分为球状菌和丝状菌。保藏：青霉素生产菌种一般在真空冷冻干燥状态下，保存其分生也子。也可以用甘油或乳糖溶液作悬浮剂，在-70C冰箱或液氮中保存抱子悬浮液或营养菌丝体。对冷冻营养菌丝体进行保存可避免分生也子传代时可能造成的变异，一般来说，分生泡子传代比菌丝传代更容易发生变异。2、发酵工艺3、培养基(1)碳源：青霉素能利用多种碳源和乳糖、蔗糖、葡萄糖等。目前普通采用淀粉经酶水解的葡萄糖糖化液(DE值50%以上)进行流加。(2)氮源：可选用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或效质粉，并补加无机氮源。(3)前体：为生物合成含有苇基基团的青霉素G,需在发酵中加入前体如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它们对青霉菌有一定毒性，故一次加入量不能大于0.1%,并采用多次加入方式。(4)无机盐：包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。铁离子对青霉菌有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含量在30ug/mL以下。4、发酵培养控制(1)青霉素产生菌生长发育可分为下面六个阶段：I期：分生抱子发芽。抱子先膨胀再形成小的芽管，此时原生质未分化，具有小空抱。II期：菌丝繁殖，原生质嗜碱性很强，在II期末有类脂肪小颗粒。山期：形成脂肪粒，积累贮藏物。原生质嗜碱性仍很强。w期：脂肪粒减少，形成中、小空孑包子。原生质嗜碱性弱。

107v期：形成大空也子其中含有一个或数个染色的大颗粒。脂肪粒消失。VI期:细胞内看不到颗粒，并出现个别自溶的细胞。其中I〜w期初称菌丝生长期。产生青霉素较少，而菌丝浓度增加很多。山期适于作发酵用种子。w〜v期称青霉素分泌期，此时菌丝生长趋势渐减弱。大量产生青霉素。VI期即菌丝自溶期，菌体开始自溶。(2)加糖控制：加糖的控制系根据残糖量及发酵过程中的pH。或最好是根据排气中CO2及。2量来控制。一般在残糖降至0.6%左右上升时开始加糖。(3)补氮及加前体：补氮是指加硫酸筱、氨或尿素，使发酵液氨氮控制在0.01%〜0.05%o补前体以便发酵液中残余苯乙酰胺浓度为0.05%〜0.08%。(4)PH控制：对PH的要求视不同菌种而异，一般为6.4〜6.6。可以加葡萄糖来控制pH。当前趋势是加酸或碱自动控制pH。(5)温度控制：一般前期25〜26C,后期23c以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。(6)通气与搅拌：抗生素深层培养需要通气与搅拌，一般要求发酵液中溶解氧浓度不低于30%饱和度以下。通气比一般为1:0.8V7V/m(每n?发酵液每分钟通入的空气在0.8m3)o搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。(7)泡沫与消沫：在发酵过程中产生大量泡沫。可以用天然油脂如豆油、玉米油等或用化学合成消沫剂“泡敌”(环氧丙烯环氧乙烯聚酸类)来消沫。应当控制其用量并少量多次加入，尤其在发酵前期不宜多用。否则，会影响菌的呼吸代谢。(四)、青霉素生物合成与理论产量1、前体氨基酸的生物合成(1)a-氨基己二酸的生物合成1.5葡萄糖+NH3+0.5ADP+0.5Pi+6NAD+►a-氨基己二酸+3CO2+0.5ATP+6NADH(I)

108(2)缀氨酸的生物合成3.22葡萄糖+3NH3+SO42-+苯乙酸+3.840,青霉素G+6-氧氢化毗咤-2-羟酸+5.34CO2(VII)这里，假定转酰基反应脱落的a-氨基己二酸不被循环使用，而是环化生成副产物6-氧氢化毗咤-2-羟酸，并认为这种环化反应不发生能量转移。事实上，这一副产物在青霉素G和青霉素V发酵中都已大量检出，检出量约为青霉素的30%〜40%(摩尔分数)。数据提示，可能有60%多的a-氨基己二酸被循环使用。由此得出相对于葡萄糖、氨、苯乙酸和氧的两种可能的青霉素理论生产得率如表4-11所列。葡萄糖+NH3+0.5ATP►缴氨酸+CO2+0.5ADP+0.5Pi(II)(3)半胱氨酸的生物合成0.5葡萄糖+N%十SCV-+12.5ATP+4NADH+FAD►半胱氨酸+AMP+PAP+10.5ADP+9.5n+2PPi+4NAD++BFADH2(III)2、青霉素的合成(1)由3个前体氨基酸及侧链前体苯乙酸生物合成青霉素G半胱氨酸+缴氨酸+a-氨基己二酸+苯乙酸+4ATP+NADP++FAD►青霉素G+6-氧氢化毗咤-2-羟酸+4AMP+4PPi+NADPH+FADH2(IV)(2)青霉素G生物合成的总化学式3葡萄糖+3NH3+SCV-+苯乙酸+15.5ATP+3NAD++2FAD►青霉素G+6-氧氢化毗咤2羟酸+4CO2+PAP+5AMP+6PPi+9,5ADP+8.5Pi+3NADH+2FADH2(VI)3、青霉素的理论生产得率p69

1093.22葡萄糖+3NH3+SO42-+苯乙酸+3.8402►青霉素G+6-氧氢化毗咤-2-羟酸+5.34CO2(VII)这里，假定转酰基反应脱落的a-氨基己二酸不被循环使用，而是环化生成副产物6-氧氢化毗咤-2-羟酸，并认为这种环化反应不发生能量转移。事实上，这一副产物在青霉素G和青霉素V发酵中都已大量检出，检出量约为青霉素的30%〜40%(摩尔分数)。数据提示，可能有60%多的a-氨基己二酸被循环使用。由此得出相对于葡萄糖、氨、苯乙酸和氧的两种可能的青霉素理论生产得率如表4-11所列。(五)发酵液的过滤和预处理发酵液放罐后，首先要冷却，因为青霉素在低温时比较稳定，同时细菌繁殖也较慢，可避免青霉素迅速破坏。发酵液除冷却外还需进行预处理，如果发酵液不经处理而直接过滤，虽然能除去大部分不溶性固体杂质，但在滤液中还会剩余一部分微小颗粒和易溶性蛋白质等物质，滤液外观是混浊的，假若不除去这部分杂质，会给后步提炼带来很大困难，为了要除去这部分杂质，所以要对发酵液进行预处理。（六）、青霉素的提取和精1、工艺流程2、影响青霉素提取的主要因素青霉素提取效果除了已选定适当的有机溶媒、破乳化剂和离心分离设备外，还与下列主要因素有关：（1）＞pH值。青霉素在各种pH下的稳定性（见表4-4）和青霉素在醋酸丁酯及水中的分配系数以及青霉素的pK值（25℃时为2.76）,从滤液萃取到醋酸丁酯时，pH选择在1.8〜2.2范围，而从丁酯反萃取到水相时，pH选择在6.8〜7.2之间。青霉素在酸性条件下极易水解破坏，生成青霉素酸，但根据pK值要求，又一

110定要在酸性时才能转移到有机溶媒中去，这是个矛盾，因此选择合适的pH非常重要。目前生产上采用上述pH值，转移比较完全，而破坏又较少，因此收得率尚高；青霉素从有机溶媒转移到水中时，选择上述pH值也较适宜。因为在中性条件下青霉素以成盐的形式溶于水中，转移也较完全。如果碱性过强，则易发生碱性水解，而且杂质也易转到水相中，质量也较差。（2）、温度根据表4-4温度对青霉素稳定性的影响，因此要求提取在低温（一般要求在10℃以下）条件下进行较为有利。在提取设备上要考虑用冷盐水（夹层或蛇管）进行冷却，以降低温度，特别是酸化岗位，温度要求更低些。（3）、时间除严格控制pH和低温条件外，青霉素在提取过程中停留的时间越短越好。因此要求操作熟练，设备良好，不发生故障。酸化提取时速度应快些，数秒钟液体充分混合后应立即分离，使青霉素游离酸尽快地转移到醋酸丁酯中（因为青霉素游离酸在丁酯中比青霉素盐类在水中要稳定得多）。青霉素0〜15C,在丁酯中放置24小时不致损失效价（但在室温下损失可达5.32%）。碱化提取时速度可放慢些，因为青霉素在中性条件下半衰期要长些，破坏情况要缓和些，故以能分离得清为原则。（4）、萃取方式和浓缩比。根据萃取方式及理论收得率计算得知，多级逆流萃取较理想。目前生产上常采用二级逆流萃取方式。浓缩比的选择也很重要，因为丁酯的用量与收率和质量都有关系。如丁酯用量太多，虽萃取较完全，收率高，但达不到结晶浓度要求，反而增加溶媒的耗用量；如丁酯用量太少，则萃取不完全，影响收率。据国外报道，丁酯用量为滤液体积的25%〜30%时，色素相对含量低，青霉素

111的纯度最高，称之为丁酯用量的最佳条件。目前生产上从滤液萃取到丁酯时,浓缩比为1.5〜2.5倍，即一次丁酯萃取液的浓缩倍数为1.5〜2.5倍。从丁酯反萃取到水相时，因分配系数之值较大，故浓缩倍数可较高些，一般为3〜5倍。经过几次反复萃取后共约浓缩10倍左右，浓度已符合结晶要求。3、青霉素的结晶结晶是提纯物质的有效方法。例如在第二次丁醋萃取液中，青霉素的纯度只有70%左右，但结晶后纯度可提iWj至98%以上。以青霉素钾盐结晶为例说明：青霉素游离酸在有机溶媒中的溶解度是很大的，但是它与某些金属或有机胺结合成盐之后，由于极性增大，溶解度大大减小而且自溶媒中析出。它和醋酸钾化学反应式如下:^CHzCONHCH-CH111GH3+CH3COOK-0=C-N-CHCOOH青霉素^^CHzCONHCH-CI^C〈C?I3+CH3COOHO=C-N-CHCOOK青霉素钾盐(1)水分的影响反应液中水分可以溶去一部分杂质，可提高晶体质量，但收率要下降，因此水分应控制在0.9%以下，则影响收率较少。同时要求乙醇-醋酸钾溶液配制的水分应控制在9.5%〜11%范围内，醋酸钾浓度在46%〜51%范围内，应注意醋酸钾浓度高低与水分含量高低成正比较好。

112如果醋酸钾浓度高，而水分含量低，则醋酸钾在配制过程中易析出结晶。如果二次丁醋提取液水分含量低于0.75%以下，加之醋酸钾溶液水分也低，会使晶体包含色素多而色深，影响晶体的色泽。如果配制醋酸钾溶液水分过高(在12%〜12.5%),再加上二次丁醋提取液中水分含量，整个反应母液中总水量增高，就会影响结晶收率。(2)温度的影响温度高时结晶速度快，晶体细小；温度低时结晶速度慢，晶体颗粒粗大。另外反应也与污染数(即污染数=杂酸/青霉素酸)高低有关。一般污染数在0.5%以下，结晶温度控制在10〜15℃污染数在0.5%以上，则结晶温度控制在15〜20℃o(3)污染数高低对结晶的影响杂酸与青霉素含量之比值称为“污染数”(即污染数=杂酸/青霉素酸)。总酸量可以氢氧化钠滴定求得，青霉素含量可以旋光法测定，两者之差即表示杂酸含量。上述工艺条件要求污染数在0.5%左右，污染数高会使反应速度降低，生成的晶体略大些结晶收率低；而污染数低使反应速度快，生成的晶体颗粒较小。同时杂酸的存在能污染晶体，影响晶体质量。(4)青霉素与醋酸钾摩尔比关系根据前面反应式知道，1摩尔醋酸钾可以生成1摩尔的青霉素钾盐。但由于反应是可逆的，故采取过量0.1摩尔醋酸钾，使反应朝生成青霉素钾盐方向进行。另外丁醋萃取液中杂酸的存在，要消耗一部分醋酸钾。因此结晶过程中根据污染数多少而决定醋酸钾的加人量，以保证反应能完全进行。如污染数在0.5%左右，则反应时加人的醋酸钾摩尔比是按1:1.6o附乙醇-醋酸钾溶液加人量的计算公式。醋酸钾摩尔分子量C2H3O2K=98,青霉素钾摩尔分子量C16H17N2SK=372.5,设乙醇-醋酸冲含量为50%=0.5kg/L,

113青霉素钾盐效价为1590u/mg,按1:1.6摩尔分子比加人醋酸钾应多少？3A萃取业的效价x5A萃取液体积x98x1.6X-372.5x15904/mgx1000mg/gx1OOOg/kgxO.5kg/L(六)、质量检定

114第五节大环内酯类抗生素一、概述1、大环内酯类抗生素：大环内酯类是由链霉菌产生的弱碱性抗菌素，因分子中含有一个内酯结构的14或16元环而得名，红霉素是本类药物最典型的代表。大环内酯类作用于细菌细胞核糖蛋白体50s亚单位，阻碍细菌蛋白质合成，属于生长期抑制剂。2、共同特点为：①抗菌谱窄，比青霉素略广，主要作用于需氧革兰阳性菌和阴性球菌、厌氧菌,以及军团菌、衣原体和支原体等；②细菌对本类各药间有不完全交叉耐药性；③在碱性环境中抗菌活性较强，治疗尿路感染时常需碱化尿液；④口服后不耐酸，酯化衍生物可增加口服吸收；⑤血药浓度低，组织中浓度相对较高，痰、皮下组织及胆汁中明显超过血药浓度；⑥毒性低微。口服后的主要副作用为胃肠道反应，静脉注射易引起血栓性静脉炎。3、种类：(1)多氧大环内酯(polyoxomactolide)；⑵多烯大环内酯(polyenemacrolide)；(3)葱沙大环内酯(ansamacrolide)。二、红霉素的结构与理化性质1、结构红霉素是由红霉内酯与去氧氨基己糖和红霉糖缩合而成的碱性甘。红霉内酯环含有13个碳原子，内酯环的C-3通过氧原子与红霉糖相联结，C-5通过氧

115原子与去氧氨基己糖相连接。2、物理性质红霉素是一个碱性化合物，能和无机或有机酸类形成在水中溶解度较大的盐类.红霉素碱易溶于醇类、酸、丙酮、氯仿和醋酸乙酯、醋酸戊酯，不甚溶于水，在水中的溶解度与一般合物不同，如：60℃,1.14mg/mL；40℃,1.28mg/mL；19℃,3.10mg/mL；7℃,14.20mg/mL；1℃,15.00mg/mLo红霉素在水中的溶解度是随温度增高而减少，以55℃时为最小,因此工业上利用此性质加温至45〜55℃并保温，使红霉素碱从水中析出结晶。3.稳定性红霉素在干燥状态下是稳定的，结晶在室温下可保藏1年，效价并不降低。在pH=6〜8的水溶液中也很稳定，在4℃下放3星期，效价并不降低。如在室温下，1星期后略有损失，但再经7星期，其效价并不再继续降低。红霉素溶液在60c保持5min并不破坏，但在pH=6〜8范围以外的水溶液，经24h即失效。4.化学性质红霉素在碱性条件下，内酯环易破裂，加酸后，也不再成环。在酸性条件下，背键易水解，经lmol/L盐酸甲醇溶液的温和水解，其中的一个背键即破裂，得到一种碱性物红霉糖胺(erythralosamine)和红霉糖。红霉糖胺再经6mol/L盐酸水解，就得到去氧氨基己糖。三、红霉素的生物合成红霉素是红霉内酯、红霉糖和去氧氨基己糖三部分以背键相连接而成的。1、红霉内酯的生物合成

116红霉内酯是21个碳原子组成的14元内酯环。红霉内酯是由一分子的丙酰CoA和6分子的甲基丙二酰CoA通过丙酸盐头部（-COOH）至中部（C2）的价键重复缩合构成的，其合成过程如图5-5所示。2、糖的生物合成红霉素中的红霉糖和去氧氨基己糖的碳架来源于完整的葡萄糖或果糖。3、红霉素生物合成的最后步骤四、红霉素的生产工艺（一）、生产菌种红霉素链霉菌（二）、发酵工艺及控制要点（三）、提取和精制红霉素是一个碱性化合物，碱性时可溶于有机溶剂中，而在酸性时则能溶于水中。因此，目前主要采用溶剂萃取法来提取，所用溶剂有醋酸丁（戊）酯、二氯甲烷、丙酮等。进行反萃取时酸的提取液，有醋酸缓冲液、磷酸冲缓液，也有用柠檬酸缓冲液。红霉素提取的步骤如下：

117第六节四环类抗生素一、概述四环类抗生素是以四并苯为母核的一类有机化合物。金霉素、土霉素、四环素、地美环素。四环类抗生素可与微生物核糖核蛋白体30S亚基接合，通过抑制氨基酰-tRNA与起始复合物中核蛋白体的结合，阻断蛋白质合成时肽链的延长。四环素、金霉素理论效价均以盐酸盐为标准，土霉素以游离碱为标准，每毫克定为1000单位(U)。1、四环类抗生素的理化性质(1)性状：这类抗生素都是黄色结晶性物质。水中结晶四环素含6个结晶水;含水有机溶剂中结晶得四环素含3个结晶水。水中结晶得土霉素含2个结晶水。(2)光学性质：265nm、350nm有入max。(3)两性性质：能和各种酸、碱形成盐。(4)等电点：等电点pH=5.4。四环类抗生素在pH=4.5〜7.2之间难溶于水，且此pH值范围，其溶解度几乎一定。(5)固体四环类抗生素较稳定。例如金霉素在20c时贮存3〜5年效价并不降低。土霉素在真空下，105℃加热140h,活性仅损失20%。四环素在37c贮存时，生物活性虽不见降低，但其中4-差向脱水四环素含量增加，后者对人体有毒。低温贮存可避免此现象。四环类抗生素的水溶液在不同pH值下的稳定性差别很大。2、化学性质和降解反应(1)脱水化合物：四环类抗生素在弱酸性溶液中很稳定。在较酸的溶液中(pH<2),四环素因6位上的叔羟基易脱落，在5a〜6位上形成双键而破坏。新生成的物质称为脱水四环素(VII)。同样，金霉素也能形成脱水金霉素(VIII)。

118(2)差向化合物：四环素、金霉素和地美环素很易差向化，而土霉素由于C-5上的羟基和二甲胺基形成氢键，因而较稳定。在弱酸性(pH=2〜6)溶液中，不对称碳原子C-4可逆地发生异构化，形成差向四环素(图6-5),生物活性大大降低。当pH<2或pH>9时，差向化速度很小。(3)降解反应：弱碱性(pH=8)溶中，四环素和金霉素的C环打开，转变成无活性的异构化合物(IX和X)。土霉素碱性条件水解生成的异土霉素，进一步水解生成土霉酸(XI)。(4)螯合物与复合物：四环类抗生素还能和其他很多高价金属离子形成螯合物，主要的螯合位置是11,126-二酮系统：螯合物的稳定性次序为：Fe3+>A13+>Cu2+>Co2+>Mn2+>Mg2+O这一性质常用来从发酵液中提取四环素。因二酮系统是酸性集团，故沉淀应在碱性中(pH=8.5〜9.0)进行。四环类抗生素还能和其他物质形成复合物，如硼酸、磷酸、六聚偏磷酸盐、氯化钙等，因此四环类抗生素在制备过程中容易夹带杂质。四环素和尿素能形成等摩尔复合物C22H24N2OxCO(NH2)2,不溶于水(在水中溶解度约为300U/ml)。当溶于有机溶剂时，复合物即分离成四环素和尿素。四环素与尿素的反应具有特异性。尿素和金霉素、土霉素、差向四环素、脱水四环素等都不能形成沉淀而自水中析出，这一性质常用来精制四环素。(5)颜色反应：四环类抗生素均能与氯化锌起颜色反应。即将50%氯化锌溶液2毫升加热蒸发到形成薄膜后加人微量四环类抗生素，并继续加热1分钟，即产生特异的颜色反应。如将此残渣余物溶于乙酸中，则金霉素呈深红色；四环素呈黄色;土霉素呈紫色。此颜色反应可用于三种四环类抗生素的鉴别。四环类抗生素在酸性溶液中能与三氯化铁作用产生棕黄色，此反应也可用作四环类抗生素含量测定的依据。

119二、四环素的发酵工艺四环素和金霉素的产生菌相同，四环素仅是从产生金霉素的菌种在特定的培养条件下产生95%以上的四环素。这个特定培养条件即通过培养基中除去氯离子或加人某种抑氯剂，使氯原子不能进人分子结构，最后获得四环素。生产上采用的抑氯剂如嗅化钠和M-促进剂（2-筑基苯余并睡哇）。（一）、菌种最早的金霉素菌种是1948年发现的金色链霉菌。随后陆续发现许多能产生金霉素和四环素的菌株，经不断选育，特别重视筛选方法等的研究及诱变因子的选择，结合工艺改进-----由稀配方至浓配方及通氨等，发酵单位可达每毫升三万以上。抗噬菌体菌株的选育成功和使用，可在污染噬菌体的情况下避免停产。土霉素的产生菌与金霉素、四环素不同，土霉素是龟裂链丝菌在发酵过程中的产物。（二）四环素发酵工艺及过程1、发酵工艺流程2、种子培养3、发酵培养基种子培养基，一般以蛋白月东、花生饼粉、淀粉等为主要成分，于30〜32℃,经24〜27h培养即可成熟。培养液因菌丝浓度增长呈稀糊状，带有微量气泡，碳源、氮源明显被利用，培养液色泽由灰色转为淡黄色，总效价200u/ml左右。此时氨基氮及pH下降，即可移入发酵罐。一般认为菌丝年轻较好。(1)氮源：目前通用的四环素发酵培养基是以黄豆饼粉、花生饼粉、蛋白陈、酵母粉、玉米浆为有机氮源，硫酸镂及氨水为无机氮源。(2)碳源：生产上曾以单糖-葡萄糖、双糖-饴糖及多糖-釉米粉、玉米粉及淀粉酶解液作为四环素发酵的主要碳源。

120(3)抑氯剂。为了抑制氯原子进入四环素分子结构、减少金霉素的含量，一般加入溟化钠作为竞争性的抑氯剂，由于它的抑氯效果不高，通常还加入M-促进剂(2-筑基苯并曝唾)作抑氯剂，在与澳化钠的协同作用下，使金霉素在总产量中低于5%。由于生产中加强了监控，发酵过程在补料中添加抑氯剂，使金霉素的含量可控制在2%以下。p91(4)无机盐：①磷酸盐：金色链霉菌，它能循己糖代谢旁路和酵解途径利用糖类，而其代谢方向视磷酸盐的浓度而转移。抗生素的产生与己糖代谢支路有关，磷酸盐浓度增加促进糖酵解过程，导致菌丝生产力的增加和丙酮酸的积聚，可是相反会抑制己糖代谢支路的进行，降低四环素的产量。过高磷酸盐浓度可以引起糖耗加速，前期单位增长很快，进入中期后增长率明显下降，甚至停滞不前，菌丝畸形。磷酸盐浓度过低时，使代谢速度缓慢，发酵单位亦低。根据玉米浆的使用量控制无机磷的加入量(磷酸二氢钾)，一般为0.01%〜0.02%。②碳酸钙：加入0.4%〜0.5%碳酸钙作缓冲剂，要求氧化钙含量低于0.05%。在四环素培养液中它还起络合剂的作用，使菌丝分泌出的四环素与钙离子络合成水中溶解度很低的四环素钙盐，从而在水中析出，降低了水中可溶性四环素的浓度，促进菌丝体进一步分泌四环素。③硫酸镁：加入硫酸镁(一般为0.002%),起激活酶的作用。4、培养条件的控制(1)通气和搅拌：一般通气量控制在l.Ov/v/m。⑵温度：前期高于后期，采用31℃〜30℃〜29℃的工艺条件。前期温度较高有利于金霉菌的生长繁殖，后期降温是为了减缓产生菌的代谢速度，使菌丝自溶期延迟。

121(3)通氨：前期要求pH较高，后期较低。0小时PH=6.0±0.1；50小时PH=5.9±0.1；150小时PH=5.8±0.1；放罐前6小时停止加氨的工艺。(4)加糖：根据发酵液的残糖值加入混有少量有机氮源和抑氯剂的淀粉酶解液。要求0〜100小时的发酵液残糖在5.5%〜5.0%,100小时后残糖在4.5%〜4.0%,放罐时控制残糖在2.5%左右。5、染菌及异常情况处理(1)经无菌试验确定染菌后应立即采取降温培养，一般为28C。根据发酵液的滤速采取其它措施，如加泡敌等。若滤速急剧下降则应加入甲醛灭菌，停止搅拌,将罐温尽量降低，并调度过滤提取。(2)发酵中pH高于6.2时可加葡萄糖或硫酸镂，以使pH下降。(3)在发酵80~90小时检定出发酵液中金霉素含量超过5%时，即补加抑氯剂澳化钠和M-促进剂，以保证放罐发酵液的金霉素含量低于5%。(4)遇发酵液转红、发酸，可以一次补入大量淀粉酶解液。(5)若出现噬菌体污染，必须将染噬菌体的发酵液加热到80C以上才可放人下水道，同时在发酵车间内外和设备等喷洒漂白粉，对滤渣要及时运走，防止噬菌体的宿主存于厂内。三、四环素的提取和精制1、四环素碱的工艺流程2、盐酸四环素的工艺流程3、去除差向异构物的方法(1)制成尿素复盐转四环素盐酸盐：四环素碱和尿素能形成复合物［C22H24N2(VCO(NH2)2］沉淀，此复合物几乎不溶于水，而金霉素、土霉素、差向四环素、脱水四环素等都不能和尿素形成沉淀。

122(2)制成氯化钙复合物：四环素与氯化钙形成复合物［(C22H24M。8)4口。2］析出。而差向四环素和氯化钙的复合物溶于酸水中，分出结晶。晶体在足量的水中搅拌就分解出四环素碱，得到的四环素碱含差向四环素较少(2%左右)。(3)制成甲酰复合物：四环素三水化合物粗晶25g,溶于甲酰胺150ml中，结晶2h,过滤，甲酰胺30ml及异丙醇100ml洗涤，结晶悬浮于300ml水中，搅拌lh,过滤、水洗、抽干，37c干燥24h,得含6个结晶水四环素15g,产品金霉素为微量，紫外测定脱水四环素和差向四环素不明显。

123第七节氨基糖玳类抗生素一概述氨基糖背类(aminoglycosides)抗生素是由氨基环醇(aminocyclitol)＞氨基糖(aminosuger)和糖组成的抗生素的总称。(一)、氨基糖甘类抗生素的应用(1)具有抗结核杆菌作用的氨基糖甘：天然产物，链霉素、卡那霉素。(2)具有抗脓绿杆菌活性的氨基糖甘：天然产物，庆大霉素。半合成品，阿米卡星、。(3)抗革兰阳性菌与阴性菌，不抗结核杆菌与绿脓杆菌的氨基糖甘：天然产物，核糖霉素、卡那霉素B。(4)具有特定用途的氨基糖甘：天然产物，大观霉素(淋病用)、新霉素(局部用)。(二卜氨基糖甘类抗生素的分类1、链霉胭衍生物组这组抗生素都是含有链霉胭结构的衍生物2、2-去氧链霉胺衍生物组这组抗生素是以2-去氧链霉胺(II)为母体所衍生的一类抗生素，根据糖在2-去氧链霉胺上的取代位置和取代数目，此组又分为一取代衍生物，如越霉素、潮霉素A等；4,5-二取代衍生物，如新霉素小组。3、其他氨基环醇衍生物组二链霉素的结构和理化性质(一)、链霉素的结构链霉素或双氢链霉素的效价标准，系以1ug链霉素碱为1个单位

124(二)、链霉素主要理化性质1、物理性质链霉素游离碱为白色粉末。大多数盐类也是白色粉末或结晶，无嗅，味微苦。链霉素分子中有三个碱性基团，其中两个是链霉胭上的强碱性胭基(pK=11.5),第三个是葡萄糖胺上的弱碱性的甲氨基(pK=7.7)。所以，链霉素在水溶液中随pH值不同可能以四种不同的型式存在。当pH值很高时，链霉素成游离碱(Str)形式；当pH值降低时，可逐渐电离成一价正离子(Str-H+)、二价正离子(Str-H22+)；在中性及酸性溶液中，成为三价正离子(Str-H33+)。链霉素在中性溶液中能以三价阳离子形式存在，故，可用离子交换法进行提取。2、稳定性链霉素比较稳定，空气和阳光对干燥粉末的影响不大。含水量为3%的成品，在室温下放置，至少两年无显著变化。但链霉素的游离碱或其盐均易吸收空气中的水分而潮解，潮解后含水量增加，容易分解破坏，稳定性显著下降。此外，成品中含有的杂质对链霉素的稳定性也有影响。3、溶解度链霉素分子中含有很多亲水性基团(羟基和胺基)，故很易溶于水，而难溶于有机溶剂中。链霉素盐酸盐易溶于甲醇，难溶于乙醇，而硫酸盐即使在甲醇中也很难溶解，链霉素硫酸盐在各种溶剂中的溶解度见表7-104、光学性质各种链霉素盐的分子，均含有许多不对称碳原子，故都具有旋光性。链霉素硫酸盐比旋度为[a]25D=-79(l%水溶液)，盐酸盐[a]25D=-86.1(1%水溶液)，氯化钙复盐的[a]25D=-7.6(1%水溶液)，双氢链霉素硫酸盐[a]25D=88.5(1%水溶液)。由此可绘制一定范围的比旋度与链霉素浓度的关系曲线，利用

125这种关系就能直接迅速测得链霉素的浓度，该法在工业生产控制上很有意义。5、链霉素盐类的性质链霉素是一种有机碱，可以和很多无机和有机酸形成盐类。有些盐类不溶于水，如链霉素和一些磺酸、竣酸、磷酸酯等形成的盐类，不溶于水，可溶于有机溶剂中，利用此性质可用溶剂萃取法提取链霉素。也可利用此性质，将链霉素从发酵液中直接沉淀出来。不纯的链霉素通过形成某些盐类，在适当条件下再将盐分解，就能得到高纯度的链霉素。磷乌酸与链霉素形成白色沉淀的反应，可用于定性鉴别试验。6、链霉素的降解反应链霉素链霉胭+链霉二糖胺(Cl3H23O9N)链霉胭+N-甲基-L-葡萄糖胺+麦芽酚麦芽酚遇氯化高铁溶液显紫色，利用这个反应可测定链霉素的效价。7、氧化和还原反应链霉素经温和的氧化或还原作用，分子一般都不会发生裂解。链霉糖是链霉素分子中比较脆弱的一部分，所以，其中所含的醛基受某些氧化剂或还原剂的作用，易发生反应。链霉素被溟水氧化后，就能形成链霉素酸(VIII),其结构见图7-5o它无生物活性。链霉素水溶液在碱性下放置，也会形成此酸。成品中有时也混有链霉素酸。8、醛基反应

126链霉素分子中含有醛基，其中醛基和伯胺发生反应。因为伯胺化合物（如苯甲胺）与链霉素在碱性条件下，能形成席夫（Schiff）碱沉淀。沉淀在水中不易分解,即可同不含醛基链霉胭（杂质1号）等杂质分开，又可在酸性下或用强酸性阳离子交换树脂处理，再分解为链霉素和伯胺。Str-CHO+H2NRStr-CH=N-R（席夫碱）Str-CHO+H2NR（链霉素）经处理，可达到精制链霉素的目的。也可以用胺型树脂代替有机胺试剂进行精制。链霉素与羟胺、半胱氨酸和氨胭反应，能生成无活性的衍生物，其中与羟胺的反应可用于链霉素的无菌试验。其反应式如下：Str-CHO+H2N0HStr-CH=N-OH在中性或弱碱性溶液中，链霉素能和NH3或NH+4作用，生成二链霉胺。二链霉胺对小白鼠的毒性比链霉素约大30〜40倍。所以，毒性较高的链霉素成品中可能含有二链霉胺。三链霉素发酵生产工艺（-）发酵工艺流程四链霉素的提取和精制

127第八节抗生素的应用与质量控制一、抗生素在医疗上的应用1、控制细菌感染性疾病：抗生素的应用使细菌感染已基本得到控制，死亡率大幅度下降，人类寿命明显延长。2、抑制肿瘤生长：抗肿瘤抗生素如多柔比星、博来霉素、丝裂霉素等，在肿瘤化疗中占有重要地位。3、调节人体生理功能：除杀菌、抗肿瘤作用以外某些抗生素的其他生理活性功能正在临床医疗中日益发挥作用，如HMG-CoA还原酶抑制剂，洛伐他汀等的应用，可有效地降低心血管病人的血脂。4、器官移植：免疫抑制剂环抱素的使用，使异体器官移植得以顺利进行。5、控制病毒性感染：抗病毒类抗生素，自1990〜1999年已报道研究的有258个，占同时期所报道微生物活性化合物（5824个）的4.43%。在各种抗病毒抗生素的化学结构中，以核甘类、醛类及大环内酯类较多，其他糖甘类及芳香族衍生物类也不少，说明微生物是筛选抗菌物质的主要来源。目前，感染性疾病仍然是发病率较高并且是造成死亡的重要疾病之一。虽然目前临床上绝大多数的感染性疾病可被控制，但深部真菌感染的治疗仍缺乏毒副反应低的有效杀菌药物，更需要确切有效的防治病毒感染的抗生素。二、抗生素在农牧业中的应用1、用于植物保护：抗生索越来越广泛地应用于植物保护。如：用链霉素防治柑橘溃疡病；链霉素与代森锌（一种化学农药）合用防治白菜软腐病、霜霉病和孤丁病；链霉素和硫酸铜混合使用防治黄瓜霜霉病，同时对白菜和黄瓜有刺激生长的作用，产量显著提高。抗生素比有机合成农药喷撤浓度低而疗效高，并易被土壤微生物分解，不致污染环境，对食品的危险性小，不会在人体内积累，所以根有发展前途。

1282、促进或抑制植物生长：有些抗生素可用作植物生长激素，如赤霉素等；有些具有选择性除草作用，如茴香霉素、东洋卡霉索（丰加霉素，）等。我国已能生产的农用抗生素有效霉索（井冈霉素）、春雷霉素、杀稻瘟霉隶S、多氧霉素、杀粉蝶素、沙利霉素，庆丰霉素和赤霉素等。世界各国都十分重视研究开发高效低毒的农用抗生素与植物生长激素。三、在畜牧业上的应用1、用于禽畜感染性疾病控制：绝大部分医用抗生素也能有效地用于治疗禽畜的感染性疾病，如青霉素、链霉素、金霉素、土霉素、四环素、杆菌肽、多黏菌素、卡波霉素与红霉素等用于治疗细菌、立克次体性疾病。2、用作饲料添加剂：可刺激禽畜生长（如四环素与大环内酯等类抗生素），沙利霉素还用作抗鸡球虫病的饲料添加剂。为了防止人畜交叉感染，耐药菌的散播和畜、禽以及水产品中抗生素残留量过高，20世纪70年代国际上已规定不允许将医用抗生素用作饲料添加剂。理想的饲料添加抗生素应具有下列条件：①与医用抗生素结构类型不同，作用机制相似；②体内不吸收，在肉、乳、蛋中没有蓄积残存。四、在食品保藏中的应用用于肉、鱼、蔬菜、水果等食品的保鲜；用作罐装食品的防腐剂。为避免耐药菌产生，现已趋向于少用或不用医用抗生素作为食品的保鲜和防腐。在食品保藏中，用作保鲜剂与防腐剂的条件为：①非医用抗生素;②易溶于水，对人体无毒；③不损害食品外观与质量。五、在工业上的应用

1291、工业制品的防霉防止纺织品、塑料、精密仪器、化妆品、图书、艺术品等发霉变质。2、提高特定发酵产品的产量如向谷氨酸发酵液中，加入适量青霉素，可提高细菌细胞膜的渗透性，有利于胞内谷氨酸的渗出，提高谷氨酸发酵的产酸水平。六、在科学研究中的应用1、用作生物化学与分子生物学研究的重要工具：如用于干扰或切断蛋白质、RNA、DNA等在特定阶段的合成；抑制特定的酶系反应等。2、用于建立药物筛选与评价模型：如利用链佐星（链胭菌素）建立糖尿病动物试验模型等。3、其他试验应用：用于防止细胞培养、组织培养的污染；用于动物精液、组织液等的保存等。七、抗生素应用应注意问题1、什么是抗生素滥用凡超时、超量、不对症使用或未严格规范使用抗生素，都属于抗生素滥用。医学界流行一句话说，在美国买枪很容易，但买抗生素却很难。而中国正好相反。世界军医会议召开期间，美国陆军卫生部长问我国的一位博士，听说第三代头也在中国谁都可以买，到处可以开，是这样吗？在美国这是不可能的。美国对抗菌药物控制很严格，定期考核医生的抗菌药知识，不及格者将停止其处方权。目前，中国的门诊感冒患者约有75%应用抗生素，外科手术则高达95%。世界卫生组织调查显示，中国住院患者抗生素药物使用率高达80%,其中使用广谱抗生素和联合使用两种以上抗生素的占58%,远远高于30%的国际水平。

1302、抗生素与病菌耐药性的赛跑从细菌的耐药发展史可以看出，在某种新的抗生素出现以后，就有一批耐药菌株出现。开发一种新的抗生素一般需要10年左右的时间，而一代耐药菌的产生只要2年的时间，抗生素的研制速度远远赶不上耐药菌的繁殖速度。于是医生一边加大用药剂量，研究者一边研究新药。更先进的抗生素不断发明，细菌的耐药性同时飞快增强。一场抗生素和细菌耐药性的赛跑始终在进行着。有远见的医学界人士担心，有朝一日病菌耐药性“进化”速度超过抗生素的研制速度，我们又将回到抗生素诞生前的黑暗岁月。3、“洁身自好”有用吗？有人说，自己和家人都尽量避免使用抗生素，因此耐药菌不会在自己身上形成。然而，事实远比这种一厢情愿的想法残酷。时至今日，国人几乎生活在一个无处不有抗生素。因此无处不有耐药菌的环境中。“洁身自好”并不能保证自己不成为抗生素滥用的受害者。我们吃的粮食、蔬菜、肉类、乳品乃至医院的空气中，都因为抗生素的滥用，充满了抗生素和耐药菌。这些耐药菌通过饮食、呼吸进入了我们的身体。人类本身成了一个耐药菌库。一旦发生细菌感染，即使从来没有使用过抗生素药物的人，同样可能面临抗生素治疗束手无策的局面。4、走出使用抗生素的9个误区误区1:抗生素=消炎药误区2：抗生素可预防感染误区3：广谱抗生素优于窄谱抗生素误区4：新的抗生素比老的好，贵的抗生素比便宜的好误区5：使用抗生素的种类越多，越能有效地控制感染

131误区6：感冒就用抗生素误区7：发烧就用抗生素误区8：频繁更换抗生素误区9：一旦有效就停药八、抗生素质量控制抗生素类药物的质量分析主要是利用生物学、物理学、药理学和化学等相关学科的经典的或现代的新技术、新方法按照国家药典、部颁标准或企业标准进行依法检验。无论哪一级标准，基本都由四方面组成：①性状描述；②鉴别试验；③一般项目检查；④含量测定。（一）、牲状（二）、鉴别试验（三）、一般项目检查（四）、含量（效价单位）测定（五）、抗生素质量的综合分析一般项目检查p431.酸碱度2.熔点3.比旋度4.溶液的澄清度与颜色5.干燥失重或水分6.炽灼残渣及重金属7.异常毒性8.热原

1321.降压物质2.无菌试验11、杂质12.溶出度13.注射用抗生素中不溶性微粒

133第九节现代生物技术在抗生素工业中的应用目前在生物制药的生产中，用传统的发酵法生产的药品仍占有较大的比例，其中以抗感染的抗生素最为突出。传统的抗生素发酵，采用经典方法育种，盲目性高，且无法集合不同菌株的优良性状。而基因重组技术可以定向的改造菌种，且能集多个菌株的多种优良性状于同一菌株，达到简化工艺、提高产品质量和产量的目的。因此，积极采用现代生物技术，加速传统发酵工业的改造，提高生产技术水平，以增加新品种，提高产品产量和质量，节约能源和原料，减少污染，是我国生物制药产业当前的重要任务。随着已知抗生素数量的不断增加，用传统的常规方法来筛选新抗生素的概率越来越低。为了能够获得更多的新型抗生素和优良的抗生素产生菌，20世纪80年代人们就开始把重组DNA技术应用于结构比较复杂的次级代谢产物的生物合成上，使得重组技术在筛选新微生物药物资源和药物的微生物代谢修饰中得到了应用。生物技术对抗生素的改造主要体现在：利用基因重组技术，提高现有菌种的生产能力和改造现有菌种使其产生新的代谢产物。抗生素生物合成基因重组的主要内容包括生物合成酶基因的分离、质粒的选择、基因重组与转移、宿主表达等。一、基因工程操作技术二、克隆抗生素生物合成基因的方法(p111)①阻断变株法；②突变克隆法；③直接克隆法；④克隆抗生素抗性基因法；

134⑤寡核甘酸探针法；⑥同源基因杂交法；⑦在标准系统中克隆检测单基因产物法。三、几种典型的抗生素生物合成基因的结构抗生素是由初级代谢产物经过一系列酶催化生的次级代谢产物，其形成是一个复杂的、多因素的调节过程。抗生素生物合成基因簇构成了对抗生素产生的最低水平的调节和控制，所以，必须了解所有与抗生素生物合成有关的基因。1.红霉素大环内酯类抗生素生物合成基因研究最清楚的是红霉素。参与红霉素生物合成的基因长度约为60kb,整个基因由23个ORF组成，红霉素生物合成途径及其基因组成见图8-2。中心部分约为35kb,称为eryA,由3个ORF(eryAI、eryAIKeryAHI)组成，主要参与内酯环的合成。eryF编码细胞色素P450单氧化酶，使6位原子羟基化；“eryB”与“eryC是两组基因，分别与红霉素的形成和红霉内酯环的3-0■红霉糖普化有关，及与红霉糖胺的形成或5-0■红霉糖甘化有关；ery侬码。12羟基化酶。四、提高抗生素产量的方法1.将产生菌基因随机克隆至原株直接筛选高产菌株其基本原理是在克隆菌株中，增加某一与产量有关的基因(限速阶段的基因或正调节基因)剂量，使产量得到提高。这一方法尽管是随机筛选，工作量较大，但如果检测产量的方法比较简便，仍是可以尝试的。2.增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数增加生物合成中限速阶段酶系基因剂量有可能提高抗生素的产量。抗生素生物合成途径中的某个阶段可能是整个合成中的限速阶段，识别位于合成

135途径中的“限速瓶颈"(ratelimitingb。ttleneck),并设法导入能提高这个阶段酶系的基因拷贝数，如果增加的中间产物不对合成途径中某步骤产生反馈抑制,就有可能增加最终抗生素的产量。1.强化正调节基因的作用调节基因的作用可增加或降低抗生素的产量，在许多链霉菌中关键的调节基因嵌在控制抗生素产生的基因簇中，它常常是抗生素生物合成和自身抗性基因簇的组成部分。正调节基因可能通过一些正调控机制对结构基因进行正向调节，加速抗生素的产生。负调节基因可能通过一些负调控机制对结构基因进行负向调节，降低抗生素的产量。因此，增加正调节基因或降低负调节基因的作用，也是一种增加抗生素产量的可行方法。将额外的正调节基因引入野生型菌株中，为获得高产量产物提供了最简单的方法。2.增加抗性基因抗性基因不但通过它的产物灭活胞内或胞外的抗生素，保护自身免受所产生的抗生素的杀灭作用，有些抗性基因的产物还直接参与抗生素的合成。抗性基因经常和生物合成基因连锁，而且它们的转录有可能也是紧密相连的,是激活生物合成基因进行转录的必需成分。因此，抗性基因必须首先进行转录，建立抗性后，生物合成基因的转录才能进行。抗生素的产生与菌种对其自身抗生素的抗性密切相关。抗生素的生产水平是由抗生素生物合成酶对自身抗性的酶所共同确定的，这就为通过提高菌种自身抗性水平来改良菌种、提高抗生素产量提供了依据。五、改善抗生素组分许多抗生素产生菌可以产生多组分抗生素，由于这些组分的化学结构和

136性质非常相似，而且生物活性有时却相差很大，这给有效组分的发酵、提取和精制带来很大不便。随着对各种抗生素合成途径的深入了解以及基因重组技术的不断发展，应用基因工程方法可以定向地改造抗生素产生菌，获得只产生有效组分的菌种以利于下游开发。六、改进抗生素生产工艺抗生素的生物合成一般对氧的供应较为敏感，不能大量供氧往往是高产发酵的限制因素。为了使细胞处于有氧呼吸状态，传统方法往往只能改变最适操作条件，降低细胞生长速率或培养密度。提高供氧水平通常只从设备和操作角度考虑，着眼于提高溶氧水平或气液传质系数，提高发酵罐中无菌空气的通入量，并采用各种各样的搅拌装置，使空气分散，以满足菌体对氧的要求。进入液相的氧分子，需穿过几层界膜，进入菌体后，再经物理扩散，才能到达消耗并产生能量的呼吸细胞器。如在菌体内导入与氧有亲和力的血红蛋白，呼吸细胞器就能容易地获得足够的氧，降低细胞对氧的敏感程度，可以利用它来改善发酵过程中溶氧的控制强度。因此，利用重组技术克隆血红蛋白基因到抗生素产生菌中，在细胞中表达血红蛋白，可望从提高自身代谢功能人手解决溶氧供求矛盾，提高氧的利用率。具有良好的应用前景。在抗生素产生菌中引入耐高温的调节基因，或耐热的生物合成基因，可以使发酵温度提高，从而降低生产成本。七、产生杂合抗生素应用基因工程技术改造菌种，产生新的杂合抗生素，这为微生物提供了一个新的来源。杂合抗生素(hybridantibiotic)是通过遗传重组技术产生的新的抗菌活性化合物。1.不同抗生素生物合成基因重组2.生物合成途径中某个酶基因的突变

1371.在生物合成途径中引入一个酶基因2.利用底物特异性不强的酶催化形成新产物

138第十节抗生素生产销售存在问题和技术上的建议一、抗生素生产销售存在问题1、微生物来源的抗生素平均发酵水平（效价）都没有国外的高，如1997年青霉素工业发酵效价平均不到5万u/ml,国外一般为6〜7万u/ml,最高可达8万u/ml；红霉素3700u/mL国外8000〜10000u/ml；利福霉素国内500u/ml,国外2万u/ml,而且近几年和往年相比，没有大的提高。在染菌问题上不仅没有消灭染菌，而且染菌率还比较高，如1997年青霉素为7.3%,链霉素14.13%。2、抗生素品种至今全部是仿制品，建国以来只有一个自己的创新霉素，由于没有临床价值未工业化生产。至今没有创制的品种在临床应用。国外研究开发一个新药总耗资要6亿美元，我国就没有投入这样大的资金来开发一个全新的抗生素。3、国内用于科研的经费太少，国外一般投入科研的费用占公司总销售额的10%以上，而我国只有1%左右。4、抗生素产量、品种结构的差距。我国抗生素产量虽然列世界前矛，但主要生产的是四环素类抗生素，占了总产量一半以上。国外一些淘汰的品种，我国仍在大量生产，主要是为了出口创汇，把工业污染引入了我国抗生素工业。工业生产的内酰胺类抗生素，除青霉素外，其他品种的产量均不多，新的品种更少，产量也很小。5、B-内酰胺抗生素的主要中间体没有专门的厂家大量生产,技术水平低于国外。有的厂家专门靠进口母核及侧链来发展B-内酰胺抗生素。制备母核用的固定化酶板也从国外进口。总之，内酰胺抗生素的主要中间体如6-APA、7-ACA、7-ADCA及GCLE等仍未大力进行研究开发形成大规模生产力，这方面和国外仍存在着较大的差距。

1396、市场销售力量较薄弱。国外大型公司均有强大的销售力量，有的达数千人之多，分布于世界各主要市场，形成销售网络。在我国市场上由于不正之风大大影响了市场的销售，厂家难于维持和发展生产的状态仍然存在。7、在大城市医院药房为了吃回扣，多收入，大力推销进口药。同时病人中有的病人及家属迷信外国药质量好，因此符合标准的国产药市场不畅。多数病人为用药经济负担很重。因此要提高国产抗生素的产品质量，希望严格限制进口药，要加强管理。8、抗生素低水平重复，生产过剩，价格下跌，不景气，是很严重的现象，造成厂家难以维持生产和一系列严重问题。9、科研单位、科研人员最感兴趣的是能简单地制取又有经济效益的课题，各单位没有长远和系统的规划和目标，没有组织力量集中攻关，技术保守，为了自己多得利益不愿协作，愿意单干，实际延误了科研周期，不能很好完成任务。10、加入世界贸易组织之后，仿制国外品种更为困难，医药工业包括抗生素工业在内如何面对新情况是一个问题。看来创新品种应放在重要日程上。二、技术上的建议（一）、利用基因工程菌继续提高抗生素菌种发酵效价及创制新型抗生素；（二）、提高抗生素产品质量，，工厂实行GMP改造；（三）、解决重要中间体如6-APA、7-ACA、7-ADCA、GCLE、GCLH、对羟基苯甘氨酸大规模生产及深加工问题；（四）、引进关键技术如抗生素产生菌及先进设备，提高产品的技术水平；（五）、研究手性化合物的分离提纯技术；（六）、由青霉素G为原料采用生物技术方法，扩环制备母核；（七）、微生物转化的深入研究

140第五章生化药品第一节生化药品概论第二节氨基酸类药物一、氨基酸类药物的基本概念二、氨基酸类药物的生产方法三、氨基酸及其衍生物在医药中的应用氨基酸是构成蛋白质的基本组成单位，生物体中众多蛋白质的生物功能都与构成蛋白质的氨基酸种类、数量、排列、顷序有密切关系，对人体及动物维持机体的蛋白质动态平衡有着极其重要作用。因此，氨基酸的生产和应用早已受到人们的重视。氨基酸的制造是从1820年水解蛋白质开始的，1850年在实验室内用化学方法合成了氨基酸。1956年用微生物直接发酵糖类生产谷氨酸研究获得成功，并进行大规模的工业生产，被认为是现代发酵工业的重大突破，是氨基酸生产方法的重大革新。该成就大大推动了其他氨基酸发酵研究和生产的发展，形成了用发酵法制造氨基酸的新型发酵工业。在各种氨基酸中，以谷氨酸的发酵产量最大，赖氨酸的发酵产量次之。一、氨基酸类药物的基本概念二、氨基酸类药物的生产方法（一）、水解法1、基本原理（1）蛋白质水解方法酸水解法、碱水解法、酶水解法（2）氨基酸分离方法

141溶解度法、特殊试剂沉淀法、吸附法、离子交换法。（3）氨基酸精制方法结晶，重结晶2、用水解法L一胱氨酸的制备：（二）、发酵法L一异亮氨酸的制备2）灭菌、发酵发酵培养液组成（％）:硫酸镂4.5,豆饼水解液0.4,玉米浆2.0,碳酸钙4.5,pH7.2,淀粉水解还原糖粗糖浓度11.5。灭菌，接种1%菌种（v/v）,搅拌，发酵。3）除菌体，酸化发酵结束后，发酵液加热至100℃并维持10min,冷却过滤，滤液加工业硫酸和草酸至pH3.5,过滤除沉淀。4）离子父换、吸附分离上述滤液每分钟以树脂量1.5%的流速进H+型732离子交换柱（@40X100cm）,以100L去离子水洗柱，再以60co.5moi/L氨水按3Umin的流速进行洗脱。分部收集洗脱液。5）浓缩赶氨6）脱色、浓缩、中和7）精制，烘干

142（三）、酶法转化天冬氨酸和丙氨酸的制备工艺过程1）菌种培养大肠杆菌（EcoZOAS1.881的培养斜面培养基为普通肉汁培养基摇瓶培养基成分（％）：玉米浆7.5,反丁烯二酸2.0,硫酸镁（7水）0.02,氨水调pH6.0,煮沸后过滤，500ml三角烧瓶中装液量50〜100ml。从新鲜斜面上或液体中培养种子，接种子于摇瓶培养基中，37c振摇培养24h,逐级扩大培养至1000〜2000ml规模。培养结束后用1mol/LHQ调pH5.0,升温至45℃并保温1h,冷却至室温，离心收集菌体。德阿昆哈假单胞kPseudomonasdacunhae）68变异株的培养斜面培养基组成（％）为蛋白月东0.25,牛肉膏0.52,酵母膏0.25,NaQO.5,pH7.0,琼脂2.0。种子培养基与斜面培养基，不加琼脂，250ml三角烧瓶中培养基装量40ml。摇瓶培养基组成（％）为L-谷氨酸3.0,蛋白腺，酪蛋白水解液0.5,磷酸二氢钾0.05,MgS04.7H200.01,用氨水调pH7.2,500ml三角烧瓶中培养基装量为80ml。将培养24h的新鲜斜面菌种接种于种子培养基中，30c振摇培养8h,再接种于摇瓶培养基中，30c振摇培养24h,逐级放大。2）细胞固定化Ecoli的细胞固定化取湿菌体20kg,悬浮于生理盐水中，保温至40℃,再加入90L保温至40℃的12%明胶溶液及10L1.0%戊二醛溶液，充分搅拌均匀，放置冷却凝固，再浸入0.25%

143戊二醛溶液中。于5c过夜后，切成3〜5mm的立体小方块，浸入0.25%戊二醛溶液5c过夜，蒸镭水充分洗涤，滤干得含天冬氨酸酶得固定化。假单胞菌体固定取湿菌体20kg,加生理盐水搅拌至稀释至40L,另取溶于生理盐水的5%角叉菜胶溶液85L,两液均保温至45c后混合，冷却至5c成胶。浸于600L2%KQ和0.2mol/L已二胺的0.5mol/LpH7.0的磷酸缓冲液中，5℃下搅拌10min,加戊二醛至0.6mol/L浓度，5℃搅拌30min,取出切成3〜5mm的立体方块，用2%KQ溶液充分洗涤后，滤去洗涤液，即得固定化脱竣细胞。3）生物反应堆的制备4）转化反应5）产品纯化与精制（四）、化学合成法L一脯氨酸三、氨基酸及其衍生物在医药中的应用（一）氨基酸的营养价值及其与疾病治疗的关系必需氨基酸一人和哺乳动物自身不能合成，需要由食物供应，称为必需氨基酸。赖氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，苏氨酸，亮氨酸，异亮氨酸,缀氨酸等8种。（二）治疗消化道疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸及其盐酸盐，谷氨酰胺，乙酰谷酰胺铝，甘氨酸及其铝盐，硫酸甘氨酸铁，维生素U及组氨酸盐酸盐等。（三）治疗肝病的氨基酸及其衍生物精氨酸盐酸盐、磷葡精氨酸，鸟氨酸、谷氨酸钠、蛋氨酸、乙酰蛋氨酸、

144瓜氨酸、赖氨酸盐酸盐、及天冬氨酸等。（四）治疗脑及神经系统疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸钙盐及镁盐，氢溟酸谷氨酸，色氨酸，5-羟色氨酸、左旋多巴等。（五）用于肿瘤治疗的氨基酸及其衍生物偶氮丝氨酸，氯苯丙氨酸，磷天冬氨酸及重氮氧代正亮氨酸等。（六）其它氨基酸类药物的临床应用第三节多肽与蛋白质类药物一、概述多肽类生化药物是以多肽激素和多肽细胞生长调节因子为主的一大类内源性活性成分。蛋白质生化药物包括蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节因子、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白及蛋白酶抑制剂等，其作用方式从对机体各系统和细胞生长的调节，扩展到被动免疫、替代疗法和抗凝血等二、多肽及蛋白质类药物的生产方法（一）、蛋白质类药物的分离与纯化1、材料的选择蛋白质类药物的来源有动植物组织和微生物等，原则是要选择富含所需蛋白质多肽成分的，易于提取得无害生物材料。对天然蛋白质类药物，为了提高质量、产量和降低生产成本，对原料的种属，发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞都有一定要求，使得纯化工作相对容易。2、蛋白质提纯的一般方法

145（1）根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质蛋白质、多肽及氨基酸都是两性电解质，在一定pH环境中，某一种蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，或解离成两性离子，其净电荷为零，此时环境的pH值即为该蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质性质比较稳定，其物理性质如导电性、溶解度、粘度、渗透压等皆最小，因此可以利用蛋白质等电点时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质。等电点沉淀等电点除杂（2）根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质蛋白质的一个主要特点是分子大，而且不同种类的蛋白质分子大小也不相等。由此可以用凝胶过滤法，超滤法、离心法及透析法等将蛋白质与其它小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质分离。（3）根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质蛋白质的溶解度受溶液的pH、离子强度、溶剂的电解质性质及温度等多种因素的影响。在同一特定条件下，不同的蛋白质有不同的溶解度，达到分离的目的。盐溶与盐析，结晶，低温有机溶剂沉淀法。（4）根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质离子交换剂作为一种固定相，本身具有正离子或负离子基团，它对溶液中不同的带电物质呈现不同的亲和力，从而使这些物质分离提纯。蛋白质、多肽或氨基酸具有能够离子化的基团。对蛋白质的离子交换层析，一般多用离子交换纤维和以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶为骨架的离子交换剂。主要是取得其有较大的蛋白质吸附容量、较高的流速和分辨力。（5）根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质。

146主要手段是亲和层析法，即利用蛋白质分子能与其相应的配体进行特异性的、非共价键的可逆性结合而达到纯化的目的。固相化金属亲和层析IMAC是新发展的一种亲和层析技术。蛋白质分子中的咪睫基和疏基可与一些金属元素（如Qj2+、Z4+）形成配位结合，使蛋白质得到分离纯化。（6）根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来纯化蛋白质蛋白质上有疏水区，它们主要由酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缀氨酸、苯丙氨酸等非极性的侧链密集在一起，并暴露于分子表面。这些疏水区能够与吸附剂上的疏水性基团结合，在通过降低介质的离子强度和极性等方法将蛋白质洗脱下来。（7）根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质逆流分配色谱（8）根据蛋白质受物理、化学等作用因素的影响来纯化蛋白质。蛋白质易受pH、温度、酸碱、金属离子、蛋白质沉淀剂，络合剂等的影响，用于各种蛋白质都存在差异，可利用这种差异来分离纯化蛋白质。（9）根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质在蛋白质分离中，最广泛使用的吸附剂有结晶磷酸钙，磷酸钙凝胶，硅胶,皂土、沸石、硅藻土、活性白土、氧化铝以及活性炭等。（10）根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质SOD酶抗蛋白水解酶。3、蛋白质的分离与纯化

147（2）选择离子交换层析条件的程序（3）蛋白质分离纯化的可能的技术组合。4、溶液中蛋白质浓度的测定（1）紫外法1）280nm光吸收法1mg/mlA280^j1.02）280nm和260nm的吸收差法mg/mI=1.45/8。—0.74Ageo3）215nm和225nm的吸收差法Mg/ml=0.144（A215—A225）（2）双缩胭法（3）福林一酚试剂法（4）考马斯亮兰G250染色法5、纯度检查4））HPLC（2）电泳法（3）免疫化学法（4）生物检测法（5）分光光度法（二）、多肽与蛋白质的化学合成多肽合成是50年代开始获得重大发展的。1965年中国科学家在世界上首次合成了胰岛素。（诺贝尔奖）

1481962年建立了固相合成新方法。多肽合成的一般步骤：1）氨基保护和竣基活化；2）竣基保护和氨基活化;3）接肽和除去保护基团。1、基团保护要实现控制多肽合成，必须做到事先把不应与接肽反应试剂发生作用的官能团，如N-末端氨基酸残基的自由一NH2,C末端氨基酸残基的自由-COOH及侧链上的一些活泼基团，特别是筑基等，加以封闭或保护。待肽链形成以后，再将保护基团除去。应用最多的氨基保护剂是芾氧谈酰氯（Cbz-Q）,它与氨基酸或肽上的游离氨基作用形成芾氧埃酰氨基酸（Cbz-氨基酸）或Cbz-肽。可用催化氢化法或钠氨法（用金属钠在液氨中处理）除去保护基，也可以用叔丁氧谈酰氯（Boc-Q）作保护剂，用稀盐酸或乙酸在室温除去保护基。竣基保护剂通常是用无水乙醇或甲醇在盐酸存在下进行酯化，使竣基上接上烷基。除去保护基可在室温下用氢氧化钠皂化法。有些氨基酸除了含氨基和竣基外，还有其它功能基团，在合成肽时都需要用适当的保护基团加以保护。例如组氨酸的咪哇基，丝氨酸的羟基，酪氨酸的酚基，半胱氨酸的筑基，都可以用卞基（-Bz）保护，用钠氨法除去。谷氨酸和天冬氨酸的B和Y竣基可用BY苯甲酯保护，用催化氢化除去。精氨酸的服基用对甲基磺酰氯（Tos-）保护。2、肽的液相合成法接肽反应除用缩合剂来完成外，还可以用分别活化参与形成肽链的氨基和竣基的方法来完成。因活化氨基地反应非常激烈，而且常常产生消旋化，所以，总是采用竣基活化的方法。

149肽的合成法可分为阶梯伸长法和片断缩合法。1）阶梯伸长法DD。去（N,N-二环已基碳二胺），首先使N-端保护氨基酸同DDC反应，形成酎后，加入另一个氨酸，缩成肽。（吊8）2+R2-NH2tRrCO-NH-Rg活化酯法，带有N保护基的氨基酸对硝基芳香族酯，能与另一个氨基酸酯的氨基缩合成肽。H-Gy-OMe+Z-Lgu-OCgH4NO2->Z-Leu-Gy-Ome2）片断缩合法常用叠氮法4、游离肽的获得分离纯化，真空干燥，冷冻干燥。三、多肽类药物（一）、多肽类药物种类：1、多肽激素（1）脑垂体多肽激素：促皮质素（ACTH）,促黑激素，催产素，加压素（2）下丘脑激素：促甲状腺激素释放激素，生长素抑制激素，促性腺激素释放激素（3）甲状腺激素：甲状旁腺激素，降钙素（4）胰岛激素：胰高血糖素，胰解痉多肽（5）胃肠道激素：胃泌素，胆囊收缩素，肠泌素，肠血管活性肽，抑胃肽，缓

150激肽，呦质（6）胸腺激素：胸腺素，胸腺肽，胸腺血清因子2、多肽类细胞生长调节因子表皮生长因子、转移因子、心钠素3、含有多肽成分的其它物质这是一类临床确有疗效，但有效成分还不十分清楚的制剂，主要有：骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、妇血宁、蜂毒、蛇毒、胚胎素、助应素、神经营养素、胎盘提取物、花粉提取物、脾水解物、肝水解物、心脏激素等。对这类物质，若能从多肽或细胞调节因子的角度研究它们的物质基础和作用机理，有可能发现新的活性成分。(二)、主要多肽类药物的制备1、胸腺素(Thymosin,Thymic-F5缩写TP)小牛胸腺素5(1)结构和性质胸腺素组分5是由80C热稳定的40〜50种多肽组成的混合物，分子量在1000〜15000之间，等电点在3.5〜9.5之间。胸腺素组分5中，胸腺a5>a7、83、B4等具有调节胸腺以来淋巴细胞分化和体内外免疫反应的活性组分。(2)药理作用TP可增淋细胞表面E受体，使未成熟的T淋巴细胞分化，转变为成熟的有免疫活性的T淋巴细胞，并使T淋巴细胞数量增加，从而达到增强或抑制B淋巴细胞产生抗体的作用，使机体免疫功能相对平衡。另外，胸腺素能提高C3

151补体和调理素水平，激活吞噬细胞，增强其对微生物的吞噬作用，并可刺激黄体形成素分泌，对生殖功能具有调节作用。T叫能使感染病毒、细菌的患者体内溶液免疫的影响甚微。T斑能使感染病毒、细菌的患者体内溶菌酶浓度增加，吞噬作用增强。（3）作用与用途：作为免疫调节剂①原发性和继发性免疫缺陷病，如反复上呼吸道感染等；②自身免疫病，如肝炎，肾病，红斑狼疮，类风湿关节炎、重症肌无力等；③变态反应性疾病，如支气管哮喘等；④细胞免疫功能减退的中年人和老年人疾病，并可抗衰老。⑤肿瘤的辅助治疗。（4）生产工艺（5）工艺控制要点①新鲜或冷冻胸腺除脂肪、绞碎，力口3倍量生理盐水，于组织捣碎机中制成匀浆,14000g离心，得提取液（组分1）。②提取液80c加热15min,以沉淀对热不稳定部分。离心去掉沉淀，得上清液（组分2）。③上清液冷至4℃,加入5倍体积的-10C丙酮，过滤收集沉淀，干燥后得丙酮粉（组分3）。④丙酮粉溶于pH=7.0磷酸盐缓冲溶液中，加硫酸镇至饱和度为0.25,离心去除沉淀，上清液（组分4）调pH值为4.0,加硫酸镂至饱和度0.50,得盐析物。⑤盐析物溶于pH=8.0的/Ltris-Q缓冲液中，超滤，取相对分子质量在15000以下超滤液。⑥超滤液经SephadexG25脱盐后,冻干得胸腺素（组分5）。国内在制备猪胸腺素注射液时，一般先脱盐，后超滤，以简化制剂工艺。四、蛋白质类药物

152（一）、主要蛋白质类药物有以下几种:1.蛋白质激素(1)垂体蛋白激素：生长素，催乳素，促甲状腺素，促黄体生成激素，促卵泡激素。(2)促性腺激素：人绒毛膜促性腺激素，绝经尿促性腺激素，血清促性腺激素。(3)胰岛素及其它激素2.血浆蛋白质：白蛋白，纤维蛋白溶酶原，血纤蛋白等。3.蛋白质类细胞生长调节因子：干扰素等。4.粘蛋白：胃膜素、硫酸糖肽、内在因子5.胶原蛋白：明胶、阿胶6.碱性蛋白：硫酸鱼精蛋白7.蛋白酶抑制剂：胰蛋白酶抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂8.植物凝集素：PHA、ConA(二)、主要蛋白质类药物的制备干扰素(interferon,IFN)英国科学家Isaacs和Lindemann于1957年在研究病毒干扰现象时发现，将56c加热1h灭活的流感病毒加入到鸡胚绒毛尿囊膜碎片中，孵育后发现此膜能抵抗活流感病毒的感染，并且向外周释放具有干扰活性的因子，他们将该物质称为干扰素(interferon,IFN)。此后，1965年发现了白细胞干扰素，1969年发现了致敏细胞干扰素。从此，关于干扰素的研究便迅速发展起来。1.结构和性质干扰素一系指由诱导剂诱导有关生物细胞所产生的一类高活性、多功能的诱生蛋白质。这类诱生蛋白质从细胞中产生和释放之后，作用于相应的其它同种生物细胞，并使其获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的免疫力。有a型、B型和Y

153型及许多亚型。人白细胞产生的干扰素为a干扰素（IFN-a）,又称人白细胞干扰素。人纤维母细胞产生者为8干扰素（IFN-B）,又称人纤维母细胞干扰素,其结构与a者相似。由特异性抗原刺激T淋巴细胞可产生Y干扰素（IFN-y）,亦称免疫干扰素或II型干扰素。2、干扰素基本功能IFN具有抗病毒繁殖、抗细胞分裂增殖及调节机体免疫三大基本功能。（1）抗病毒繁殖：IFN具有发好的广谱抗病毒作用。IFN不是直接中和或杀伤病毒体，而是病毒体做为IFN的诱生剂，启动细胞内抗病毒蛋白质的结构基因,诱导细胞合成抗病毒蛋白质的，从而阻止感染性病毒颗粒的形成，达到抗病毒的目的。（2）直接抗肿瘤：这主要表现在IFN具有抑制肿瘤细胞增殖，直接溶癌，降低肿瘤细胞的恶性生物学行为及暴露肿瘤特异性表面抗原等功能方面。IFN有抑制细胞癌基因表达，诱导肿瘤细胞分化，促进“逆转”等作用。（3）间接抗肿瘤：IFN不仅对肿瘤细胞有直接作用，而且还通免疫系统发挥间接作用。IFN是自然杀伤细胞（Natualkillcell,NK）天然的强有力的诱导剂，在体内外IFN皆可促使N的0胞的成熟与活化，增强N侬胞杀伤肿瘤细胞的能力。IFN在体内外均能激活巨噬细胞，增强其吞噬和细胞毒功能。IFN还具有双向免疫调节作用，可调节自身免疫性疾病的过度反应到接近正常水平。3、作用与用途由于干扰素的抗病毒作用，抗细胞分裂及免疫调节作用，可用于：

154（1）病毒性疾病：普通感冒、疱疹性角膜炎、带状疱疹、水痘、慢性活动性乙型肝炎。（2）恶性肿瘤：成骨肉瘤、乳腺癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病等（3）由于病毒引起的良性肿瘤可控制疾病发展。4、传统方法生产工艺（1）工艺流程（2）、工艺过程：1）分离灰黄层取献血者血液（每份400ml）采入含抗凝血剂的塑料袋内，离心后分出血浆，小心吸取黄灰层，每份血可吸13〜15mL约为血中细胞的40%〜50%,放置4c冰箱过夜。2）氯化镂处理每份灰黄层加入30ml缓冲盐水，在加入总体积9倍量的0.83%的氯化铁溶液，混匀，4c放置10min。然后离心20min,收集沉淀细胞，做成悬浮液，再用氯化镂处理一次，融解残存的红细胞。取沉淀的白细胞并悬浮于培养液中，置于冰浴，取样作活细胞计数，用预温培养液稀释成IO7个/ml。培养液的基础成分为Eagle's培养基。3）起动诱生取稀释的细胞悬浮液加入白细胞干扰素，使其最后浓度为100u/ml,置37℃水浴搅拌培养。4）正式诱生起动后的白细胞加入仙台病毒，使其最后浓度为100〜150血凝单位ml,在37℃搅拌培养过夜。

1555)收获：次日将培养物离心30min,吸取上清液即得粗制干扰素。6)纯化：将粗制人白细胞干扰素加入硫氟化钾处理等。5、基因工程干扰素的生产(1)基因工程菌的构建(p175)(2)基因工程干扰素的生产工艺(3)基因工程人干扰素aHb生产过程(174)①发酵a.生产种子b.种子培养基c.种子摇瓶培养d.发酵培养基②产物的提取与纯化a.提取b.纯化(4)基因工程干扰素质量检验2、胰岛素一年一度的世界糖尿病日11月14日，是以胰岛素的发现者一伟大的加拿大科学家班亭的生日命名的。自1921年班亭发现并运用胰岛素治疗糖尿病以来，采用胰岛素一直是控制糖尿病的特效手段。1921年，加拿大年青医生班亭，用狗的胰腺提取物注射到一条被切除了胰

156腺的糖尿病狗身上，使这条奄奄一息的狗恢复了活力。班亭又用更纯的胰腺提取物——胰岛素，挽救了一名因糖尿病而生命垂危的14岁小男孩汤普森的性命,使汤普森成为世界上第一个接受胰岛素治疗的幸运儿。1965年，我国科学家在世界上第一次人工合成牛胰岛素。(1)胰岛素的结构和性质胰岛素(insulin)为含51个氨基酸残基的小分子蛋白质，分子量5808,由含有21个氨基酸的A链和含有30个氨基酸的B链借助2个二硫键联结而成。(2)胰岛素的生物学作用胰岛素是促进合成代谢、维持血糖正常水平的主要激素。1)对糖代谢的影响胰岛素加速全身组织，特别是肝脏、肌肉和脂肪组织摄取和利用葡萄糖,促进肝糖原和肌糖原的合成，抑制糖异生，从而使血糖降低。2)对脂肪代谢的影响胰岛素可促进脂肪的合成与储存，促进葡萄糖进入脂肪细胞，合成甘油三酯和脂肪酸。胰岛素还抑制脂肪酶的活性，减少脂肪的分解。3)对蛋白质代谢的影响胰岛素可促进氨基酸进入细胞内；促进脱氧核糖核酸、核糖核酸和蛋白质的合成；抑制蛋白质的分解。由于能促进蛋白质合成，所以胰岛素对机体的生长有调节作用，但需与生长素共同作用，促生长效果才显著。(3)胰岛素的生产工艺

157①粗制工艺流程②精制工艺流程③工艺过程及控制要点a、提取冻胰块用刨胰机刨碎后加入2.3〜2.6倍的86%〜88%乙醇（质量分数）和5%草酸，在13〜15c搅拌提取3h,离心。滤渣再用1倍量68%〜70%乙醇和0.4%草酸提取2h,离心，合并乙醇提取液。沉淀用于回收胰岛素。b、碱化、酸化提取液在不断搅拌下加入浓氨水调pH=8.0〜8.4（液温10-15℃）,立即进行压滤，除去碱性蛋白，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化至pH=3.6〜3.8,降温至5℃,静置时间不少于4h,使酸性蛋白充分沉淀。c、减压浓缩吸上层清液至减压浓缩锅内，下层用帆布过滤，沉淀物弃去,滤液并人上清液，30C以下减压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液相对密度为1.04-1.06（约为原体积的1/10~1/9为止）。d、去脂、盐析浓缩液转入去脂锅内在5min内加热至50-C后，立即用冰盐水降温至5℃静置3〜4h,分离出下层清液（脂层可回收胰岛素）。用盐酸调pH=2.3〜2.5,于20〜25℃在搅拌下加入27%（质量体积分数）固体氯化钠，保温静置数小时。析出之盐析物即为胰岛素粗品。e、精制盐析物按干重计算，加入7倍量蒸储水溶解，再加入3倍量的冷丙酮，用4moi/L氨水调pH=4.2〜4.3,然后补加丙酮，使溶液中水和丙酮的比例为7：3o充分搅拌后，低温5℃以下放置过夜，次日在低温下离心分离，得过滤液。在滤液中加入4mol/L氨水使pH=6.2〜6.4,加入3.6%（体积分数）的醋酸锌溶液（浓度为20%）,再用4moi/L氨水调节pH=6.0,低温放置过夜，次日过滤，分离沉淀。f、结晶将过滤的沉淀用冷丙酮洗涤，得干晶（每千克胰脏得0.1〜0.125g干品）再按干品质量每克加冰冷2%柠檬酸50mL、6.5%醋酸锌溶液2mL、丙酮16mL

158并用冰水稀释至100mL，使充分溶解，5℃以下，用4mol/L氨水调pH=8.0,迅速过滤。滤液立即用10%柠檬酸溶液调pH=6.0,补加丙酮，使整个溶液体系保持丙酮含量为16%。慢速搅拌3〜5h使结晶析出。在显微镜下观察,外形为似正方形或扁斜形六面体结晶，再转入5c左右低温室放置3〜4d,使结晶完全。离心收集结晶，并小心刷去上层灰黄色无定形沉淀，用蒸镭水或醋酸镂缓冲液洗涤，再用丙酮、乙酸脱水，离心后，在五氧化二磷真空干燥箱中干燥,即得结晶胰岛素，效价应在26U/mg以上。g、回收在上述各项操作中，应注意产品回收，从pH=4.2沉淀物中回收的胰岛素最多，占整个回收量的近一半，约为正品的10%。从油脂盐析物中回收的胰岛量也可达正品的5%左右。第四节核酸类药物一、概述（一）、基本概念核酸（RNA、DNA）是由许多核甘酸以3,5-磷酸二酯键连接而成的大分子化合物。在生物的遗传、变异、生长发育以及蛋白质合成等方面起着重要作用。核甘酸是核酸的基本结构，核昔酸又由碱基、戊糖和磷酸三部分组成,碱基与戊糖组成的单元叫核甘。生物体内核酸代谢与核甘酸代谢密切相关。因而核酸类药物包括：核酸、核甘酸、核甘、碱基及其衍生物（见表12-1）。（二）、核酸类药物第一类为具有天然结构的核酸类物质，有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，促进缺氧组织恢复正常生理机能。临床上用于放射病，血小板减少症，急慢性肝炎，心血管疾病，肌肉萎缩等代谢障碍。

159如肌背，ATP,辅酶A,脱氧核甘酸，肌甘酸等第二类为自然结构碱基、核甘、核甘酸结构的类似物或聚合物，这一类核酸类药物是当今治疗病毒，肿瘤，艾滋病得重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物。已经正式在临床应用的8个抗病毒核甘酸类药物。见图12-1二、核酸类物质的分离提取及其发酵生产(一)、RNA与DNA的提取与制备(p193)1、RNA的提取与制备(1)工业用RNA的提取1)RNA及其工业来源从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。通常在细菌中RNA占5%〜25%,在酵母中占2.7%〜15%,在霉菌中占0.7%〜28%,面包酵母含RNA4.1%〜7.2%。培养酵母菌体收率高，易于提取RNA,在工业上主要由RNA生产5'-核甘酸。2)高RNA含量酵母菌株的筛选可以从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株，也可以用诱变育种的方法提高酵母菌的RNA含量。3)用工业废水培养高含量RNA酵母(p194)减少环境污染，降低粮食消耗4)RNA的提取实例啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。取100g压榨啤酒酵母(含水70%),力口入230ml含NaOH3g的水，20℃以下搅拌30min。用6moi/LHQ调至pH7,搅拌15分钟，离心得上清液255ml。冷至10C以下，6mol/LHC^pH2.5,置冷过夜，离心等RNA1.8g（纯度80%）。

1602、DNA的提取与制备（p195）（1）工业用DNA的提取取新鲜冷冻鱼精20kg,用绞肉机粉碎2次成浆，加入等体积水，搅拌均匀,倾入反应锅内，缓慢搅拌,升温至100℃,保温15分钟，迅速冷却至20〜25℃,离心去除鱼精蛋白等沉淀物，共获得35L含热变性DNA溶液。加乙醇沉淀，可得到固体DNA产品。（2）具有生物活性DNA的制备动物内脏加4倍量生理盐水经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500rpm离心30分钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗涤后离心，将沉淀悬浮于20倍量的冷生理盐水中，再捣碎3分钟，加入2倍量5%十二烷基磺酸钠，并搅拌2〜3小时，在0°C2500rpm离心，在上层液中加入等体积的冷乙醇，离心即可得纤维状DNA,再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。（二）、用酶解法、发酵法和半合成法制备核甘酸（2）酶解法制备戊糖核甘酸（3）双酶法生产肌甘酸和鸟甘酸（I+G）呈味核甘酸（4）菌体自溶法生产核甘酸（5）碱水解法生产2,3'-混合核甘酸RNA中的磷酸二酯键对碱性条件不稳定的特性，很容易生成2,3'-环状磷酸酯，水解生成2',3'-核甘酸。取RNA配成3%〜3.5%的水溶液，加氢氧化钠达0.3mol/L浓度，升温380C,保温16〜20小时，用6moi/L盐酸中和至pH7.0,从RNA水解成2',3'-核甘酸降解率达95%以上。

1612、发酵法生产核甘酸(197)(1)发酵法生产肌甘酸(IMP)肌甘酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠中添加2%,鲜度可以增加3倍。(2)发酵法生产黄甘酸(XMP)及酶法转化成鸟甘酸3、半合成法制备核甘酸半合成法即微生物发酵和化学合成并用的方法。例如由发酵法先制成5-氨基-4-甲酰胺咪哇核甘(AICAR),再用化学合成制成鸟甘酸。又如用发酵法先制成肌昔，再利用微生物的或化学的磷酸化作用，使肌背转变为肌甘酸。(三)、核昔的制备1、RNA化学水解法制备核普2、发酵法生产核普(1)发酵法生产肌甘(2)发酵法生产鸟背和黄甘(3)发酵法生产腺昔三、主要核酸类药物的生产(一)、叠氮胸昔(AZT)1、结构与性质AZT治疗艾滋病的新药。化学名为3'-叠氮2-脱氧胸腺喀咤核甘。68%的病人临床表现为减轻症状，延长寿命的显著效果，常见副作用为贫血，白血球减少，部分病人骨髓坏死等。AZT的药理作用染色体端粒对维持细胞生存具有重要作用。只有大量消耗癌细胞的有效端粒片段，才能控制其无限分化和增殖，端粒酶介导的端粒合成是细胞端粒

162补充的重要手段和分子基础。因此，阻止端粒酶的活性对于控制肿瘤无限生长具有重要的意义。端粒酶是一种自带RNA模板的反转录酶，在合成端粒过程中需依赖其反转录特性，抑制反转录就有可能达到阻断端粒酶活性和抑制癌细胞增殖的目的。而3'-叠氮脱氧胸腺喀咤核甘(AZT)简称叠氮胸背，其国外商品名为齐多夫咤(Zidovudine),是一种反转录抑制剂(RTI),它进入细胞后在一系列酶的作用下转变为AZT三磷酸盐，后者可与核酸结合，竞争性抑制5'-三磷酸胸背与核酸的结合，使得合成链终止而阻断了正常途径的反转录过程。2、生产工艺(DMF二甲基甲酰胺)(二)、阿糖腺昔(AdenosineArabinoside,简称Ara.A)1、结构与性质阿糖腺普化学名称为9-B-D-阿拉伯吠喃糖腺喋吟。阿糖腺甘是一种天然抗病毒化合物，它对多种DNA病毒均有抑制作用，外用可治疗各种疱疹病毒感染，疗效较好，静脉注射可治疗疱疹脑炎、能显著降低患者的死亡率和神经损伤，是治疗单纯疱疹脑炎较好的药物。阿糖腺甘在体内受激酶作用生成阿糖腺三磷，是脱氧腺三磷(dATP)的拮抗物，从而抑制了以dATP为底物的病毒DNA聚合酶的活力。2、生产工艺(三)、三氮唾核甘(Ribavirin,利巴伟林)1、结构与性质三氮哩核普商品名病毒哇，对DNA病毒，RNA病毒都具有广泛作用。三氮哩核昔除了主要应用于小儿呼吸系统的疾病治疗以外，已用于猩红

163热，流感以及爱滋病的治疗，特别是在临床上能明显改善患者症状，而且毒副作用比AZT小，药物价格与AZT相差50倍。在体内被磷酸化成三氮哇核甘酸，抑制肌甘酸脱氧酶阻断鸟甘酸的生物合成，从而抑制病毒DNA合成。2、生产工艺核甘酸法肌普法

164第五节酶类药物一、酶类药物的原料来源（一）、原料选择1、不同酶的用料选择乙酰化酶（鸽肝）、凝血酶（牛血）、透明质酸酶（羊睾丸）、溶菌酶（鸡蛋清），超氧化物歧化酶（血、肝）2、注意不同生长发育情况及营养状况3、原料来源丰富4、从简化提纯步骤着手5、如用动物组织作原料，应在此动物宰杀后立即取材。（二）、微生物酶制剂高产菌株的选育菌种是工业发酵生产酶制剂的重要条件。优良菌种不仅可以提高酶制剂产量和发酵原料的利用率，而且还与增加品种，缩短生产周期，改进发酵和提炼工艺条件等密切相关。优良菌种获得的三种途径：1、从自然界分离筛选。2、用物理或化学的方法处理，诱变。3、用基因重组与细胞融合技术。（三）、微生物酶制剂生产的发酵技术1、培养基（1）碳源（甘薯、玉米、萩皮、米糠）

165（2）氮源（豆饼、花生饼、菜籽饼、硫酸铁、尿素）（3）无机盐（4）生长因子和产酶促进剂2、培养方法（1）固体培养法固体培养法也称款曲培养法，该法是利用熟皮或米糠为主要原料，另外视需要添加其它谷糠、豆饼等，加水拌成含水适度的半固态物料作为培养基。（2）液体培养法液体培养法是利用液体培养进行微生物的生长繁殖和产酶。根据通气方法的不同，又分为液体表面培养和液体深层培养。深层通气培养是目前应用最广的方法。（3）影响酶产生的一些因素除培养基，发酵工艺参数对产酶的影响也十分明显。1）温度2）pH3）通气4）搅拌5）泡沫发酵过程中，由于发酵液受到强烈的通气搅拌，培养基中某些成分的变化及代谢中产生气体，会形成较多的泡沫，而且气泡不易消失，是由于培养基中蛋白质分子排在气泡表面形成一层吸附膜，聚集成泡沫层之故。消泡剂：天然油类，醇类，脂肪酸类，胺类，酰胺类，磷酸酯类，金属皂类，聚硅氧烷等。6）添加诱导剂和抑制剂

166诱导酶抑制剂（表面活性剂）二、酶类药物的提取和纯化（一）、生物材料的预处理1、动物材料的预处理（1）机械处理（2）反复冻融：冷冻到-10度左右，再缓慢解冻至室温，如此反复。（3）丙酮粉组织经过丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可以减少酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使得蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到溶液中。将组织糜或匀浆悬浮于0.01mol/L、pH=6.5的磷酸缓冲液中，再在0度下降其一边搅拌，一边慢慢倒入10倍体积的-15度无水丙酮内，10min后离心过滤取其沉淀物，反复用冷丙酮洗几次，真空干燥即得丙酮粉。2、微生物的预处理要是胞外酶，则除去菌体后再直接从发酵液中吸附提取酶。但对胞内酶则需要将菌体细胞破壁，制成无细胞的悬浮液后再行提取。（1）干燥法：①空气干燥、②真空干燥、③冷冻干燥（2）机械法：①研磨法、②组织匀浆法、③超声波法、④高压匀浆法（3）酶法处理2、酶的提取（1）水溶液法

167常用稀盐溶液或缓冲液提取。经过预处理的原料，包括组织糜，匀浆，细胞颗粒以及丙酮粉等，都可以用水溶液抽提。许多酶在蒸储水中不溶解，而在低盐浓度下易溶解，所以提取时加入少量盐可提高酶的溶解度。（2）有机溶剂法某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂质牢固结合，用水很难提取，为此必须除去结合的脂质，且不能使酶变性，最常用的有机溶剂是丁醇。丁醇具有以下特点：1）亲脂性强，特别是亲磷脂的能力；2）兼具亲水性，在0C在水中的溶解度为10.5%；3）在脂与水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。（3）表面活性剂法（三）、酶制剂的工业提取法1、发酵液的预处理及过滤：絮凝剂2、酶液的脱色：0.1〜1.5%活性炭3、盐析法4、有机溶剂法5、喷雾干燥直接制备粉末酶制剂（四）、酶的纯化1、杂质的除去

168酶提取液中，除所需酶外，还含有大量杂蛋白、多糖、脂类和核酸等，需要除去。（1）pH和加热沉淀法利用蛋白质酸碱变性性质的差异可以通过调pH和等电点除去某些杂蛋白，也可以利用不同蛋白质对热稳定性的差异。（SOD酶）（2）蛋白质表面变性法利用蛋白质表面变性性质的差别，也可以除去杂蛋白。制备过氧化氢酶，加入氯仿除杂蛋白。（3）选择性变性法利用蛋白质稳定性不同，除去杂蛋白。（4）核酸沉淀剂法在微生物制备酶时，常含有较多核酸，可用核酸酶降解，离心分离，用核酸沉淀剂如三甲基十六烷基溟化核，硫酸链霉素等。（5）将酶与底物结合，用加热法除去杂蛋白。近来发现，酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后，稳定性大大提高，这样可以用加热法除去杂蛋白。2、脱盐和浓缩（1）脱盐：①透析：玻璃纸袋；②凝胶过滤：Sephadex010（2）浓缩：①冷冻干燥法；②离子交换法；③超滤法；④凝胶吸水3、酶的结晶

169把酶提纯到一定纯度以后，可使其结晶。蛋白质分子多数处于含水的环境中，蛋白质分子与水分子结合形成稳定的水合物。当蛋白质的浓度非常高的时候，溶液中没有足够可以与蛋白质结合的水分子用于形成水合物，在蛋白质分子之间也没有足够的水分子可以将它们充分隔开，于是蛋白质就以无定形沉淀或结晶的形式从溶液中析出。（1）酶的结晶方法1）盐析法在适当的pH、温度等条件下，保持酶的稳定性，慢慢改变盐浓度进行结晶。结晶时采用的盐有硫酸镂，柠檬酸钠，乙酸镂，硫酸镁等。利用硫酸镂结晶时一般是把盐加入到一个比较浓的酶溶液中，并使溶液微呈浑浊为止。然后放置，并且非常缓慢地增加盐浓度。操作要在低温下进行，缓冲液pH要接近酶的等电点。2）有机溶剂法酶液中滴加有机溶剂，有时也能使酶形成结晶。结晶用溶剂有：乙醇、丙醇、丁醇、乙盾、异丙醇、二恶烷、二甲亚硼、二氧杂环已烷。3）复合结晶法有时可以利用某些酶与有机化合物或金属离子形成复合物或成盐的性质来结晶。4）透析平衡利用透析平衡进行结晶也是常用方法之一。5）等电点法（2）结晶条件的选择1）酶的纯度酶只有达到相当纯度后才能结晶。酶的纯度越高，结晶越容易，长成大

170的结晶可能性也越大。2）酶的浓度结晶母液尽可能保持高的浓度。酶的浓度越高越有利于溶液中溶质分子间的相互碰撞聚合，形成结晶的机会也越大。3）温度4）时间5）pH有时相差0.2pH,只能达到沉淀，而不能达到晶体。6）金属离子许多金属离子能引起或有助于酶的结晶。7）晶种8）结晶器皿处理。4、酶分离和纯化工作中的注意事项（1）防止酶蛋白变性（2）防止辅因子的流失（3）防止酶被蛋白水解酶降解三、酶类药物（p200）（一）、药用酶类的概述早期酶制剂主要用于治疗消化道疾病，烧伤及感染引起的炎症。1、促进消化酶类2、消炎酶3、与纤维蛋白溶解作用相关的酶类4、抗肿瘤的酶

1715、其它药用酶（二）、重要的酶类药物1、胃蛋白酶胃蛋白酶广泛存在于哺乳动物的胃液中。（1）组成（结构）、性质药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的化合物，含有胃蛋白酶，组织蛋白酶，胶原酶等，为粗制的酶制剂。性状：外观为淡黄色粉末，等等临床上主要用于因食蛋白过多，引起的消化不良及病后恢复期消化机能减退等。(2)生产工艺1)工艺路线2)工艺过程①自溶、过滤在夹层锅内预先加水100L及盐酸，加热至50c时，加入200kg猪胃粘膜,快速搅拌使酸度均匀，保持45〜48c消化3〜4小时。用纱布滤去未消化的组织蛋白，收集滤液。②脱脂、去杂质将滤液降温至30℃以下，静防24〜48h,使杂质沉淀除去，得到脱脂酶液。③浓缩干燥取脱脂酶液，在40℃以下浓缩到原体积的1/4,真空干燥，球磨，得到产品。4、尿激酶(p212)尿激酶(urokinase,UK),具有激活纤溶酶原(Pfasmingen)转变为纤溶酶

172(Plasmin)进而产生纤维蛋白溶解作用的一种蛋白水解酶。与其它纤溶酶激活剂相比，Uk具有无抗原性，无热原［热原质是细菌体中的脂多糖(LPS),多由G菌产生，注入人体或动物体内能引起发热反应。1，毒副作用小，纤维酶特异性高和疗效确切等优点，一直为国际上畅销的昂贵注射用生化药物。尿激酶是一种碱性蛋白酶，由肾脏产生，主要存在于人和哺乳动物的尿中。人尿平均含有5〜6U/ml。临床上，尿激酶已经广泛应用于治疗各种新血栓形成或血栓梗塞疾病。（1）组成性质1）尿激酶有多种分子量形式，主要有31300、54700两种。尿中的尿胃蛋白酶原在酸性条件下可以激活生成尿胃蛋白酶，后者可以把分子量54700的天然尿激酶降解为分子量为31300尿激酶。2）尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，血纤维蛋白溶酶原是它唯一的天然蛋白质底物，它作用于精氨酸一缀氨酸键使得纤溶酶原转为纤溶酶。3）尿激酶的pl为pH8〜9.（2）生产工艺1）工艺路线：2）工艺过程①收尿：收集男性尿②沉淀处理：尿液冷至10C以下，用NaOH调pH至8.5,静置1h,虹吸上清液。用盐酸调至pH5.0—5.5。③硅藻土吸附：处理好的尿液加入1%尿量的硅藻土，于5°C下搅拌吸附1h。④洗脱：硅藻土吸附物洗涤装柱，先用0.02%氨水加0.1mol/L氯化钠洗脱，当洗脱液油清变混时开始收集。

173⑤除热源、去色素：⑥CMG农缩：⑦透析除盐：5、超氧化物歧化酶（SOD）超氧化歧化酶（superoxidedismutase简称SOD）是一种催化超氧阴离子（CV）歧化反应的酶，属金属酶，这种歧化反应本身就是自身氧化还原反应。超氧阴离子在H+存在的情况下，经SOD催化，一半氧化为Q,一半还原为（Q）SOD+Q-SOD+02SOD+Q-+2H+SOD+H2O总反应为02+02+2H+5+H2O2（SOD：氧化型，SOD"：还原型）自从Mccord和Fridovich首先从牛的红细胞中提取SOD以来，人们已经建立起一整套快速而有效的分离及分析方法，并对它的种类，特性、化学、药理、临床及作用机理迸行了一系列研究，发现SOD的存在可能与机体的衰老，肿瘤的发生，自身免疫性疫病（红斑狼疮，皮肌炎等）和辐射防护等存在关系。因此近几年来它不仅受到生化界的重视，而且也受到医药界的极大关注。因此研究SOD不仅具有重大的理论意义，而且也有重大的应用价值。超氧化物歧化酶是一种重要的氧自由基清除剂，作为药用酶在美国、德国、澳大利亚等国已有产品。由于SOD能专一性去除超氧阴离子自由基，故引起国内外生化界和医药界的极大关注。目前临床上应用集中在自身免疫性疾病上如类风湿关节炎，红斑性狼疮，皮肌炎等。（1）组成性质

174SOD属金属酶，其性质不仅取决于蛋白质部分，还取决于活性中心金属离子的存在。按照金属离子的不同，SOD有Cu,Zn-SOD,Mn-SOD>fllFe-SODoSOD的主要理化性质见表SOD是一种金属蛋白，因此它对热，pH及在某些性质上表现出异常的稳定性。①对热稳定性：SOD对热稳定，天然牛血SOD在75℃下加热数分钟，其酶活性丧失很小。但SOD对热稳定性与溶液的离子强度有关。②pH对SOD的影响：SOD在pH5.3〜10.5范围稳定。③吸收光谱：Cu,Zn-SOD的吸收光谱取决于酶蛋白和金属辅基，不同来源的Cu,Zn-SOD的紫外吸收光谱略有差异。④金属辅基与酶活性：含金属配基Cu与Zn,Zn仅与酶分子结构有关，而与催化活性无关，而Cu与催化活性有关，透析法除去Cu则酶活全部丧失，一旦重新加入Cu,酶活性又可恢复。(2)生产工艺分离纯化SOD常根据原料，种类和性质的差异而有所不同。1)牛红细胞提取Cu,Zn-SOD的生产工艺：2)工艺过程①收集、浮选：取新鲜牛血，离心除去血浆。②溶血、去血红蛋白：干净红细胞加水溶血30min,然后加入0.25倍体积的乙醇和0.15倍体积的氯仿，搅拌15min,离心去血红蛋白，收集上清液。③沉淀、热变性：将上述清液加入1.2〜1.5倍体积的丙酮，产生大量絮状的沉淀,

175离心得沉淀物。再将沉淀物加适量水，离心去不溶物，上清液于60〜70c热处理10分钟，离心去沉淀得浅绿色得澄清液。④柱层析、洗脱、超滤浓缩：将上述澄清液超滤浓缩后小心加到已用2.5mmol/L,pH7.6磷酸缓冲液平衡好的DEAE-sephadexA50柱上吸附，并用pH7.6的2.5〜50mmol/L的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SOD活性的洗脱液。⑤冷冻干燥第六节糖类药物一、糖类药物的类型及生物活性简介(一)、糖类药物的类型(1)单糖：如葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖等。(2)糖的衍生物：如6-磷酸葡萄糖、1,6-二磷酸果糖、磷酸肌醇。(3)低聚糖：常指由2〜9个单糖组成的多聚糖，低聚糖又称寡糖，主要包括：低聚乳糖、低聚半乳糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、帕拉金糖、低聚龙胆糖、大豆低聚糖、棉籽糖、野芝麻四糖等。主要存在于人乳、大豆、棉籽、枝树、甜菜、龙胆属植物根及淀粉的酶水解物中。低聚糖的生理功能：a促使双歧杆菌增殖：b减少有毒发酵产物及有害细菌酶的产生；c抑制病原菌和腹泻；d防止便秘；e保护肝脏功能；f降低血清胆固醇；g增强机体免疫力，抗癌；h生成营养物质；i属于水溶性膳食纤维；j低能量或无能量；k不会引起牙齿踽变国际上近年开发的主要低聚糖(4)多聚糖：常称为多糖是由10个以上单糖聚合而成的，如香菇多糖、右旋糖酎、肝素、硫酸软骨素、人参多糖和刺五加多糖等。多糖按其组份分类，有均一多糖和杂聚多糖。

176均一多糖是由多个相同的单糖分子通过糖普键缩聚而成的链状大分子化合物，如葡聚糖(右旋糖甘)。杂聚多糖是由不同的单糖分子或单糖衍生物与非糖物质组成的大分子化合物，如蛋白聚糖、粘多糖等。通常说的“多糖”就是杂聚多糖，我们所要生产的香菇多糖也属于杂聚多糖。多糖作用机理：多糖主要是通过激活免疫细胞，如激活T细胞、B细胞、活化补体巨噬细胞、自然杀伤细胞、细胞毒T细胞等，促进细胞因子生成等途径对免疫系统发挥多方面的调节作用。临床应用于抗肿瘤的真菌多糖a.香菇多糖：由8(1-3)糖背键构成主链骨架，每5个糖残基有8(1-6)键形成的2个分支点，日本已将香菇多糖注射液(静脉给药)应用于胃癌、直肠癌、结肠癌、乳腺癌等癌证的治疗。临床表明，香菇多糖可提高病人50%生存时间，而且无副作用。b.裂褶菌多糖：裂褶菌多糖是由高等真菌裂褶菌分离纯化的B(1-3)糖昔键构成主链骨架，6位上有分支的葡聚糖。1986年日本采用深层发酵法生产该多糖,临床上主要应用治疗子宫颈癌。C.云芝多糖：云芝多糖是由真菌发酵菌丝中分离的由B(1-3),与B(1-4)葡聚糖构成的主链骨架，侧链为8(1-6)葡聚糖，因多糖中含有15%的结合蛋白又称其为云芝糖肽。d.茯苓多糖：从真菌茯苓的子实体中分离到的B(1-3)葡聚糖，含少量B(1-6)葡萄糖残基构成的侧链。将该多糖进行化学修饰制成竣甲基茯苓多糖，在临床上主要用于鼻咽癌、胃癌的治疗。具有抗艾滋病作用的硫酸化多糖

177目前应用最广泛的艾滋病治疗药物AZT(叠氮胸背)、二脱氧肌甘是一种3脱氧的碱基类似物，是逆转录酶的抑制剂，有较大的毒副作用。一些天然硫酸化多糖如角叉芽胶、肝素、硫酸软骨素从堇菜和夏枯草中分离出来的硫酸化多糖，等对HIV均有抑制作用，其作用机理可能有三条途径：硫酸化的糖能抑制逆转录酶的活性；能抑制靶细胞与病毒结合；能增强机体免疫功能。从海藻中提取的原卡拉胶多糖的硫酸酯可以阻断病毒对细胞的吸附。并抑制HIV的逆转录酶。壳聚糖甲壳质是一种与纤维素类似的含氮多糖类物质。广泛存在于虾、蟹、昆虫的外骨骼及真菌的细胞壁中。有人说：“二十一世纪多糖的研究最有希望的是甲壳质”。足以说明人们对甲壳质研究的重视。常见糖类药物见下表(二)、糖类药物的生理活性多糖是研究得最多的糖类药物。多糖类药物具有以下多种生理活性。(1)调节免疫功能：主要表现为影响补体活性，促进淋巴细胞增生，激活或提高吞噬细胞的功能，增强机体的抗炎、抗氧化和抗衰老。(2)抗感染作用：多糖可提高机体组织细胞对细菌、原虫、病毒和真菌感染的抵抗能力。如甲壳素对皮下肿胀有治疗作用，对皮肤伤口有促进愈合的作用。(3)促进细胞DNA、蛋白合成可促进细胞增殖和生长。(4)抗辐射损伤作用：茯苓多糖、紫菜多糖、透明质酸等均有抗6°Co-y射线损伤的作用。(5)抗凝血作用：如肝素是天然抗凝剂，用于防治血栓、周围血管病、心绞痛、

178充血性心力衰竭与肿瘤辅助治疗。甲壳素、芦荟多糖、黑木耳多糖等均具有类似的抗凝血作用。(6)降血脂、抗动脉粥样硬化作用：如硫酸软骨素、小分子肝素等具有降血脂、降胆固醇抗动脉粥样硬化作用。(7)其他作用：多糖类药物除上述活性作用外，还具有其他多方面的活性作用，如：右旋糖酎可以代替血浆蛋白以维持血液渗透压，中等相对分子质量的右旋糖肝用于增加血容量、维持血压，而小相对分子质量的右旋糖酎是一种安全有效的血浆扩充剂；海藻酸钠能增加血容量，使血压恢复正常。二、糖类药物原料与制备方法糖类药物原料来源有动植物和微生物，其生产根据品种不同可以有从生物材料中直接提取、发酵生产、酶法转化三种。动植物来源的多用直接提取的方法，微生物来源的多用发酵方法生产。(一)、动植物来源的糖类药物的生产1、单糖、低聚糖及其衍生物的制备2、多糖的制备生产工艺流程多糖的分离与纯化(1)多糖的提取：提取多糖时，一般先需进行脱脂，以使多糖释放。方法：将植物材料粉碎，用甲醇或乙醇-乙醛(1:1)混合液，加热搅拌温浸1〜3h,也可用石油酸脱脂。动物材料可用丙酮脱脂、脱水处理。1)稀碱液提取：主要用于难溶于冷水、热水、可溶于稀碱的多糖。提取时可

179先用冷水浸润材料，使其溶胀后，再用0.5mol/LNaOH提取，提取液用盐酸中和、浓缩后，加乙醇沉淀多糖。如在稀碱中不易溶出者，可加入硼砂，如甘露醇聚糖、半乳聚糖等能形成硼酸配合物。2）热水提取：适用于难溶于冷水和乙醇，易溶于热水的多糖。提取时材料先用冷水浸泡，再用热水（80〜90C）搅拌提取，提取液除蛋白质，离心，得清液。透析或用离子交换树脂脱盐后，用乙醇沉淀的多糖。3）黏多糖的提取：大多数黏多糖可用水或盐溶液直接提取，但因大部分黏多糖与蛋白质结合于细胞中，需用酶解法或碱解法裂解糖-蛋白间的结合键，促使多糖释放。①碱解：多糖与蛋白质结合的糖肽键对碱不稳定，故可用碱解法使糖与蛋白质分开。碱处理时，可将组织在40c以下，用0.5mol/LNa。H溶液提取，提取液以酸中和，透析后，除去杂蛋白，再用酒精沉淀多糖。黏多糖分子上的硫酸基一般对碱较稳定，但若硫酸基与邻羟基处于反式结构或硫酸基在G3或C6,此时易发生脱硫作用，因此对这类多糖不宜用碱解法提取。②酶解：蛋白酶水解法已逐步取代碱提取法而成为提取多糖最常用方法。鉴于蛋白酶不能断裂糖肽键及其附近的肽键，因此成品中会保留较长的肽段。为除去长肽段，常与碱解法合用。酶解液除杂蛋白，再经透析后，用乙醇沉淀即可制得粗品多糖。（2）多糖的纯化1）乙醇沉淀法：乙醇沉淀法是制备黏多糖的最常用手段。乙醇的加入，改变了溶液的极性，导致糖溶解度下降。供乙醇沉淀的多糖溶液，其含多糖的浓度以1%〜2%为佳。2）分级沉淀法：不同多糖在不同浓度的甲醇、乙醇或丙酮中的溶解度不同，因此可用不同浓度的有机溶剂分级沉淀分子大小不同的黏多糖。在Ca2+、zn2+等二价金属离子的存在下，采用乙醇分级分离黏多糖可以获得最佳效果。

1803）季镂盐络合法：黏多糖与一些阳离子表面活性剂如十六烷基三甲基浪化镂（CTAB）和十六烷基氯化毗咤（CPC）等能形成季镂盐络合物。这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，在离子强度大时，这种络合物可以解离，溶解，释放。4）离子交换层析法：黏多糖由于具有酸性基团（如糖醛酸和各种硫酸基），在溶液中以聚阴离子形式存在，因而可用阴离子交换剂进行交换吸附。3、多糖市场分析（1）用于治疗肿瘤及肝炎等疾病的多糖药品，年需求量约53吨，年产量不足2吨。据卫生部的1999年资料，目前癌症病人600万人左右，肝炎病人约1.2亿人左右，按5%的使用率计算，每人每年使用按10g计算，每年需各种多糖产品约53吨。近年我国适合于此类病人的多糖的总产量不足2吨，市场缺口大。（2）中、老年人用多糖保健品市场，年需求量约60吨，年产量不足3吨。1999年的资料，城市人口约4亿，城市中中老年人约有1.2亿人，使用率按5%计算，每人每年使用按10g计算，年需要量为60吨，而目前各种多糖保健品总产量还不足3吨。4、市场价格情况（二）、微生物来源的多糖类药物的生产微生物来源的多糖类药物用发酵法生产，也可用酶转化法生产，如液体深层培养香菇产生菌生产香菇多糖、1,6-二磷酸果糖的生产等，其方法同其他发酵和酶转化产品乙发酵类型多属有氧发酵。三、重要糖类药物生产工艺（一）异麦芽寡糖异麦芽寡糖具有葡萄糖a-1.6键，亦称为分枝低聚糖，主要由异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖等寡糖组成。

1811、异麦芽寡糖的性质异麦芽寡糖甜度仅有蔗糖的45〜50%；50%糖浆在pH为3；温度为120℃的条件下加热10小时不分解。水份保持力极好，能保住食品的水份含量，抑制蔗糖与葡萄糖的结晶。异麦芽寡糖水份活性低(0.75)>比蔗糖(0.85)>高麦芽糖浆(0.85)>葡萄糖浆(0.77)都低，有较强抑菌防腐作用。2、异麦芽寡糖的生理功能(1)抗/齿的特性:异麦芽寡糖为非发酵性糖，不易被微生物利用，异麦芽寡糖不仅自身不易被蛀牙病菌链球菌发酵腐蚀。异麦芽寡糖具有调节口腔酸度的作用，不至于口腔于过酸而损坏牙齿。(2)可调整动物体肠道内的微生物菌群，增加有益菌群的比例，抑制有害菌。低聚糖麦芽寡糖为双歧杆菌等有益菌群选择性地利用，而不能被肠道腐败细菌所利用。异麦芽寡糖对全肠内双歧杆菌确具极佳增殖效果，可使肠内有益菌增加而形成优势，从而抑制和减少有害菌。(3)异麦芽寡糖可调节机体代谢，对蛋白质的消化吸收有帮助，有利于动物的生长发育。异麦芽寡糖不仅具有促进合成维生素8、&、B4>K、尼克酸、叶酸等，并缓慢地被人体吸收，而且具有促进钙、铁等主要儿种矿物质吸收，促进骨骼发育。(4)异麦芽寡糖能够促进肠道的消化功能:异麦芽寡糖促使肠道有益菌的生长与繁殖，加速了肠道分泌物的产出，促进消化酶的分泌与活力的提高。此外，肠道内的双歧杆菌可产生大量的短链脂肪酸，刺激了肠道的蠕动，增加了粪便的湿润度，防止便秘的发生。(5)异麦芽寡糖有助于肠道内有毒物的排出：肠内有害菌使食物转变成对甲酚、酚类或口引口朵，甲基口引咪等腐败产物，异麦芽寡糖可增加有益菌的生长及增加胃道蠕动，减少有毒物的产生并排出体内有毒物。

182（6）提高机体免疫能力:异麦芽寡糖对双歧杆菌明显地有增殖作用，使双歧杆菌在肠内的数量和出现率增加。异麦芽寡糖能够激活动物体的免疫功能，抵御体内外有害病毒和致病因子等侵入，起到防病治病作用。另外，异麦芽寡糖还具有保护肝脏、降低血清胆固醇的作用。3、异麦芽寡糖的生产4、操作要点调浆控制淀粉乳浓度为30〜35%。浓度过低，后续浓缩过程能耗大，增加了产品成本；浓度太高，淀粉液化不完全，影响到糖化转昔的顺利进行,导致产品中糊精含量偏高（大于10%）。液化使用耐高温a-淀粉酶时，底物pH控制在6.2〜6.4,酶用量0.5〜0.6l/t原料，温度91〜95℃保持40〜60min,当底物DE值达到12〜17,碘反应合格即停止液化。糖化转昔使用a-葡萄糖甘酶和8-淀粉酶（或真菌a-淀粉酶）协同作用，控制PH4.8〜5.0,56c维持8〜10h,搅拌，使物料均匀。精制浓缩按照常规操作过滤、脱色、脱盐和浓缩。5、异麦芽寡糖的主要用途新型低聚糖由于具有优异的功能，应用前景十分广阔，用它来制造各种饮料、乳制品、面包和冰淇淋、调味品，也可以用于医药、疗效食品、营养剂等。尤其是异麦芽寡糖是双歧杆菌的最佳伴侣，用它制成糖果有很好的效果。异麦芽低聚糖将是二十一世纪所瞩目的甜味剂和营养、疗效、功能性食品。发展低聚糖的市场前景十分广阔，可作为重要创汇产品进入国际市场。在寡糖类物质中，以异麦芽寡糖最具代表性之一，它可以提高有益菌的战斗力及数目，同时能通过胃酸及氧气考验的困扰。市面上的异麦芽寡糖制品，建议每天摄取约8〜10克。

183（二）硫酸软骨素从猪、牛、羊等动物的喉、鼻、软肋骨中提取的软骨素是生产硫酸软骨素、软骨素片、硫酸软骨素注射液、硫酸软骨素A等药品的主要原料。它用于某些神经性头痛、神经痛、关节痛、偏头痛、四肢麻木病症的治疗，也可用于因使用链霉素而引起的听觉障碍及肝炎等的辅助治疗。特别是预防和治疗轻度中毒效果明显。软骨素除供应国内药品市场外，国际市场需求量也大，我国生产的软骨素一直外销出口，产品供不应求。每百公斤鲜软骨可提6〜10公斤成品（干软骨产出率18〜30%）。目前，国内市场软骨素每公斤售价6〜7百元，生产软骨素成本低、利润高，销售前景看好。1、结构与性质硫酸软骨素一般含有50〜70个双糖单位，链长不均一，相对分子质量在1〜3万，硫酸软骨素按其化学组成和结构差异，又分为A、B、C、D、E、F、H等多种。它们均由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖组成，只是硫酸基团位置不同而己。硫酸软骨素为白色粉末，无臭，无味，吸水性强，易溶于水而成黏度大溶液，不溶于乙醇、丙酮和乙醛等有机溶剂，其盐对热较稳定，受热80c亦不破坏。游离硫酸软骨素水溶液，遇较高温度或酸即不稳定，主要是脱乙酰基或降解成单糖或相对分子质量较小的多糖。2、生产工艺（碱-酶水解快速提取）3、工艺过程及控制要点原料80℃蒸煮4〜6h,捞起洗净，于-25°C冷库速冻使骨质疏松，绞碎，称重。加入材料：46°BeNaOH=1:0.25,室温提取L5h,用2moi/LHCL调pH,双层纱布过滤（滤液待用），再按滤渣：46°BeNaOH=1:0.12,40℃下提取1h,再用双层滤布过滤，

184弃滤渣，合并两次滤液，量取体积待用。滤液用4mol/LHCL调节pH8.0〜8.5左右。料液与胰蛋白酶1000:0.5加入胰酶，40〜50℃水解1.5卜后（终末取水解液5ml,滴加5%三氯醋酸石呈微浑浊，表明水解较完全，否则仍加胰酶水解直至溶液透明），续按100005加入木瓜蛋白酶，40〜50℃水解1.5h,用四层纱布过滤，向清液中按重量比0.5%分别加入高岭土和活性炭吸附，慢速间歇搅拌1h,置冷室下，自然澄清，虹吸清液。其底层沉淀物用过滤棉抽滤，弃沉淀，合并二次清液，调pH6.8〜7.2,按重量比向滤液加2%十二烷基磺酸钠于68c水浴保温20min抽滤，取清液，按照滤液与氯仿-甲醇混合液1:1进行翠取，去底部有机溶液剂相，向水相加2.5倍体积95%以上乙醇沉淀，待其澄清后，虹吸上清液，底层沉淀以1500转/min离心7〜10min,收集沉淀，往沉淀中按重量比加入4倍丙酮后，抽滤后放入生石灰或五氧化二磷中干燥烈于60〜80C直接烘干得高纯成品。医药产品质量要求澄清度（以吸收度表示）＜0.05,氨含量为2.5〜3.80。（三）、肝素肝素钠（别名肝素），属高分于化合物，分于量6000〜20000以前肝素钠一般都由动物肝脏中提取，现在大多从猪、羊、牛等动物的肠粘膜中提取，亦可从肺脏和心脏中提取。从猪肠中提取肝素钠的方法有盐解法、酶解法、酶解结合法、射流法等多种，以盐解法使用较为普遍。国内目前肝素钠原料药生产厂有上海生物化学制药厂、江苏苏州生化制药厂、江苏无锡生物制药厂等。肝素钠注射液为无色或淡黄色澄明液体。肝素钠是粘多糖硫酸酯类抗凝血药，这类药物能降低血液凝固性以防止血栓形成或促使己形成的血栓溶解，其生理作用是通过阻滞凝血过程，能延缓和阻止血液凝固。抗凝血作用机理极其复杂，通常认为抑制凝血活素的形成

185和对抗己形成的凝血活素，阻止凝血酶原转变成纤维蛋白单体、防止血小板的集聚和破坏，对于突发性血栓栓塞性疾病一般首选肝素钠抗凝。研究表明肝素钠还有降血脂作用。肝素钠是由生物体中提取出来的天然物质，在临床使用中受到广大消费者的青睐。广泛用于防治各种静脉血栓或栓塞、脑血管病、动脉硬化和降低胆固醇，以及防止各种癌细胞的转移等病症。我国人口众多，是一个医药工业的大市场，制药行业得到了国家产业政策的重点扶持，潜力巨大，成为一个知识技术密集，具有高效益和高附加值的朝阳产业。预计国内医药市场在未来15年仍将保持较快的增长速度，平均每年增幅约在11%左右。肝素钠作为一种重要的血液系统治疗药物，市场需求十分旺盛。但目前世界上仅有少数国家能生产肝素钠，我国肝素钠产品不仅需满足国内市场日益增长的需求，还是世界第一位的主要出口国。近年未,肝素钠产品价格虽然一直在起伏波动，但仍是一种紧悄的出口创汇产品。我国的生猪资源十分丰富，但从猪心、肚等器官中提取肝素钠成本高。猪小肠的粘膜是生肠衣的废弃物，且其中肝素钠的含量又较高，因此目前国内的肝素钠生产大多从猪肠中提取。一根猪小肠经加工后可得肠衣、肠皮、肠渣和肝素钠4种产品，可创产值7〜10元，其中肝素钠占2〜4元。国内最近开发成功的肝素钠生产新技术，比传统生产技术产量可提高70%,产品质量稳定，主要辅料消耗减少80%,安全系数达到100%,劳动量减少40%,整套工艺流程具有科学、简便、实用、高收益、低消耗的特点，属国内领先水平。国内研究单位开发的1t/a肝素钠的生产装置，总投资需4000万元，建筑而积2000m2,定员约30人。生产主要原料是猪肠，每年消耗9.8kt,其他生产辅料涅化十五烷毗陡和丙酮年耗量分别为420t和2800t。业内人士认为，在肝素钠生产中，若能与猪肠的综合利用结合起未，在同一生产装置中对猪

186肠进行多层次的深加工开发，将能取得更为显著的经济效益。1、结构与性质肝素作为一种重要的生化药物，是一簇酸性粘多糖化合物的统称，它是由已糖醛酸（L-艾杜糖醛酸、葡萄糖醛酸）与硫酸氨基葡萄糖分子以一定的比例交替联结形成的具有六糖或八糖单位的线型链状大分子，其结构单元为：2、生产工艺盐解离子交换生产工艺（1）工艺流程（2）工艺过程及控制要点①提取：取新鲜肠黏膜投入反应锅内，按3%加入NaQ,用30%NaOH调pH=9.0,于53〜55℃保温提取2h。继续升温至95℃,维持10min,冷却至50℃以下，过滤，收集滤液。②吸附：加入714强碱性C「型树脂，树脂用量为提取液的2%。搅拌吸附8h,静置过夜。③洗涤：收集树脂，用水冲洗至洗液澄清，滤干，用2倍量1.4mol/LNaQ搅拌2h,滤干。④洗脱：用2倍量3moi/LNaCI搅拌洗脱8h,滤干，再用1倍量3moi/LNaQ搅拌洗脱2h,滤干。⑤沉淀：合并滤液，加入等量95%乙醇沉淀过夜。收集沉淀，丙酮脱水，真空干燥得粗品。⑥精制：粗品肝素溶于15倍量1%NaQ,用6moi/L盐酸调pH=1.5左右，过滤至清，随即用5moi/LNaOH调pH=11.0,按3%用量加入心力浓度30%),25℃放置。维持pH=11.0,第2天再按1%量加入味。2，调整pH=11.0,继续放置，共48h,用6moi/L

187盐酸调pH=6.5,加人等量的95%乙醇，沉淀过夜。收集沉淀，经丙酮脱水真空干燥，即得肝素钠精晶。

188第七节脂类药物一、概述脂类系脂肪、类脂及其衍生物的总称。其共同物理性质是不溶或微溶于水，易溶于某些有机溶剂，在体内以游离或结合的形式存在于组织细胞中，其中具有特定生理药理效应者称为脂类药物。脂类生化药物分为复合脂类及简单脂类两大类，复合脂类包括与脂肪酸相结合的脂类药物，如卵磷脂及脑磷脂等，简单脂类药物为不含脂肪酸的脂类，如留体化合物，色素类及CoQio等。二、脂类药物生产方法（一）、脂类药物制备1、直接抽提法在生物体或生物转化反应体系中，有些脂类药物是以游离形式存在的，如卵磷脂、脑磷脂，亚麻油、花生四烯酸及前列腺素等。因此通常根据各种成分的溶解性质，采用相应溶剂系统从生物组织或反应体系中直接抽提出粗品，再经过各种分离纯化技术和精制方法，得到纯品。2、水解法在体内有些脂类药物与其它成分构成复合物，含这些成分的组织需经过水解或适当处理后再水解，然后分离纯化。如脑干中胆固醇酯经丙酮抽提，浓缩后残留物用乙醇结晶，再用硫酸水解和结晶才能获得胆固醇。

1893、化学合成或半合成法来源于生物的某些脂类药物可以用相应有机化合物或来源于生物体的某些成分为原料，采用化学合成或半合成法制备。4、生物转化法发酵、动植物细胞培养及酶工程技术可统称为生物转化法。如微生物发酵法或烟草细胞培养法生产CoQio。（二）、脂类药物的分离脂类生化药物种类较多，结构多样化，性质差异很大，通常用溶解度法及吸附分离法分离。1、溶解度法是根据脂类物质在不同溶剂中溶解度差异进行分离的方法,如游离胆红素在酸性条件溶于氯仿及二氯甲烷，故胆汁经碱水解及酸化后用氯仿抽提，其它物质难溶于氯仿，而胆红素则溶出，因此得以分离；又如卵磷脂溶于乙醇，不溶于丙酮，脑磷脂溶于乙醛而不溶于丙酮和乙醇，故脑干丙酮抽提液由于制备胆固醇，不溶物用乙醇抽提得到卵磷脂，用乙醛抽提得脑磷脂。2、吸附分值法是根据吸附剂对各种成分吸附力差异进行分离。（三）、脂类药物的精制经分离后的脂类药物中常有微量杂质，需要适当方法精制，常用的方法有结晶法，重结晶法和有机溶剂沉淀法。如用层析分离的PGE2经醋酸-已烷结晶。（四）、脂类药物在临床上的应用1.胆酸类药物临床应用胆酸类化合物是人及动物肝脏产生的留类化合物，集中于胆囊中排入肠道，对肠道脂肪起乳化作用，促进脂肪消化吸收，同时促进肠道正常菌群繁

190殖，抑制致病菌生长，保持肠道正常功能，但不同胆酸又有不同药理效应及临床应用。胆酸钠治疗胆囊炎、胆汁缺乏症及消化不良等；鹅去氧胆酸及熊去氧胆酸均有溶胆石作用，用于治疗胆石症，后者尚用于治疗高血压，急性及慢性肝炎、肝硬化及肝中毒等。1.色素类药物临床应用色素类药物有胆红素、胆绿素、血红素、原口卜琳、血口卜琳及其衍生物。胆红素是由四个毗咯环构成的线性化合物，为抗氧化剂，有清除氧自由基功能，用于消炎，也是人工牛黄重要成分。2.不饱和脂肪酸类药物临床应用该类药物包括前列腺素、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸及二十碳五烯酸等。前列腺素是多种同类化合物的总称，生理作用极为广泛。3.磷脂类药物临床应用该类药物主要有卵磷脂及脑磷脂，二者都有增强神经组织及调节高级神经活动作用，又是血浆脂肪良好的乳化剂，有促进胆固醇及脂肪运输作用，临床上用于治疗神经衰弱及防止动脉粥样硬化。4.固醇类药物临床应用该类药物包括胆固醇、麦角固醇及谷固醇。胆固醇为人工牛黄原料，是机体细胞膜不可缺少成分，也是机体多种留体激素及胆酸原料；麦角固醇是机体合成维生素D2的原料；B-谷固醇可降低血浆胆固醇。5.人工牛黄临床应用根据天然牛黄的组成而人工配制的脂类药物，其主要成分为胆红素、胆

191酸、猪胆酸、胆固醇及无机盐等。三、重要脂类药物的生产（一）、磷脂类药物磷脂类药物中除神经磷脂等少数成分外，其结构中大多含甘油基团,如磷脂酸，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等。1、卵磷脂的结构2、卵磷脂性质卵磷脂存在于动物各组织及器官中，脑，精液、肾上腺及红血球含量最多，卵黄中含量高达8%〜10%,故得名。其在植物中含量很少，唯大豆中含量甚高。为白色蜡状物质，无熔点，有旋光性，在空气中因不饱和脂肪酸烽链氧化而变色。极易溶于乙醛及乙醇，不溶于水，丙酮，为两性电解质。3、卵磷脂制备(1)工艺路线(2)工艺过程①提取与浓缩取动物脑干加3倍体积丙酮循环浸提20〜24h,过滤得滤液分离胆固醇。滤饼蒸去丙酮，力口2〜3倍体积乙醇浸提4〜5次，每次过滤的滤饼用于制备脑磷脂。合并滤液，真空浓缩，趁热放出浓缩液。②沉淀与干燥上述浓缩液冷却至室温，加入半倍体积乙酸，不断搅拌，放置2h,令白色不溶物完全沉淀，过滤，取滤液于激烈搅拌下加入粗卵磷脂重量1.5倍体积

192的丙酮，析出沉淀，滤除溶剂，得膏状物，以丙酮洗涤两次，真空干燥后得卵磷脂成品。4、应用临床上用于治疗婴儿湿疹、神经衰弱、肝炎、肝硬化及动脉粥样硬化。(二)、胆酸类药物胆酸类药物大多为24个碳原子构成得胆烷酸。人及动物体内存在的胆酸类物质是由胆固醇经肝脏代谢产生。其中胆酸及鹅去氧胆酸为初级胆酸，在肠道菌作用下生成去氧胆酸，猪去氧胆酸及石胆酸等次级胆酸。体内胆酸类化合物在肝脏大多与甘氨酸或牛磺酸形成结合型胆酸，总称胆汁酸，经胆囊排至肠道在微生物作用下大部分分解为游离胆酸和甘氨酸或牛磺酸，一部分经粪便排出体外，大部分为肠道吸收进行肠肝循环。1、猪去氧胆酸(1)猪去氧胆酸的结构与性质猪去氧胆酸的化学名为3a,6a-二羟基-58-胆烷酸，是猪胆酸(3a,6a,7a-三羟基-58-胆烷酸)经肠道菌催化脱氧而成。(2)工艺路线(3)工艺过程①猪胆汁酸制备取猪胆汁酸制取胆红素后滤液，加盐酸酸化至PH1〜2,倾去上层液体得黄色膏状胆汁酸。②水解与酸化上述胆汁酸加1.5倍氢氧化钠和9倍体积水，加热水解16〜18h,冷却后静

193置分层，虹吸上层淡黄色液体，沉淀物加少量水溶解，用6moi/LHQ酸化至pH1〜2,过滤，滤饼用水洗至中性，真空干燥得猪去氧胆酸粗品。③精制上述粗品加5倍体积醋酸乙酯，15〜20%活性炭，搅拌回流溶解，冷却，过滤，滤渣再用3倍体积醋酸乙酯回流，过滤。合并滤液，加20%无水硫酸钠脱水，过滤后，滤液浓缩至原体积1/5〜1/3,冷却结晶，滤取结晶并用少量醋酸乙酯洗涤，真空干燥得成品。3、胆色素类药物(1)胆红素结构与性质胆红素在动物肝脏中存在形式比较复杂，大部分与葡萄糖醛酸结合成酯,也有与葡萄糖或木糖成酯，游离者甚少。结合胆红素为弱酸性，溶于水，带电荷，难透过细胞膜，游离者溶于脂肪，不溶于水而易透过细胞膜。哺乳动物不能排泄游离胆红素，在肠道中可被吸收加入肝脏再结合，形成肠肝循环,结合胆红素经胆汁排入肠道后，变成尿胆原排出体外。

194第八节维生素及辅酶类药物一、概述(一)、基本概念1、维生素：是维持机体正常代谢机能的一类化学结构不同的小分子有机化合物,它们在体内不能合成，大多需从外界摄取。2、维生素在机体内生理作用特点：①维生素不能供给能量，也不是组织细胞的结构成分，而是一种活性物质,对机体代谢起调节和整合作用。②维生素需求量很小。③绝大多数维生素是通过辅酶或辅基的形式参与体内酶促反应体系，在代谢中起调节作用，少数维生素还具有一些特殊的生理功能。④人体内维生素缺乏时，会发生一类特殊的疾病，称“维生素缺乏症”。人体每日需要量是一定的，摄入量应根据机体需要提供，使用不当，反而会导致疾病。3、维生素种类：分为脂溶性和水溶性两大类。脂溶性维生素：主要有维生素A、D、E、K、Q和硫辛酸等；水溶性维生素：有日、&、氏、B12,烟酸，泛酸，叶酸，生物素和维生素C^o4、各种维生素及辅酶的主要功能、生产方法、临床用途见表16-2(p249)（二）、维生素及辅酶类药物的一般生产方法（p250）（1）化学合成法：

195用化学合成法生产的维生素有：烟酸、烟酰胺、叶酸、维生素巳、硫辛酸、维生素£、维生素D、维生素E、维生素K等。（2）发酵法：目前完全采用微生物发酵法或微生物转化制备中间体的有维生素B2,维生素&，维生素OU生物素，维生素A原（B胡萝卜素）等。（3）直接从生物材料中提取：猪心中提取辅酶Q.槐花米中提取芦丁，提取链霉素后的废液中制取B12等。在实际生产中，有的维生素既用合成法又用发酵法，如维生素C、叶酸、维生素&等；也有既用生物提取法又用发酵法的，如辅酶Qi。和维生素B12等。二、重要维生素及辅酶类药物生产（一）、维生素B2维生素62（vitaminB2）又称核黄素（riboflavin）,广泛存在于动植物中，以酵母、麦糠及肝脏中含量最多。临床上用于治疗体内因缺乏维生素&所致的各种黏膜和皮肤的炎症，如角膜炎、结膜炎、口角炎和脂溢性皮炎等。1.维生素&结构分子中异咯嗪环中第1位和第10位的氮原子可被还原，在生物代谢过程中有递氢作用。2.生产工艺（1）培养基：米糠油4%,玉米浆1.5%，骨胶1.8%,鱼粉2.5%,KH2Po40.1%，NaQ0.2%,CaO20.1%,（NH4）2SO40.02%o（2）维生素R发酵工艺流程(3)维生素屯的提取与结晶

196将维生素屯发酵液用稀盐酸水解，以释放部分与蛋白质结合的维生素民；然后加黄血盐和硫酸锌，除去蛋白质等杂质，将除去杂质后的发酵滤液加3-羟基-2-蔡甲酸钠，使之与维生素B形成复盐进行分离精制。提取工艺流程如下：(二)、维生素C维生素C(vitaminC,Vc)又名抗坏血酸(ascorbicacid),用于防治坏血病和抵抗传染性疾病，促进创伤和骨折愈合，以及用作辅助药物治疗。维生素C广泛存在于自然界，以新鲜蔬菜及水果中含量较多，药品可用化学合成方法或二步发酵法生产。1.结构2.两步发酵法生产工艺流程(1)维生素C两步发酵法工艺流程(2)工艺过程及控制要点在整个合成过程中山梨糖的制备是关键的一步，用醋酸菌能使山梨醇氧化成山梨糖。第二步发酵是氧化葡萄杆菌或假单胞杆菌经过二级种子扩大培养转移至含有第一步发酵液的培养基中，在28〜34c下培养60〜72h放罐发酵液转化精制获得维生素Co(三)辅酶I辅酶I(Col)又称NAD+,为烟酸胺腺喋吟二核甘酸，是脱氢酶的辅酶。临床用于精神分裂症、冠心病、心肌炎、白细胞减少症可加强体内物质的氧化并供、急慢性肝炎、迁移性肝炎及血小板减少症，也是多种酶活性诊断试剂的重要组成。Col广泛存在于动植物中，如酵母、谷类、豆类、动物的肝脏、肉类等。1.结构2.生产工艺

197（1）工艺流程（2）工艺过程及控制要点（p255）①细胞破壁、提取；②吸附、洗脱；③中和，吸附：④洗脱、吸附、洗脱；⑤沉淀、干燥。第九节脩类激素药物一概述激素是生物体产生的，对机体代谢和生理机能发挥高效调节作用的化学信使分子。激素的特点1.高度专一性：包括组织专一性和效应专一性。前者指激素作用于特定的靶细胞、靶组织、靶器官。后者指激素有选择地调节某一代谢过程的特定环节。例如，胰高血糖素、肾上腺素、糖皮质激素都有升高血糖的作用，但胰高血糖素主要作用于肝细胞，通过促进肝糖原分解和加强糖异生作用，直接向血液输送葡萄糖；肾上腺素主要作用于骨骼肌细胞，促进肌糖原分解，间接补充血糖；2.极高的效率：激素与受体有很高的亲和力，因而激素可在极低浓度水平与受体结合，引起调节效应。激素在血液中的浓度很低，一般蛋白质激素的浓度为10-1°〜10'12moi其他激素在10-6〜而且激素是通过调节酶量与酶活发挥作用的，可以放大调节信号。(一)、密类激素药物的分类及其生理作用

198根据其生理活性可分为肾上腺皮质激素、性激素和蛋白同化激素三大类。留类化合物的基本结构1.肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素按其生理功能，又可分为糖皮质激素和盐皮质激素两大类。以可的松(conisonc)和氢化可的松(hydrocoritsonc)为代表的糖皮质激素是由肾上腺束状带细胞所合成和分泌，主要影响人体的糖、蛋白质和脂肪的代谢，而对水、盐的代谢作用影响较小。临床上主要用于抗炎、抗过敏等。以醛密酮和去氧皮脩酮为代表的盐皮质激素是由肾上腺的球状带细胞所分泌，主要作用是促进钠离子由肾小管的重吸收，从而使钠的排泄量减少，促进钾的排泄。临床上主要用于治疗慢性肾上腺皮质机能减退症(阿狄森病)及低血钠症。2.性激素性激素按生理功能分为雄性激素和雌性激素两大类。性激素的重要生理功能是刺激副性器官的发育和成熟，激发副性特性的出现，增进两性生殖细胞结合和孕育能力，还有调节代谢作用。临床上主要用于两性性机能不全所致的各种病症、计划生育，妇产科疾病和抗肿瘤等。雄性激素属于G9类固醇，主要由睾丸和肾上腺皮质所产生，卵巢也有少量合成。睾丸分泌的雄激素主要有3种：睾酮、脱氢异雄酮和雄烯二酮。雌性激素包括雌激素和孕激素两类，主要由卵巢合成和分泌，肾上腺皮质和睾丸也能少量合成。雌激素，真正由腺体分泌、有活性的只有3种：176-雌二醇、雌酮和雌三醇。它们的生理活性相差很大，其相对比活为100:10:3。孕激素属于Gi类固醇，体内真正存在的是孕酮，其结构与活性的关系较密切。3.蛋白同化激素蛋白同化激素是一类从睾丸酮衍生物中分化出来的药物。如17a-甲基去氢

199睾丸素（商品名为大力补）。该类药的特点是性激素的作用大为减弱，而蛋白同化作用仍然保留或增强，临床使用比较安全，较少引起男性化症状等不良反应。其主要作用有：①促进蛋白质合成和抑制蛋白质异化；②加速骨组织钙化和生长；③刺激骨髓造血功能，增加红血球量；④促进组织新生和肉芽形成；⑤降低血胆脩醇。临床上用于与上述作用相应的病症。（二）、每类激素药物的生产这些天然笛类激素，有的可进行人工合成，如雌二醇等；有的可利用微生物或其他方法对已有的化合物进行结构改造，以获得生物活性更强的新化合物，供临床使用。早期，笛类激素药物的生产主要靠化学全合成。目前在脩类激素药物的生产中，一般都采用化学和微生物两种方法相结合的生产工艺。（三）、微生物转化的特点和类型1、微生物转化的特点①可减少化学合成步骤，简化生产设备，缩短生产周期。如由黄体生产快诺酮,利用微生物法后，可减少6步工序。②可提高产物得率和质量，降低成本。如用黑根霉羟化孕酮得率达90%以上。③可进行化学法难以进行的反应，如脩类化合物G11上的加氧(即羟化)等反应,化学法很难进行，而采用微生物法则比较容易。④其他生物虽能产生这类羟化酶，但微生物产生的酶系种类最多。据统计，微生物要比哺乳动物多16、38、5a、12B、15a、166等12种羟化酶。⑤可改善工人的劳动条件，避免或减少使用强酸、强碱或有毒物质。

2002、微生物转化的反应类型微生物转化脩类化合物的反应类型，至今已发现的有：氧化反应、还原反应、水解反应、酰化反应、异构化反应、卤化反应和A环开环反应等。(1)氧化反应a羟化反应；b环氧化反应；c脱氢反应；d芳环化反应(2)还原反应(3)水解反应二、留类激素的生产一、脩类激素生产原料胆固醇(14)、胆酸(15)、薯薪皂普配基(16)、豆密醇(17)、B-谷留醇(18)、澳洲茄碱(19)海柯皂普配基(20)、替告皂昔配基(21)薯薪皂昔配基的提取工艺流程薯薪皂普配基在全世界的产量为最大，也是制造脩类激素的最理想原料,其中有60%的产量用于合成皮质激素药物。如果将原料在酸水解之前经过预发酵，不但能缩短水解时间，还能提高薯薪皂昔元的收得率。2%提高到54%o（二）、脩类激素生产的基本过程

201从起始原料，合成每类药物，需要经过比较复杂的反应过程。大多数是采用化学合成和微生物转化相结合，根据反应的难易程度，确定哪一步反应采用微生物学方法。（三）、微生物生物转化（p266）微生物转化的工艺流程：1.筛选转化菌①首先在适当培养基上培养试验菌1〜2d；②将留类化合物溶解在水溶性溶剂中（如二甲基甲酰胺、丙酮、丙二醇），将其加入微生物培养液中继续培养1〜5d,结束培养；③利用二氯甲烷或其他非极性溶剂（氯仿、乙酸乙酯）提取所得发酵液，用柱层析或其他方法精制，得转化产物；④利用有机化学方法确定产物的结构。利用这个筛选方法，已经发现大多数霉菌和链霉菌能转化某些密类化合物。2.确定催化转化反应可利用微生物细胞的形式催化转化反应的微生物所产生的酶系，有不同的生长阶段性，因而，进行转化反应可以利用各种不同形式的微生物细胞：①菌体培养物；②非增殖（“静止”）细胞悬浮液或无细胞提取物；③同时进行其他反应的微生物系统；④微生物抱子悬浮液；⑤固定化全细胞或酶。其中④、⑤两种形式的生物催化剂已经引起人们广泛的重视，但尚未达到工业化生产规模。

2021.微生物转化的发酵(1)菌体培养物的制备(2)脩类物质的转化

203第六章生物制品第一节生物制品概述一、基本概念1.生物制品(biologicalproducts)及其发展沿革第一次是以牛痘及脊髓灰质炎疫苗为代表的减毒、灭活疫苗，它为天花及小儿麻痹症等疾病的控制及根除作出巨大的贡献，但存在潜在致病性的危险。随着生物技术的发展，以天然或重组成分为主的亚单位疫苗的研制成功是疫苗的第二次变革。这类疫苗以其成分单一、效果明确、无致病作用为特点，但其工艺复杂、价格昂贵等问题限制了应用的范围。近年发展起来的用表达特定抗原蛋白的核酸制成的核酸疫苗，因具有高效、持久、广谱、简便、稳定、廉价、无致病性等特点发展得十分迅速。预见核酸疫苗将作为第三代新型疫苗而得到广泛的研究和应用。2.亚基疫苗(subunitvaccine)利用病原体的某一部分通过基因工程克隆而制得的疫苗称为亚基疫苗。3.活体重组疫苗通过基因工程的方法，对非致病性微生物(细菌和病毒)进行改造，使之携带并表达某种特定病原体的抗原决定簇基因，产生免疫原性；或通过基因工程的方法修饰或删除致病性微生物的毒性基因，使之仍保持免疫原性所制成的疫苗。4.核酸疫苗

204核酸疫苗就是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在生物体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。1.免疫佐剂及其效应免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用，能增强机体对抗原的免疫应答能力，或改变免疫应答类型的物质，包括：无机佐剂如氢氧化铝，有机佐剂如脂多糖、分支杆菌等，合成佐剂如双链聚肌胞等。2.基因治疗基因治疗是将具有正常功能的基因转移到病人体内并发挥功能，纠正病人体内所缺乏的蛋白质或赋予机体新的抗病功能。更为广义的基因治疗还包括从基因水平对基因表达的调控。二、生物制品的分类p271(一)根据所用材料分类(1)菌苗：由有关细菌、螺旋体制成。(2)噬菌体：由特定宿主菌的噬菌体制成。(3)疫苗：由有关立克次体、病毒制成。(4)抗血清与抗毒素：经特定抗原免疫动物后，采血分离血浆或血清制成。(5)类毒素：由有关细菌产生的外毒素经脱毒后制成。(6)混合制剂：由两种以上菌苗或疫苗或类毒素混合制成。(7)血液制品：由人或动物的血液分离提取制成。(二)根据用途分类

2051.预防类制品此类制品主要用于感染性疾病的预防。(1)疫苗(2)类毒素：常用的有白喉、破伤风、肉毒类毒素及葡萄球菌类毒素等。(3)混合制剂：常用的混合制剂有以下几种。①联合细菌：伤寒、副伤寒甲、乙联合菌苗，霍乱、伤寒、副伤寒甲、乙联合菌苗。②联合病毒：麻疹、牛痘苗联合疫苗，麻疹、风疹联合疫苗，风疹、腮腺炎联合疫苗，麻疹、腮腺炎风疹联合疫苗。③细菌和类毒素混合制剂：白喉类毒素、百日咳菌苗和破伤风类毒素混合制剂。2.治疗类制品(1)抗血清与抗毒素：用特定抗原免疫马、牛或羊，经采血、分离血浆或血清，精制而成。抗细菌和病毒的称抗血清；抗蛇毒和其他毒液的称抗毒血清；抗微生物毒素的称抗毒素。(2)血液制品：常用血液制品见表18-4,其中正常人丙种球蛋白和超免疫球蛋白亦可兼作预防剂。(3)噬菌体：用于裂解宿主菌，以治疗由宿主菌所引起的疾病，如痢疾杆菌噬菌体和绿脓杆菌噬菌体，可分别用于治疗菌痢和绿脓杆菌感染症，但其疗效尚难肯定。(4)疫苗：乙型肝炎治疗疫苗；单纯疱疹病毒疫苗：麻风病治疗疫苗；其他治疗疫苗。(5)抗体：抗乙型肝炎表面抗原单克隆抗体，单克隆抗体靶向制剂等。(6)基因治疗：有两种治疗方式：①矫正性基因治疗，包括基因置换(genereplacement)基因矫正(correction)和基因增强(geneaugmentation)；②调

206控性基因治疗，是通过调控某些基因的表达来改善症状，属于更广义的基因治疗。1.诊断类制品(1)体内诊断用品：用于皮内接种，以判断个体对病原的易感性或免疫状态。如锡克毒素和结核菌素等。(2)体外诊断用品：三、生物制品的免疫学基础1.机体的抗感染免疫机体的抗感染免疫传统上分为先天性免疫和获得性免疫两大类：2.人工免疫人为地给机体输入抗原以调动机体的免疫系统，或直接输入免疫血清，使其获得某种特殊抵抗力，用以预防或治疗某些疾病者，称为人工免疫(artificialimmunization)o人工免疫用于预防传染病时，常称预防接种，它是增强人体特异免疫力的重要方法。有两种人为方式，可使机体获得有效的免疫力，即自动免疫和被动免疫。(1)人工自动免疫(artificialactiveimmunization)人工自动免疫是给机体输入抗原物质，使免疫系统因抗原刺激而产生类似感染时所发生的免疫过程，从而产生特异性免疫力。这种免疫力出现较慢，常有1〜4周诱导期，但维持较久，可从半年到数年。用于人工自动免疫的抗原性制剂，大部分由病原微生物直接制成，称为疫苗；亦可取微生物毒素去毒而制成，称为类毒素。(2)人工被动免疫(artificialpassiveimmunization)输入免疫血清(含特异性抗体)，使机体获得一定免疫力，以达到防治某些疾病目的，称为人工被动免疫。输入特异性抗体后，可立即发挥免疫作用。但由于免疫力的产生不经自身免

207疫系统，因此维持时间常较短暂。人工自动免疫与人工被动免疫的主要特点比较1.机体免疫的机制类免疫系统主要分为两大类，即体液免疫和细胞免疫。所谓体液免疫也就是通过形成抗体而产生的免疫能力。抗体是由血液和体液中的B细胞产生，主要存在于体液中，它可与入侵的外来抗原物质相结合，使其失活。所谓细胞免疫是指主要由各种淋巴细胞来执行的免疫功能，它又可以分为两类，即MHCI型和MHCII型。主要组织相容性复合体(majorhistocompatibiHtycomplexMHC)MHCI型是指抗原经过一系列复杂的传递过程，由MHCI型分子(主要组织相容性抗原I型)加工后，产生一些传递信号的小肽激活88T细胞，而CD8T细胞可以通过释放水解酶和其他化合物把受病原体感染或变异的细胞杀死。MHC1I型是指外源抗原通过细胞内吞噬，经MHCH型分子(主要组织相容性抗原II型)加工后，激活CD4T细胞。激活的84T细胞可辅助激活抗原专一性的B细胞，它能产生杀伤性T细胞(killerTcell),并进一步激活更多种类的T细胞，从而杀死外来病原体。人体免疫系统的工作机制图第二节生物制品的一般制造方法一、病毒类疫苗制造方法1.毒种的选择和减毒用于制备疫苗的毒株，一般需具备以下几个条件：①必须持有特定的抗原性，能使机体诱发特定的免疫力，阻止相关病原体的入侵或防止机体发生相应的疾病。②应有典型的形态和感染特定组织的特性，并在传代的过程中，能长期保持其生物学特性。

208③易在特定的组织中大量繁殖。④在人工繁殖的过程中，不应产生神经毒素或能引起机体损害的其他毒素。⑤如是制备活疫苗，毒株在人工繁殖的过程中应无恢复原致病力的现象，以免在使用时，诱发机体发生相应的疾病。⑥在分离时和形成毒种的全过程中应不被其他病毒所污染，并需要保持历史记录。用于制备活疫苗的毒种，往往需要在特定的条件下将毒株经过长达数十次或上百次的传代，降低其毒力，直至无临床致病性，才能用于生产。1.病毒的繁殖p276所有动物病毒，只能在活细胞中繁殖。病毒通常可用下列几种方法繁殖。(1)活体动物培养(2)鸡胚培养(3)组织培养(4)细胞培养细胞培养时主要控制以下内容①常用的维持液和生长液②培养条件的控制a.pH值的控制；b.CQ的提供；c.氧的提供；d.培养容器内壁洁净度的控制；e.细菌污染的控制；f.培养温度和时间的控制2.疫苗的灭活不同的疫苗，其灭活的方法不同，有的用甲醛溶液(如乙型脑炎疫苗、脊髓灰质炎灭活疫苗和斑疹伤寒疫苗等)，有的则用酚溶液(如狂犬疫苗)。

209所用灭活剂浓度则与疫苗中所含的动物组织量有关。如鼠脑疫苗、鼠肺疫苗等含有多量动物组织的疫苗，需较高浓度的灭活剂，若用甲醛溶液，用量一般为0.2%〜0.4%。如系组织培养的疫苗一般含动物组织量少，灭活剂的浓度可低一些，若用甲醛溶液，一般为0.02%〜0.05%。灭活温度和时间，需视病毒的生物学性质和热稳定性质而定。有的可于37c下灭活12d（如脊髓灰质炎灭活疫苗），有的仅需18〜20℃下灭活3d（如斑疹伤寒疫苗）。其原则是既要以足够高的温度和足够长的时间充分破坏疫苗的毒力，又要尽量减少疫苗免疫力的损失。1.疫苗的纯化疫苗纯化的目的，是去除存在的动物组织，降低疫苗接种后可能引起的不良反应。用细胞培养所获得的疫苗，动物组织量少，一般不需特殊的纯化,但在细胞培养的过程中，需用换液的方法除去培养基中的牛血清；用动物组织所制成的疫苗，可经过乙醛纯化，或经透析、浓缩，或用超速离心提纯，亦可用三氯醋酸提取抗原。这些方法的工艺均较复杂，且不能达到完全消除不良反应的目的，故这种疫苗已被细胞培养的疫苗取代。2.冻干疫苗的稳定性较差，一般在2〜8c下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。在37℃下，许多疫苗只能稳定几天或几小时，故非常不利于在室温下运输。为使疫苗的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥。这样，疫苗的有效期往往可以延长一倍或一倍以上，在室温下其效价的损失亦较慢。冻干的要点是：先将疫苗冷冻至共融点以下，在真空状态下将水分直接由固态升华为气态，然后缓慢升温，不使疫苗在任何时间下有融解情况发生，直至完全干燥，冻干的疫苗在真空或充氮后密封保存，使其残余水分保持3%以下。这样的疫苗将能保持良好的稳定性。

210二、细菌类疫苗和类毒素的一般制造方法1.菌种的选择用于菌苗的菌种，一般须具备以下几个条件。①菌种必须持有特定的抗原性，能使机体诱发特定的免疫力，阻止有关病原体的入侵或防止机体发生相应的疾病。②菌种应具有典型的形态、培养特性和生化特性，并在传代的过程中，能长期保持这些特性。③菌种应易于在人工培养基上培养。④如系制备死菌苗，菌种在培养过程中应产生较小的毒性。如系制备活菌苗，菌种在培养过程中应无恢复原毒性的现象，以免在使用时，机体发生相应的疾病。⑤如系制备毒素，则菌种在培养的过程中应能产生大量的典型毒素。总之，制备菌苗和类毒素的菌种，应该是生物学特性稳定、能获得安全性好、效力高的产品的菌种。2.培养基的营养要求除碳源、氮源和各种无机盐类等培养微生物所需要的一般营养要素外，由于某些微生物生理上的特殊性，往往需要某些特殊营养物才能生长。例如结核杆菌需以甘油作为碳源；有些分解糖类能力较差的梭状芽抱杆菌需以氨基酸作为能量及碳与氮的来源；又如百日咳杆菌生长需要谷氨酸和胱氨酸作为氮源。培养致病菌时，在培养基中除应含有一般碳源、氮源和无机盐成分外，往往还需添加某种生长因子。生长因子是某些细菌生长时所必需，自身不能合成，需要自外界摄取的一些微量的有机化合物。不同的细菌需要不同的生长因子。3.培养条件的控制p278（1）气体；（2）温度；（3）pH值；（4）光

2111.杀菌只有死菌疫苗制剂在制成原液后需要用物理或化学方法杀菌，而活菌苗不必经过此步骤。各种菌苗所用的杀菌方法不相同，但杀菌的总目标是彻底杀死细菌而又不影响菌苗的防病效力。以伤寒菌苗为例，可用加热杀菌法、甲醛溶液杀菌、丙酮杀菌等方法杀死伤寒杆菌。2.稀释、分装和冻干经杀菌的菌液，一般用含防腐剂的缓冲生理盐水稀释至所需的浓度，然后在无菌条件下分装于适当的容器，封口后在2〜10C保存，直至使用。有些菌苗，特别是活菌苗，亦可于分装后冷冻干燥，以延长它们的有效期。三、生物制品的分包装1.生物制品的分装2.生物制品的包装1.生物制品的分装（1）待分装的制品必须检定合格，待分装的制品标签必须完整、明确，品名、批号须与分装通知单完全相符，瓶口须包扎严密，瓶塞须完整，容器无裂痕,外观符合要求。（2）分装前应加强核对，防止错批、混批。（3）制品的实际装量应多于标签标示量。2.生物制品的包装熔封后的安甑，须经破漏检查，可采用减压或其他方法。包装前应按包装通知单所载有效期准备瓶签、盒签或印字戳。瓶签上应载明制品名称、批号及亚批号、有效期。抗血清、抗毒素及诊断血清应加注单位或效价。在盒签上须载明制品名称、批号及亚批号、规格、有效期、保

212存温度、注意事项及制造者姓名。每盒应附有说明书。包装后制品装箱时，箱外要注明制品名称、批号、规格、数量、有效期、制造者姓名、保存及运输中应注意事项。第三节生物制品质量要求与检定（自学）一、生物制品的质量要求二、生物制品的质量检定三、生物制品检定标准第四节重要生物制品的制备一、乙型肝炎疫苗二、流行性乙型脑炎疫（自学）三、脊髓灰质炎疫苗的制备（自学）四、卡介苗的制备（自学）五、霍乱菌疫苗的制备（自学）六、白喉类毒素（自学）七、破伤风类毒素的制（自学）一、乙型肝炎疫苗（一）基因工程疫苗（二）血源乙型肝炎疫苗的制备（一）基因工程疫苗指将乙型肝炎病毒(HBV)基因组中乙肝表面抗原(HBsAg)的DNAJ子列构建到表达载体上，并在宿主细胞中表达，所表达的抗原经纯化后制备成的重组

213亚单位乙肝疫苗。主要有下述几种：1、重组酵母乙肝疫苗(YDV),指在酵母表达系统表达的HBV包膜蛋白疫苗。2、重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞乙肝疫苗，指在CHO细胞中表达的HBV包膜蛋白疫苗。该疫苗免疫原性强，抗原纯化简单，适于大规模生产。3、C127乙肝疫苗(Hepagene)是由英国Medeva公司采用鼠c127纯系细胞株表达的一种含Pre-S1,Pre-S2及S抗原成分的新型乙肝疫苗。1、HBADNA结构Dane颗粒表面由一种蛋白质包裹，被称作表面抗原(HBsAg),HBsAg含有3种蛋白成分，分别由3种不同基因编码：①小蛋白(S蛋白)，为S£因编码的由226个氨基酸残基组成的多肽，是HBsAg和HBV包膜的主要成分，也是HBV的主要蛋白；②中蛋白(M蛋白)，由S蛋白和前S2基因编码的55个氨基酸残基多肽(前S2蛋白)组成，它具有一个多聚人血清白蛋白(pHSA)受体位点；③大蛋白(L蛋白)，为M蛋白和前S1基因编码的108〜109个氨基酸残基多肽(前S1蛋白)组成。2、乙肝病毒(HBV)基因在真核细胞中的表达途径①将HBV的S、S2或S1基因重组质粒转化酵母，用重组酵母生产HB疫苗；②将S、S2或S1基因重组质粒转化哺乳动物细胞；③将S、S2或S1基因插入痘苗病毒DNA拒必需区，传染中华地鼠卵巢细胞，大量培养该动物细胞株生产HB疫苗；④将S、S2或S1基因插入昆虫核多角体病毒DNA非必需区，转染家蚕和蝶蛹生产HB疫苗。3、酵母表达系统制备乙型肝炎疫苗

214基因工程疫苗酵母表达系统建立后，将3.2kbHBsAg基因组DNA插进酵母表达质粒载体，转进酵母菌，在编码甘油醛脱氢酶（GAPDH）I基因的强启动子作用下进行转录，该载体上有细菌及酵母菌两者的DNA复制起点（即为穿梭质粒），后加ADH-1作为终止物形成一个基因盒，它可以通过转化进入大肠杆菌或酵母菌，并在其中复制和表达。当上述表达载体进入酵母菌后，在发酵罐内酵母细胞达到高密度，并产生大量与天然物类似的病毒蛋白，大约占酵母总蛋白量的1%〜2%。重组酵母细胞乙肝基因工程构建图酵母乙肝疫苗生产流程用含HBsAg基因的质粒转化中国仓鼠卵巢细胞，该细胞用单层或悬浮培养可表达HBsAg,其培养基为含10%小牛血清的Eagle培养基，待长成单层后转入含5%小牛血清的Eagle培养液。所分泌的HBsAg可释放到培养液中。从培养液中回收上清液，进行过滤，硫酸镂沉淀浓缩，浓缩物用不降解的沉淀剂处理（一般为聚乙二醇6000起始及终止浓度分别为5%〜9.5%）,以沉淀出大分子DNA、逆转录病毒颗粒及蛋白，所需蛋白溶液得到进一步浓缩。再用蔗糖或甘油进行密度梯度离心（该梯度对逆转录病毒颗粒无促溶作用并能按照被分离物的大小及密度分离HBsAg）。最后用阴离子交换柱纯化，得到纯度大于95%、具有较强免疫原性、能在短期内迅速诱生高滴度的前S2抗体的HBsAg疫苗。（二）血源乙型肝炎疫苗的制备血源乙型肝炎疫苗的制备方法大致有三种。①取无症状带毒者的HBsAg阳性血浆，经硫酸镂沉淀，沉淀透析除去硫酸锈，用溟化钾及蔗糖作等密度与速率区带离心，去杂蛋白与Dane颗粒，加入1:2000福尔马林60C,10h（或1:4000福尔马林36c灭活72h）,以氢氧化铝作佐剂，有的还以尿素及胃酶消化，以除去杂蛋白及灭活潜在病毒。

215②用含HBsAg阳性血浆，以聚乙二醇浓缩（30倍）和羟基磷灰石吸附（浓缩200倍），再等密度超速离心（浓缩1500倍），然后用去垢剂把Dane颗粒破坏，甲醛灭活后加佐剂。此法可大大减少超速离心次数，节省经费。该疫苗除含HBsAg外，还含HBeAg,但不含HBcAg和病毒DNA。③用ThtonX-lOO裂解HBsAg,又经亲和层析及2-甲基甘露糖甘洗脱，获得P25与P30的多肽二聚体，但不含人血清白蛋白P64成分，用蔗糖梯度超速离心去除去垢剂，得到的直径为80〜250mm蛋白质聚合体（微胶粒）中不含脂蛋白，免疫原性很强。第五节核酸疫苗一、概述1、什么是核酸疫苗核酸疫苗（nucleicacidvaccine）,也叫基因疫苗（geneticvaccine）、核酸免疫（nucleicacidimmunization）、DNA免疫（DNAbasedimmunization）,它是利用基因重组技术直接将编码某种抗原蛋白的外源基因（DNA）与质粒重组后，直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。2、核酸疫苗的特点（1）免疫保护力增强：接种后蛋白质在宿主细胞内表达，直接与组织相容性复合物MHCI或II类分子结合，同时引起细胞和体液免疫，对慢性病毒感染性疾病等依赖细胞免疫清除病原的疾病的预防更加有效。(2)制备简单，省时省力：核酸疫苗作为一种重组质粒，易在工程菌内大量扩增，提纯方法简单，可制备多价核酸疫苗。(3)同种异株交叉保护：这是基因疫苗的最大优点之一。在制备基因疫苗时，可通过对基因表达载体所携带的靶基因进行改造，从而选择抗原决定簇。

216(4)应用较安全：接种核酸疫苗后，蛋白质抗原在宿主细胞内表达，无因毒力返祖或残留毒力病毒颗粒而引发疫病的危险，也不会引起对机体的不良反应。(5)产生持久免疫应答：免疫具有持久性，一次接种可获得长期免疫力，无需反复多次加强免疫。(6)贮存、运输方便：核酸疫苗的质粒DNA稳定性好，无须冷藏。(7)可用于防治肿瘤：核酸疫苗可以诱导CTL(细胞毒性T淋巴细胞),CTL应答也是机体杀死癌变细胞的有效清除途径。3、核酸疫苗潜在的危险因素(1)质粒DNA可能诱导自身免疫反应，但是人和动物的许多试验表明质粒DNA诱发自身免疫性疾病的可能性较小。(2)持续表达外源抗原可能产生一些不良后果。质粒长期过高水平地表达外源抗原，可能导致机体对该抗原的免疫耐受或麻醉。(3)肌肉注射质粒后，仅有很少部分被肌细胞所摄取，反复用PCR技术检查血中质粒，结果为阴性，揭示肌注后逸入血流的疫苗质粒数量是微不足道的，质粒去向如何尚待进一步阐明。(4)影响核酸疫苗诱发机体免疫应答的因素很多，目前已知的主要有载体设计、核酸疫苗的导入方法、佐剂及辅助因子会对其免疫效果有影响。另外年龄和性别因素、肌注剂量和体积、预先注射蔗糖溶液等都会对肌注质粒DNA表达有影响。（5）外源DNA注入体内后，可能整合到宿主基因组上，使宿主细胞抑癌基因失活或癌基因活化，使宿主细胞转化成癌细胞，这也许是核酸疫苗的诸多安全性问题中最值得深入研究的地方。二、核酸疫苗的免疫机理

2171、核酸疫苗是近年发展的一种核酸介导的免疫接种疫苗，其本质是含有病原体抗原基因的真核表达载体。当它被导入机体后，可被机体细胞所摄取并表达病原体的抗原蛋白，从而诱发机体对该蛋白的免疫反应。随着导入途径和部位的不同可引发全身或局部的免疫反应。在全身性的免疫应答反应中，既可激活体液免疫，也可诱发细胞免疫。2、核酸疫苗可以引发全面免疫应答当带有高效表达调控序列的保护性抗原基因导入动物体细胞（任何有核细胞）后，只有少量被细胞摄取而进入细胞核，在载体上的启动子调控下，转录出抗原基因mRNA,后者进入胞浆而转译出相应的抗原蛋白。抗原呈几种方式而呈递到免疫系统：①抗原在细胞内经加工后与MHCI分子结合呈递到细胞表面，刺激细胞毒性T淋巴细胞（CTL）；②蛋白质从细胞中释放出来与B细胞受体结合，刺激B细胞；③部分释放出的蛋白质被抗原呈递细胞所吸收、降解，然后与MHCII分子结合后刺激辅助性T细胞，最终引发了免疫系统的响应。免疫系统的响应程度，它与不同的免疫部位、细胞的表达程度和是否增加免疫调节基因有关。3、核酸疫苗还可诱发局部的免疫应答和免疫记忆如果用基因枪将包裹有核酸疫苗的金颗粒导入粘膜下，即可能被粘膜下丰富的粘膜相关淋巴组织中的淋巴细胞或粘膜上皮细胞摄取并表达，产生的抗原蛋白也很容易被局部丰富的抗原提呈细胞（APC）识别、摄取、加工并提呈给TH细胞，进一步激活局部淋巴滤泡中的B细胞分化为浆细胞和Bm细胞,后者产生免疫记忆，前者可合成IgA,且两个IgA单体有J链连接在一起，通过粘膜时，由粘膜上皮细胞产生的分泌片与双体IgA连接，组成稳定的分泌型IgA

218随粘膜分泌液一起排出细胞，分布于粘膜表面，在粘膜局部防御感染中起十分重要的作用。4、细菌DNA本身也是一种免疫佐剂，可有效地激活免疫效应细胞介导这一作用是一类具有特征性的短核甘酸序列，被称为免疫刺激DNA序列（ISS）。ISS的发现以及对其生物学功能研究的不断深入，扩展了人们对DNA生物学的新认识。有学者认为，对ISS的研究有望提供一种高效、低毒、适用于人类及动物的新型佐剂。5、还有人认为DNA免疫时，肌细胞和抗原提呈细胞（APC）均被转染，引起84+T、88'T细胞亚群的同时活化，产生了特异性免疫应答。肌肉细胞如何吸收质粒DNA,机制尚不明确。有人提示可能与骨骼肌纤维有丰富的含多处内折的T小管系统有关，其独特的解剖结构有助于质粒DNA的吸收。三、核酸疫苗的制备要获得大量的、纯度较高、超螺旋结构的重组质粒DNA。就需要通过培养含有表达质粒的工程菌使质粒扩增，利用一系列的纯化方法获得纯度较高的质粒DNA。1、工程菌的扩增2、核酸疫苗的纯化3、质粒的浓缩1、工程菌的扩增工程菌的扩增主要采用深层液体培养的方法，该方法由于其营养丰富，振荡培养过程中又能提供相对较多的氧气，工程菌生长状态较好，适合实验室规模的培养和扩增。具体方法如下：从固体培养基中挑取单菌落接种于30mLLB培养基(含适量

219相应抗生素)中，于37C空气摇床中振荡培养(200r/min)过夜；次日，将含相应抗生素的500mLLB培养基放入三角烧瓶中，加入25mL上述过夜菌，于37℃振荡培养2.5h,使细菌得以充分扩增；加入氯霉素溶液，使其终浓度为170ug/mL,于37℃振荡培养16h。氯霉素的加入，可抑制细菌的繁殖，但不影响质粒的复制，这样就能大大提高每个细菌中质粒的拷贝数，并可减少纯化过程中细菌裂解物的体积和黏稠度，能较大程度地简化质粒纯化过程，提高质粒提纯效率。2、核酸疫苗的纯化(1)收集、裂解细胞的和质粒的初步抽提细胞的收集可利用离心的方法完成。裂解细胞(使细菌的细胞壁和细胞膜破裂的过程)一般有煮沸法、5口颤裂解法、非离子型去垢剂法等。(2)质粒DNA的纯化①聚乙二醇(PEG)沉淀法②氯化钠-溟乙锭梯度平衡离心法③柱层析法3、质粒的浓缩经纯化(尤其是柱层析纯化)后的质粒一般较稀，有必要对其进行进一步浓缩。目前，质粒DNA的乙醇沉淀是最有效且简便的浓缩方法。异丙醇也可使DNA沉淀，但由于其不易挥发，且易导致杂质的共沉淀，因此，在核酸疫苗制备的最后一步一般不宜使用。具体步骤：①在DNA溶液中加入1/10体积的盐离子溶液(3mol/LCH3coONapH=5.2为最常用，2moi/LNaQ也可使用)，混匀；②再加入2〜2.5倍体积的无水乙醇，混匀后于0℃放置5〜10min；

220③4℃,高速离心(12000g)15-20min；④去上清，用70%乙醇漂洗沉淀，于室温晾干；⑤将沉淀溶于适当体积的PBS(pH=7.4)中。四、核酸疫苗免疫效果的影响因素1、质粒载体和启动子的选择真核表达质粒是核酸疫苗的主体，表达载体表达抗原蛋白的能力越强，诱发宿主产生的免疫应答能力越强。不同类型的启动子/增强子、内含子序列、翻译起始序列、转录终止序列、mRNA的稳定性等调控元件可直接影响基因表达效率，其中启动子是影响核酸疫苗表达最重要因素。RSV启动子/增强子的表达水平比SV高1000倍，CMV(巨细胞病毒)启动子/增强子的表达水平又比RSV高2倍。一般认为CMV是最理想的启动子。强启动子可以产生较好的免疫应答，但弱启动子可能诱导长期的持续性免疫应答。总之，要求用作核酸疫苗的载体必须具备以下特点：在哺乳动物细胞内能高水平的表达目的基因；本身不复制；不会整合到宿主染色体中。2注射途径与方法核酸疫苗免疫接种的方法主要分为三种：①可产生高转染效率的途径，如肌肉接种；②转染效率虽不高，但是经常被用于实验动物接种的途径，如皮下、腹腔内接种；③转染效率不高，但有高水平局部免疫监视，如皮肤、呼吸道接种。一般地，用注射器直接注射要求DNA为10〜200ug,用基因枪注射要求的DNA量可少至亚纳克级。3、接种部位的预处理

221Davis等报告，试验组小鼠免疫前肌肉注射100ul10mmol/L心肌毒素（cardiotoxin）,对照组注射高渗蔗糖（25%W/V,用PBS；容解），然后两组分别接种等量HBsAgDNA疫苗。结果试验组抗〜HBs水平较对照组高10倍以±oDanko等报告，在DNA接种前7天注射0.5%〜0.75%丁哌卡可使外源基因的表达提高40倍以上，它能选择性地破坏肌细胞，引起肌细胞再生，而再生肌细胞表达外源DNA的能力高于成熟肌细胞。4、接种剂量与次数核酸疫苗的特点是在体内的表达量低，但是持续时间长。核酸疫苗在动物或临床试验中的免疫程序一般都是3次，大动物或人体的接种量一般为500~1000ligo多数加强免疫在小动物中可以达到增强免疫应答和获得理想免疫保护效果的目的。Ulmer等报告，给小鼠分别注射1〜100ug甲型流感病毒HA或NPDNA疫苗，结果抗-HA和抗-NP水平与接种剂量呈正相关。5、免疫佐剂免疫佐剂指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫应答类型的物质，包括无机佐剂（如氢氧化铝）、有机佐剂（如脂多糖、分支杆菌）及合成佐剂？如双链多聚肌甘酸。近年来随着细胞因子研究的进展，发现许多细胞因子也具有明显的免疫佐剂效应，能增强特异抗原的免疫原性或增强机体对抗原的反应性，这些细胞因子包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF.IL-6、IL-12等。五、核酸疫苗的质量监控1、浓度测定2、纯度测定3、限制性内切酶图谱分析

222六、核酸疫苗在传染病防治研究中的应用1、病毒感染性疾病的核酸疫苗病毒的减毒、灭活疫苗已有成功的范例，但在艾滋病（AIDS）等病毒感染性疾病的应用中显然不够理想。目前，用于病毒性疾病治疗方面主要有牛疱疹病毒、禽流感（AI）、伪狂犬病、肺霉形体、狂犬病、牛病毒性腹泻、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、甲型流感病毒核蛋白（NP）、轮状病毒以及乙型肝炎（HBV）、丙型肝炎（HCV）。2、非病毒微生物感染性疾病的核酸疫苗非病毒微生物感染时，非病毒微生物蛋白都由微生物本身表达，而不是被宿主细胞表达，因此核酸疫苗免疫后，在真核细胞内表达的非病毒微生物蛋白有可能产生不同类型的非自然感染状态下的蛋白。但是迄今为止，许多实验表明，向动物体内注射编码非病毒微生物蛋白的核酸疫苗后，非病毒微生物蛋白可在注射部位原位表达，引发保护动物免受非病毒微生物攻击的免疫反应。目前，用于防治非病毒微生物引起的疾病主要有结核病、肺炎支原体感染、肺炎球菌感染、幽门螺旋杆菌感染、破伤风杆菌感染、布鲁杆菌感染、沙眼衣原体感染、考德里立克次体感染、莱姆病等。但是从目前的试验结果来看，核酸疫苗的预防疗效还存在着种种不足，尚进一步研究阐明。3、寄生虫核酸疫苗寄生虫所致疾病种类多、分布广、危害大。抗寄生虫感染是一个世界性的问题，但是由于虫体的抗药性，以及现有各种寄生虫疫苗存在的种种尚难解决的问题，寄生虫病还不能有效地进行防治。但是，核酸疫苗的出现给人

223类抗寄生虫感染带来了新的希望。迄今为止，主要开展了针对疟原虫、利氏曼原虫、血吸虫及囊虫病核酸疫苗的研究，取得了一定效果。4、肿瘤核酸疫苗肿瘤是机体中正常细胞在各种致瘤因素的长期影响和作用下，发生过度增生和异常分化所形成的新生物(neoplasm),通常表现为肿块。随着人类对肿瘤认识的加深,DNA疫苗开始应用于肿瘤的预防和治疗，而且偏重于治疗,在这个意义上肿瘤的核酸疫苗同时又是核酸药物。随着研究的发展，DNA疫苗为治疗恶性肿瘤提供了新的思路，主要有：①激发免疫系统杀死致癌病毒；②激发免疫系统识别并消除表达共同癌细胞信号的癌细胞；③转染和表达基因工程蛋白，从而使癌细胞成为更好的免疫靶子。将编码肿瘤相关抗原的基因转导到肿瘤细胞内表达，可提高肿瘤免疫原性，从而增强宿主抗肿瘤的免疫应答。七、核酸疫苗的发展前景核酸疫苗的研究只是近十几年发展起来的一项新的生物技术，它已成为疫苗研究领域中的热点之一。它可用于细菌、病毒、寄生虫等多种疾病的防治，其多价、高效、廉价等优点使其潜在的应用价值不可估量。核酸疫苗可能对人类疾病的防治起到划时代的作用。人们对核酸疫苗的研究日益深入，艾滋病和T细胞淋巴瘤的核酸疫苗已进入了临床前阶段，前列腺癌、肺癌、乳腺癌等核酸疫苗也正处于研究阶段。美国FAD已批准乙肝疫苗等10余种DNA疫苗进入临床试验。但是，人们对DNA免疫的作用机理和如何提高免疫水平仍然需要进一步

224研究。如外源DNA进入体内后，就无法认定控制其免疫途径，外源DNA在体内各器官是否表达，摄入DNA后如何进行抗原呈递？如何增强其免疫应答水平？同时DNA疫苗的构建以及生产方面还存在需要改进的地方。尽管核酸疫苗接种后引进的宿主细胞发生恶性转化的可能性很少，但在短期内很难代替目前大量使用的传统疫苗。

225第七章单克隆抗体第一节概述第二节抗体分子的结构与功能第三节单克隆抗体第四节抗HBsAg的单克隆抗体生产第五节单克隆抗体的应用第六节单抗药物研究的主要趋向及存在问题第一节概述1、单克隆抗体的发展历程(1)1890年Behring发现白喉抗毒素，其特点是用抗原免疫动物来获得多克隆抗体。(2)Landsteiner(1910)等人首先应用偶氮蛋白的人工结合抗原，研究抗原-抗体反应特异性的化学基础开始的。(3)1972Edelman&Poter抗体分子结构(4)1975年Kohler创建杂交瘤技术制备单抗。(5)1994年Winter用基因工程方法制备抗体。2、几个基本概念①抗体(antibody,Ab)是由抗原刺激机体后,由淋巴B细胞经分化增殖的浆细胞合成、分泌的，能与相应抗原特异结合并具有多方面免疫功能的球蛋白。

226②免疫球蛋白（immunoglobin,Iq）是指具有抗体活性或其化学结构与抗体相似的球蛋白。③这些1g分子可以在其他免疫系统的帮助下与外来物质结合，并抵消其生物学功能，诱发机体产生抗体的外来物质即称为抗原（antigen）3、两种免疫机制哺乳动物及人具有一套完整的免疫系统用以保护自身的健康。机体本身对自己或异己的物质（包括细胞、组织和器官）的识别及一系列反应称之为免疫反应。体内的免疫系统包括体液免疫和细胞免疫两种，参与反应的是骨髓产生的两类细胞，一类是B林巴细胞，B淋巴细胞发育成浆细胞产生抗体，抗体参与体液免疫；另一类是经过胸腺产生的T淋巴细胞，T细胞发育成吞噬细胞直接参与细胞免疫，虽然不能产生抗体，但却可以帮助B淋巴细胞产生抗体。本文主要涉及的是体液免疫中的抗体。4、与抗体密切相关的抗原能引起机体发生免疫反应使之产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内或体外与反应产物发生特异性结合反应的各类物质统称为抗原。抗原具有3个特性：即外源性（机体以前从来未接触过的外源异物或异体）；结构性（蛋白质或多糖类的大分子物质）；特异性（由于抗原有不同的决定簇而决定的），因而能成为抗原的物质主要有病毒、细菌及细菌分泌的毒素、花粉，以及与载体分子结合的低聚糖、寡糖、吗啡等。5、抗体的种类（1）多克隆抗体多克隆抗体的含义有两层①由含有多抗原位区大分子抗原刺激产生的、识别不同抗原位区的各种抗体；②由体内不同淋巴细胞产生的、可针对同一

227抗原位区的多克隆抗体。广泛存在动物血清中。（2）单克隆抗体仅识别抗原分子上同一抗原位区的由同一克隆细胞产生的抗体。（3）基因工程抗体是利用DNA重组技术，通过对抗体分子基因结构与功能了解，有目的地在基因水平上对抗体分子进行切割、拼接或修饰，或者直接合成基因序列，再将基因导入细胞表达产生的一类抗体。

228第二节抗体分子的结构与功能一、抗体分子的结构抗体分成3个部分，即两个Fab片段和一个Fc片段。抗体的结构抗体是机体在抗原物质刺激下由浆细胞产生的一类能与抗原发生特异结合反应的免疫球蛋白。其基本结构是由(两重H链两轻L链)四条肤链组成，四链互以S键结合，形成一个“Y，形的四链分子。每一链又分为二段，一段为恒定部分，该部分的氨基酸序列是相同的；另一段为可变部分,这一部分的氨基酸序列各不相同，因而其上具有抗原结合位点。主要位于“Y'的两臂末端1/2L链和1/4H链相结合部位。抗体的特异性就是由结合部位的构象决定的。只有分子构象与抗体结合部位的分子构象互补的抗原才能与该种抗体结合。这样一个抗体就可和两个抗原结合。此外抗体的柄部Fc段上有补体结合区。根据抗体重链的C区(Ch)的不同，可将人的重链分为丫、以、£、6和a五大类，由这五种重链形成的lg分别称为IgG、IgM、IgE、IgA和IgD。二、抗体分子的功能(1)lgG是体内最主要的免疫球蛋白，约占血清总蛋白的15%,参与几乎所有的体液免疫反应，具有免疫凝集与免疫沉淀、免疫调理、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、激活补体系统、固定细菌及中和病毒等作用。此外,IgG(除lgG2外)还是惟一能通过胎盘由母体传输给胎儿的免疫球蛋白，胎儿因此可获得对多种疾病的抵抗能力。(2)lgA主要由黏膜相关淋巴组织中的浆细胞产生，主要分布在鼻、咽、支气管、胃肠道、生殖器官等黏膜及分泌液中，是机体黏膜局部防御感染的重要因素。

229主要功能有杀菌、抗病毒活性，同时分泌型IgA还具有很强的免疫凝集作用。(3)lgM主要分布在血液中，具有补体激活功能，在防止发生菌血症、败血症等方面起重要作用。在机体受到T细胞依赖抗原刺激后，一般先产生IgM,又因IgM的半衰期较短，因此IgM血清水平的升高往往代表有近期感染。另外，IgM具有较IgG更强的免疫凝集作用，但它中和病毒和毒素的能力均很弱。(4)lgE是半衰期最短、血清浓度最低的一类lg,IgE的Fc片段与肥大细胞和嗜碱粒细胞表面的Fc受体具有极高的亲和力，因此能激活这些细胞，促使它们释放组胺、肝素等介质触发I型病态反应。(5)lgD为单体球免疫蛋白，仅在B细胞成熟的某一阶段出现在B细胞膜上，在防止免疫耐受方面有一定作用。

230第三节单克隆抗体一、杂交瘤细胞系的产生杂交瘤细胞的植被必须具备两种各具特性的亲本细胞，一是能产生抗体细胞，二是能够无限生长繁殖的细胞。但这两种细胞并不能自然进行融合，必须在促溶剂的存在下，才能使其融合。1、杂交瘤技术原理简述杂交瘤技术根基于3个原理:动物免疫、细胞融合以及杂交瘤细胞的筛选。1）动物免疫动物体内的B淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可以大量增殖变成浆细胞，以分泌针对于该抗原的抗体。这种抗体具有特异性，动物免疫作用就是用特定的外来抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激其能分泌对于该抗原的B淋巴细胞大量增殖，从而得到大量产生专一反应的B淋巴细胞。2）细胞融合及林巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但在体外存活时间很短（最多两周）后即死亡;而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白，却能在体外长期存活。如果将这两种细胞的特性结合起来，就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。然而在杂交过程中必然将产生混合物，因此就需要进一步筛选出其中唯一有用的杂交瘤细胞。3）杂交瘤细胞的筛选用HAT培养基（H-次黄漂吟、A-氨基喋吟、T-胸腺喀咤）进行筛选。细胞的DNA合成有内源性和外源性两种途径。内源性途径就是利用Gn（谷

231氨酰胺）或单磷酸尿甘酸在二氢叶酸还原酶的催化下合成DNA；外源性途径则利用次黄漂吟或胸腺喀咤在HGPRT（次黄漂吟鸟漂吟磷酸核糖转移酶）或TK（胸腺口密咤激酶）的催化作用下补救合成DNA。HAT培养基中的氨基喋吟是二氢叶酸还原酶的抑制剂，因此能有效的阻断DNA合成的内源性途径。及林巴细胞具有HGPRT和TK这两种酶，因此在内源性途径被阻断后仍能利用HAT培养基中的次黄漂吟和胸腺喀咤完成合成。但由于B淋巴细胞是正常细胞故不能长期存活。而杂交瘤细胞由于继承了B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成HGPRT和TK,故在HAT培养基中可长期存活。在历经2周左右的时间后即可得到该杂交瘤细胞，从而成为制造单克隆抗体的细胞源。2、单克隆抗体的产生1.动物体内生长杂交瘤细胞注射同系小鼠腹腔，先注射石蜡或不完全佐剂。使腹腔渗出液增多，1〜2周后无菌方法抽取腹水，离心取上清。2.体外培养较常用，用普通培养瓶培养，根据培养时间、细胞生长情况收取上清液。另有高密度培养，在单位体积内增加细胞的培养数量。3、单克隆抗体的纯化腹水或细胞上清液，均含有脂蛋白、脂质、细胞碎片等杂质，用滤纸去掉脂质和大颗粒，离心去除细胞碎片和蛋白聚合物，目前纯化方法有十几种，一般采用盐析、凝胶过滤、离子交换层析和辛酸提取等，现在最有效的方法是亲和纯化法，常用SPA或抗小鼠免疫球蛋白抗体与载体交联。称为Sepharose

232柱，抗体结合上去，然后洗脱。4、单克隆抗体的性质鉴定鉴定的方法很多，用已知抗原测定抗体，几乎所有的抗原抗体反应试验都可以作，如阳性，再定量，确定工作浓度。二、基因工程抗体技术杂交瘤单克隆抗体在诊断、治疗、预防和蛋白质提纯应用中非常广泛，但鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性，可产生较强的人抗鼠抗（humananti-mouseantibodyHAMA）反应。鼠单抗的生产成本较高，难于大规模普及应用。基因工程抗体，应用基因工程技术减少小鼠源成分，保留原有的抗体特异性。基因工程抗体优点：（1）通过基因工程技术的改造，可以最大程度降低抗体的鼠源性，降低甚至消除人体对抗体的排斥反应。（2）基因工程的分子较小，穿透力强，更易到达病灶的核心部位。（3）可以根据治疗的需要，制备多种用途的新型抗体。（4）可以采用原核细胞、真核细胞或植物等多种表达系统大量生产抗体分子，成本大大降低。（一）、人源化抗体人源化抗体主要指鼠源性单克隆抗体的基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体。其大部分氨基酸序列为人源序列所取代，既基本保留亲代鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了鼠异源性。抗体分子由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，每一条重链和轻链都分为恒定区和可变区两大部分。重链可变区和轻链可变区共同组成抗原结合部位，抗体的特异性正是由这一部位决定的。轻、重链的可变区都长约110

233个氨基酸残基，分别占轻、重链全长的1/2和1/4。在抗原结合部位中真正与抗原决定簇空间构象互补的是3个氨基酸变化较大的区域，即互补决定区（complementaritydeterminantregion,CDR）CDRI、CDR2和8R3。每个8R区长约15〜16个氨基酸残基，不同抗体的8R区氨基酸残基变化很大，以适应自然界数以亿计的抗原。与可变区相对的是骨架区（frameworkregion）,其氨基酸序列相对保守。基因工程抗体就是按不同目的和需要，对抗体基因进行加工、改造和重新装配，然后导人适当的受体细胞中进行表达得到的抗体分子。1、人-鼠嵌合抗体通过基因工程技术将人IgGC区与鼠IgGV区连接，导入细胞内表达制备的抗体称为嵌合抗体，因IgG的抗原性在C区，来自人，故抗原性降低，且半衰期明显延长，在介导8c及ADCC（抗体依赖细胞介导细胞毒作素）亦明显增强。（1）鼠单克隆抗体可变区基因克隆用探针从该杂交瘤细胞的基因组文库中调取。用PCR方法从该细胞的RNA中扩增VH及Vl基因。（2）表达载体的构建人-鼠嵌合抗体的表达载体基因依可变区基因克隆的表达方式不同而分为两类，从基因文库所克隆的可变区基因带有上游的转录调控组件及内含子剪接信号，因此载体只需要包括细胞内增殖所必须的抗生素抗性基因和质粒复制的起始序列以及在真核细胞进行选择的显性标记基因。将载体DNA导入真核细胞称为转染。导入的DNA整合至细胞基因组DNA

234中得到转染子，要得到稳定的转染子需利用真核细胞的显性选择标记基因，这些标记基因使细胞获得对某些细胞毒物质的抗体，在培养液中加入相应的细胞毒物质可杀死转染不成功的细胞，达到选择的目的。(3)表达用哺乳动物细胞或大肠杆菌表达量较少，而应用二氢叶酸还原酶(DHFR)扩增系统使抗体表达增强。DHFR是正常核酸代谢必须的酶，缺乏该酶的中华仓鼠卵细胞(CHO)需在有次黄喋吟和胸腺喘咤核普条件下利用DNA合成，因此，DHFR作CHO的显性选择标记基因，在无次黄喋吟、胸腺喘陡核昔的情况下，只有导入DHFR基因，细胞才能存活。该系统可用来扩增导入的目的基因。2、抗体的表面修饰人和鼠lgV区来自不同的种属，轻链不同型别，互补性决定区(complementaritydeterminingregion.CDR)的长度可不一致，但暴露于表面的AA残基的位置数量都很保守，通过改变表面残基使其人源化，降低鼠可变区的异源性，将Fv的表面人源化，消除其免疫原性而不影响Fv的整体空间构象。(二)、小分子抗体具有结合抗原功能的分子片段称为小分子抗体。其优点：1)可在原核细胞表达，生产成本低；2)易于穿透血管或组织到靶细胞部位。有利于疾病的治疗；3)不含Fc段，副作用小；4)半衰期短，有利于毒素中和及清除。小分子抗体包括：抗原结合片段(fragmentofantibodybinding,Fab),可变区片段(fragmentofvariableregion,Fv),单链抗体(singlechainFv,ScFv),单区抗体。1、Fab

235由一条完整的L链和约为1/2的H链组成，是完整抗体的1/3,只有一个Ag结合位点，它是将McAb重链V区和Cm区cDNA与完整轻链cDNA连接，在细胞启动子的控制下分泌表达。2、Fv和单链抗体（ScFv）Fv由Vh和Vl构成，非共价键结合，为完整抗体的1/6,单一抗原结合位点,W和Vl连接有三种方法：1）用戊二醛处理，使之交联；2）引入半胱氨酸残基，使Vh和Vl之间形成二硫键；3）把Vh和Vl用一段适当的寡核甘酸分子连接起来，表达成一个单链，称为ScFv。3、单区抗体及最小识别单位根据抗体分子的结构，一般将Fv称为抗体的最小单位，但有些更小亚单位仍结合抗原，如单独重链W仍可保留相当程度抗原结合能力，其作用比M大，称为单区抗体（singledomainantibody）,其亲和力低于完整的Fv,因单区抗体的疏水区的暴露，增加了非特异性吸附，水溶性减低，其应用受到限制，但分子量小，单位体积浓度高，副作用小，是很有前景的抗体部分。（三）、抗体融合蛋白将抗体分子片段与其他蛋白的融合，可得到有多样性生物功能的融合蛋白，有几种构建方式：1）将Fab或ScFv与其他生物活性蛋白融合，建成生物导弹。2）在融合时可根据某些恒定区，可使某些药物的某些生物活性与抗体的生物学效应功能联结在一起。3）将ScFv与某些细胞膜蛋白融合，形成嵌合受体，使细胞结合抗原。1、含Fv片段的抗体融合蛋白

236将Fv与某些毒素、酶及细胞因子等的基因连接，能编码Fv与毒素、酶及细胞因子复合物，即生物导弹，主要在于抗肿瘤。2、嵌合受体将ScFv与某些细胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白可表达于细胞表面。其抗体部分与相应抗原特异性结合。如将抗体的可变区基因与TCR的a链和8链恒定区融合，将融合基因导入T细胞，既表达特异性抗体，又表达TCR,该TCR不受MHC分子限制。3、含Fc的抗体融合蛋白如将CD4分子细胞膜外部分与Fc融合后用真核细胞表达，由二硫键连接成双体，分泌到细胞外，产生二种功能：1)延长在血循环中的半衰期；2)通过功能蛋白与配体分子的作用，将Fc的生物学效应引导至特定目的，如84与Fc融合蛋白，84是T辅助细胞表面糖蛋白，是HIV的受体，该融合蛋白能竞争结合HIV,可阻断HIV对TH的感染，可介导ADCC及8C,可通过胎盘。(四)、双特异性抗体小分子抗体都是单价，不能偶联。将特异性不同的两个小分子抗体连接在一起可获得双特异性抗体(bispedficantibody,BsAb),双价ScFv与抗原结合比单价敏感性高，亲和力大，结构和功能上都更接近亲本抗体。BsAb分子片段可从Fab、Fv或ScFv组建，可在体内或体外连接。1、双价抗体分子的构建(1)体外构建在小分子抗体的竣基端设计半胱氨酸残基，如带钱链区的Fab段或带半胱氨酸残基尾巴的ScFv,可在体外通过化学交联成为双价抗体分子，亮氨

237酸钱链也可用来构建，两个不同抗体连接成为功能抗体。如抗体CD3和抗IL-2R的Fab在体外直接介导T细胞对表达IL-2R的细胞有杀伤作用。（2）双抗体分子的细胞内组建对小分子抗体基因的改造修饰，使细胞直接表达双抗体分子，比体外组建更有效，现有以下几种方法：①设计促进双聚体形成的结构域，半胱氨使是促进双聚体形成的结构域，使小分子抗体在大肠杆菌的分泌型表达过程中形成双体，亮氨酸轻链和CH3亦有螺旋-转角-螺旋结构，使之成为双体。②在基因构建上直接将两个抗体分子片段融合。③双体分子：两个ScFv的W和Vl相互配对，可产生双价的双抗体分子。3、双特异性抗体的应用能同时结合两种不同抗原，因而可介导标记物与靶抗原的结合，或某些高级分子定位于靶细胞。在临床上有以下应用：（1）在免疫检测中的应用：一个臂结合靶抗原，另一个臂结合酶，不需用酶标记抗体，避免在标记过程中降低酶及抗体的活性。（2）在肿瘤放射免疫显像中的应用：一个臂结合肿瘤细胞，另一个臂结合半抗原螯合剂，半抗原螯合剂能选择与放射性核素结合。放射免疫显像，清晰度和灵敏度高。（3）双特异性抗体介导的药物杀伤效应：治疗肿瘤生物导弹如药物、毒素或核索。（4）介导的细胞杀伤效应：一臂结合肿瘤抗原，一臂结合免疫活性细胞起介导作用并激活免疫细胞。（五）、抗体库技术及其应用抗体库技术是指应用基因克隆技术将全套抗体重链及轻链可变区基因

238克隆出来，重组到质粒表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，最后筛选到特异的可变区基因，取决于两项技术的突破：一是PCR技术的发展，可用一组引物克隆出全套抗体的可变区基因，一是大肠杆菌表达分泌型抗体分子片段的成功。1、组合抗体库技术采用RT-PCR技术从淋巴细胞克隆出全套抗轻链基因和重链基因，将二者分别组建到表达载体中，得到轻链基因库和重链基因Fd段基因库，再通过DNA重组技术将轻链基因和Fd随重组于一个表达载体中，即形成组合抗体库。2、噬菌体抗体库技术(1)噬菌体显示：指将蛋白分子或肽段基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中，使噬菌体表面表达该异源性分子，主要特点是在同一病毒颗粒内将特定分子的基因型和表型统一，在噬菌体表面表达特定蛋白，在该噬菌体核心DNA中含有该蛋白的基因。(2)噬菌体抗体：将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白融合，使之表达在噬菌体表面，形成噬菌体抗体，将全套抗体可变区基因，组装到表达载体，其抗体表达到噬菌体表面，得到噬菌体抗原。3、抗体库的应用在诊断、治疗中具重要意义，还有人源性抗体比鼠源性抗体的副作用低，很有发展前途。(1)在抗感染中的作用：对细菌产生的毒素、病毒感染。(2)在肿瘤治疗中的作用：一是抗体直接作用于肿瘤，一是抗体连接药物、

239毒素、酶、细胞因子等。(3)抗独特异抗体：抗原内影像来代替相应抗原，因为这种抗原量少或难于获得。第四节抗HBsAg的单克隆抗体生产一、单抗制备示意图及工艺流程1、单克隆抗体制备过程示意图2工艺流程二、工艺过程及控制要点(1)培养基(2)饲养细胞制备(3)亲本细胞准备(4)固定化抗大鼠K轻链单抗的制备(5)细胞融合(6)杂交瘤细胞筛选(7)抗HBsAg单克隆抗体的生产⑻抗HBsAg单抗的分离纯化三、单抗纯化策略及注意事项常规策略：①单抗的分子量IgG：150〜160kDa,IgM：900kDa,等电点PI在4到9之间，大部分超过pl6,比其它血清蛋白更偏碱。②IgG的疏水性更强，在硫酸氨浓度30〜50%时会沉淀。在水溶液中的溶解性更好，在近等电点和低盐时溶解度会减弱，在室温下相对比较稳定，除在相对

240偏酸的溶液中不稳定外一般缓冲液下均较稳定。③在单抗纯化时既要了解他们的共性又要了解个性，整个纯化策略与其他蛋白纯化一样可分为三步，粗提用来分离浓缩和稳定样品，中度纯化去除大部分杂质，精细纯化达到最高纯度。④在选择一个纯化策略时应考虑儿个因素，如抗体的来源，单抗本身的理化性质，最终产品的生产规模及纯度要求，目的蛋白的分析鉴定方法，药品管理部门对产品的要求。在抗体来源中单抗本身的性质，样品的培养和处理方法,潜在污染及发酵液蛋白浓度均会影响纯化策略的设计。⑤如果是大量单抗的生产，体外单抗培养技术是首选。越来越多的单抗用哺乳动物细胞来培养，例如用CHO表达的单抗表达水平在1〜2g/L。在样品的制备和粗提中常用的是离心和超滤。⑥大部分单抗在中性偏碱和低电导的缓冲液中是稳定可溶的，但是有一些抗体在温度低于37℃时溶解度会降低，易结晶；强碱性单抗在多价阴离子缓冲液中易形成稳定的离子复合物导致抗体之间的聚合；单抗同时经常与核酸形成复合物，这种结合在0.3M〜10MNaQ存在时是可逆的，所以在单抗纯化中粗纯时选择缓冲液是非常重要的。⑦粗样品的预处理可选用脱盐交换缓冲液，浓缩把样品部分纯化转入所需环境,起始纯化一般选用离子交换或亲和层析，产品纯度可达50〜98%,最终纯化可选凝胶过滤或疏水层析。单抗纯化中杂质的去除杂蛋白不论是腹水或细胞培养单抗白蛋白，转铁蛋白及宿主免疫球蛋白是三种主要的杂质，白蛋白的量比较大，转铁蛋白和许多单抗有相似的带电性质，宿主免疫球蛋白或牛免疫球蛋白的性质和要分离的目的单抗有很多相似的性质，另外脂蛋白可能

241比较容易阻塞柱子，这在实际工作中也经常碰到。BlueSepharose介质是去除白蛋白的一种方法。二聚体和寡聚体在蛋白浓度较高时容易形成，这些聚合物将降低样品的生物活性，一般来讲凝胶过滤Superdex200能有效去除这些杂质。牛免疫球蛋白的污染问题在单抗纯化中十分显著，一般来说用疏水层析和离子交换可能会除去此类杂质。白蛋白和转铁蛋白也可用离子交换和疏水的方法去除，有一些单抗比它们的疏水性更强,疏水介质可以使目的蛋白结合而使杂质流穿。

242第五节单克隆抗体的应用单克隆抗体由于其特异性强、纯度高和能大量生产等特点，在医疗和其它方面已显示出其重大的价值，并具有巨大的潜力。主要表现在新型诊断试剂、骨髓和器官移植、治疗试剂、蛋白质分离提纯以及在其它相关学科等领域的应用。一、新型诊断试剂1、癌症诊断经过多年的研究，发现肝癌和畸胎瘤患者血清中存在有大量的甲胎蛋白(AFP)o甲胎蛋白是一种在正常胎儿血清中含量较大的蛋白质，但在成人血清中显著减少，临床上不易捡出。因此甲胎蛋白可用于肝癌和畸胎瘤诊断的癌标志抗原。目前，甲胎蛋白的基因已克隆成功，其分子中含有约4%糖链，而且根据糖链的差别已能区别不同来源的甲胎蛋白，从而根据其抗原的特异性，可以制成相应的单克隆抗体用于癌症诊断。2、体内定位诊断不同的癌症或肿瘤在体内所表现出的癌抗原或瘤抗原不同，可以获得各种特异的单克隆抗体，而采用合适的同位素标记法使特异的单克隆抗体上带有放射性标记。当这种放射性的单克隆抗体注入到患者体内时，被血流输送到肿瘤部位，同其相应的肿瘤抗原在体内进行特异的结合反应随着时间的延长，标记放射性单克隆抗体会在肿瘤组织中(肿瘤抗原含量大)聚集，并根据肿瘤形状形成一个放射强度较大的区域，然后利用仪器在体外进行探测，

243了解肿瘤的大小、形状、位置与数量，也可以帮助确定病变的性质。3、药物的测定利用放射免疫测定和酶联免疫测定法可以测定体内微量的激素或药物等成分，而且由于单克隆抗体的精度高，使敏感度和重复性大大增高，因此在临床诊断上取代多克隆抗体的抗血清已成为发展趋势。4、传染病诊断病毒、细菌及寄生虫等传染病都可以用相应的单克隆抗体给以快速而准确的诊断，并且根据特异性强的单克隆抗体和相应抗原结合的特点能够鉴定出病毒的抗原亚型。二、临床治疗临床上单克隆抗体可用于某些细菌和病毒感染而引起的疾病以及如蛇毒或其它毒物造成急性中毒症的被动免疫或治疗。单克隆抗体对b型流感嗜血杆菌、肺炎球菌、破伤风以及乙型脑炎等疾病有预防作用。单克隆抗体在肿瘤治疗方面目前正显示着其巨大的优势，其中治疗效果较好的有白血病、淋巴瘤、肾癌、肉瘤、黑色素瘤、肝癌以及胃肠道肿瘤等。因为肿瘤细胞和正常细胞相比，其表面具有一些附加的或新的抗原，这样结合到肿瘤细胞上的单克隆抗体都被分离后，可以得到一个或更多的肿瘤特异性的单克隆抗体，这种抗体就可以用于肿瘤化学治疗基础免疫毒素学的载体——导弹。例如鹿麻蛋白是一种细胞毒素，它具有同细胞结合的基团和杀死细胞的基团，不仅可以杀死肿瘤细胞，也可以破坏正常的细胞，但是如果将这种毒素中能杀死细胞的活性基团分离出来，结合到能够识别肿瘤细胞的单克隆抗体上，则形成了新型的单克隆抗体，它可以特异地识别肿瘤细胞，而不和正常细胞结合，最终在单克隆抗体的带领下，杀死肿瘤细胞。由于它具有定性

244致死作用，因此这种新功能单克隆抗体又称生物导弹。目前研制生物导弹的最新途径是将双功能单克隆抗体或嵌合抗体/T-细胞受体基因拼接在一起并在某种受体中表达，表达产物在体内与肿瘤细胞结合,然后被T-细胞选择性地识别，最终将肿瘤细胞杀灭。三、骨髓和器官移植器官移植的成功要求由同种而不同个体移植来的细胞或组织不被受体排斥，即移植组织具有免疫耐受性，又称为组织相容性。因此在手术前必须检测供体和受体的主要组织相容性抗原的配型是否相同。以前检测所用的抗血清中抗体滴度低，而且供应量有限。而使用单克隆抗体（包括抗组织相容性抗原、抗淋巴细胞和巨噬细胞）可以制成高效价的诊断试剂，提高器官移植的成功率。四、大分子蛋白的提纯利用免疫亲和层析的方法提纯蛋白类大分子，杂质成分很低，而且对产物的起始浓度要求较低。例如用免疫亲和层析柱提纯的干扰素IFN-a,在起始浓度低于0.02%的情况下，回收率达到97%具体方法是将单克隆抗体交联到经嗅化氢活化的琼脂糖基质上，制成免疫亲和层析柱。经过免疫层析后，由于单抗对目的蛋白的特异性结合，可以从单一尖锐峰上洗脱下目的蛋白，使蛋白得到纯化。五、在相关学科中的应用单克隆抗体在微生物学中可以作为一种新兴的微生物分类方法对病毒、细菌、酵母菌和霉菌等微生物进行更为细致的分类。在寄生虫学中可以拓宽预防的途径，开发新型的疫苗预防寄生虫病。免疫学中也可以利用单克隆抗体分析抗体的多样性、特异性、交叉反应性、亲和力以及个体基因型的结构基因，从而阐明抗体多样性的机理；可以提纯各种抗原，从而对这些抗原进行结构分析和功能的研究或用于制备疫苗等。

245在发育生物学中，可以利用单克隆抗体分析不同阶段的细胞和不同部位、不同分化状态以及不同分化方向的细胞所具有的不同的细胞表面抗原，从而有助于研究细胞发育和分化的机理。遗传工程学领域中，单克隆抗体也大有用武之地，最突出的例子是可以分离和纯化目的基因。另外，单克隆抗体在肿瘤学和传染病学等领域也具有广泛的应用。

246第六节单抗药物研究的主要趋向及存在问题一、单抗药物研究的主要趋向1、寻找新的分子靶点单抗对相应的抗原具有高度特异性，这是单抗药物显示靶向性抗肿瘤作用的分子基础。确定并利用与肿瘤细胞相关的分子靶点是研制单抗药物的关键。特定的癌基因表达蛋白、生长因子受体等均可作为单抗药物的分子靶点研究表明，HER-2/neu在多种上皮性恶性肿瘤都有过度的表达，可以作为治疗小细胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤的单抗药物的分子靶点血管生成与肿瘤生长密切相关，因此与血管内皮细胞增殖相关的因子，可能作为分子靶点Endoglin是与内皮细胞增殖相关的抗原。2、抗体的人源化研究证明，在临床治疗中使用鼠源性单抗的主要障碍之一是产生人抗鼠抗体(HAMA)反应，因此，单抗的人源化是单抗药物的发展趋向。人源化抗体的特点是可降低HAMA反应。单抗人源化主要是通过基因工程技术制备嵌合抗体或改形抗体。3、偶联物分子的小型化单抗及其偶联物均为大分子物质。以IgG型单抗为导向载体、以薨麻毒素A链为“弹头”制成的免疫毒素，其分子量约为180kDa；用IgM型单抗为导向载体，偶联物的分子量更大。庞大的偶联物分子难以通过毛细管内皮层和细胞

247外间隙到达实体瘤深部的肿瘤细胞。因此，研制小型化单抗药物对提高疗效有重要意义。4、单抗药物的高效化由于单抗药物实际到达肿瘤细胞的数量有限，为取得良好效果，单抗药物需要高效化，仅有微量到达靶部位即可杀伤肿瘤细胞。研制高效化单抗药物需要高效“弹头”药物。常与单抗偶联的化疗药物如阿霉素、丝裂霉素、氨甲蝶吟等虽然对肿瘤细胞有相当强的杀伤作用，但作为“弹头”物质仍需用十儿个或数十个药物分子去连接一个抗体分子，以求加强偶联物的活性。5、具有抗体功能的融合蛋白利用DNA重组技术制备具有抗体功能的融合蛋白是新的发展趋向。融合蛋白一般包括抗体的Fv部分和作为“弹头”的活性蛋白部分。融合蛋白一般兼有低免疫原性和分子小型化的特点。力达霉素对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用。力达霉素与抗IV型胶原酶单链抗体的基因工程组装融合蛋白，不仅具有阻断肿瘤细胞侵袭作用，而且具有强烈的细胞毒性。二、单抗体技术在发展中还存在问题虽然利用单克隆抗体技术在人类肺癌、肝癌、胃癌的治疗中取得一定效果，可是肿瘤细胞产生一些封闭性抗体，把自己保护住，使单克隆抗体所携的药物不能很好地发挥作用。再如，新近报道一项银屑病单克隆抗体治疗试验的失败，也表明人类对单克隆抗体技术的应用还并不是那么得心应手，仅仅是刚刚起步。而更根本的问题在于，“单克隆抗体产物是从具有肿瘤细胞表型特征细胞而来的，那么来自这种细胞的产物是否有潜在的生物毒害作用，特别是可能释放致癌病毒工另外，“单克隆抗体与任何其他lg类似，可能诱发抗个体型反应，而从抗体对其靶抗原角度看，这可能造成单克隆抗体失活。反复注射单克隆抗体,

248可能造成对单克隆抗体的个体型免疫，并使单克隆抗体失去生物活力，这在理论上是可能的”。细胞融合制药技术（细胞工程制药）细胞融合是60年代发展起来的一门细胞工程技术，它不但在基础研究，如核质相互关系、基因作用和定位、肿瘤发生等方面有重要作用，而且在植物、微生物改良、基因治疗、疾病诊治等应用领域也展现了美好的前景。细胞工程学是建立在细胞融合的基础上发展起来的，目前，细胞融合已成为细胞工程中的核心技术。■一、概述-二、细胞融合在制药中的应用1.植物细胞融合2.动物细胞融合制药——杂交瘤技术与单克隆抗体2.1诞生2.2单克隆抗体2.3杂交瘤技术的基本原理2.4杂交瘤的制备2.5杂交瘤细胞选育过程中容易出现的问题及解决方法2.6T-淋巴细胞杂交瘤的产生2.7单克隆抗体研究方向和新型单克隆抗体

2491.1单克隆抗体的应用2.微生物原生质体融合技术-三、展望-细胞工程的概念一以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心设计，精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖,并提取出对人类有用的产品的一门应用科学和技术-细胞工程的组成一上游工程（包括细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏）和下游工程（即将已转化的细胞应用到生产实践中用以生产生物产品的过程）两部分构成。当前细胞工程所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞器特别是细胞核移植技术、染色体改造技术、转基因动植物技术和细胞大量培养技术等方面。-细胞融合一是指人为地使两种、不同的生物细胞在同一个培养器中，用无性的人工方法进行直接接触，产生能同时表达两个亲本细胞有益性状的细胞杂交技术。由于该技术是在细胞水平上的操作，因此有人称细胞融合技术为细胞水平的生物工程。-细胞融合现象最初是在动物细胞中发现的，后来逐渐扩展到植物细胞和微生物细胞。动物细胞的外层只有一层脆弱的细胞膜，融和前无需做前处理；而植物和微生物细胞则不同，其外部有细胞壁。为了促使这样的细胞融合，就必须事先出去细胞壁，获得植物或微生物原生质体，从而

250达到融合，因此，植物和微生物的细胞融合一般称为原生质体融合。植物细胞融合-植物细胞可通过体细胞融合克服远缘杂交不孕性培育新品种。-80年代初，细胞融合技术在培育作物新品种方面，曾经有过一段辉煌，在改善油料栽培作物向日葵的品质和产量方面作出了贡献，后因技术上的问题趋向冷落。细胞融合技术的主要问题是杂种细胞筛选，植物杂种细胞不能像微生物那样，可通过选择性培养基，如耐药性或营养突变型筛选，否则会引起变异得不到所需要的杂种。近年来，国外出现一种新的技术，即利用植物细胞通常都有一个占细胞体积90%以上的液泡的特点，将亲本细胞之一的液泡除去再行融合，获得细胞密度介于两亲本细胞之间的杂种细胞，通过简单的密度梯度离心就可将其与亲本细胞和同源杂种细胞分开。遗憾的是，地面上由于地球重力的存在，有/无液泡原生质体的密度差加大，异源细胞融合得率十分有限。-植物细胞融合技术可用于某些农作物的脱毒和复壮，某些根茎类作物长期种植，往往感染病毒或退化，严重影响其产量和品质。利用组织培养可有效进行脱毒和复壮，对农业生产有重要意义。如马铃薯、大蒜、郁金香、水仙等，通过组织培养，可保持品种的优良特性。动物细胞融合制药——杂交瘤技术与单克隆抗体-动物细胞融和技术——在外力作用下，使两个或两个以上异源动物细胞合并为一个多核细胞的过程。动物细胞工程制药主要涉及细胞融合技术、细胞器移植尤其是核移植技术、染色体改造技术、转基因技术和细胞大规模培养技术等。我国目前动物细胞工程的发展中，技术最成熟的当数细胞融合。

251其中淋巴细胞杂交瘤在国内已普遍开展，并培育了许多具有很高实用价值的杂交瘤细胞株系，它们能分泌产生在诊断和治疗病症方面发挥重要作用的单克隆抗体。如甲肝病毒单克隆抗体口卜抗人IgM（见下注）单克隆抗体［2卜肿瘤疫苗［3］等可用于治疗疾病；抗人结肠癌杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体［4］、抗MCSFR（MacrophageColonyStimulatingFactorReceptor）,巨噬细胞集落刺激因子受体）胞外区的单克隆抗体等［5］则对诊断疾病具有重要价值。由于技术已趋成熟，目前许多单克隆抗体已经进入产业化的生产阶段。-1g融合蛋白是将目的蛋白的结构基因与Ig基因相连，在原核或真核细胞中表达的具有双重功能的重组蛋白。根据重组时利用的Ig基因的片段不同，Ig融合蛋白可分为两大类：一类是将目的蛋白基因与Ig的可变区基因融合而表达的产物，另一类是将目的蛋白基因与Ig的恒定区基因融合而表达的产物，后者又称免疫黏着素（immunoadhesin）o与恒定区融合的蛋白不但具有目的蛋白的功能，而且由于具有Ig的Fc段结构，可使重组蛋白获得多种新的特性，例如：①引入的CH区可使重组蛋白获得更长的半衰期；②易于纯化和检测；③Fc段具有穿过胎盘，结合补体，介导CDC及ADCC等效应，因此可应用于疾病的靶向治疗；④不同Ig（IgG、IgM、IgA）的Fc结构域可以形成多聚体分子，提高重组蛋白结合抗原或配体的能力等［6,7］2.1诞生1838年Miller描述了脊椎动物肿瘤细胞融合而成多核细胞的现象。1907年Harrison建立了体外组织培养技术，发现了体外培养的细胞也能融和形成多核细胞，1954年Enders等人观察到麻疹病毒能使离体培养的宿主细胞产生多核体，1958

252年冈田发现紫外线灭活的仙台病毒可以引起艾氏腹水瘤细胞融合，提出了仙台病毒具有诱发细胞融合的功能。1965年Harrison在仙台病毒的促进下于体外使培养的Hela细胞（HenriettaLackscell,人子宫颈癌传代细胞）与小鼠艾氏腹水瘤细胞融合成杂交细胞，该杂交细胞具备了两亲本的某些特性。随后建立起了骨髓瘤细胞，为杂交瘤技术的诞生奠定了基础。1975年从事免疫学研究的Kohlor和Milstein利用仙台病毒诱导经过免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，并最终获得了能分泌单一抗体的杂种细胞，该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养条件下大量繁殖的能力，以及能长期分泌单克隆抗体，从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术，使免疫学领域出现了一场革命性转机。为此，Kohlor和Milstein两人获得了1984年诺贝尔医学奖。及临床，尤其是各种癌症的诊断和治疗等各个领域，现已经发展为一门新兴的高技术产业。2.2单克隆抗体'人体和动物都有免疫系统，包括特异性免疫和非特异性免疫，其中特异性免疫又分为体液免疫系统和细胞免疫系统或细胞介导免疫系统。当机体受抗原刺激后，体内的抗原特异性淋巴细胞识别抗原，然后被活化，发生一系列的增殖和分化等变化，最终表现出一定的体液免疫或细胞免疫。细胞免疫主要指机体受到异己物质抗原的刺激后，一类小淋巴细胞——依赖胸腺的T细胞发生增生、分化，直接攻击靶细胞或间接地释放一些淋巴因子从而使机体达到免疫的过程。■体液免疫则是当机体受到抗原刺激后，来源于骨髓的小淋巴细胞——B细胞（即B型淋巴细胞）进行增生和分化为浆细胞，进而合成各类免疫球蛋白（即抗体），然后在体液中发挥免疫作用的过程。不同抗原所对应的抗体结构不同，每种抗原所存在的每种构型都和其特定的抗体相匹酉己。

253-动物的免疫系统接受到一个新的抗原时，并不是对抗原的所有表面都作出反应，而只对抗原中特异的抗原决定簇产生应答，一般一个抗原可能具有多个抗原决定簇，即可以同时诱导产生多个B型淋巴细胞的增生。而且机体在短时间内也不可能只接受一种外界的抗原物质，使得B型淋巴细胞的增生的种类也不止一种，造成不同种类的B型淋巴细胞同时存在与于体液中，由此而分泌形成的抗体也不止一种，所以从体液所分离提取的抗体也是由多种B型淋巴细胞产生出来的，是多种抗体的混合物。而B型淋巴细胞的增生过程是一个无性繁殖过程，即由一个B细胞分裂而形成的细胞群，称一个克隆。因此存在于体液中各种抗体的总和可称为多种B细胞克隆体，简称多克隆抗体。机体内的多克隆B型淋巴细胞和由此产生的多克隆抗体，类似发酵工业中的非纯种发酵，即由多株菌种发酵成产物及其复杂体系，任何一种产物的浓度都相对较低，难以纯化，为产品的研究和应用带来很多困难。■根据1957年Burnet提出的克隆选择理论，如果把能分泌某种特异抗体的一个B型淋巴细胞分离出来，通过纯种培养，所产生的抗体则只有一种，可以特异性地和体内一种抗原结合，这种单一的特异性抗体即为单一B细胞克隆抗体，即单克隆抗体，简称单抗。由于单抗的特异性强、重复性好、操作简单易行，所以在临床诊断方面得到了广泛的应用，可以作为免疫荧光、酶联和放射免疫测定的第二抗体，已在大部分常规血清学检查中替代了多克隆抗体。■单克隆抗体从含有低浓度多克隆抗体的血清中很难分离和纯化。而且B型淋巴细胞虽然可以被外来的抗如SRBC（绵羊红细胞）所激活并产生相应单一、均匀的特异抗体，但却无法在体外进行繁殖和传代，因此在应用过程和体外生产中，无法用来制备单克隆抗体。骨髓癌变细胞，在体外具有繁殖能力特别强的特点。如果将骨髓癌变细胞和经

254抗原刺激致敏分化的脾细胞B型淋巴细胞融合为一体，制成杂交瘤细胞，则杂合子就包含了两细胞的染色体，具有双重特性，在体外可以持续分泌出成分单一的特异抗体，即单克隆抗体。基于这一设想，1975年英国Milstein和博士后的青年科学家Kohlor一起进行尝试性的工作，将经绵羊红细胞免疫小鼠的脾B淋巴细胞（108）与小鼠骨髓瘤细胞（107）在仙台病毒的诱导下进行融合，利用HAT选择性培养基筛选出融合后形成的杂交细胞，这种细胞既有小鼠骨髓瘤细胞在体外培养条件下大量繁殖的本领，又有B淋巴细胞分泌特异性抗体的能力，使得单克隆抗体在体外生产成为可能。2.3杂交瘤技术的基本原理杂交瘤细胞的制备必须具备两种各具特异性的亲本细胞，一是能产生抗体的细胞，二是能够无限生长繁殖的细胞。细胞并不能自然进行融合，必须在促融剂存在下才能使其融合。促融合的方法包括三种：生物法主要是利用仙台病毒和副流感病毒I型作为促进剂，诱导细胞融合率低，目前几乎不再使用。化学法是用聚乙二醇（PEG）、高级脂肪酸衍生物、磷脂聚合体和Ca2+络合物等作为促融剂，其中PEG促进细胞融合力最强，应用最多。物理法主要是利用电场的作用使细胞达到融合，该法诱导频率比PEG高100倍，而且，操作简单、快速，对细胞无毒性，目前已有不少杂交瘤细胞的融合采用这一种方法。骨髓瘤细胞还应满足两个独特的性质：第一，为避免杂交瘤细胞分泌的抗体不纯，骨髓瘤细胞系自身不能具有产生抗体的能力；第二，用于融合的骨髓瘤细胞体内喋吟核甘酸或喀咤核甘酸合成的补

255救途径必须丧失，即磷酸核糖转移酶或喀陡核甘酸激酶的活力丧失。杂交瘤细胞检出的培养基——HAT培养基在正常培养基中添加了次黄喋吟（H）、氨基蝶吟（A）和胸腺喀咤（T）。当HGPRT阴性细胞在HAT上生长时，由于细胞合成核甘酸的主要途径被氨基蝶喋吟抑制，而且喋吟补救途径缺失，细胞中核酸合成所需要的口票吟核甘酸缺失，细胞不能生长。而正常细胞中由于补救途径的存在，可以转化次黄喋吟生成喋吟核甘酸，转化胸腺喘陡生成胸腺喀陡核甘酸，保证细胞生长。因此当B淋巴细胞和HGPRT阴性骨髓瘤细胞在促融剂的作用下融合后，在HAT培养基中，淋巴细胞在组织培养中不能生长繁殖，一般在5〜7天内死亡，骨髓瘤细胞由于不能利用培养基中的二次黄喋吟导致DNA的合成受阻，只有杂交瘤细胞由于吸收了淋巴细胞中的补救途径，可在阻断核甘酸合成主要途径的前提下，仍然可以利用培养基中的二次黄喋吟和胸腺喀咤，获得HGPRT和TK的产物以供DNA的合成所需，而且从骨髓瘤细胞中获得了肿瘤细胞在体外不断生长

256繁殖的特点，最终在HAT培养基中选择性地存活了下来。2.4杂交瘤的制备杂交瘤的制备一般包括免疫动物、骨髓瘤细胞系的选择、融合、杂交瘤培养物的早期鉴定与检测，克隆化、杂交瘤细胞的冻存以及单克隆抗体的生产。BALB/C小鼠BALB/C小鼠注射矿物油诱发注射某种抗原免疫骨髓瘤细胞脾细胞TK或HGPRT缺陷B淋巴细胞融合(PEG)分装于多孔培养板培养(HAT)亲株死亡杂交瘤细胞生长繁殖鉴定单克隆抗体、克隆化选出优良杂交瘤细胞，用于生产或冷冻保藏■免疫■(1)、啮齿类动物免疫在制定出合理的杂交瘤细胞筛选方案后，杂交实验开始前，应免疫儿只小鼠以增加对B淋巴细胞的刺激，一般末次注射抗原后3〜4天，即可从小鼠体内取出脾脏作为杂交瘤细胞的一个亲本B淋巴细胞的来源。■杂交瘤细胞是否能分泌出所需要的单克隆抗体，很大程度上取决于抗原的性质，使用强免疫原性和有充足来源的抗原免疫动物，能成功地制备出所需的单克隆抗体。但是利用弱免疫原和微量免疫动物来制备单克隆抗

257体，则很难达到实验要求。■(2)、人细胞免疫由于道德方面原因，大多数抗原不能用于对人进行免疫。只能在一些特殊情况下，淋巴细胞从受到某些抗原刺激后天然免疫的人的外周血或淋巴结，或者手术切除肿瘤时取出的脾脏或淋巴样细胞中获得。由于这种获得淋巴细胞的方式具有极大的偶然性，通常不能得到较为满意的B淋巴细胞。骨髓瘤细胞系为了获得稳定的杂交瘤细胞，骨髓瘤细胞的来源应同免疫动物种属一致。而且一般不选择产生自身免疫球蛋白的细胞系，除非特别需要杂种免疫球蛋白分子。(1)、啮齿类细胞系鼠类骨髓瘤细胞系主要来自于BALB/C小鼠，少数来自于LOU大鼠。这些细胞系能够在D-15或其他培养基中保存，在应用于融和前应保持其生长活力较高。目前这类细胞系有商品供应。(2)、人细胞系人骨髓瘤细胞培养系的建立还比较少，目前多是利用非洲淋巴瘤病毒(EBV)转化的B淋巴细胞，但是这些细胞系大多数向培养基中分泌不同的自身免疫球蛋白，不利于单克隆抗体的生产。融合不同实验室在筛选杂种瘤细胞时程序可能不同，但是原则不变，主要分两类融和方式：其一是Calfre等人提出的细胞悬浮融合法（包括B淋巴细胞的获得、骨髓瘤细胞洗涤、小鼠腹腔巨噬细胞的制备、细胞融合和培养等五个步骤），其二是粘着单层融合法。杂交瘤培养物的早期鉴定与检测

258经培养而得的杂交瘤细胞，并非都能针对免疫原而产生特异性抗体的细胞，往往只有一部分细胞才能产生专一的目的抗体。因此一般杂交瘤细胞培养初期，在11天左右集落直径达到1mm时，就应对其分泌的抗体进行特异性鉴定，以便对抗体分泌阳性的杂交瘤细胞进行克隆和扩张。抗体的测定方法应快速、灵敏、简便，一般除简便的与抗原直接结合试验外，还包括放射免疫试验（RIA）、荧光免疫试验（FAT）、酶联免疫吸附测定（ELISEA）等利用第二抗体测定的方法，为确定抗体的均一性，还可采用SDS-PAGE板层电泳来进行分析。克隆化通过检测，如果杂交瘤的培养上清液中含有所需的特异性抗体（称之为阳性杂交瘤），就应对这一杂交瘤集落进行克隆化，克隆化的目的就是通过对大量的杂交瘤细胞群进行分离筛选，得到一个能产生一类特异抗体的杂交瘤细胞的过程。尽早克隆化可以避免无关集落的过度生长。方法：应用最多的克隆化方法为有限稀释法，其次是软琼脂平板法杂交瘤细胞的冻存为安全起见，克隆化同时或之后，都应冻存少量的阳性克隆细胞。而且当某些杂交瘤细胞进行克隆化时，其它未克隆化的阳性集落细胞应保存在25cm2的培养瓶中，同时将未克隆化的细胞制成安甑冻存。克隆化结束后，生长良好的阳性杂交瘤细胞也需冻存一些。对于有价值的克隆，在冻存后的前几天，需要将冻存细胞融化，并进行培养，检查细胞的存活情况，用以判断冻存是否可靠。而且这种安甑一般单独放于液氮罐中。2.5杂交瘤细胞选育过程中容易出现的问题及解决方法

259■杂交瘤细胞选育过程中，可能会出现一些问题，一般包括以下几个方面：■(1)、细菌污染必须弃去污染物，并寻找污染源；■(2)、真菌污染应该弃去污染物，并寻找污染源，但是污染如果只■生在多孔板的个别小孔中，可以用70%的酒精清洗。一旦发现培养箱中培养板大量污染，则应立即清除；■(3)、支原体污染B淋巴细胞污染支原体后，倍增时间延长，而且在发生杂交后，最终会导致杂交瘤细胞停止生长。这时，一般假设支原体是由B淋巴细胞带入，检查淋巴细胞，同时启用最初冻存的淋巴细胞，重新进行融合实验；■(4)、杂交细胞停止分泌抗体出现这种情况的第一个原因可能是由于克隆化进行过晚，导致一些非必需细胞或不分泌抗体的细胞过分生长。其二是由于污染了支原体。如果判定是污染了支原体，可将细胞培养在小鼠的巨噬细胞上来净化细胞；■(5)、克隆化困难这主要是因为有些细胞在低细胞密度时生长较差,■此可以通过加入较多的饲养细胞来改善，也可以在培养夜中加入10-4moi/L6-筑基乙醇(2ME)和20%FCS来促进细胞克隆化的进行。2.5T-淋巴细胞杂交瘤的产生T-淋巴细胞在机体细胞免疫系统中起着重要的作用。一般T-淋巴细胞杂交瘤技术和B-淋巴细胞杂交瘤技术基本相似，同样需要HGPRT缺陷的T-细胞系瘤，例如来自AKR胸腺瘤的BW1547、化学致癌剂诱导的C57B1/6淋巴瘤EL4等。这些细胞和T-淋巴细胞发生融合，可以产生各种特性的T-细胞杂交瘤。2.6单克隆抗体研究方向和

260新型单克隆抗体新型单克隆抗体主要是通过基因工程手段来实现的，近年来发展十分迅速，相继出现了嵌合抗体、人源化抗体以及用原核细胞构建和表达的全套抗体。1、嵌合抗体2、重构型抗体和人源化抗体3、新效能抗体4、双功能抗体5、单链、单区抗体6、原核克隆抗体和噬菌体抗体7、抗独特型抗体嵌合抗体嵌合抗体是利用基因重组技术，将控制小鼠抗体重链和轻链的中可变区的基因片段和控制人抗体重链和轻链中不变区的基因片段在体外连接形成重组基因，然后导入真核细胞的某种表达质粒中，再将这种含有重组基因的表达载体转化哺乳动物骨髓瘤细胞，筛选能分泌完整的鼠一人单克隆抗体的转化子。重构型抗体和人源化抗体在嵌合抗体中由于鼠抗体仍然占有一定比例，在反复应用于临床时，人抗鼠抗体反应的可能性必然存在。又因为决定抗体特异性的部位由可变区中的互补决定基而定，因此为进一步减少鼠抗体的免疫抗原性可以用人抗体可变区基因中的互补决定基取代嵌合抗体中鼠抗体可变区中的对应基团，彻底改变了嵌合抗体中和抗原结合部位的结构，创造了一个适合人体的抗原结合区，进一步增加了单克隆抗体在临床上应用的机会。

261新效能抗体抗体经过木瓜蛋白酶水解后可以获得一个易结晶的重链区，称为Fc片断，它不具有抗体活性，但具有免疫活性，因此可以引发机体产生抗体，这种抗体可以造成单克隆抗体的失活，还可能导致机体的过敏反应。因此如果利用基因重组的方法，将抗体Fc片断基因替换成能产生特异功能物质的基因，则表达后的基因产物即为新的抗体，这种抗体具有新的功效，同时又消除了Fc片断的免疫遗传性。或者利用点突变技术改变Fc片断其中的某个特殊氨基酸，以提高整个单克隆抗体与抗原的结合力。双功能抗体双功能抗体即是在一种单克隆抗体中揉合了另一种不同功能的抗体，使得抗体不仅具备了和抗原结合的能力，同时还能有效而彻底地消灭抗原物质。单链、单区抗体单链抗体是将抗体轻链可变区的C末端的基因与抗体重链可变区N末端的基因重组后，转入大肠杆菌中，表达后的产物为抗体的混合可变区单链，它既包括了原双链抗体轻链的C末端片断，同时又包括了重链N末端片断，因此和原完整抗体相比，二者与抗原的结合力以及特性相同。表现在临床应用时有许多优点：由于仅仅具有原抗体的可变区单链部分，分子量非常小所以其免疫原性能低，可以进入实体瘤周围的微循环等。单区抗体即只将抗体重链可变区的基因插入到噬菌体俗体中，使其表达，产生仅仅具有抗体重链可变区片断，即单区抗体。这种抗体和原始抗体相比较，它和抗原的亲和力降低约90%。但是这种方法与传统细胞融合杂交瘤技术比较，简便而且省时，可以在短时间内建立起多种抗体重链可变区的基因文库。不过这种单区抗体由于和抗原的亲和力低，因而在应用上具有很大的局限性。

262原核克隆抗体和噬菌体抗体利用各种抗体基因在原核细胞中表达的原核细胞系统生产的抗体称为原核克隆抗体，是一种更快、更简单的单克隆抗体的筛选、生产系统。同时又因为在段时间内可以构件和表达出大量的抗体，而且产量极高，还可以按抗体的具体用途筛选出各种能与各种抗原结合的最佳单克隆抗体，即满足一个抗原上所有抗原决定基的整套抗体，简称整套抗体。这种方法克服了以往采用真核细胞体系带来的转化或转染困难的缺点，为拓宽和开发单克隆抗体的种类提供了一条有效的途径。如果将原核细胞系统改为噬菌体系统，则抗体的表达效果更好。抗独特型抗体根据Jerne在1974年提出的免疫网络学说，认为任何抗体分子或B、T-淋巴细胞抗原受体都存在着独特的抗原（Id）,这些抗原可以进一步被身体中的相对应的另一类免疫细胞所识别，并分泌出抗独特抗原的抗体（抗-Id）,而抗-Id上同样存在着特异的抗原，可以继续诱发产生独特的抗-抗-Id,如此进行下去，形成一个免疫网络，即抗体的可变区不仅具有抗体的活性，而且还具有抗原的特性，既能识别抗原也能被另一类淋巴细胞识别，将这种抗体可变区所具有的抗原特性称为独特型，而能够识别这种独特型的另一种抗体则称为抗独特型抗体（抗-Id）o2.8单克隆抗体的应用单克隆抗体由于其特异性强、纯度高和能大量生产等特点，在医疗和其它方面已显示出其重大的价值，并具有巨大的潜力。主要表现在新型诊断试剂、骨髓和器官移植、治疗试剂、蛋白质分离提纯

263以及在其它相关学科等领域的应用。-、新型诊断试剂-、临床治疗-、骨髓和器官移植-、蛋白质提纯-、在相关学科中的应用-新型诊断试剂-（1）、癌症诊断-经过多年的研究，发现肝癌和畸胎瘤患者血清中存在有大量的甲胎蛋白（AFP）。甲胎蛋白是一种在正常胎儿血清中含量较大的蛋白质，但在成人血清中显著减少，临床上不易捡出。因此甲胎蛋白可用于肝癌和畸胎瘤诊断的癌标志抗原。目前，甲胎蛋白的基因已克隆成功，其分子中含有约4%糖链，而且根据糖链的差别已能区别不同来源的甲胎蛋白，从而根据其抗原的特异性，可以制成相应的单克隆抗体用于癌症诊断。-(2)、体内定位诊断-不同的癌症或肿瘤在体内所表现出的癌抗原或瘤抗原不同，可以获得各种特异的单克隆抗体，而采用合适的同位素标记法使特异的单克隆抗体上带有放射性标记。当这种放射性的单克隆抗体注入到患者体内时，被血流输送到肿瘤部位，同其相应的肿瘤抗原在体内进行特异的结合反应随着时间的延长，标记放射性单克隆抗体会在肿瘤组织中(肿瘤抗原含量大)

264聚集，并根据肿瘤形状形成一个放射强度较大的区域，然后利用仪器在体外进行探测，了解肿瘤的大小、形状、位置与数量，也可以帮助确定病变的性质。-(3)、药物的测定-利用放射免疫测定和酶联免疫测定法可以测定体内微量的激素或药物等成分，而且由于单克隆抗体的精度高，使敏感度和重复性大大增高，因此在临床诊断上取代多克隆抗体的抗血清已成为发展趋势。-(4)、传染病诊断-病毒、细菌及寄生虫等传染病都可以用相应的单克隆抗体给以快速而准确的诊断，并且根据特异性强的单克隆抗体和相应抗原结合的特点能够鉴定出病毒的抗原亚型。-临床治疗临床上单克隆抗体可用于某些细菌和病毒感染而引起的疾病以及如蛇毒或其它毒物造成急性中毒症的被动免疫或治疗。单克隆抗体对b型流感嗜血杆菌、肺炎球菌、破伤风以及乙型脑炎等疾病有预防作用。-单克隆抗体在肿瘤治疗方面目前正显示着其巨大的优势，其中治疗效果较好的有白血病、淋巴瘤、肾癌、肉瘤、黑色素瘤、肝癌以及胃肠道肿瘤等。因为肿瘤细胞和正常细胞相比，其表面具有一些附加的或新的抗原,这样结合到肿瘤细胞上的单克隆抗体都被分离后，可以得到一个或更多的肿瘤特异性的单克隆抗体，这种抗体就可以用于肿瘤化学治疗基础免疫毒素学的载体——导弹。例如魂麻蛋白是一种细胞毒素，它具有同细胞结合的基团和杀死细胞的基团，不仅可以杀死肿瘤细胞，也可以破坏正常的细胞，但是如果将这种毒素中能杀死细胞的活性基团分离出来，结合到能够

265识别肿瘤细胞的单克隆抗体上，则形成了新型的单克隆抗体，它可以特异地识别肿瘤细胞，而不和正常细胞结合，最终在单克隆抗体的带领下，杀死肿瘤细胞。由于它具有定性致死作用，因此这种新功能的单克隆抗体又称为生物导弹。-目前研制生物导弹的最新途径是将双功能单克隆抗体或嵌合抗体/T-细胞受体基因拼接在一起并在某种受体中表达，表达产物在体内与肿瘤细胞结合，然后被T-细胞选择性地识别，最终将肿瘤细胞杀灭。骨髓和器官移植器官移植的成功要求由同种而不同个体移植来的细胞或组织不被受体排斥，即移植组织具有免疫耐受性，又称为组织相容性。因此在手术前必须检测供体和受体的主要组织相容性抗原的配型是否相同。以前检测所用的抗血清中抗体滴度低，而且供应量有限。而使用单克隆抗体（包括抗组织相容性抗原、抗淋巴细胞和巨噬细胞）可以制成高效价的诊断试剂，提高器官移植的成功率。蛋白质提纯利用抗体和抗原高度亲和的特点，单克隆抗体可以广泛应用于亲和层析分离纯化蛋白质物质。在相关学科中的应用单克隆抗体在微生物学中可以作为一种新兴的微生物分类方法对病毒、细菌、酵母菌和霉菌等微生物进行更为细致的分类。在寄生虫学中可以拓宽预防的途径，开发新型的疫苗预防寄生虫病。免疫学中也可以利用单克隆抗体分析抗体的多样性、特异性、交叉反应性、亲和力以及个体基因型的结构基因，从而阐明抗体多样性的机理；可以提纯各种抗原，从而对这些抗原进行结构分析和功能的研究或用于制备疫苗等。在发育生物学中，可以利用单克隆抗体分析不同阶段的细胞和不同部位、不同分化状态以及不同分化方向的细胞所具有的不同的细胞表面抗原，从而有助于研究细胞发育和分化的机理。遗传工程学领域中，单克隆抗体也大有用武之地，最突出的例子是可以分离和纯化

266目的基因。另外，单克隆抗体在肿瘤学和传染病学等领域也具有广泛的应用。微生物原生质体融合技术■微生物原生质体和原生质体融合■微生物原生质体融合技术的应用微生物原生质体和原生质体融合微生物原生质体是除去细胞壁的裸露细胞，但仍保持完整细胞的遗传特征及生理生化特性，在适当条件下，能再生细胞壁，恢复成完整细胞。微生物原生质体融和技术是改造微生物细胞遗传特性的重要新技术之一。微生物原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以去除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹着的球状原生质体，然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，在外力作用下（如采用PEG或电压）助融，使它们相互凝集进行细胞质融合，接着发生两套或多套基因组之间的接触、交换和重组，在再生细胞中获得异核体或重组体。■微生物原生质体融合技术的应用■原生质体融合技术已称为微生物育种的重要手段，它的最大特点是超越了生物体所具有的“性''的障碍，为不同种细胞间的融合提供了可能。■目前，在链霉菌、酵母菌和其它真菌中，应用原生质体融合技术已获得了一些性状优良而且稳定的菌株。链霉菌是许多重要抗生素的产生菌，将庆丰链霉菌和吸水链霉菌井冈变种进行原生质体融合，其融合株能在细胞内积累一种抗菌活性物质，其性质不同于两亲株所产生的抗生素——庆丰霉素和井冈霉素，说明这两个不同种链霉菌的基因组在融合时发生了新的基因组合。■用原生质体融合方法培育具有多种杀灭害虫能力的新菌株也是重要的研究课题。苏云金杆菌是杀玉米螟的重要生物农药；灭蚊球也菌具有杀灭蚊子的效能。科学家将这两种菌的原生质体进行融合，获得了既能灭蚊

267又能杀螟的新菌株。展望■很多不同种类的动物细胞之间或动物与人的细胞之间都能进行融合，形成杂种细胞，例如人一鼠、人一兔、人一鸡、人一蛙、鼠一鸡、鼠一兔、鼠—猴等的细胞都能进行融合。动物细胞融合技术最重要的用途，是制备单克隆抗体。人源化抗体的研制和生产■抗体可以对抗各种病原体，亦可作为导向器，但目前的单克隆抗体多为鼠源性抗体，注入人体后会产生抗体（抗抗体）或激发免疫反应。目前国外已研究噬菌体抗体技术、嵌合抗体技术、基因工程抗体技术等来解决人源化抗体问题。-单克隆抗体的实验成功，不仅在生物学基础理论的研究中具有重要意义，而且在实践上也有很高的实用价值。单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，优越性非常明显。国内外已有多种单克隆抗体实现商品化，制成单抗诊断盒，有的已投放市场。人们正在研究用单克隆抗体治疗癌症，就是在单抗上连接抗癌药物，制成“生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部位，既消灭了癌细胞，又不会伤害健康细胞。