异病同证之肝阳化风证的蛋白质组学研究及PRX3在肝阳化风证的表达及意义

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中南大学硕士学位论文异病同证之肝阳化风证的蛋白质组学研究及PRX3在肝阳化风证的表达及意义姓名:程田カ申请学位级别:硕士专业:中西医结合临床指导教师:梁清华20090501

1病肝阳化风证组与健康对照比较有17个相同表达的蛋白质,15个差异蛋白表达,其中13个蛋白质较健康对照组表达下调,2个蛋白质较健康对照组表达上调,而四病的肝阳化风证共有5个表达相同的蛋白质,且表达均较健康对照组表达下调。鉴定出的蛋白质根据涉及的功能进行分类:包括细胞骨架蛋白、代谢酶类、细胞信号转导蛋白、抗氧化蛋白、血液蛋白等。2.,差异蛋白验证结果:RT.PCR法证实PRX3在各组的表达水平与2—DE结果一致:与健康对照组表达比较,脑出血,脑梗塞,颈椎病,帕金森病四病的肝阳化风证PRX3表达量均明显下调（P<0.05）»而四病各组间PRX3表达无差异（p>0.05）〇结论1.初步建立了脑出血,脑梗塞,‘颈椎病，帕金森病肝阳化风证患者及健康人对照组的外周血单个核细胞蛋白质表达图谱。2.脑出血,脑梗塞，颈椎病,帕金森病四病的肝阳化风证（异病同证）患者具有相同及差异表达的蛋白质,提示异病同证既有证的共同的物质基础（相同的蛋白质表达）,又有疾病本身不同的特点（差异蛋白质表达）。3.PRX3的RT.PCR验证结果与2—DE结果一致,提示蛋白质组学检测的准确性,可靠性。4.异病同证之肝阳化风证均有PRX3表达，并均较健康对照组相比下调,且脑出血，脑梗塞,颈椎病，帕金森病四病间的肝阳化风证的PRX3

2组间表达无明显差异,提示PRX3蛋白可能为肝阳化风证特异性蛋白。关键词脑出血,异病同证,肝阳化风证,蛋白质组,外周血单个核细胞,RT-PCR

3ABSTRACTOBJECTIVE①Toexp1oretheessenceofLiverYangFormingWindSyndrome(inc1udingCerebra1hemorrhage、Cerebralinfarction>Cervica1spondylosis、Parkinsondisease)byEstab1ishingthetwodimensiona1polyacry1amidege1e1ectrophoresis(2一DE)expressionmapsoftota1proteininPBMCsoftheandthenorma1personsandanalysingthedifferentexpressionproteins.(2)ToexploretheessenceoftheLiverYangFormingWindSyndromebycomparingmRNAexpressionofPRX3mRNAintheLiverYangFormingWindSyndromeandthenorma1METHODSPBMCsoftheLiverYangFormingWindSyndrome(inc1udingCerebraIhemorrhage,Cerebralinfarction,Cervicalspondylosis>Parkinsondisease),andthenorma1personswereisolatedbyusingLymphozytesseparationmedium.2—DEwasappliedtoseparatethetotalproteinsofthethreegroupstogaindifferentepressionproteinsandestabi1ish2—DEimageandana1ysethembyPDQuest7.3.1software.DifferentepressionproteinwereidentifiedbyMALDI•—TOF・ーMSanddatabaseanalysis.RT-PCRwasusedtodeterminetheexpressionsofPRX3inthetwogroup'RES哪S1.TheexpressionmapsofproteomicsinPBMCsofLiverYangFormingWindSyndrome(inc1udingCerebra1hemorrhage、Cerebra1infarction、CervicalspondylosiSxParkinsondisease)andnormalpersonswereestabiishied.Comparedwiththenorma1controlromeofCerebralhemgroup,LiverYangFormingWindSyndorrhagehas21identicalpeoteinspots,andhasl7differentproteinspotproteinsexpressionhavedown,4proteinsexpressionhaveup.Comparedwiththenorma1contr〇1group,LiverYangFormingWindSyndromeofCerebralinfarctionhas22identicalpeoteinspots,andhas22differentproteinspots,and18proteinsexpressionhavedown,3proteinsexpressionhaveup.Comparedwiththenorma1controlgroup,LiverYangFormingWindSyndromeofParkinsondiseasehas23identica1peoteinspots,andhas20differentproteinspots,

4andl8proteinsexpressionhavedown,2proteinsexpressionhaveup.Comparedwiththenorma1contr〇1group,LiverYangFormingWindSyndromeofCervicalspondylosishasl7identicalpeoteinspots,andhas15differentproteinspots,andl3proteinsexpressionhavedown,2proteinsexpressionhaveup.Andhave6sameproteinsexpressioninLiverYangFormingWindSyndrome.1.ComparedwiththenormaIcontrolgroup,Thioredoxin—dependentperoxidereductasedecreasedinthe1iver—yangformingwindgroup(p

5原创性声明本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名:日期:盟年』月Et学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内容,可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》,并通过网络向社会公众提供信息服务。

6…名:鲤新签名群噺彳上心刖菁目前的研究表明,证是中医辨证论治的核心,是理法方药ー脉相承的桥梁和关键，多年来一直是中医研究现代化的突破口.中医证候是指在致病因素作用下，机体内外环境各系统之间相互关系发生紊乱所产生的综合反应,是反映疾病处于某ー阶段病因、病性、病位、病势等病理因素的综合性诊断概念，是致病因素与机体反应两方面情况的综合。“证”是生命物质在疾病过程中具冇时相性的本质反映,“候''是指病变的临床表现。"证候’’说明了中医学是通过观察患者整体的异常表现来把握疾病本质的。证候是对致病因子与体质因素相互作用的综合反映,这种相互作用的过程一定冇其物质基础。因此，釆用现代科技手段和方法来揭示其物质基础并对其定量和定性研究是可能的。不同的疾病可能出现中医理论所阐述的相同的证（异病同证），相同的疾病在不同的发展阶段和不同的个体上也可能表现为中医不同的证（同病异证）。通过大量的试验及研究,观察到许多与中医证本质有关的现象和事实:①证与植物神经系统:实践表明，在证的发生发展过程中,植物神经系统的功能状态常有一定的异常改变,如叶雪清等【1.2】对月经不调等妇科疾病阳虚和阴虚患者的观察,经植物性神经功能测定和Wenger植物性神经平衡因子分析，阳虚者大多数表现为交感神经功能减退或副交感神经功能增强;阴虚者的变化不明显。陆启滨等【3]则研究报道绝经前后阴虚火旺者的植物性神经功能异常增强,经用滋阴降火药治疗后可获得显著改善。②证与免疫系统:各种虚证患者常有免疫功能的紊乱和降低。全建峰等【4】在慢性肾炎及糖尿病患者中,肾阴虚证患者呈现体液免疫功能相对亢进的相似变化,其中以血清IgM（免疫球蛋白M）升高较为显著。蔡宛如等【5】研究发现不论是痰热型还是痰热伤阴型其细胞免疫功能都是低下的,主要表现为TH细胞（辅助型T细胞）降低，T4/T8（辅助性淋巴细胞/抑制性淋巴细胞）比例下降。③证与内分泌系统:许多研究报道虚证时常有激素分泌功能的异常,特别是下丘脑.垂体.肾上腺皮质轴、下丘脑.垂体.甲状腺轴、下丘脑.垂体.性腺轴的功能失调等。秦路平等【61报道。肾阳虚证血浆皮质酮、ACTH（促肾上腺皮质激素）浓度明显降低。樊蔚虹等【7】研究发现肝，肾阴虚模型大鼠下丘脑TRH（促甲素释放激素）增高，血清TSH（垂体促甲状腺素）、FT3（游离甲状腺素）、FT4（游离三碘腺原氨酸）水平均降低，而血清rT3（反甲状腺素）、T细胞亚群浓度升髙,说明此轴功能紊乱可能是肝肾阴虚证本质之ー。丘瑞香掣8】研究发现:肾阴虚患者血浆雌二醇（E2）和E2/T（睾酮）

7均显著增高,肾阴虚的E2值显著高于肾阳虚者。④证与环2磷酸腺昔（cAMP）和环磷酸鸟苗（cGMP）：1973年美国生物学家G〇!dberg曾提出过“阴阳学说与cAMP和cGMP双向调节关系假说”。曾经一度有人把cAMP、cGMP认为可能是阴阳的本质,认为阴虚者cAm.w占优势,阳虚者eGMP者占优势,两者在cAMP/cGMP比值上存在差别。但是后来的研究者们在研究其它病种不同证型患者的环核甘酸变化时,却没有得出相同的结论。⑤证与其它实验指标:有研究表明阴虚时机体内常存在着微量元素代谢异常表现,薛沙等【9I研究发现全血屮微量元素铁、锌铜含量下降。申维玺等【1。】研究表明阴虚证的本质是细胞因子,其发病学机理是由于机体在各种致病因素的作用下,白细胞介素.1和肿瘤坏死因子等炎性细胞因子基因的表达水平增强、生物学活性相对升高,弓I起细胞因子网络紊乱。上述试验结果表明在中医证候的发生发展过程中,人体的神经系统、内分泌系统、免疫系统及各器官、组织和细胞等的结构和或功能大都发生了一定的变化,其相应的实验室指标也大都发生了相应的改变。证候是生命活动的表现特征，而生命活动的主要执行者则是蛋白质,基因决定蛋白质的表达,蛋白质的表达决定人的外表、特征、行为等,那么不同的“证”可能受不同的基因调控。从基因分子水平研究中医证候是冃前热门的研究课题,而基因作为遗传信息的载体，均要表达为相应的蛋白质或修饰相关蛋白才能影响生物的功能,蛋白质组学正是从整体的角度,分析细胞内所有动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，是从基因层面向蛋白质层面的深化。对异病同证的研究,可通过对不同疾病中同一证候基因或蛋白质表达差异的研究,揭示形成该证候的关键基因和蛋白质。中医证候具有明显的整体性和动态观,而蛋白质组又是对不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体进行研究.育邑够从整体水平反映疾病过程中蛋白质表达的动态演变，与中医辨证论治的认识论和方法论具有极大的相似性.而证候学研究需要我们正确的研究思路和研究方法“证候既然是有规律的病理表现,就必然冇其物质基础”,这是我们研究证候实质建立的命题。中医学是通过研究人体生理病理现象，来把握人体这个复杂巨系统在ー个时间段的生理病理状态的。中医基础理论中的证候不是在解剖、实验等实证基础上形成的,而是通过研究疾病的外在现象,运用理论思维,把握了现象与本质的矛盾关系,对疾病某ー阶段的病理状态进行的理论概括,是理性思维的成果。本研究在我所过去研究工作的基础匕运用蛋白质组学技术，以不同疾病的肝阳化风证（脑出血,脑梗塞,颈椎病,帕金森病〉及健康人的外周血淋巴细胞为研究靶标,通过比较肝阳化风证（脑出血,脑梗塞,颈椎病,帕金森病）及健康人对照组的外周血淋巴细胞细胞蛋白质表达的相关性和差异性,并选择与肝阳化风证相关蛋白,采用RT-PCR方法加以验证，从异病同证的角度及蛋白组学水平来探讨“肝阳化风证’’的物质内涵,以期为“肝阳化风证”证本质的深入研究提供科学依据。第一章中医肝阳化风证患者和健康人外周血淋巴细胞二维凝胶图谱的建立1材料与方法1.1材料1.1.1主要实验仪器与生物信息学软件(1)超低温冰箱(Sany〇公司,日本)。

8(2)离心机(Bi0一Rad公司),低温高速离心机(Beckman公司)。(3)IPGphor等电聚焦仪,EttanDALT垂直电泳槽(AmershamPharmacia公司)。(4)Imagescanner扫描仪,Labscan扫描控制和分析前处理7.3软件凝丿鋼物析軟件WB』〇.Pad公司)。1.1.2试剂和材料(1)二硫苏糖醇(DTT),碘乙酰胺(iodoacetamide),双向凝胶电泳标准蛋白质,碳酸氢桜(NH4HC03),三氟乙酸(TFA),乙睛(acetonitri/ドイ基.牛屎羟基肉桂酸(CCA),TEMED,去白蛋白和IgG试剂盒Pr〇te〇PrepJl^ueAlbuminDep1etionKit均为Sigma公司产翳.(2)固相PH梯度干胶条(IPGstrippH3-10L,24cm),IPG缓冲液(pH3-IONL),两性电解质(pharmalyte,pH3-IONL),覆痴质!1W制平ea),丙烯酰胺(acrylamide),甲叉双丙烯酰胺,甘氨酸(glycine),Tris,CHAPS,SDS,测定蛋白质浓度试剂盒Amersham2—DQ史マP向为AmershamBioscieces公司产品。亠(3)考马斯亮蓝G-250为USB公司产品。(4)硫酸铉,无水乙醇,冰醋酸,丙酮,甲醛,甲醇,澳酚蓝,琼脂糖,磷酸,盐酸,甘油均为国产分析纯级。(5)双蒸水由本实验室制备。1.1.3研究对象1.1.3.1病例来源严格选择脑出血,脑梗塞，颈椎病，帕金森病肝阳化风证患者各10例,均为本院2007年1月至2007年8月住院病例，脑出血西医诊断与排除标准:符合1995年畲第四届脑血管病学术会议通过的脑出血诊断标准【11］并经颅脑CT确诊;脑梗死西医诊断与排除标准:符合1995年全国第四届脑血管病学术会议通过的动脉粥样硬化性血栓性脑梗死诊断标准【12】;颈椎病诊断标准符合1992年第2届颈椎病专题座谈会上制订的颈椎病诊断标准,并排除严重的脊髓型引起明显的脊髓压迫、颈椎椎体滑脱、明显的椎管狭窄及颈椎有结核、肿瘤等骨质破坏者;帕金森病诊断标准符合1992年CAPIT(C〇reAssessmentProgramforIntracerebralTransplantation)制定的标准,排除标准:化学药物、创伤、脑血管病及其他病因所致的帕金森综合征。辨证标准参照中华全国中医学会治疗内科学会1986年8月订的中风病诊断标准及参考金益强《中医肝脏象现代研究与临床》经过鉴定的肝病证候临床辨证标斛13，14］。具体标准如下:肝阳上亢证1.眩晕2.头痛3.面制甌热4.烦躁易怒5.口苦咽干6.脉弦.风证1.眩晕欲倒2.肢麻3.步屉不正4.手足抖动5.语言蹇涩6.半身不遂7.口舌歪斜。肝阳化风证具备肝阳上亢证4项及风证3项(5.6.7必备ー项)即可确诊;纳入排除标准:参照《中药新药治疗中风的临床指导原则》［1511.1.3.2健康对照组选择10例健康志愿者,经体格检查符合老龄健康人条件者(参照1982年2月中华医学老年医学会规定),均来自医院体检中心,男女各5名,年龄40—64岁,平均年龄53.7±7.9岁,均排除心、肝、肾等功能不全者,有活动性胃肠病变者，血液及内分泌系统疾病者，过敏体质者，孕期或哺乳期妇女。1.2实验方法1.2.1各种溶液的配制

9(1)水化液8MUrea480mg4%CHAPS4OmgDTT20mg溟酚蓝痕量双蒸水1rn1保存于.2冰箱备用。(2)30%聚両烯酰胺贮液丙烯酰胺150930%甲叉双丙烯酰胺490.8%双蒸水至500ml过滤后,保存于4"C冰箱备用。

10(3)1.5mo1/LTristtpH8.8浓盐酸调节PH值至PH8.8过滤后,保存于4”C冰箱备用。(4)2%琼脂糖S电泳缓冲液100ml(5)10%SDS琼脂糖溪酚蓝100ml混匀后,室温保存备用。(6)SDS—PAGE凝胶制备(新鲜配制)30%聚丙烯酰胺贮液125.1m11.5MnIrisPH8.81〇%SDS751111TEMED至300ml凝胶新鲜配制,3块胶大约需要300m1溶液。(7)平衡液1.5MnIrisPH8.83.335ml澳酚蓝痕量双蒸水至100ml①保存于4"C冰箱备用;②平衡液A:平衡液2Om1+40ragDTT(2根胶条所需剂量,临用前配制);⑧平衡液B：平衡液2Oml+O.69碘乙酰胺(2根胶条所需剂量,临用前配制)。(8)SDS电泳缓冲液(新鲜配制)甘氨酸144.29

11Tris30.29SDS!〇9双蒸水10L(9)考染液(新鲜配制)考马斯亮蓝G.2500.69磷酸50ml硫酸核509双蒸水至400ml甲醇临用前加100m]表中为2块胶所需用量。Q09脱色液(新鲜配制)无水乙醇100ml双蒸水400ml表中为2块胶所需用量。1.2.2实验分组按1.1.3.1标准分为肝阳化风组(脑出血,脑梗塞，颈椎病，帕金森病)，健康对照组。1.2.3淋巴细胞细胞标本的处理抽血10ml放入盛有肝素(3125U/1.5rm)的玻璃试管中，常温静置26,时令其分层,抽取上层混悬液(血浆)放入装有淋巴细胞分离液的15ml带盖离心管中(分离血浆=1：1/1：3)«水平离心机离ー1二,(1800r/min,20min)»离心后液体分刎下依次为血浆、淋巴细胞、淋巴分离液、红细胞,用1m1注射器抽取淋巴细胞转移到另ー15I珂带盖离心管中,往离心管中加满N.S,摇匀后,离.凸,(800r/min,10n(fin):弃上淸液,再往离心管中加满N.S,摇匀后,再次离心(1000r/min,10r弃匕得薪;往离心管中加1m1N.S,摇匀，转移到EP管离心后弃上清液后.70"C长期存。1.3.4蛋白质样品准备和浓度测定（1）样品制备每EP管标本放细胞裂解液50u1（反复振荡令其充分溶解（I0sec/次x8次）,每次间隔10分钟,离ーL,（10000转x1hr,4℃）,吸取上清液即为细胞总蛋白质。取5u1,.20ヒ存放,（2）BCA法测血清蛋白浓度

121.5"ーー’2小时后BAC法测外周血淋巴细胞蛋白浓度,采用2—DQuantKit试剂盒。按Amersham2.DQuantKit说明书进行操作:1）准备工作液:将colorreagentA与colorreagentB以100：1的比、例混合成workingcolorreagento每管需workingcolorr，）准备样品管,样品体积5m。）每管加5001-tlprecipitant,并短暂振荡后室温孵育2—3分用"）每管加500}tlco-precipitant,短"中ヤ0000转/分离心5分钟以沉淀蛋白质。）倒去管内液体,应避免将沉淀的蛋白质打散。）再次短暂离心各管,将管壁上的液体离心至管底,试管应与步骤6中持同一方向。用移液器吸去管底液体。9）每管加coppersolutionlOO肛1和双蒸水400It1.快速振荡重溶沉淀的白质。蛋10）每管加workingcolorreagentllll1,哗?）室温孵育20分钟。12）每管吸2001.t1至96孔板。用酶标仪以双蒸水为对照在490nt〇处读取吸光度值（0D值）。13）绘制标准曲线,计算回归方程,算出样品的蛋白质浓度。（3）第一向固相PH梯度等电聚焦1）用洗涤剂清洗持胶槽（Holder）,用水冲洗干净后再以双蒸水漂洗,干燥。冃£づ南看糕油曲线:根据下表用浓度为2mg/ml的BSA（bovineserurl1albumin,牛血清白蛋白）标准液准备标准曲线。每ー浓度重复3次。表1标准曲线的制备2）取一定体积的肝阳化风证患者外周血淋巴细胞细胞,和健康対照者外周血淋巴细胞细胞蛋白溶液,上样量1000ug（经LL较。发现上样量1000ug时雪质点最清晰）,根据蛋白浓度计算蛋白上样量,加入DTTO。001359,IPGBuffer2.250a,以水化液补足至45091O混匀后均匀加至IPGstrip持胶槽中。3）将IPG干胶条（PH3.10L,24Ommx3mmx0.5ram）去保护膜胶面朝下,轻轻置入H。1der中。胶条酸性端朝向H。1der的正极,碱性端朝向H。1der的负极。用无菌镜子持胶条碱性端慢慢压向水化液面,将胶条置于H。1der中,避免气泡产生。胶条与H〇!der电极紧密接触。覆盖以800p,1的覆盖液,盖好持胶槽盖。将H。1der按规定放置在IPGph。r的平板电极上,关上安全盖。4）水化和等电聚焦在20C自动进行,总电压时间积为70020Vh,电流为每根胶条20从。其中水化在30V电压下进行13h,然后在100V/0.5卜0003/°1エムa♦〇吊り'1h,8000V>8h（8.5h,68000Vh）进行等电聚焦电泳条件下进行等电聚焦。

135）平衡:等电聚焦结束后,迅速取出带有样品的IPG胶条,用双蒸水冲洗多余的水化液,滤纸吸干多余水分。分别置入10ml平衡液A和10m1平衡液B中,脱色摇床上摇振,各平衡15mm。从平衡管中取出胶条,用电泳缓冲液泡洗一次，行第二向SDS.PAGE电泳。（4）第二向垂直S1）S.PAGE电泳1）灌胶将配制好的30%聚丙烯酰胺贮液,1.5MTris（PH8O8）,10%SDS,AP,TEMED,双蒸水,按试剂配方配制12.5%SDS.PAGE胶溶液。将现配制的胶溶液注入安装好的制胶玻璃槽内,以正丁醇封胶。凝胶聚合2小时以上,制备完成。2）胶条转移至第二向胶除去凝胶上覆盖的水层,滤纸吸干胶面上水分。将平衡后的IPG胶条移至0.75mm厚的PAGE胶上端,在其一端加上标准蛋臼质标记,排净气泡后用〇.5%琼脂糖封固。3）电泳加入SDS电泳缓冲液,盖上电泳槽盖,电泳条件为2.5W/strip电泳30min,然后按每块胶12w的恒功率电泳,直到溟酚蓝指示线到达凝胶底边为止,停止电泳。4）脱胶从电泳槽中取出凝胶玻璃板,轻轻将两玻璃板揭开,将凝胶至于染色盘中。5）凝胶染色1）染色:在装有凝胶的染色盘中加入现配制的考马斯亮蓝G.250染色液,每块凝胶加入250ml,完全覆盖凝胶。置于脱色摇床过夜。2）脱色:倒去染色盘内染色液,以双蒸水漂洗两遍,加入现配的脱色液,每块凝胶250ml,置于脱色摇床,振摇15min。倒去脱色液,加双蒸水，覆盖凝胶,以备图像扫描。6）凝胶图像分析1）图像扫描Imagescanner扫描仪,Labscan扫描控制中,执行扫描。采用300DPI扫描的图像,扫描时图像与凝胶大小比例为1：1。强度校正时使用已知光密度的灰度尺。2）PDQuestV7.3.1软件分析胶图①点检测A.打开凝胶图像文件:B.Crop修剪图像:把要比较的图像修剪成同样分辨率大小:C・自动点检测：AutomatedDetectionandMatching»选择Master胶;DetectSpotsonGels斑点检测,点一个最弱的点CIickonafaintspot,框出ー个最大

14的点Boxthelargestspotcluster,重复几次，得到班点数目。斑点重复性按G〇rbett的计算方法②点匹配A,按AutomatedDetectionandMatching指令的对话框ー步步操作,自动整魏。B.手工加上斑点标记（AddSp〇t）或删除斑点标记（RemoveSpot）。每对斑点进行一次手工修改，软件自动重新进行全图的匹配。C.点击MatchT〇〇!s下的Landmark工具，校正不同胶图的位置偏差。D.Normalize工具校正实验中上样量的差异导致的斑点浓度差异。③获取差异点包括各个胶图上的斑点数,匹配的斑点数和匹配率。2结果经过多次预实验,PBMCs总蛋白质经双向凝胶电泳分离，考染显色后得到背景淸晰、分辨率高、重复性好的脑出血肝阳化风证组、脑梗塞肝阳化风组,颈椎病肝阳化风组，帕金森病肝阳化风组及健康对照组外周血淋巴细胞2.DE图谱（总蛋白上样量为1000ug时图象最佳）。在相同条件下对各组PBMCs总蛋白分别进行了3次重复性检测,发现3次双向电泳图谱非常相似。采用Image

15Scanner扫描仪扫描获取图象,使用PDQuestV7.3.1双向凝胶电泳图象翕権駿面谱进行图象分析,通过选择最弱点、最小点、及最强点,PDQuestV73.1能修自动过滤背景,将识别的获得的蛋白点的面积、灰度等数据拟合成一张新的凝胶,在拟台胶的基础之上对各胶进行匹配分析。在相同的设定值时检测到蛋白质点れ业し_^1^组552A=33个,脑出血肝阳化风证组621=E21个,脑梗塞肝阳化风组459ー掣53个,颈椎病肝阳化风纳85=R6个,帕金森前叶I血风组542a=42个。经过背漏减后，分别将其中的ー块胶作为参考胶进行5块胶间的蛋白质点的匹配,结果得到健康麗组的平均匹配点数为414±-09个,脑舟所月I训为ノ，•「期。0ヘ=5.,脑梗塞肝阳化风组399a=79个，颈椎病肝阳化风组498=t=12个，帕金森病肝阳化风组425±牛向1向配奉分别为75%、80%、87%、85%、78%。差异点的判断有两个标准:ー是有和无的差别,二是蛋白质点比率小于。5或大于2为差异点,大干300%生〇5〜2之间为相I,与正常组比较差、此24个蛋白质斑▲3.图4,图5部分为显著差异蛋白同表达蛋「以异均在两倍以上点用箭头标示〇且至&出现在三次不同的实验中。病肝阳イ・イ正的酷1》蛋白质点的Fョ蛋白质点,泳"表达K+t奠蜀釜哮瓣"pH3-10,NL,24cmI

16Scanner扫描仪扫描获取图象,使用PDQuestV7.3.1双向凝胶电泳图象分析软件对凝胶图谱进行图象分析,通过选择最弱点、最小点、及最强点,PDQuestV7.3.1能够自动过滤背景,将识别的获得的蛋白点的面积、灰度等数据拟合成一张新的凝胶,在拟合胶的基础之上对各胶进行匹配分析.在相同的设定值时检测到蛋白质点数分别为:健康对照组552±33个,脑出血肝阳化风证组621±21个，脑梗塞肝阳化风组459i53个,颈椎病肝阳化风组585±36个,帕金森病肝阳化风组542i42个。经过背景消减后,分别将其中的ー块胶作为参考胶进行5块胶间的蛋白质点的匹配,结果得到健康对照组的平均匹配点数为414±09个，脑出血肝阳化风证组509±55个，脑梗塞肝阳化风组399±79个，颈椎病肝阳化风组498±12个,帕金森病肝阳化风组425±52个,其平均匹配率分别为75%、80%、87%、85%、78%。差异点的判断有两个标准:ー是有和无的差别,二是蛋白质点比率小于0.5或大于2为差异点,大于300%为显著差异蛋白点，且至少出現在三次不同的实验中・比率在。.5〜2之间为相同表达蛋白质点，选取24个四病肝阳化风证的共同表达蛋白,与正常组比较差异均在两倍以上,作为目标蛋白质点,进行下ー步质谱鉴定,此24个蛋白质斑点用箭头标示。各组蛋白质电泳表达图谱见图1,图2,图3,图4,图5.部分蛋白质点的局部放大图见图6.图1健康组2-DE图谢考马斯亮苴染色pH3-10,NL,24cmlPG股条）

17LLU!ーー。ーーーーニ〜.一目2冀出血肝阳化风证妞2—眦目｛R考马斯竞苴棠邑邮.10,NL,24〇〇皿雕紊）0!,—=一:rin-目3脑梗塞肝阳化风纽2—DE图谱4考马斯竞蓝窠色pm—10.NL,24血删腔条）

18图2脑出血肝阳化风证组2-DE图谱（者马斯亮苴染色pH3-10,NL,24cmiPG胶条）

19'•‘——'I・一一.〜ヽ••—nj目4囊推病肝阳化风蛆2—DE目谱（孝马斯竞蓝染色pm-10,NL,24c—Je

20困4類楂病肝阳化风鉅2-DE图谱（考马斯亮苴染色pH340,NL,24cmiPG股条）图5怕金森肝阳化风组2-DE图谱（考马斯亮蓝染色pH3-10,NL.24cmiPG胶条）

2108..正常组08号蛋白质点11.-正常姐】】号蛋白质点脑出血肝『日化风08号蛋白质点脑出血肝阳化风11号蛋白质点I1一.脑梗塞肝阳化风08号蛋白质点脑梗塞肝阳化风】I号蛋白质点08.41111—••颈椎稿肝阳化风〇8号蛋白质点颈椎病肝阳化风L1号蛋白质点08ー・11〇e•帕全森病肝FStt,风〇8号蛋白质点帕空森癌肝阳化风11号蛋白质点囤6惦.11号蛋白点在健盘人组与肝阳化凰汪组的局部放大图3讨论本研究利用蛋臼质组学方法研究肝阳化风证（脑出血,脑梗塞,颈椎病,帕

22正常组08号蛋白质点11-正常组11号蛋白质点08-11-脑出血肝阳化风08号蛋白质点脑出血肝阳化风11号蛋白质点脑粳塞肝阳化风08号妥白质点脑梗塞肝阳化风11号蛋白质点颈椎痛肝阳化风08号蛋白质点顼椎病肝阳化风11号蛋白质点11-e帕金豪洛肝阳化风08号蛋白质点帕金豪搞肝阳化风11号蛋白质点图608.11号及白点在健康人组与肝阳化風汪短的局部放大图

233讨论本研究利用蛋白质组学方法研究肝阳化风证（脑出血,脑梗塞，颈椎病，帕金森病）及健康对照组的变化情况,找出23个蛋白质差异点,脑梗塞肝阳化风证组与健康对照组比较有21个相同表达的蛋白质,17个差异蛋白表达,其中13个蛋白质较健康对照组表达下调,4个较健康对照组表达上调,脑出血肝阳化风证组与健康对照组比较有22个相同表达的蛋白质,21个差异蛋白表达,其中18个蛋白质较健康对照组表达下调,3个较健康对照组表达上调,帕金森病肝阳化风证组与健康对照组比较有23个相同表达的蛋白质,20个差异蛋白表达,其中18个蛋白质较健康对照组表达下调,2个较健康对照组表达上调,颈椎病肝阳化风证组与健康对照比较有17个相同表达的蛋白质,15个差异蛋白表达,其中13个蛋白质较健康对照组表达下调,2个蛋白质较健康对照组表达上调。而四病肝阳化风证共有5个表达相同的蛋白质,且表达均较健康对照组表达下调。脑出血,脑梗塞,颈椎病,帕金森病的肝阳化风证（异病同证）具有相同及差异表达的蛋白质,提示异病同证既有证的共同的物质基础（相同的蛋白质表达）,又冇疾病本身不同的特点（差异蛋白质表达）。本研究下ー步应用质谱鉴定技术,蛋白质数据库检索等生物信息血分析鉴定上述相同蛋白质及差异蛋白质的类别,初步阐明其蛋白质的功能，拟解释肝阳化风证的本质内涵。4小结本实验初步构建了脑出血,脑梗塞,颈椎病,帕金森病四病的肝阳化风证及健康人的外周血单个核细胞蛋白质双向凝胶图谱，丰富了肝阳化风证的蛋白质组双向电泳数据库，为后续相关的比较蛋白质组研究及差异蛋白质鉴定奠定了基础。

24第二章质谱分析!材料与方法1.1材料1.1.1主要实验仪器App1iedBi〇systemVoyager—DESTRBiospectrometryTMworkstationsystem4307MALDI.TOF.MS质谱仪(ABI公司),冷冻抽干ー仪。1.1.2主要实验试剂(1)甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮ー胰蛋白酶(TPCK・Trypsin),三氣乙酸(TFA),乙月青(ACN),基质a.氟基4.羟基肉桂酸(CCA)等均购自Sigma公司。(2)碳酸氢筱(NH4HCO3)»无水乙醇均为国产分析纯级试剂。超纯水,双蒸水为本实验室制备。1.2方法1.2.1试剂配制(1)200mm〇I/LNI-hHC03:称取79.069NI-hHC03溶于50m!双蒸水中。(2)5%TFA.25001TFA+ddH204.75m1〇(3)脱色工作液:200mmo1/LN/-hHC0365001+1000AACN650010(4)覆盖液(酶解缓冲液)Imhl00%ACN9001+200mm〇!/LNI-hHC03200lA+ddH2071〇#•(5)萃取工作液:100%ACN+等体积5%TFA。(6)CCA基质工作液:CCA0.019,5%TFA2091,100%ACN1.す.0タ咸谱样曲时朝畧048001。(1)取点:切割选定蛋白质点并置于1.5ml的Eppendorf管中(另取不同2—DE胶对应的匹配点以及空白胶做对照)。(2)洗胶:超纯水振动洗涤3次。(3)脱色:每点加脱色工作液50p1,水浴37C共30分钟。(4)脱水:100%ACN50山共两次。(5)抽干:冷冻抽干仪抽干50分钟至胶块完全脱水。(6)酶解:每点加酶解工作液(已稀释TPCK.Trypsin胰酶1支用覆盖液再稀释成15个点的总体积)5山,冰上吸胀60分钟。(7)加覆盖液30ill,37ヒ離解过夜。(8)取上清,将上清收集于0.5rnlEppendorf管中。(9)萃取:每胶点加萃取工作液30I-t1,37ヒ水浴共6〇分钟。

25⑩抽干浓缩:冷冻抽干仪抽干浓缩至总体积2—51x1〇QD洗板:按先后ddH20,无水乙醇和1〇〇%ACN各两次。⑩点样:每点样孔先均匀点0.5Pl样品,再加0,5p,ICCA基质工作液于锈钢板セ。8室温干燥待测。1.2.3MALD丨-TOF-MS质谱分析制备好的样品用App1iedBiosystemVoyager—DESTRBiospectrometrvIIIworkstationsystem4307MALDI.TOF.MS质谱仪进行分析:采用反射模式,正离子谱测定,离子源加速电压为2000V»反射电压为1.12,N2激光波长337nm,脉冲宽度为3ns,离子延迟抽取100nsec,飞行管道真空度为4x!0"Torr,德堤l次扫描累加50次。使用ACTH作为外部标准,胰蛋白酶自切降解峰(842.510,2211.105)作为内部标准校正,获得肽质量指纹图(PMF)〇1.2.4数据库查询获得的PMF图谱用MascotDistiller软件(Matrixscience)识别单同位素信号峰,获得的肽片段的质荷Lt(m/z)数值输入Mascot查询系统(Matrixscience,www.matrixscience,corn)进行检索,搜索数据库为NCBI和MSDB蛋白质数据库,其他搜索条件为:肽片段质量8004000kDa,表观等电点的(PI)的误差范围无限制,表观分子量(Mr)的误差无限制，肽片段质量最大允许误差为200ppm«允许漏切的胰前酶切位点数为1个,物种来源为人类(Homosapiens),离子种类拓[M+H]+和单同位素峰(mon。isotopic),固定修饰为半胱氨酸碘乙酰胺化(carbamidomethyl)o另根据需要调整参数。2差异蛋白质点的质谱鉴定结果利用MASC0T软件检索Swisspr〇t蛋白质数据库进行了鉴定，鉴定出脑梗塞肝阳化风证组与健康対照组比较有21个相同表达的蛋白质,17个差异蛋白表达,其中13个蛋白质较健康对照组表达ド调,4个较健康对照组表达上调,脑出血肝阳化风证组与健康对照组比较有22个相同表达的蛋白质,21个差异蛋白表达,其中18个蛋白质较健康对照组表达下调，3个较健康对照组表达上调，帕金森病肝阳化风证组与健康对照组比较有23个相同表达的蛋白质，20个差异蛋白表达,其中18个蛋白质较健康对照组表达下调,2个较健康对照组表达上调,颈椎病肝阳化风证组与健康对照比较有17个相同表达的蛋白质，15个差异蛋白表达，其中13个蛋白质较健康对照组表达下调,2个蛋白质较健康对照组表达上调,而.四病的肝阳化风证共有5个表达相同的蛋白质,旦表达均较健康对照组表达下调。分别为假想蛋白Hypoflaetical-protei

26肌球蛋白调节轻链,丝氨酸/苏氨酸激酶特异蛋白激酶、硫氧化蛋白依赖性过氧化物还原酶、Tr2.1：ansge1in.2。差异蛋白检测结果及在各组表达情况见表表2差异蛋白检测结果及在各组表达情况Sp〇tAccessionNoProtc細Nomatche$塞/*/森/健病/1nameP1/MWPepIide脑帔脑出帕金颈椎健康健康康组健康组组组1Q5T6W2Heterogeneousnuclear5,43/4200912/33ribonucleoprotein上J11—•K2Q53QU3HypotheticalproteinNEDD56.85/368248/251IJ1I03QSWgSCappingprotein5.69/2970310/26-JJ-一4myosinrcgulatorylightchaln.sm〇othJX0232muscle4.80/197407/11上j[上上上5ACP1Adenylylcyclase—ass〇8.12/517957/20'1±jj"°ciatedproteini4一,ハ……,…,,6AAA61237Thrombospondin*16,60,4221518/43上]上上ー7Q96AF9ZYXproteintFragment]7.56/516948/27I1上上上一"8Thioredoxin-dependentperoxiC〜15802dereduetase.mltochondrl7-67/280178/19a]9serine/threonine-specS68455kinase(EC:1)CIPkF[va^l?d*aPed]8.30/518029/2511lOserlne/threonine-speciTIcproteln¥68455kinase(EC2.7.1)ILK[validated]8.30/5180211/30'[1J11J.111C—L114603Transgelii1-27.63/2124411/1511JJJJ1J12A47742RhoGDP-dissocIaIi0111nhibiIor25.1O/2303J8/34UJJJ13AAD13152Talin-15.75/27182812/23')11111-14AAH12854Aetin.cytoplasmic25.55/405369/28t—tttT15Q6PUJ7HUMANProhibII1n5.57/2984313/2.6无1JJ16P47756F—aetincappingproteinsubunitbcta5.36/3148515/36tttt无17V〇|tage—dependents)aion-$electiveP45880channelprotein24.95/5050312/45.C1—118FGHUBfibrinog胁beta.:hainprecursor8.54/5657714/43J1tJ1I9fibrinogenalphachainpreclIrsor.shoatFGHUAspIIceform[va1idated]8.23/7022715/36-11J20AFI76703F—boxonlypi-ote1n46.49/350636/24J111-RSUIRassuppressorproteini8.57/313909/19,’无1J22AAF73376Giutath)on(»transreraseomega-16.23/2783310/34.'''一’23Q502X3RAPIBproteinJ•■■■■••a••>.65/2100810/3i竹TI1j■—•■■—1—_•1.■■■■-1_•mminm1ma——1•_•1•_、注“。’代表与健康对照组比较无差别;“一‘代表较健康对照组下调50%;"上ノr”代表较饑腺由75%以上:“t一代表较健康对照组上调200%：“tt”代表较健康对照组上调300%以上;“无‘〇良示缺失

27经胰蛋白酶胶内酶切（以2—DE图谱中8号蛋白质质谱伯':为伊驹征假的弟M堪©;圓谱ひぶ利用嘶!F〇ts〇Rwa佗在Swiss-sp〇t数据库鉴定过程见图7,图8,图9•图1〇.!ハ…ロtf昼菇豪徙亟。£二,埋茧品。。香蕊图72DE图谱中8号蛋白质置的MALD!-T0FMS肤质量指缱图谱（PMF）横坐标代表质荷比（M/Z）,纵坐标代表离子相对强度,峰旁标示的数字代表肽”断的单同位禁峰的质量数{s4•釜磊;/MascotSearcもT毎0%tぞ!EW1：daf；旬e^^cjhけ的•e鹏0蛆H01_0116：,ndA3Frお<2通喇沿i!潮出ilfザ蝴曩阻i110l_01IKdatsubminedほNpiiv>W-giS<50tWtz1rd力口Dn-b•辨:MSDB2006083「搦，〇糟"qneTcai诙ioim夕95同07m嘲“c!中)ie哪熊潴㈠册、ザ2。(。ヅ型832Pl〇0eqTopS8”:船forAAF73376,AF212303N1D：-Hoセ女曲嘲う1图82-DE图谱中8号蛋白质点的Mascot搜索站果的羲图Pr〇babi1ityBasedMowseSgrQ)Fe^ins00排is110'Logco)*wherePistheprobabi1耐thattheobservedm§曲、hisarandomProteinscoresgreaterthan64arcsignificant(p<005)经膜蛋白醃胶内酶切（以2-DE图谱中8号蛋白质点为例）,在MALDI-TOF质谱仪上得到的特征性的肽质量指纹图谱以及利用Mascotsoftware在Swiss-spot数据库鉴定过程见图7,图8,图9,图10.Vo/«9«rSp««1206®.5041）

28图72-DE图讣中8号蛋白质る的MALDI-TQF-MS肽质量指纹用谱（PMF）横坐标代を质荷比（M/Z）,纵坐标代衣离子相对强度,峰旁标示的数字代表肽片断的单同位索峰的质最数送怒卷?MascotSearchResultsUser:MascotWizaniEmail:dafimg20(M@163.coaiSearchdtk:deagguit101.9116.dat-Samplelafo,E:\DAFANG\dtttfgwi20d61l\denfguil101_0116.datsabnittedfromMascotWizardonUNIT-WKS5Database:MSDB20060831(3239079sequences：10795947Mresidaefl)Taxonomy:Homosapiens(humaa)(148210sequences)Timestamp:2Nov2006at07:30:18GMTTopScore:85forAAF73376,AF212303NID:-Homosapiens图82-DE图谱中8号妥白质点的Mascot搜索结果的戴图ProbabilityBasedMowseScoreProteinscoreis-10,Log(P),wherePistheprobabilitythattheobservedmatchisarandomevent.Proteinscoresgreaterthan64aresignificant(p<0.05).

291J图98号蛋白质点PMF在NCB1nr数据库中Masc〇!检索结果横坐标表示蛋白质的MOIJSE得分,太于r1a(M)［影E的分教具有统计学意义【pV005）,対于时分数需太于64分,纵坐标表示得到集一分数的蛋白质数目.ゴ：CarbamidometIications：OxidatiIpsin：cutsC•termsideofKRun1essnextfmassvaluessearcheNumbrof(Wva1uesmatchMatchedpeage：PIiGsshovARH1PWGTSATへ51AKI.FSISSSCIlAPAVIoHAHYFKGI'AVVNGEFKD1AAcGRTSLINIJ1.CSGDFKGKYLVFFFY201SVEET25IVN(j图102—DE10IPIDFTFVC1^1E1CAFSDKN151GGLGHMNIALLSDLTKQISRLR图谱「18号中】质£卒列,序列覆盖率显示厦肤片段的E配情况（红色为相厶ユ・配的ル••段）••

30三X0-11"一1I鼻ーハ!r-Lr一「ー』,0100200内pm1】MBasedHovseScore图98号蛋白质点PMF在NCBlnr数据库中Mascot检索结果:横坐标表示蛋白质的MOUSE得分,大于阴影区的分数具有统计学意义(p<0.05),对于该分数需大于64分,纵坐标表示得到某一分数的蛋白质数目.Fixedmodifications:Carbamidomethyl(C)Variablemodifications:Oxidation(M)CleavagebyTrypsin:cutsC-termsideofKRunlessnextresidueisPNumberofmassvaluessearched:19Numberofmassvaluesmatched:8SequenceCoverage:40%MatchedpeptidesshowninBoldRed1MAAAVGRLLRASVARHVSAIPWGISATAALRPAACGRTSLTNLLCSGSSQ51AKLFSTSSSCHAPAVTQHAPYEKGTAVVNGEFKDLSLDDFKGKYLVFFFY101PLDFIFVCP1EICAFSDKANEFHDVNCEVVAVSVDSHFSHLAW1NTPRKN151GGLGHMN1ALLSDLTKQISRDYGVLLECSGLALRGLFIIDPNGVIKHLSV201NDLPVGRSVEETLRLVKAFQYVETHGEVCPANWTPDSPTIKPSPAASKEY251FQKVNG图102・DE图谱中8号蛋白质点序列,序列覆盖率显示及肤片段的匹配情况(红色为相匹配的肽片段)

31entryP30048ー蜀芨闌邀Mink1[N...a...orign]m...•易®!PcRoQnXi3TFb.％KL..〇e*]卩金，©roK0I怖...@tsfq...州a嚥&3:岫冽即娜...砌い，，，，a・e・丘05mlacy号健康人纟野蟒加蠣地.他耐网站查制梆B硯龜片^＜戶川京地走HonI〇P证”是个体。:外］心侍皿ー种反应性的宏观表现,它是机体的ー种特定的功能状态,有其自身的物质基础,“证”实质研究是中医学理论研究的基石和核，主是，医除化引重都题。人体生命活动最终体现为蛋白质的活动,人类蛋白质学可以直接揭示生命活动的本质和规律,发现人类重大疾病与病原体致病的物质基础及其发展的病理机制,并且蛋白质组学的整体性和系统性与中医基础理论的整体性和系统性相类似，因而具有高效解码证候生物学基础的潜カ,是揭示证实质的有效手段.本实验的创新点在于采用双向电泳（2—DE）与质谱（MS）及生物信息学分析结合研究方法,建立了异病同证脑梗塞,脑出血,颈椎病,帕金森病肝阳化风证及健康对照组外周血淋巴细胞总蛋白质的21）凝胶图谱，并初步鉴定了异病同证“肝阳化风证叶日同及差异表达的蛋白质。本研究中鉴定的23中蛋白质涉及到细胞膜，细胞质，细胞核,线粒体等多种细胞结构，涉及细胞分化，细胞凋亡,细胞增殖及信号传导等方面。根据SWISS-PROT和NCBI蛋白质数据库中提供的功能信息进行分类。鉴定涉及有以下几种蛋白质:1细胞骨架类蛋白,其功能在细胞运动、分裂、信息传递、能量转换、代酣调控以及纤维细胞形态方面具有重要作用，包括成帽蛋白、Transge1in—2,饗白（ta1in）、肌球调节蛋白轻链、Fー肌动蛋白;2.细胞信号转导类蛋白,在信号传导中发挥重要作用的蛋白,包括核内不均一核糖核酸蛋白、腺甘酸环化酶、丝氨酣苏氨酸蛋白激酶、Rh。家族GDP解离抑制因子、ras基因抑制蛋白;3

32entryP30048[EntryInfo)(Nam«andorigin](Reference*)(Comments)(Cross-references)(Keywords)Features)(Sequence](Tools]NofFO1afft-S•venイdoryapp—ra/~rgTMy3cf©"»•UkF.e“ordocuEMiEntryinfonnstionErtrytwnePRDX3.MUMANPnrnaryMxes$»cnnumberP3004SSecondaryaccessionmmbersP35690O13776O5T5V2Q96HK4mtegratedintoSvMSS-ProtonApnl1,1993SequencewaslastmodifiedonNovenreer1.1997(Sequenceversion3)AnnotationswerelastmodrftedonOctober3.2006(Entryversion81)NameandoriginoftheproteinProtwnnameSynonymsGenenameFromTaxonomyThioredoxin^j«p«nd«ntperoxiderwductaw,mMochondrtal(Precursor]EC1.11.1.15PeroxWdoxin-3PRXMAnttoxichintprotein1AOP-1ProteinMER5homologHBC1S9Nam•:PRDX3SynonymsAOP1Homosapiens(Human)(TaxlO9606)Eukaryota.MetazoaChordata.Cramata.Vertebrata.Euleieostomi.Mamma皿FumenaEuarcixxy/www.matnxscioice.c

33抗氧化类蛋白,参与氧化还原的蛋白质,主要为硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶（PRX3）、谷胱甘肽转移前.1；4.血液蛋白类,包括凝血酶敏感蛋白1ヽ纤维蛋白原a链前体蛋白、纤维蛋白原B链前体蛋白:5.凋亡相关蛋白类,包括抗增殖蛋白（Prohibitin）、电压依赖性阴离子通道蛋2：6.未知或假想蛋白类,包括ZYXpr〇tein、受体相关蛋白/RNP聚合酶相关蛋白（RAPIBprotein）、假想蛋白NEDD5。现将上述差异蛋白质中选择代表性蛋白质进行如下讨论:1.硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶（Thioredoxin-dependentperoxireductase»又称Peroxiredoxin3,PRX3）定位于线粒体,相对カ〇・石质量/M5ス,深・pQX都含有一个还原性半胱氨酸（Cys41,该蛋臼与细胞增殖和分化及信号转导有判ml9］〇近期研究发现,PRX3具有很强的抗氧化作用,与氧化应激密切相关。是ー种硫基特异性抗氧化蛋白，其与硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶组成了细胞内最重要的抗氧化系统之ー，可以清除自由基,在对抗细胞的氧化应激,保护脑组织中,起着重要作用，另外还通过调节细胞间H202浓度参与生长因子和肿瘤坏死因子a1pha的信号调节机制。本实验中PRX3在肝阳化风证组（脑出血,脑梗塞,颈椎病,帕金森病）较健康组表达下调,提示肝阳化风证（脑出血,脑梗塞,颈椎病,帕金森病）在氧化应激条件下,大量氧自由基形成,在对抗氧化应激,清除氧自由基过程中该蛋白大量消耗所致。2.Transgelin.2Transgelin是ーー种相对分子质量22000的蛋白,是具有转型变异及形状改变敏感性的肌动蛋白凝胶蛋白，为SM22.a1pha同系物,属于钙结合蛋白家族,以前仅在平滑肌细胞中研究较多,在淋巴细胞中很少报道。最近RubenFranc6s等发现在腹膜B.1细胞和被刺激的脾脏B.2细胞中表达,并推测其作用机制为通过限制肌动蛋白的解聚作用从而调整BCR信号传导来激活该类细胞120］。但KangS等在用蛋白质组学方法研究L谷氨酸诱导的神经细胞死亡过程中发现Transge1in.2表达上升【21】。Pimiha【22】对麻味StS斑［gie皐的和林£地佛进族旗嬴腌和测序?。结、鼠P27,人wS3.10高度同源,从而定义了一个新的肌动蛋白交联蛋白家族。Laws〇nD12副的研究表明:成纤维细胞中的Transge1in蛋白与平滑肌中的SM22.a是同一种蛋白质。善鸟自管平滑肌细胞的细胞骨架构成及调节细胞的收缩功能,对维持血管平滑肌细胞处于收缩表型具有重要作用。本实验中发现Transge1in.2在脑出血，脑梗塞,颈椎病，帕金森病四病的肝阳化风证表达均下调，提示肝阳化风证均出现血管平滑肌收缩障碍，从而导致微循环障碍,加重组织缺血缺氧状态，引起机能紊乱和组织损伤。3.肌球蛋白调节轻链，其分子量为460KD,可由肌球蛋白轻链激酶在钙及钙调蛋白存在时催发其磷酸化而导致肌动蛋白与肌球蛋白反应进而引发肌肉收缩。在平滑肌,肌球蛋白轻链起着重要的调节作用。细胞内钙超载,高浓度的钙离子与钙调素形成复合物(CA4.CAM),使肌球蛋白轻链从失活态变为活化态,转而催化肌球蛋白轻链磷酸化,肌球蛋白与肌动蛋白相互作用,引起收缩。本研究中,发现肌球蛋白调节轻链在脑出血,脑梗塞,颈椎病，帕金森病四病的肝阳化风证共同表达下调,提示肝阳化风证血管平滑肌收缩障碍,从而致微循环障碍，加重组织缺血缺氧状态,引起机能紊乱和组织损伤。4.丝氨酸/苏氨酸激醒(serine/threoninekinase,Akt)分子番为"邨集k嘲!悔其蔘与由生长因子激活的经磷脂酰肌醇.3激酶(phosphoinositide.3kir1ase,v13K)介导的信号转导过程。P13K是许密案就補備号分子，P13K介导的信号转导通路调节细胞的分裂、分化、凋亡等活动,P13K依赖Akt的激活。许多实验表明,Bad是Akt的直接底物，Akt是强有力的Bad.Ser136激酶，可以使Bad的Ser136位点磷酸化,有效阻断Ba由龍罷死亡。Akt因其能使Ser/Thr磷酸化，称之丝氨酸/

34苏氨酸激酶(serine/threoninekinase,Akt)»又因其具有与蛋白激酶A和蛋白C同源的序列,而又被命名为蛋白激酶B(Pr〇teinKinaseBPKB)[24],Akt下调使其在抗细胞凋亡的蛋白信号转导中作用减弱。激活的PKB可以介导多种生长因子如PDGF、ECG/胰岛素、凝血酶、IGF.1及NGF等所诱导的细胞生长和抑制凋亡作用[25—26J。能癌孱细胞死亡信号通路酶Caspase.9的前体磷酸化，使其失活,从而促进细胞生存。本研究发现丝氨酸/苏氨酸激酶在脑出血，脑梗塞，颈椎病,帕金森病四病的肝阳化风证共同表达下调,推测可能是由于肝阳化风证形成过程中机体在缺血缺氧的应激条件下信号转导活性受损，下游介导磷酸化/脱磷酸化反应失活,从而导致丝氨酸/苏氨酸激酶的表达相应受到抑制。1.假想蛋白NEDD5,假想蛋白一般都可以忽略，因为其功能不确切,多数时候是fl了genescan等ORF预测软件从gen〇meq丁预测出,但是不能找到很好的已知功能的同源蛋白,所以无法确定功能。在脑出血,脑梗塞,颈椎病,帕金森病四病的肝阳化风证中共有5种表达相同的蛋白质,分别是硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶(Thi〇red〇xin-dependentperoxidereductase又称Peroxiredoxin3,PRX3)、丝氨酸/苏皴酸激醉(serine/threoninekinase,Akt)、Transge1in・2、肌球蛋白调节轻链(my〇sinregulatory1ightchain),假想蛋I刍NEDD5(Hypothetica1proteinNEDD5),其功能主要涉及氧化应激,细胞骨架结构，细胞信号转导等。而肝阳化风证中存在着氧化应激、微循环障碍、信号转导障碍异常导致组织细胞缺血缺氧,功能紊乱,这与我科既往研究的结果相吻合，从而从蛋白质组水平进ー步证实肝阳化风证的病理机制，为中医肝阳化风证研究奠定了科学基础。本研究还鉴定了•些脑出血,脑梗塞,颈椎病,帕金森病四病的肝阳化风证中差异表达的蛋白质,分别是成帽蛋白、肌动蛋白、核内不均一核糖核酸蛋白、腺甘酸环化防、GDP解离抑制因子、Ras抑制蛋白1、谷胱甘肽S.转移酶。mega1、凝血酶敏感蛋白1、纤维蛋白原0【链前体蛋白、纤维蛋白原P链前体蛋白、抗增殖蛋白、电压依赖性阴离子通道蛋2、ZYXprotein、RAPIBprotein。异病同证有其相同的蛋白质表达,而不同的疾病又有其特异的蛋白质表达,说明疾病本身的特异性。现将部分具代表性的蛋白质功能分述如下。成帽蛋白是真核生物中普遍存在的a/13异源二聚体,其与肌动蛋白丝容易聚合的末端结合，是参与细胞中肌动蛋白聚合作用的重要成分。成帽蛋白也是细胞骨架的关键成分,可以影响细胞、细胞器及细胞核的活力，成帽蛋白异常可以使细胞骨架蛋白的有丝分裂能力下斛27]〇本实验研究发现在脑出血肝阳化风证中表达下调，而在脑梗塞,颈椎病,帕金森病肝阳化风证组中与健康对照组比较表达无差异，可能表明在脑出血肝阳化风证形成过程中有细胞骨架蛋白的有丝分裂能力下降，而在脑梗塞,颈椎病,帕金森病肝阳化风证组中细胞骨架蛋白的有丝分裂能力下降表达可能不明显。核内不均一核糖核酸蛋白(Heterogeneousnuc1earRibonuc1eopro是一葵稱メ尹真

35處由断磷的具有类似结构特征的髙丰度RNA结合蛋白，一般均分布在核内。hnRNP.K是种主要的前信使RNA凝结蛋白质,紧密结合多聚胞甘酸序列,参与mRNA的转运及转录后调节。细胞核内hnRNP.k蛋白能直接与人c2myC的促进子区域结合而发挥转录因子的功能【28】乳腺癌细胞中h11对。.k蛋白能显著增强细胞的增殖【291。丫2110等£30】研究发现,通过与p21mRNA3.U善さ邱:域结合,hnRNP.k能抑制p21基因的翻译表达,促进细胞增殖。本实验发现在脑出血.,脑梗塞,帕金森病肝阳化风证中表达较健康对照组下调，而颈椎病肝阳化风证中与健康对照组相比表达无差别,其作用机制还有待进ー步研究。腺甘酸环化旃是膜整合蛋白，它的氨基端和按基端都朝向细胞质。AC在膜的细胞质面有两个催化结构域，还有两个膜整合区，每个膜整合区分别有6个跨膜的Q螺旋。哺乳动物中已发现6个腺甘酸环化酶异构体。由于AC能够将ATP转变成cAMP,引起细胞的信号应答,故此,AC是G蛋白偶联系统中的效应物。本研究发现,腺甘酸环化酶在脑出血,颈椎病,帕金森病肝阳化风证中较健康对照组表达下调,而在脑梗塞肝阳化风证组中较健康对照组表达无差异,表明在脑出血,颈椎病,帕金森病肝阳化风证可能存在AC-cAMP信号转导通路受损有关,而在脑梗塞肝阳化风证组可能无明显此通路的损坏。谷胱甘肽S,转移酶。mega1(GST01)是ー组具有多种生理功能的蛋白质,主要存在细胞液中。在哺乳类动物各组织中均含有不同种类的GSTs,其含量和活性亦各不相同。其中以肝脏中含量最高,约占肝脏可溶性蛋白的5%。GSTs能催化还原型的谷胱甘肽(glutathione,GSH)的疏基(.SH)结合到疏水的化合物上,使亲电子的化合物变成亲水的物质,易于从胆汁或尿液中排泄。通过这种方式将体内各种有潜在毒性的物质及亲脂性化合物降解排出。某些GSTs同功酹含有非硒依赖性谷胱甘肽过氧化配活性,能清除脂类自由基,有抗脂质过氧化的作用。GSTs另ー种重要特性是它们的活性是可以被诱导的,通常但并非专ー地被其参与代谢的亲电子化合物所诱导。GSTs在机体有毒化合物的代谢、保护细胞免受急性毒性化学物质攻击中起到重要作用。本研究发现GSTO1在脑出血，脑梗塞，颈椎病肝阳化风证中表达较健康对照组上调,而在帕金森病肝阳化风证中与健康对照组表达无差异,可能提示在脑出血,脑梗塞,颈椎病肝阳化风证中存在有毒化合物的代谢,而在帕金森病肝阳化风证中可能没有明显的冇毒化合物的代谢。本实验发现四种疾病中肝阳化风证相同的蛋白质表达有5个,提示异病同证有其共同的物质基础,不同疾病相同的证有共同的蛋白质表达;同时又有不同的蛋白质表达,说明不同的疾病又有其特异的蛋白质表达,说明疾病本身的特异性。本研究启示我们中医证是具有物质基础的,有本质可循，但也受疾病本身的影响,故在临床上应采用病证结合,辨病与辨证相结合，才能获得满意的临床疗效。

36第三章差异蛋白质PRX3结果验证通过蛋白组学研究,发现肝阳化风证患者外周血单个核细胞存在多种蛋白质表达,选取在肝阳化风证（脑出血,脑梗塞,颈椎病,帕金森病）均有表达,且有特异性的蛋白进行验证。硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶在肝阳化风证中（脑出血，脑梗塞，颈椎病，帕金森病）均表达下调,该蛋白与细胞增殖和分化及信号转导有关。近期研究发现,PRX3具有很强的抗氧化作用，与氧化应激密切相关,故选取PRX3进行RT-PCR验证。而RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和eDNA的聚合的链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录随的作用从RNA合成eDNA,再以eDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的eDNA序列，技术比较成熟，重复性好,故采用RT-PCR进行PRX3的验证。1.1实验材料1.1.1主要试剂与药物:Triz〇1提取试剂盒Lnvi1r〇gen公司PCR试剂盒品美公司焦碳酸乙二脂（DEPC）北京博大泰克逆转录试剂盒、pr〇mega公司TagDNA聚合前promega公司dNTPpromega公司琼脂糖西班牙Biowe「公司溟化乙锭美Nsigma引物由上海生エ生物工程技术服务冇限公司合成其序列和扩増序列长度如下PRX3;上游引物5'CAGCACCAGTTCCTCA3'下游引物5，AACCACCATTC-rTCTTG3*产物Length：296GAPDH：5I游引物51CGGGAAACTGTGGCGTGAT-3'下游引物51TGGTGGTCCAGGGGTCTTAC.3'产物Length：449bp

37其他试剂:异丙醇,氯仿,无水乙醉,溟乙锭,10%水合氯醛等由湘雅医院药剂科提供。英国TECH】虹公司公ebe司g公antaamrktcse]B—国美皇1.1.2主要仪器:TC.512型PCR仪ag1eEye11凝胶成像分析系统低温高速离心机微量:离心机.80ヒ超低温冰箱.30ヒ超低温冰箱DYYIII型电泳仪转膜仪1.2实验方法:美国Eppend〇淞司ANY〇公司日本SANYO公司北京六一仪器厂美国Bi〇.Rad公司1.2.1引物设计:从Genbank中检索出验证蛋白目的基因的eDNA序列,根据其eDNA序列及PCR随机引物的设计原则,使用PrimerPremier4.10软件设计,在pubmd数据库中用BLASTEN验证引物。1.2.2PRX3总RNA的提取:1.2.2.1总RNA的抽提1）各组PBMC的分离同1.2.3.12）每EP管加入适量的Triz〇1.用匀浆器将细胞彻底匀浆,转移至EP管中。混匀颠倒10下,室温放置5分钟;3）每ImlTrizolJJIlO.2m!氯仿,振荡器剧烈混匀15秒,室温放置5分钟:4）4ヒ、12000转离心15分钟:5）将上层水相转移至另ー干净的EP管中,加等体积的异丙酔,混匀室温下放置10分钟;6）4ヒ、12000传离,5,10分钟;7）弃上淸,加入4CDEPC水配制的75%乙醇1mL,4"C离,心7500转,5分钟;8）弃上清,空气干燥5分钟,溶于DEPC水,取少量测定RNA浓度,电泳检测RNA质量。然后剩余部分贮存于.80C备用。1.2.2.2总RNA的鉴定1）RNA浓度测定:取RNA溶液用双蒸水做150倍稀释,以三蒸水做对照,读取紫外分光光度计260nm处光密度值RNA含量。2）RNA纯度测定:取RNA溶液用双蒸水傲150倍稀释,以双蒸水做对照,读取紫外分光光度计260nm、280nm处光密度值，计算A260、A250（1.7接进・2,°，〇为理想,若低于1.7表示存在蛋白质污染）。3)琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性:若28s条带的亮度约为18s的2倍,说明所提取的总RNA无明显降解,完整性好。1.2.3eDNA合成

38按M.MuLV逆转录酸说明书进行操作，总反应体积为20u1。①取RNA5ul}JILKlug/uL01ig〇(dT)181uL后加入DE上70K(赫用1,渕崛溶,彌融心:②一次加入下列试剂:5xRTbuffer4山,10mMdNTPMix2m,剂1p/例咽1,PCR仪上37^C反应5min,冰上骤冷,短暂离心;③于最后加入M.MuLV逆转录酶1uL,PCR仪上42℃反应60min,冰上PCR罪価.20ヒ保存。1.1.4PCR反应10XPCR缓冲液25此MgC1；15此10mMdNTP05此GAPDH上、下游引物各05*LPIIX3上、下游引物各05TaqDNA酶05此cDNA产物2皿DEPC水1•此扩增条件:首先加热至94ヒ变性5min,然后进行35个PCR循环(94"C30s、61"C45s、72"C45s),最后72"C延セ度局金ヒ冷却。ain,1.2.5PCR扩增产物半定量分析将每个标本的目的基因产物取21aL,加1皿1oadingbuffer,加糖凝胸礫,％［的璃脂TBE缓冲液,1〇〇伏电压电泳，电泳约30分钟后置于紫外灯下观察,根据产物长度判断目的基因产物,并用凝胶图像分析系统对凝胶中条带的灰度进行扫描测定〇D值,以GAPDH作为内参照,目的基因OD值与GAPDH的OD值的比值代表其表达水平。2%的琼脂糖凝胶配制方法:0.69琼脂糖+30ra10.5xTBE微波炉加热煮沸,常温冷却至60。C231入EB2.5“L混匀倒模,4"C冰箱保存。1.3统计学分析所有计量资料以X4-S表示,用SPSSI3.0和Excel2003统计分析软件包进行处理,采用t检验、方差齐性检验及方差分析等方法对数据进行统计学处理,以P<0.05作为显著性检验水准。2结果2.1各组PBMCsPRX3mRNA的表选用RT-PCR方法扩增的mRNA片段,所有标本均检测到目的基因片段,内参GAPDH在不同组中表达基本一致。对照组与肝阳化风组的PRX3的mRNA强度不一,在肝阳化风组中表达下调（见图3—1）。各组Per〇xired〇xin3目的条带粵如あ於得参OD值比值见表1。实验结果显示,脑出血组、脑梗塞组、帕金森病组、颈椎病肝阳化风四组的Per〇xiredoxm3表达水平接近,无统计学意义.

39肝阳像组的Per〇xired〇xin3表达水平较健康对照组表达下调,差异有显著性。见表1胡町・横・田・可直撬•齟曩囊・姐帕立触id。…3基因表aCIa表3各姐硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原醇mRNA表选比较（n=10｛实魁组例数019比值PRX3/GA硯麟セ组10例1025：£0035脑出血组i〇’瞬10865±。035上，脑梗塞组10例0.884±-0.036▲•颈椎病组10例〇.870I-0030A-帕金森病组10例0878：£0030A•注:▲与健康时照纽相比P（005；•四病肝阳化风组组问P＞。05；3讨论通过RT—PCR验证,PRX3的表达结果与蛋白组学的检测结果一致。说明蛋白组学检测的准确性与可靠性。PRXs是ー类广泛存在于各种原核和真核生物细胞中的硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原能,其活性基团为位于N端的一个高度保2结果1.1各组PBMCsPRX3mRNA的表达用RT-PCR方法扩增的mRNA片段,所有标本均检测到目的基因片段,内参GAPDH在不同组中表达基本一致。对照组与肝阳化风组的PRX3的mRNA强度不-,在肝阳化风组中表达下调(见图3-1)。各组Peroxiredoxin3目的条带的0D值与对应的内参0D值比值见表】。实验结果显示,脑出血组、脑梗塞组、帕金森病组、颈椎病肝阳化风四组的Peroxiredoxin3表达水平接近,无统计学意义，肝阳化风组的Peroxiredoxin3表达水平较健康对照组表达下调,差异有显著性。见表1.

40图12Peroxiredoxin3基因表达表3各组硫氧还蛋白依敍性过氧化物还原・nRNA表达比较(n-10)实验分组例数OD比值PRX3/GAPDH健康对照组10例1.025±0.035脑出血组10例0.865±0.035脑梗塞组】0例0.884±0.036颈椎病组10例0.870±0.030帕金森病组10例0.878±0.030注:▲与健康对・照组相比P<0.05；•四病肝阳化风组组间PXJ.05;3讨论通过RT-PCR验证，PRX3的表达结果与蛋白组学的检测结果一致,说明蛋白组学检测的准确性与可靠性。PRXs是ー类广泛存在于各种原核和真核生物细胞中的硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶，其活性基团为位于N端的一个髙度保守的半胱氨酸残基,在NADPH2硫氧还蛋白硫氧还蛋白还原解系统的协助卜.可以清除H202等过氧化物［31—33】。Peroxiredoxin3是PRXs蛋白家族成员,孫ア廳林在生物体需氧能量代谢中起着重要作用,是活性氧（R0S）产生的重要部位.氧应激时,线粒体膜上的蛋白质被氧化而使膜的通透性増高,PRX3通过清除过氧化物类ROS,维持线粒体膜的稳定性,因此，PRX3在线粒体的抗氧化防御机制中起着至关重要的作用.证候的多态性是指在目前所认为的某ー最基本的证型中包含着若干可分辨的有意义的不同病理状态。本实验发现,肝阳化风组（包括脑出血、脑梗塞、颈椎病、帕金森病）的PRX3基因较健康对照组表达下调,有显著性（P<0.05）,提示该蛋白表达异常可能是肝阳化风证的病因病机之一，四病肝阳化风证组PRX3表达组间无差异，异病同证具有相同的蛋白表达,提示异病同证是有证的物质基础。肝阳化风组（包括脑出血、脑梗塞、颈椎病、帕金森病）的PRX3较健康对照组表达下调,其原因可能是中医肝阳化风证病人存在大量氧自由基,PRX3通过清除过氧化物类ROS,大量消耗PRX3,从而引起其下调。四病的肝阳化风证的PRX3表达均成

41一致性（组间比较无差异性）,提示PRX3很可能为肝阳化风证的特异性蛋白,而PRX3在肝阳化风证的具体机制还有待进ー步研究。

42第四章结论1.初步建立了脑出血,脑梗塞,颈椎病,帕金森病肝阳化风证患者及健康人对照组的外周血堆个核细胞蛋白质表达图谱。2.脑出血，脑梗塞，颈椎病，帕金森病四病的肝阳化风证（异病同证）患者具有相同及差异表达的蛋白质,提示异病同证既有证的共同的物质基础（相同的蛋白质表达），又有疾病本身不同的特点（差异蛋白质表达）。3.PRX3的RT.PCR验证结果与2—DE结果一致,提示蛋白质组学检测的准确性,可靠性。4.异病同证之肝阳化风证均有PRX3表达,并均较健康对照组相比下调,且脑出血,脑梗塞，颈椎病，帕金森病四病间的肝阳化风证的PRX3组间表达无明显差异,提示PRX3蛋白可能为肝阳化风证特异性蛋白。

43参考文献U,叶雪清,曾淑华,张宛明,等.月经失调的ハ纲辨证与植物神经系统功能关系的研究[J].中西医结合杂志,1984,(4)4：198.ロ,叶雪清,杨少文,李安,等.阳虚患者植物神经系统功能、甲微循环和血液流变学的改变及相互作用[J】.中西医结合杂志，1989,9(10)：618.p.陆启滨，夏桂成，陈丹华，等.159例绝经前后诸证阴虚火旺型患者的植物神经功能观察[J].上海中医药杂志,1990,(2)：12.H,全建峰，吴晓康,孙晓虹.肾阴虚证患者的血清免疫球蛋白G、A、M及补体c3、C4相关性研究[J】.现代中医药，2004,5(2)：P,蕪魏寐エ翠,徐志瑛,等.肺心病痰热型与痰热伤阴型的免疫学指标观察[J].中国医药学报,2000,15(2)：43.K,秦路平,张家庆.蛇床子香豆素对肾阳虚模型大鼠腺垂体ー肾上腺皮质轴功能的影响【J】•中国中西医结合杂志,1997,17(4)：2272229.P,樊蔚虹,岳广欣,任小巧，等.肝肾阴虚证大鼠下丘脑.垂体.甲状腺轴的变化及中药对其调节作用[J].中国中医药信息杂志,2001,8(10)：21.哆,丘瑞香,吴国珍,金明华.性激素对肾虚患者阴阳平衡的调节作用【J】.中国中医基础医学杂志，1999,5(3)：46.P,薛沙,汤学军.右归丸对肾阳虚动物模型血液微量元素含量的影响[J].中国中医药科技,2002,7(3)：168216n伽南维玺,孙燕,刘晓燕,等.用现代医学理论阐明肾阴虚证的本质和发病学机制[J].医学与哲学,2005,26(11)：67nUWr1ghtAF.NeurogeneticsII：comp1exdisorders.JNeuroINeurosurgPsychiatry.2005May：76(5):^623-631u中华内科杂志，1996；6：379.n刁如金益强主编，中医肝脏象现代研究与临床.北京:人民卫生出版社，2000,2(1)；238.阻q金益强主编,中医肝脏象现代研究与临床.北京:人民卫生出版社,2000,2(1)：240—2n习な依萸主编.中药新药治疗中风的临床指导原则.j匕京：中国医药科技出版社,2002.III印FujiiJ,IkedaY.Advancesin0111Munderstandingofperoxiredoxinamu1tifuncflonal,mamma1ianredoxprotein.RedoxRep,2002,7(3)：123-130口力Rabi11oudT,He11erM,GasnierF,eta1.Proteomiesanalysisofce11u1arresponsetooxidativestress.EvidenceforinVIVOoveroxidationofperoxiredoxinsattheiractivesite.JBiolChem,2002,277(22)：19396—19401[18/inDY，ChaeHZ*RheeSG,eta1,RegulatoryroleforanovelhumanthioredoxinperoxidaseinNF2kappaBactivation.JBi〇1Chem,1997,272(49)：30952—30

44【191W«粟永萍,艾国平.Per〇xiredoxin蛋白家族与电离辐射[J].中單躺斃V志,2005,25(1)：95.9[20冃ranc6sR,Tumang瓜,KakuH,eta1.B—IcelIsexpresstransgelin2：unexpected1ymphocyteexpressionofasmoothmusc1eproteinidentifiedbyproteomicanalysisofperitonealB—Icel1s[J].Mo1ImmunO1.2006,43(13)：2124—2129.[2IJCangS,KimEY,BahnYJ,eta1.Aproteomicanalysisoftheeffectofmapkpathwayactivationonl-g1utamate—inducedneurona1ce11death[J1.Ce11M〇!Bi〇1Lett.2007；12(I)：139-14[22]PrinjhaRK,Shap1andCE,HsuanJJ,C1oningandsequenci.ngofCdna......r.encoaingtheactincross•1inkingproteintransgelinaefinesanewfami1yofactinassociatedproteins.Ce1MotilCytoskeletonl994；28(3)：243—255「23jLawsonD,HarrisonM,ShapIandC.Fiblasttransgelinandsmoothmusc1eSM22a1phaarethesameprotein,theexpressionofwhichisdown-regulatedinmanyce11ines.CelMotiICytoske1eton.1997：38(3)：250-257[24]Be11acosa/VTestaJR,Staa1Sp,cta1.Aretroviralone.ogene,al.a,encodinga..……，...r.n„serine-threoninekinasecontaininga11SH2,I1keregionLJJ-Science.1991.254.274[25pudekH.DattaSR.FrankTF.eta1.Reguiationdoneronalsurviva1bytheserine—threonineproteinkinaseAkt[J].Science.1997.275：661-665[26]EvesEM.XiongW.Be11acoseA.eta1.Akeatargetofphosphatidy1inosti〇!kinaseinhabitsapoptosisinadifferentiatingneuroalcel11ine[J].M〇!CelIBiOl.1998.18：2143.2152[27デulesserianT,KimSH,FountoulakisM,cta1.AberrantexpressionofcentractinandcappingProteins,integralconstituentsofthedynactincomp1ex,infeta1downsyndromebrain[J].BiochemBiophysResCommUn,2002,291(1)；62—7.[28j^ichelottiEF,MiehelottiGA,AronsolmAI,eta/.Heterogeneousnuc1earribonucleoproteinKisatranscriptionfactor.Mo1Ce1IBiol,1996：16(5):235022360.

45[29]MandaIM,VadIamudiR,NguyenD,eta1.GrowthfactorsregulateheterogeneousnuclearribonucleoproteinKexpressionandfunotion.JBi〇!Chern,2001；276(13)：96992「,9704.L30]YanoM,OkanoI-IJ,OkanoH.Invo1vementofHuandheterogeneousnuc1e.ar....,„ribonucleoproteinKinneuronaldifferent1ationtnroughP21mRNApost2transcriptionalregulation.JBiolChem,2005；280(13)：12690212699.[31]WoodZA,SchroderE,RObinHarrisJ,cta1.Structuremechanismandregu1ationofperoxiredoxins.TrendsBiochernSci2003,28(1)：32-40[32]FujiiJ,IkedaY.Advancesinourunderstandingofperoxi.redoxinamu1tifunctiona1,mamma1ianredoxprotein.RedoxRep,27k，n2eOH_J33(3)：123.1301eDuhrsenKKampkotterA.Antioxidantenzymef1iesinp,arasit,lc.,ハ..ハヘ…nematodes.MolBiochemParasitol,2001,114(2)：129.142

46附表肝阳化风证病例辨证计分表症状〇轻（1分）。中（2分）重（3分）严重（4分）频发,影响剧烈难忍须崛翔娜翩消失偶有,轻常有,轻饮水量稍饮水量较饮水量增大量饮水不能肝口干无或消失增加常增加加2倍以上止渴阳1〜2倍主偶有情绪常有情绪易怒常与烦躁如狂不能症烦躁易怒无或消失波动波动人吵闹自控每日1〜2每日4"脉弦有（1分）/无（0分）部烘犠羅鍔1次常发,能不能准确不能飜蠹襄遶辭兩或消实徳変,轻常发麻木终日麻木活动婚r消失偶发’肝偶发,局常发,部常发全身持续全身震颤风震颤无或消失分肢体震主部轻微麻颤震颤不能自理症半身不遂无或消失轻,手足持拐杖行需扶行完全不能活动不灵活走需卧床常有,较动则眩晕欲倒,眩晕欲倒无或消失偶有,轻常有,轻重,不能坚必须卧床持工作【注】具有肝阳症状（①头痛②□干③脉弦④烦躁易怒⑤面部烘热）中的任何4项加肝风症状3项者,计分超过8分即可辨证为肝阳化风证,入选对象18分以上

47综述中医肝阳化风证的现代研究进展综述程田カ审校梁清华1.中医现代化的研究技术肝阳化风证由肝阳上亢发展而来,由于肝肾同源,肝肾的阴阳之间,是相互联系相互制约的,同时,在病理上也常相互影响,如阴液不足,可导致阳的偏亢,阳偏盛，也可消灼阴液,导致阴的不足。因此,肝火太盛,则下劫肾阴，致肾阴不足,而肾阴亏耗,无カ制约肝阳,又致阳升太过,由此恶性循环,导致阳亢无制，久而生风。故其病机为:肝肾阴虚阳亢无制,亢而生风。临床以眩晕欲仆、肢麻震颇、甚则突然昏倒、半身不遂为其主症。本证预后,由于风痰上扰,蒙蔽心窍,导致阴阳离决而亡，若及时救治可幸存，但可遗留半身不遂,伴手足轻微抖动等疾瘀阻络之症。目前的研究表明,中医证的本质是细胞因子（特殊物质群）,其基本发病学机理是由于细胞因子（群）基因表达调控异常引起细胞因子网络紊乱（特定异常功能状态）的结果［1，71。由于细胞因子网络中某些细胞因子的生物学活性相对升高,而与之相拮抗的细胞因子不能有效地予以对抗,从而引起一系列的级连病理变化和临床表现的产生，即中医证的产生。这就是说证的病因虽然可以有许多种,但这些不同的致病因素要引起证的发生，最终都是通过细胞因子基因表达调控异常,引起细胞因子网络紊乱的结果。证候是在致病因素作用下,机体内外环境各系统之间相互关系发生紊乱所产生的综合反应，是反映疾病处于某ー阶段病因、病性、病位、病势等病理要素的综合性诊断概念。而证候的多态性是指在目前所认为的某ー最基本的证型中包含着若干可分辨的有意义的不同病理状态【8］。不同的疾病可能出现中医理论所阐述的相同的证（异病同证）,相同的疾病在不同的发展阶段和不同的个体上也可能表现为中医不同的证（同病异证）。然而,由于证的非特异性、动态性和异病同证、同病异证等特征,不可能用纯粹西医或实验室理化指标来加以说明。已经有大量中医证候多理化指标研究的报道,这并不是说证候多理化指标现象就是中医证候实质研究的失败,而恰恰说明了中医的“证”同生命物质运动的关系PJ.证候是生命活动的表现特征,而生命活动的主要执行者则是蛋白质,基因决定蛋白质的表达,蛋白质的表达决定人的外表、特征、行为等，那么不同的“证''可能受不同的基因调控。从基因分子水平研究中医证候是冃前热门的研究课题,而基因作为遗传信息的载体,均要表达为相应的蛋白质或修饰相关蛋白才能影响生物的功能,蛋白质组学正是从整体的角度,分析细胞内所有动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，是从基因层面向蛋白质层面的深化。对异病同证的研究，可通过对不同疾病中同一证候基因或蛋白质表达差异的研究，揭示形成该证候的关键基因和蛋白质【10】。有学者【11】采用差异双向蛋白质电泳等方法,借助sP大型统计分析软件,通过生物信息学的方法，从蛋白质组水平研究慢性乙型肝炎、肝纤维化、早期肝硬化,最终确立慢性肝病证候蛋白质组学分类标准。可见，以蛋白质组学技术研究证候有其理论和实践基础。2,肝阳化风证的现代研究

482.1NE,E.TXB2,rT3,TSH.cGMP,ALD及TNF在肝阳化风证的表达肝风内动证又可分为肝阳化风、阴虚风动、血虚生风3个亚型。研究各证型的客观参考指标,是当前中西医结合研究的热点、难点。李家邦【12】等在过去研究工作【13以4】的基础上,应用现代医学的实验方法，对肝阳化风证、气虚血瘀证及阴虚风动证进行不同层次的14项指标同步检测，以探索三证型与健康对照组间有否差异,并观察异病同证的指标变化。结果显示，肝阳化风证的脑梗塞与脑出血二病种的NE,E,TXB2,rT3,TSH,cGMP,ALD及TNF较健康对照显著升髙,而6.keto.PGF1ct及T3降低;上述病理变化显示了二病的共性,从面构成肝阳做｝病理特征。本研究的检测与分析发现，肝阳化风证患者机体有4方面严重的病理变化:①外周交感.肾上腺髓质机能亢进,表现为NE,E,F增高,有交感神经机能相对亢进表现。②机体处于低T3综合征状态,表现为T3显著降低而rT3显著升高。提示机体处于重症营养不良，病变损伤严重【15】与临床实际情况相符。③调节血管平滑肌舒缩机能的活性物质有显著变化，即收缩血管作用的TXB2,TXB2/6-keto—PGF1ct值升高,eGMP及ALD升高,而舒张血管的6.keto.P展,F人而致微槍探製囈,加重组织缺血缺氧状态，引起脑机能紊乱和脑组织损伤。④炎症介质释放增加，表现为TNP含量升高,致使脑组织损伤加重。此外气虚血瘀证和阴虚风动证的各项指标，表现出与肝阳化风证相类似的变化，且与健康对照组相比,差异有显著性，但异常程度较轻。由于后两证型为疾病恢复期或后遗症期，病情相对稳定,故指标显示的异常变化较小。表明指标的异常程度与病情程度密切相关。其确切的病理生理基础,尚待深入研究。梁清华【16】等研究发现急性脑出血患者血浆中NE,E均明显高于正常人对照组。这可能为急性脑出血时,机体处于应急状态，交感.肾上腺髓质系统兴奋，大量释放CA进入血液;同时脑损伤后,脑内CA能使神经元大量合成和释放CA,由于BBB开放亦进入血液中，从面导致患者血浆中CA明显升高。过量的CA可对中枢神经系统造成一系列损伤作用。其机制有如下三方面:OCA可引起脑血管剧烈收缩,继而舒缩功能紊乱,最终导致脑微循环障碍,脑缺血,水肿坏死。②高浓度cA可导致脑代谢亢进，同时又造成脑血管痉挛，脑微循环障碍,使脑的有效灌注降低，而使神经元能量迅速消耗,局部代谢产物堆积,酸中毒,能量耗竭时,神经元衰竭死亡。③可促进神经元细胞内钙超载【17】,大量CA使神经元能量耗竭，可导致ATP酶活性抑制,最终导致神经元死亡。因此,防治CA的损伤作用对于减轻患者脑水肿和继发性脑损伤十分重要刘爱平f18］等用高压液相色谱ー电化学检测法在肝阳化风证患者血浆中去甲肾上腺素（NE）与肾上腺素（E）的含量,并与肝阳上亢证、肝风痰厥证及健康人对照组比较结果肝阳化风证呈交感神经功能亢进特征:血浆NE和E之间呈线性正相关:按西医标准诊断的不同疾病的肝阳化风证，其血浆NE、E含量均显著増高，有共同的病理生化基础。鄢东纠191等研究通过对中医肝病证候的流行病学调査【20】本研究结果发现,梗礴肝阳化风证为最多。本研究在本所对肝阳化风证进行异病同证多指标研究阐明的病理生理学基础【12J上，从20余项指标中选择阳性率较高，重复性好,且方法稳定,具有可行性的血浆F、NE、E、TXB、6-keto.PGF1a。及血清T3.进行同病异证对比观测，以健康人组、阴虚风动.气虚血瘀、气阴两虚证组作对照,以评价上述指标对于脑梗塞肝阳化风证有无诊断价值及特异性。本研究结果发现

49脑梗塞肝阳化风证患者血浆NE、F、TXB含量均增高,血清T3含量降低，从而说明脑梗塞肝阳化风证时机体处于应激状态，交感ー肾上腺髓质、肾上腺皮质均处于亢进状态,甲状腺功能偏低:微循环中收缩血管物质含量增加,微循环障碍。由此说明上述指标対于脑梗塞肝阳化风证具有证的特异性,认为可考虑作为该证的实验诊断参考指标。易振佳【21】等研究显示:①肝阳化风证存在血浆NE,E,F,TXB。含量增高和血清T3含量降低,结果与鄢氏的报道一致:②经平肝熄风、活血通络的天龙熄风颗粒剂治疗后，随着病情好转,症状积分递减,血浆NE,E,TXB2和F含量逐渐减低,血清T3含量逐步增高③在治疗前、治疗2周和4周指标的动态变化中,症状积分、血浆NE,血浆F与血浆E之间存在正相关关系,差异具有显著性（PVO.05）综上所述,随着肝阳化风证疗效的提高,症状积分递减，各指标星现相应的变化。本文从“方证对应角度分析证ー效一指标变化规律,进一步验证了血浆NE,E,F和TXB2的增髙.,则血清T3降低。是否能作为急性脑梗塞肝阳化风证辨证综合指标有待和同病异证迸ー步验证。2.2血浆血栓素B2,前列环素12及血浆降钙素基因相关肽肝阳化风证的表达黎杏群【22J研究发现前列腺素PG12与TXB2失衡。TXB2和TXB2/6-keto.PG比間井嵩是共性改变,其中以肝阳化风最突出，尤以TXB2升高与肝气郁结证.肝火上炎证.肝血虚证比较.有着统计学上的意义。此外,肝病5类证候前列腺素变化与以MP升高亦相一致;导致以加dGMP比值均降低。以上说明中医肝病常见5类证型存在神经ー体液代谢失衡.而植物神经功能异常,神经递质释放水平,与前列腺素，环核甘酸代谢呈相互联系和具特征性改变。机体的神经一体液调节与环核甘酸有关，植物神经系统释放的递质，内分泌腺释放的激素和生物活性物质,都通过细胞内环核甘酸代谢产生生理效应。已知儿茶酚胺（CA）p成份,前列腺素E,激活腺昔环化酶,使CAMP升高;己酰胆碱，5.羟色胺，儿茶酚胺成分.前列腺素F等都使cGMP升高,所研究的肝病的植物神经功能状裂23］发现交感神经功能偏亢:肝气郁结证、肝胆湿热证〈肝阳上亢证、肝火上炎证〈肝阳化风证;副交感神经功能偏亢;肝肾阴虚证〈肝血虚证く肝气虚证有学者证明,儿茶酚胺影响人血和尿液环核甘酸水平。过去本所曾检测过肝阳上亢证、肝阳化风证、肝火上炎证血浆CA水平，发现阳性结果124】证明此三证型均表现外周交感ー肾上腺髓质功能增强；因此肝气郁结证、肝阳上亢证、肝风内动证、肝火上炎证都存在cAMP升高,导致cAMP/cGMP比值降低.这与交感神经功能偏亢,可能与儿茶酚胺成傍释放增多有关;而肝血虚证属肝病证候中虚证,副交感神经功能偏亢,但环核甘酸的变化与上述四证相同。因此,环核甘酸代谢除受植物性神经递质影响外.还受多种激素、多种生物活性物质和不同疾病病理的影响，它的失调又影响不同系统的疾病,这些都持进一步研究。实验结果【25】显示,肝阳化风证血浆降钙素基因相关肽（Ca1citoningenere1atedpeptide（CGRP）水平低于健康人（P<牀0°lユ在相髀健康人口V0.05,P<0.01）»但三组两两比较CGRP含量差异无显著性。揭示了肝阳上亢证，肝阳化风证,风痰证均有共同的病理生理基础。国内石氏【26】报道,自发性高血压患者血浆CGRP水平降低;本研究结果相符。证明了循环血中CGRP含量不足可能是高血压发病及病情发展的重要因素，也是中医辨证肝阳上亢,肝阳化风，风痰证的一项客观指标应用平肝熄风汤治疗脑溢血肝阳化风证,随着病情好,血浆中CGRP含量升高。近代研究认为,CGRP除具有强大的舒张血管，降低血压,增加冠状动脉血流量和正性肌力作用外,CGRP和受体结合后可以

50激活腺甘酸环化酶，使细胞内的cAMP水平增加，促进前列环素和心钠素的释放【27。。脂质体携带CGRP可以透入血脑屏障,因此CGRP可以治疗髙血压和脑卒中.金益强【12】等利用现代医学实验方法对肝风内动证进行不同层次多指标检测，验证三亚型与健康人组间差异显著性，并选择其中14项指标进行同步测定及多因素分析。研究发现，肝阳化风证时,机体发生了三方面严重病理变化:（1）脑供血障碍和脑组织损伤:能较客观反映颅内微循环状态的球结膜微循环显著异常;血粘度增加;颈动脉多普勒超声异常率90%;脑干听觉传导和视觉传导通路功能的显著异常;记忆障碍;氧自由基损伤;脑组织损伤后的血清zn、Cu、K、M始量显著异常。（2）机体处于应激状态:此时血浆皮质醇增高;曲線甲馅I降低;肾上腺素增高;交感植物神经相对亢进;表现为肾上腺皮质、外周交感一肾上腺髓质机能亢进。（3）调节血管平滑肌舒缩功能活性物质水平显著变化:具收缩血管作用的血浆TXB、TXB2/6—keto.PGFla比值升高、要"及血小板CaM增高;具舒张血管作用的血浆TXB2/6.keto—PGF1a、SP、ANP,cGRP含量下降。临床上肝阳化风证起病急、变化快、病情较重,最具“风动”特征,常见于脑梗塞、颈椎病的急性缺血和脑出血急性期而无昏迷的患者。依据实验结果分析,脑缺血、出血或造成缺氧和葡萄糖不足,迅速引起脑功能紊乱和脑组织损伤.缺血组织在“再灌’’供血供氧时急骤产生大盘自由基,从而加重脑组织破坏,在缺血、出血应激情况下,引起肾上腺皮质、髓质、交感神经兴奋呈机能亢进状态.循环血中缩血管物质增加和扩血管物质减少,进ー步加重脑缺血时低灌流、血小板徽血栓形成及脑微循环损伤。血虚生风、阴虚风动ニ类亚型各项实验测定值大致相近;颈动脉多普勒超声、血清T3,测定结果与肝阳化风亚型近似；其他指标结果异常程度较轻或基本正常,多指标同步异常率较低;2.3泛素竣基末端水解酶在肝阳化风证中的表达谢映【28J等在试验中发现泛素.蛋白酶体通路（ubiquitinproteasomepathU,y）a,y而L刀）P在生理情况下降解突变、损伤和错误折叠蛋白质的主要途径【291,目则种普遍的观点认为在某些有害的环境中,如氧化应激、内质网应激和老化过程中的蛋白错误折叠,细胞内可发现损害蛋白的积聚【301。此外，由于新合成蛋白翻译后修饰的改变、蛋白质异常裂解,机体降解异常表达蛋白的能力減弱,都可引起异常蛋白的积聚。在某些情况下，损害蛋白超过了VI,P的降解能力,导致泛素化损害蛋白的积聚,最终可导致神经元功能障碍或死亡【311。本实验发现,正常组，肝阳上亢组,肝阳化风组（缺血性肝阳化风组,出血性肝阳化风组）的泛素竣基末端水解酶的基因表达不同，取24小时点，三组基因表达量比较有显著差异（P<0.。i）,肝阳上亢组与肝阳化风组基因表达量均比正常组低,肝阳化风组基因表达量最低。其原因可能是随着疾病的进展从正常组到肝阳上亢证再到肝阳化风证,泛素竣基末端水解酶下降,而泛素.蛋白酶体通路为降解异常蛋白沉积，变性蛋白质与泛素结合后，被蛋白酶体以ATP依赖的方式降解【321。但当损害蛋白超过了UPP的降解能力，导致泛素化损害蛋白的积聚,蛋白质异常增加，提示疾病发展到不同证的受损严重程度不同。2.4内皮素和一氧化碳在肝阳化风证的表达

51谭晓文【331等研究脑出血，其急性期多具有肝阳化风证的证候，发病急,变化快，病死率及致残率高对肝阳化风证、血虚生风证、阴虚风动证的病理生理研究发现,肝阳化风证表现为脑供血障碍和脑组织损伤,机体处于应激状态.调节血管平滑肌舒缩功能的活性物质含量有显著变化。大量研究表明,N0在脑缺血中介导了谷氨酸等兴奋性氨基酸的神经毒性作用及直接毒性损伤【34】。本研究发现:脑出血急性期肝阳化风证患者血浆ET水平显著增高,N0水平明显降低。2.5P淀粉样前体蛋白在肝阳化风证的表达熊新贵P5J等在实验研究中发现D淀粉样前体蛋白(D.amy1〇idA1prePcVrtseoi?,B.APP)在高血压脑出血肝阳化风证组较高血压肝阳上亢证组表达希霍高血压病肝阳上亢证组又较健康对照组表达上调,说明P.APP在阳亢化风形成的过程中发挥作用，可能对“肝阳化风证”具有提示意义，既往研究表明B淀粉样前体蛋白在大鼠弥漫性脑损伤早期即有增加，增加趋势呈波动性，不同部位的变化规律不同,APP作为ーー种反应蛋白可能有望成为用于检测早期脑损伤的生物学指标【361。2.6GST01,Adenylylcyclase,Thioredoxinperoxidasel,PRX3在肝阳化风证的表达萧梅芳【37J等在研究中发现GST01,而Omega家族是近年来发现的GSTs成员和该家族广泛分布在体内组织,与碑的代谢及某些中枢神经系统疾病的关系较为密切。GST01具有与谷氧还原蛋白相同的谷光背肽依赖性硫醇转移酶和脱氢抗坏血酸还原酶活性，同时GST01.1可能在抗细胞凋亡中发挥一定的作用[3S-39]»本实验中该蛋白在肝阳上亢证与肝阳化风证组均表达上调，提示由肝阳上亢证发展到肝阳化风证机体的ー种抗氧化及抗凋亡能力的代偿性增强。曾年菊m]等蛋白质组学中发现脑梗塞肝阳化风证患者腺甘酸环化酶(Adenylylcyclas度南化族组中表达缺失,阴虚生风组中表达明显下调，从而抑制催化ATP生成。CAMP,使肝阳化风证应激状态趋于平衡。二者可能为应激负反馈调节蛋白，同时大量外周血淋巴细胞进入脑组织,使得二者在外周血淋巴细胞表达相应下调。而硫氧还蛋白过氧化物酶1(Thioredoxinperoxidasel)和细胞氧化还提反鹿理襯兼通蛋白系统产生的能量还原过氧化超氧化物，除了在清除自由基方面有重要作用外，还通过调节细胞间H202浓度参与生长因子和肿瘤坏死因子a1pha的信号调节机制，肌动蛋白启动子能够指导硫氧还蛋白基因在脑组织中的表达。我们研究发现,在肝阳化风组中，硫氧还蛋白过氧(化)物酶.1在肝阳化风组中下降,在后期的阴虚生风组中表达上调，提示急性期机体处于氧化应激状态,大量氧自由基产生,从而该蛋白在清除氧自由基大量消耗，从而表达下降，而后期机体相对处于恢复过程，表达的上调表明脑缺血的修复过程。硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶(Thioredoxin—dependentperoxidereduc$R殳§)整卷旱纓救体,X表畫自乌纳曲*商南分化及信号转导有关【41舶】。近期研究发现,PRX3具有很强的抗氧化作用,与氧化应激密切相关。肝阳化风证属祖国医学常见病证,此类患者体内存在氧化应激反应【45J其原因可能是中医肝阳化风证病人存在大量活性氧,硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原醃通过清除过氧化物类ROS,大量消耗硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶,从而用起其下调。肝阳化风组的硫氧还蛋白依耐性过氧化还原能的下降明显,硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶可能成为肝阳化风证的特异性指标。赵艳m】等运用蛋白组学研究发现脑出血肝阳化风证Ap〇A!,Cyc!〇phi1inA及HH—transportingtr0ecursr°,To*c3hSon9FFaA義

52斑熊駕礎fl下调。提示脑出血肝阳化风证后Ap〇AI输损害，其对血管、免疫方面的保护作用被削弱。Francis[47J等发现Ap〇AI能有效地介导胆固醇和磷脂从入主动脉平滑肌细胞的流出。casfJ-0148]等在实验中发现:ApoA—I能加速胆固醇从胞外溢。Tangira1af49J等报道ApoAI水平升高，除了延缓病变的发生和进展外,确能消退斑块,Navab等【581】提出TApoAI抑制低密度脂蛋白(lOwdensitylipoprotein,LDL)氧化的机理，保护血管壁细胞不受氧化的LDL的损伤。而Cyc1。phi1inA在脑出血肝阳化风证患者急性期间接起到平衡免疫功能,稳定细胞结构的作用。H+.transportingtwo.sectorATPasebetach可以接受代谢物脱下的氢,把线粒体基质中的H泵到内膜的外侧,最后传给氧气生成水。在电子传递过程中释放能量,使二磷酸腺甘磷酸化生成三磷酸腺甘。这个过程即为线粒体的氧化磷酸化,为机体提供大部分的能量【52巧3】2.展望目前通过大量的试验方法,已经找到部分与中医肝阳化风证相关的蛋白，但还有很多机理尚未清楚,通过进ー步使用现代研究手段深入研究。

53参考文献硼申维玺,孙燕.论中医证的化学本质是蛋白质和肽及证本质的分子标准［J】.中国中西医结合杂志,1999,19(11)：69用旅星9證中医证的现代医学属性和概念［J］,中医杂志,2001,42(5)：批汉单维奎,S孤在.中医证的本质是细胞内基因表达调控异常产生的细胞因子［J］.河北中西医结合杂志，1998,7(增刊)：123.卅申维玺,孙燕.用分子生物学理论阐释阴虚证的本质【J］.医学研究通讯,1998,(8)：10本全玺,孙燕,张叔人，等.白细胞介素1等细胞因子与肺阴虚证本质相关的免疫组化研［J］.中医杂志,2000,41(7)：4E3車施羞ア孫燕;张叔人,等.IL21a、IL21P基因mRNA表达与肺癌阴虚证更也］.医学研究通讯，2000,29(8)：の年轟蓊,孙燕。细胞因子网络紊乱是疾病的基本发病学原理［J］。医学学通讯,2000,29(7)：印标ホ窗.证候实质研究中弱特异性的正面观【J］.医学与哲学，1995,16(6)：311.赵国求,中医证候实质与阴阳平衡［J】.辽宁中医杂志,1999,26(4)：1打M金养亮.证候基因组学和证候蛋白质组学浅论［J］.中国医药学报,2003,18(6)：332.n1J刘为民,姚乃礼，吴志奎等.中医证候学研究与证候蛋白质组学［J］.中医药学报,2003,31以山上豪露;本瑛，等，肝阳化风证病理生理学基础的进ー步研究［J］,湖南医科大学学报,2000,25(4)；343.3a皿卷△强,黎杏群,胡随瑜，等.肝风内动证三亚型的病理生理学基础研究［J］,中国中西医结合杂志,1993,13(7)：39びM+蒙我ア由永立,朱双罗，等.肝阳化风证患者多项指标检测分析【J】，中国现代医学杂志,1998,8(11)：4除瀬族呈编内科学［M］北京:人民卫生出版社,1997：669.ズ悭啊!华,黎杏群,金益强,脑溢安颗粒剂对急性脑出血病人血浆儿茶酚胺的,响［J湖南医科大学学报湖南医科大学学报，1999,24(5)：429CJzSCAMcintoshTK,Nob1eLJ.Experimenta1fluidpercussionbraininjury：Vasculardisruptionandneurona1andg1ia1an蜘刘爱平,李家邦,易正佳,肝阳化风证血浆去甲肾上腺素和肾上腺素测定[J],湖南医科大学学报，1991,16(1)：33.3n明如东红，金益强,翁伟强,脑梗塞肝阳化风证实验诊断指标的研究[J],中

54国中西结合杂志,1996,16(11)：664.66ロ叩潘其民,陈国林，赵玉秋,等,中医肝病流行病学调查[J].中西医结台杂志,1991；11(3)：153—ロUノ振?装鄢东红,金益强，天龙熄风颗粒剂治疗急性脑梗塞肝阳化风证的指标变化及其意义[j],湖南医科大学学报，1997,22(5)：41口刁拿香禅,皐变学,等,中医肝病各证患者血浆血栓素B2和前列环素12水平研究[J],湖南中医学院学报，2001,12(21)：9.1ロ习曲随喻.潘其民，王勇华,等中医肝痛常见证型的植物神经功能状志研究[J],湖南中医杂志，1996.12(1)：11.14.ロ卅金益强,黎杏群.陈国林,等.肝阳上亢证本质研究[J】•中西医结合杂志,1988.(3)-136—1U习・と群,邓旭光,李学文,等,脑卒中肝阳化风证患者血浆降钙素基因相关肽水平的临床观察[J],湖南医科大学学报,1992,17(3)230.2口叼余潮芸.杨晔,赵云游,等.原发性高血压患者血浆降钙素基因相关肽水平的临床观察.中华内科杂志。1990,29(19)：616.618口刀汤健.降钙素基因相关肽与心血管疾病.中华心血管病杂志，1989,7(2)：12口跚谢映,梁清华,等,泛素竣基末端水解酶在肝阳化风证中的表达【J】,实用预防医学,2007,14(2)：270.272ロ观SakamotoKM.Ubiquitin—dependentproteolysis：itsr〇!einhumandisensesandthedesignoftherapeuticstrategies[J].MoIGenetMetab»2002,77：44256.[30]ShastryBS.Neurodegenerativedisordersofproteinaggregation[J].Neurochem1nt,2003,43(1)：1—7.[31]ChungKK,DawsonVL,DawsonTM.Theroleoftheubiquitin—proteasoma1pathywayinParkinson'Sdiseaseandotherneurodegenerativediseases[J].TrendsNeurosei,20—01,24(supp1)：S7-¥14.[32]CarlsonM,RogersS,RechsteinerM,eta1.Ce1Bi〇1,1987,104(3)：547-555.[33]谭晓文,黎杏群,程丑夫,等,脑溢安对脑出血肝阳化风证患者血浆内皮素和一氧化氮水平的影响[J],中国中西医结合急救杂志,2002,3,(9)：65.67[34]罗团连,黎杏群,脑溢安对出血性大鼠脑损伤保护作用[J],湖南医科大学学报,2000.25(3)：245.2[35ナ論新贵,梁清华,侯俊良,等,高血压脑出血肝阳化风证与肝阳上亢证患者血清蛋白质组学研究[J],实用预防医学,2007,12(14)：16〔36]海晓邮:廖全钢,刘敏,等,大鼠脑弥漫性损伤早期p.APP变化的研究[J],中国法医学杂志,2001,16(4)：198.20【37》萧梅芳,梁清华,能新贵,等,高血压脑出血肝阳化风证患者外周血单个核细

55胞的蛋白质组学研究[J],实用预防医学,2008,15(3)：62[38]Ea^^^erteRE,PerregauxDG,HothLR,etal.GlutathioneStransferasesqnjega,•「IisatargetoicytokincrelcaseinnibitorydrugsandmayberesponsiblefortheireffectOl1intedeukin-Ibemposttrans1ationaIprocessing[J].JBi〇1Chem,2003,278：16567—165781[39]DulhuntyA,GageP,CurtisS,etal.Theglutathionetransferasestructura1familyincludesanuclearchloridechannelandaryanodinereceptorca1ciumreleasechannelmodulator[J].JBiolChem,2001,276(5)：33j9—3323.[40I曾年菊，梁清华,熊新贵，等，脑梗死肝阳化风证外周血淋巴细胞相关蛋白质鉴定和分析[J],中国中医药信息杂志，2008,15(4)：11.13[41]FujiiJ,IkedaY.Advancesinourunderstandingofperoxiredoxinamu1tifunctiona1»mamma1ianredoxprotein.RedoxRep,2002,7(3)：123—130[42]Rabi11oudT,He11erM,GasnierF,etal.Proteomicsanalysisofcel1u1arresponsetooxidativestress,Evidenceforinvivooveroxidationofperoxiredoxinsattheiractivesite.JBiolChem,2002*277(22)：19396—19401[43]JinDY,ChaeHZ,RheeSG,etal.Regulatoryroleforanove1humanthioreaoxinperoxidaseinNF2kappaBactivation.JBi〇!Chem,1997,272(49)：30952-30(44j国标,粟永萍,艾国平.Peroxiredoxin蛋白家族与电离辐射[J中华放射季与防护杂志2005,25(1):95.9[45f区建刚，曾年菊，萧梅芳.中医不同证型帕金森病患者外周血单个核细胞蛋白质组学研究【J】，2008,15(6)[46j迎艳ノ犠肝熄风汤对脑出血肝阳化风证患者外周血单个核细胞蛋白质组学的影响[J],2008.23(10)：885—888[47]FrancisGA,tsyjitaM,TerryTL,etal.Apolipoprote,nA1らもPJ*%f^^terolphospholipidef11uxfromhumanbutnotrataorticsmoothmusclecel1s.Biochemistry»1999,38(49)s16315*16322