壹期煤工尘肺患者血清氧化应激指标水平变化

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独创性说明本人郑重声明:所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究エ作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北联合大学以外其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。论文作者签名:日期:年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解河北联合大学有关保留、使用学位论文的规定，即:已获学位的研究生必须按学校规定提交学位论文，学校有权保留、送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅;学校可以将学位论文的全部或部分内容采用影印、缩印或编入有关数据库进行公开、检索和交流。作者及导师同意论文公幵及网上交流的时间:□自授予学位之日起;口自年月日起。

1作者签名:签字日期:导师签名:签字日期:年月日

2摘要目的煤エ尘肺(Coalworker'spneumoconiosis,CWP)是煤矿作业人员在煤炭生产中长期吸入粉尘而致的以肺结构慢性炎症、纤维化为主要病理表现的ー类疾病-也是我国职业病中发病率最高，对工人健康危害极为严重的ー类疾病。最近・许多研究发现肺部炎症和纤维化发病机制除与机体免疫功能有关外，氧化/抗氧化失衡起到重要作用。以前的许多研究中，常用超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)'过氧化氢酶(Catalase,CAT)'谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathioneperoxidase,GSH-Px)及丙二醛(Maleicdialdehyde,MDA)等来评价患者体内氧化应激水平的程度，但易受检测方法本身及干扰因素的影响。近年来・研究者们又发现几个新的评价指标如血红素氧合酶-1(Hemeoxygenase-1,HO-1)'核因子E2相关因子2(Nuclearfector-E2-relatedfactor2,Nrf2)和8ー异前列腺素F2a(8-iso-prostaglandinF2a,8-iso-PGF2a)。HO-1和Nrf2与抗氧化作用密切相关而8-iso-PGF2a则是脂质过氧化的终末产物。当粉尘进入人体后・粉尘刺激机体产生许多抗氧化物质・如HO-1(其水平的变化受Nrf2调控)等以对抗有害物质引起的破坏作用(总抗氧化能力(Totalantioxidecapacity,T-AOC)可以反应各种抗氧化物质总的抗氧化水平)。当抗氧化作用不充分或受到破坏时•引起细胞膜脂质过氧化反应,产生有细胞毒性的脂质过氧化产物(Lipidperoxide,LPO)和终产物8-iso-PGF2a等・导致细胞结构和功能的破坏。目前，HO-1'Nrf2和8-iso-PGF2a水平的变化在煤工尘肺中研究很少，因此，我们检测CWP患者血清HO-1'Nrf2'8-iso-PGF2a含量，并结合检测T-AOC、LPO含量的变化，进ー步探讨抗氧化及脂质过氧化指标在CWP发生发展中的变化及作用•为CWP的机制研究、临床诊断和抗氧化治疗提供依据。方法1本次研究对象来自2012-2013年开滦医疗集团钱营职业病医院部分住院的壹期CWP患者。选取经开滦职业病防治院按照2009年国家尘肺诊断标准(GBZ-2009)确诊患者91例，具备与病例组相同接尘条件的40例健康井下接尘矿エ(接尘组)和33例开滦非接尘井上健康查体工人(正常对照组)。各组性别、年龄及接尘年限匹配。全部查体人员均采集清晨空腹静脉血，常规消毒后，抽取肘正中静脉血4ml无抗凝剂采血管保存，住院患者于治疗前采集。使用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)法检测HO-1'Nrf2和8-iso-PGF2a的含量，比色法检测T-AOC和LPO的含量。2运用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计量资料进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以均数土标准差（x±s）表示,两均数比较采用t检验;偏态分布的计量资料以中位数（M）、四分位数间距（Q）表示，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验，多组间的两两比较采用Nemenyi检验-Mann-WhitneyU检验用于两组间的比较，采用Spearman方法进行相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

3结果1壹期CWP组、接尘组及正常对照组血清中HO-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化:三组间的Kruskal-WallisH检验结果显示，Nrf2、T-AOC和LPO各组间有统计学差异（ノ=8.809、34.075、55.462-P=0.012、0.000'0.000），而HO-1和8-iso-PGF2a无明显差异（ノ=2.657'2.705-P=0.265'0,259）。Nemenyi检验结果显示，与正常对照组相比,壹期CWP组LPO含量明显升高（P<0.01）-Nrf2和T-AOC有升高趋势・HO-1和8-iso-PGF2a有降低趋势・但均无明显差异（尸>0.05）;与接尘组比较,CWP组血清T-AOC含量明显降低•差异有统计学意义（P<0.01），HO-1'Nr£2ヽ8-iso-PGF2a和LPO含量降低，但均无明显差异（t>0.05）。接尘组与正常对照组相比，Nrf2、T-AOC和LPO含量明显升高（P<0.05）•而HO-1和8-iso-PGF2a也升高，但变化不明显。2不同接尘年限壹期CWP患者血清中HO-1'Nrf2ヽT-AOCヽ8-iso-PGF2a和LPO含量变化:接尘年限~25年、25~30年和30年~3组Kruskal-WallisH检验结果显示，壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO浓度均无明显改变，差异无统计学意义（2>0.05）。3壹期CWP并发肺部疾病组与单纯壹期CWP组血清中HO-1'Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化:壹期CWP并发肺部疾病组与单纯壹期CWP组Kruskal-WallisH检验结果显示•HO-1、Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO血清含量无明显变化・差异无统计学意义（P>0.05）。4壹期CWP吸烟与非吸烟患者血清中HO-1'Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化:壹期CWP吸烟与非吸烟患者两组之间进行Mann-WhitneyU检验,结果显示，两组CWP患者血清中HO-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量无显著性差异（2>0.05）。5壹期CWP饮酒与非饮酒患者血清HO-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化:壹期CWP饮酒与非饮酒患者两组之间进行Mann-WhitneyU检验，结果显示・壹期CWP饮酒患者血清中HO-1'Nrf2和8-iso-PGF2a含量降低・差异有统计学意义（Z=-2.122'-2.138'-2.253，P<0.05）-T-AOC和LPO也有降低趋势，但无显著性差异（P>0,05）。6壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO的相共性分析:壹期CWP组相关分析结果显示•HO-1与Nrf2'8-iso-PGF2a-8-iso-PGF2a与Nrf2'LPO-T-AOC与LPO均呈明显正相关(厶=0.840ヽ0.882'0.885'0,292'0.316•P<0.05)•其余各指标之间均不相关(尸>0.05)。7壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2ヽT-AOC、8-iso-PGF2a、LPO与肺功能的相关性分析:壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2、T-AOC、8-iso-PGF2a'LPO与肺功能指标FEV1(%)'FVC(%)'FEV1/FVC(%)'MW(%)无相关关系(P>0.05)。结论1壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量较接尘组均降低，但T-AOC含量降低明显•认为T-AOC在CWP的早期筛检中可能具有重要作用。2与正常对照组相比，接尘组LPO和T-AOC的升高幅度明显高于CWP组,认为接尘组中氧化应激程度较CWP组强烈。同时，2组中LPO升高幅度均高于T-AOC•说明CWP患者和接尘工人体内氧化损伤作用占优势。3壹期CWP饮酒患者血清HO-1'Nrf2和8-iso-PGF2a含量显著降低，提示CWP患者体内氧化应激指标水平的变化受饮酒影响。

4图5幅;表8个;参71篇。关键词:煤エ尘肺;血红素氧合酶-1;核因子E2相关因子2；总抗氧化能力;8-异前列腺素F2a;脂质过氧化物分类号：R135.2

5AbstractObjectivesCoalworker'spneumoconiosis(CWP)isaseriouskindofsystemicdisease,whichiscausedbylong-terminhalationofCoaldustwithchronicpulmonaryinflamationandfibrosis.IthasthehighestincidenceofoccupationdiseaseinChina.Manyresearchesfindthatthemechanismofpulmonaryinflammationandfibrosisisrelatedtothebody'simmunefunction.Oxidant/antioxidantimbalancemayalsopalysanimportantroleinthemechanism.Inmanyofthepreviousstudies,peopledetectthechangeofsuperoxidedismutase(SOD),catalase(CAT),glutathioneperoxidase(GSH-Px)andmaleicdialdehyde(MDA)toevaluatethelevelofoxidativestressinpatients,buteasytobeinfluencedbythemethodandinterferencefactors.Inrecentyears,researchershavediscoveredseveralbetterevaluationindicatorssuchasHemeoxygenase-1(HO-1),Nuclearfactor-E2-relatedfactor2(Nrf2)and8-iso-prostaglandinF2a(8-iso-PGF2a).ItiscloselyrelatedtoHO-1andNrf2inantioxidanteffect.8-iso-PGF2aistheendproductoflipidperoxidation.Theduststimulatethebodytoproducemanyantioxidantsubstances,suchasHO-1(changeofitslevelisregulatedbyNrf2)againstharmfulsubstancescauseddamage(Totalantioxidantcapacity(T-AOC)levelresponsevariousantioxidants).Whentheantioxidanteffectofinadequateordamage,lipidperoxidationofcellmembranemaybeinduced,generatinglipidperoxidesandendproduct8-iso-PGF2a.Atpresent,thechangesofserumHO-1,Nrf2and8-iso-PGF2aisrareincoalworkerspneumoconiosis.Therefore,thedetectionofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLipidperoxide(LPO)contentinpatientswithCWP,tofiitherexploretheantioxidantandlipidperoxidationindexinCWPchangesanddevelopment,providethebasisforthemechanismresearch,clinicaldiagnosisandthetreatmentofantioxidantCWP.MethodsThecasegroupofthisstudyinclude91caseswithstageICWPfrom2012to2013,allofthemwerediagnosedaccordingto2009nationalpneumoconiosisstandards(GBZ70-2009).Meanwhile,40casesofhealthyminerwererecruitedasdustcontactedgroup,Besides,another33casesofhealthyvolunteerswhoneverworkedinminewerealsorecruitedascontrolgroup,whichmatchedwiththecasegroupinsex,agesandwordedcondition.AllcasesaboveweredonehealthyexaminationintheInstituteofOccupationDiseasePreventionandCureofKaiLuanin2013.Allcasesweredrawnout4mlveinbloodreservedwithnonanticoagulanttubesafterroutineantisepsisinearlymorning.Enzyme-linkedImmunosorbentAssayswereappliedtodetecttheconcentrationofserumHO-1,Nrf2and8-iso-PGF2a.ColorimetricmethodwereappliedtodetecttheconcentrationofserumT-AOCandLPO.2SPSS13.0statisticalsoftwarewasusedtoanalyzetheabovementioneddate.Measuermentdatewhichfollowsthenormaldistributionweredescribedwithmean±standard,thenT-testwasusedtocomparethedifferencebetweentwogroups.F-testwasusedtocomparethedifferenceamongthreegroups.Thedatewhichdonotfollowsthenormaldistributionweredescribedwithmedianandquartilerange.Mann-WhitneyUtestwasusedtocomparethedifferencebetweentwogroup.Kruskal-WallisHtestwasusedtocomparethedifferenceamongthreegroups,thenNemenyitestwasusedtocomparethedifferencebetweentwogroupsamongthreegroups.Thespearsonmethodwasusedforthecorrelationanalysis.P<0.05wassupposedtobestatisticallysignificant.Results1ThechangesofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswithstageICWP.Kruskal-WallisHtestwasusedtocomparethedifferenceamongCWPgroup,dustcontactedgroupandhealthycontrolgroup,theconcentrationsofserumNrf2,T-AOCandLPOwereobviousdifference(x2=8.809,34.075,

655.462,P=0.012,0.000,0.000),butHO-1and8-iso-PGF2awerenoobviousdifference(x2=2.657,2.705,P=0.265,0.259).TheconcentrationsofserumLPOinpatientswithstageICWPweresignificantlyhigher(P<0.01),thanthatinhealthycontrolgroup,theconcentrationsofserumNrf2andT-AOCwereslightlyhigher,theconcentrationsofserumHO-1and8-iso-PGF2awereslightlylower.TheconcentrationsofserumNrf2,T-AOC,HO-1and8-iso-PGF2ahadnodistinctdifferenceamonggroupsinstatistics(P>0.05).TheconcentrationsofserumT-AOCweresignificantlylowerinstageICWPgroupthanthatindustcontactedgroup(P<0.01),whileHO-1,Nrf2,8-iso-PGF2aandLPOwerelower,buthadnoobviousdifference(P>0.05).TheconcentrationsofserumNrf2,T-AOCandLPOindustcontactedgroupweresignificantlyhigherthanthatinhealthycontrolgroup(P<0.05),therewerenodifferencefbrtheconcentrationsofserumHO-1and8-iso-PGF2aincreased.2ThechangesofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswithstageICWPindustexposureyears.Kruskal-WallisHtestwasusedtocomparethedifferenceamongpatientswithstageICWPwhoengagedindustexposurefor~25years,25〜30yearsand30years~,theconcentrationsofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswithstagesimpleICWPhadnodistinctdifferenceamonggroupsinstatistics(P>0.05).3ThechangesofserumHO-1,Nrf2,1-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswithstageICWPwithcomplication.Kruskal-WallisHtestwasusedtocomparethedifferencebetweengroups,theconcentrationsofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswithstagesimpleICWPhadnodistinctdifferenceamonggroupsinstatistics(P>0.05).4ThechangesofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinsmokingpatientswithstageICWP.TheconcentrationsofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOhadnodistinctdifferencebetweensmokingpatientswithstageICWPandnon-smokingpatientswithstageICWPinstatistics(P>0.05).5ThechangesofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOindrinckingpatientswithstageICWP.TheconcentrationsofserumHO-1,Nrりand8-iso-PGF2aindrinckingpatientswithCWPweresignificantlylowerthanthatinno-drinckingpatientswithCWP(Z=-2.122,-2.138,-2.253,P<0.05),whiletheconcentrationsofserumT-AOCandLPOindrinckingpatientswithCWPwerealsoslightlylowerthanthatinno-drinckingpatientswithCWP(P>0.05).6ThecorrelationoftheconcentrationsofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswithstageICWP.TheconcentrationsofserumHO-1hadsignificantlypositivecorrelationtoNrf2and8-iso-PGF2a,theconcentrationsof8-iso-PGF2ahadalsopositivecorrelationtoNrf2andLPO,T-AOCwaspositivelycorrelatedwithLPO(ね=0.840,0.882,0.885,0.292,0.316,P<0.05)inpatientswithstageICWP.Therestindexwerenotreleated(P>0.05).7ThecorrelationoftheconcentrationsofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2a,LPOandpulmonaryfunctionindexesinpatientswithstageICWP.InstageICWPpatients,theconcentrationsofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2a,LPOandlungfunctionindexesrespectivelyFEV1(%),FVC(%),FEV1/FVC(%),MVV(%)isnocorrelation(P>0.05).Conclusions1TheconcentrationsofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOwerealllower,butT-AOCwassignificantlylowerinpatientswithstageICWPthanthatindustcontactedgroup,suggestthatT-AOCmayplayanimportantroleintheearlydetectionofCWP.2Comparedwiththenormalcontrolgroup,serumLPOandT-AOCchangescopewassignificantlyhigherindustcontactedgroupthanthatinCWP

7group,itsuggestedthatthedegreeofoxidativestresstobestrongerindustcontactedgroup.Atthesametime,serumLPOchangescopeintwogroupsincreasedsignificantlyhigherthanthatoftheT-AOC,suggestedthattheoxidativedamageeffectsplayedamajorroleinstageICWPgroupanddustcontactedgroup.3TheconcentrationsofserumHO-1,Nrf2and8-iso-PGF2aweresignificantlylowerindrinkingpatientswithstageICWPthanthatno-drinkingpatients,suggestedthatthechangesofserumoxidativestressindexlevelwereinfluencedbydrinking.Figure5;Table8;Reference71Keywords:cwp,ho-1,nrf2,t-aoc,8-iso-pgf2a,IpoChinesebookscatalog:R135.2目次引言1第1章实验研究41.1样本收集41.1.1一般资料41.1.2标本的采集与处理51.1.3主要检测指标51.1.4所需仪器及设备51.1.5主要试剂61.1.6实验操作方法61.1.7统计学分析111.1.8质量控制111.2结果121.2.1壹期CWP组、接尘对照及正常对照组血清中H0-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化121.2.2不同接尘年限壹期CWP患者血清中HO-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化121.2.3壹期CWP并发肺部疾病组与单纯壹期CWP组血清中H0-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化131.2.4壹期CWP吸烟与非吸烟患者血清中HO-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化14

81.1.1壹期CWP饮酒与非饮酒患者血清HO-1'Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化14壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO的相关性分析15壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2、T-AOCヽ8-iso-PGF2a'LPO与肺功能的相关性分析161.2讨论161.3结论22

9-VII-河北联合大学硕士学位论文参考文献22第2章综述26HO-1和Nrf2在氧化/抗氧化肺部疾病中的研究进展262.1HO-1和Nrf2分子结构、来源及生物学功能262.2HO-1和Nrf2在哮喘中的作用272.3HO-1和Nrf2在慢性阻塞性肺疾病中的作用282.4HO-1和Nrf2在急性肺损伤中的作用292.5HO-1和Nrf2在肺癌中的作用292.6HO-1和Nrf2在肺纤维化中的作用302.7纟言语31参考文献31附录35致谢40导师简介41作者简介43子位Iロ乂数扌居集44

10VIII-

11英文缩略表英文缩略表英文缩写英文全称中文全称CWPCoalworker'spneumoconiosis煤エ尘肺COPDChronicobstructivepulmonarydisease慢性阻塞性肺疾病HO-1Hemeoxygenase-1血红素氧合酶ー1Nrf2Nuclearfactor-E2-relatedfactor2核因子E2相关因子2T-AOCrotaIantioxidantcapacity总抗氧化能力8-iso-PGF2a8-iso-prostaglandinF2a8ー异前列腺素F2aLPOLipidperoxide脂质过氧化物ROSReactiveoxygenspecies活性氧MDAMaleicDialdehyde丙二醛ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验ODOpticaldensity光密度FEV1Forcedexpiratoryvolumeinonesecond一秒钟用カ呼气量FVCForcedvitalcapacity用カ肺活量MWMaximalvoluntaryventilation每分钟最大通气量ILInterleukin白细胞介素ThHelperTcell辅助性T细胞SODSuperoxidedismutase超氧化物歧化酶CATCatalase过氧化氢酶GSH-PxGlutathioneperoxidase谷胱甘肽过氧化物酶GSHGlutataione谷胱甘肽

12引言CWP是煤矿作业人员在煤炭生产中长期吸入粉尘而致的以肺结构慢性炎症、纤维化为主要病理表现的ー类疾病川，它是我国职业病中发病率最高、严重危害煤矿工人健康的主要疾病。目前，CWP的发病机制尚不明确，特别是关于促进炎症和纤维化形成的机制仍不十分清楚，也无有效的治疗手段。最近，许多研究发现肺部炎症和纤维化发病机制除与机体免疫功能有关外，氧化/抗氧化失衡起到重要作用[2]"以往研究中，经典的抗氧化酶有超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)'过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathioneperoxidase,GSH-Px)等，而评价脂质过氧化的常见指标有丙二醛(Maleicdialdehyde,MDA)，抗氧化酶能够抑制脂质过氧化作用，减轻氧化应激给机体造成的损伤。但是，上述指标检测方法特异性不高，易受非特异物质如糖、胆红素，乙醛等干扰，加热时间和温度会对检测结果产生影响网。因此.我们期待进ー步寻求新的抗氧化及脂质过氧化指标，以期弥补上述物质检测中的不足。研究者们最近发现几个比较新的反应氧化应激程度的指标，包括血红素氧合酶-1(Hemeoxygenase-1,HO-1)、核因子E2相今因子2(Nuclearfactor-E2-relatedfactor2,Nrf2)和8ー异前列腺素F2a(8-iso-prostaglandinF2a,8-iso-PGF2a)■HO-1和Nrf2主要在抗氧化、脂质过氧化产物8-iso-PGF2a主要在评价氧化损伤及疾病程度中发挥重要作用，SiO2粉尘进入机体后可引起呼吸暴发,产生大量的自由基,驱动肺泡巨噬细胞膜的过氧化反应。氧自由基与生物膜的磷脂、酶和膜受体有关的多不饱和脂肪酸侧链及核酸等作用，形成脂质自由基的链式反应过程，可以使生物膜的流动性和通透性产生变化⑷。体内还可产生许多抗氧化物质，如H0-1(其水平的变化受Nrf2调控⑸)等以对抗有害刺激引起的破坏作用(总抗氧化能力(Totalantioxidecapacity,T-AOC)可以反应各种抗氧化作用总的抗氧化水平)。当抗氧化作用不充分或受到破坏时，生物膜脂质过氧化反应占优势，产生有细胞毒性的脂质过氧化产物Lipidperoxide(LPO)和终末产物8-iso-PGF2a等，导致细胞结构和功能的破坏。下面将几个新指标结合两个反应总体水平的指标进行介绍:人体HO-!蛋白由288个氨基酸组成，分子量为32000。HO-!基因定位于人第22号染色体长臂1区2带，包括5个外显子和4个内含子。有一个官动子、ー个近端增强子和两个远端增强子，这些区域含有许多转录因子如Nrf2的结合位点。生理状态下，HO-1主要分布于单核-巨噬细胞系统的微粒体中，在神经元、肝脏、脾脏中浓度较高，而又在脾脏组织中最高・约为肝脏的10倍。肺中HO-1主要在肺泡巨噬细胞中表达在上皮细胞中偶见表达，在淋巴细胞、

13中性粒细胞，嗜酸粒细胞、肥大细胞及浆细胞中均未见表达向。HO-1属微粒体酶•是血红素氧合酶同工酶之ー・为诱导型血红素氧合酶,能被多种能够产生氧化应激的因素如炎性细胞因子、高热、重金属，紫外线照射、血红素等所激活，以减少细胞损伤、蛋白质氧化及脂质过氧化。而且•HO-1对成纤维细胞、血管内皮细胞、肝细胞、心肌细胞和其他多种细胞具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗增殖的保护作用。Nrf2是ー个由2.2Kb的碱基对编码,相对分子质量为66000的蛋白。人类Nrf2基因位于2号染色体长臂3区1带，含有6个不同的同源结构域。Nrf2主要表达于如肝脏、肾脏等代谢和解毒组织中•以及ー些持续暴露在环境中的组织如皮肤，消化道、肺等・普遍表达于各种细胞。Nrf2在肺中主要表达于巨噬细胞和上皮细胞[7]。生理条件下，胞浆中的Nrf2处于不断降解状态,以维持细胞内平衡。当受到氧化应激刺激时•Nrf2稳定性增加并被激活,转移入核和相应蛋白形成二聚体，这种复合物通过顺式作用DNA元件激活HO-1基因转录阳。Nrf2起到感受器的作用，它水平的变化可能先于抗氧化酶的变化。体外研究称•人Nrf2基因多态性对内毒素刺激后巨噬细胞中的Nrf2蛋白和基因表达有显著影响，并对巨噬细胞炎症反应平衡有重要的调控作用⑼。在对鼠肺泡H型上皮细胞的增殖与分化的研究中也发现，Nrf2-/・细胞中ROS水平较Nrf2+/+细胞高，而抗氧化物谷胱甘肽水平低下，认为肺泡!!型细胞中Nri2的缺陷可使ROS水平升高，抗氧化物谷胱甘肽水平下降[10]〇T-AOC代表体内酶类少数小分子量抗氧化物质和非酶类抗氧化物质的总和，反映各抗氧化物之间相互联系、协同保护作用的关系，是反映机体抗氧化能力的重要指标。它较其他单纯反应氧化/抗氧化损伤的指标更加综合和全面。T-AOC可用于早期发现CWP患者，其灵敏度达70.5%，特异度达68.1%口リ。8-iso-PGF2a是ー组含20个碳原子的不饱和脂肪酸，是ー个分子量为354.5的小分子脂类物质。生理条件下，它主要存在于天然低密度脂蛋白中，当体内产生氧化应激时，天然低密度脂蛋白可被氧化修饰，此时8-iso-PGF2a水平升高口为。8-iso-PGF2a主要存在于人的各种组织和体液中，尤其以肺组织中最多囘。8-iso-PGF2a是自由基催化细胞膜上的花生四烯酸发生脂质过氧化（非酶促反应）后的稳定终末产物，尽管不是脂质过氧化的主要产物，但能够引起成纤维细胞的增殖和分化，还能够灵敏地反映体内氧化应激水平并与疾病严重程度相关，是评价氧化/抗氧化状态和脂质过氧化反应的理想生物指标。8-iso-PGF2a的形成可被超氧化物歧化酶和二丁基羟基甲苯所抑制內。另外,8-iso-PGF2a自身能促进细胞分裂，趋化单核细胞和中性粒细胞粘附于内皮细胞，形成慢性炎症反应和氧化环境即氧化应激。有研究显示・监测血清8-iso-PGF2a水平有助于反应哮喘患者体内氧化应激状态•评价病情严重程度［⑸。LPO是脂质过氧化的主要产物，出现在脂质过氧化作用的后期阶段•是脂类中不饱和脂肪

14酸和自由基亚氧化产物对细胞起破坏作用时产生物的总称・是细胞膜损伤的重要因素。脂质过氧化可能促进细胞外基质m型前胶原和层黏连蛋白的合成，使细胞外基质沉积增加，促进肺间质纤维化发生发展［的。HO-l'Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO是比较新的评价机体氧化应激的几个指标。在煤エ尘肺的研究中氧化/抗氧化机制越来越受到重视,但在煤エ尘肺中的效应机制的研究尚处于初始阶段，本试验采用酶联免疫吸附法、比色法检测91例已确诊壹期CWP及40例具有相同接尘条件但未发病的井下接尘对照以及33例正常对照组血清中HO-l'Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO的水平;旨在探讨壹期CWP患者体内HO-l'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO血清水平的变化及相互关系，为CWP的机制研究、临床诊断及抗氧化治疗提供新思路。

15第1章实验研究1.1样本收集1.1.1一般资料本次研究对象来自2012年到2013年开滦职业病防治院部分住院的壹期CWP患者。选取经开滦职业病防治院按照2009年国家尘肺诊断标准(GBZ-2009)确诊患者289例。井下接尘矿エ40例，井上不接尘的健康人33例，分别来自吕家坨矿、唐山矿、林西矿'范各庄矿等各个矿区。病例资料均详细核对并录入excel表，以方便进行查询和数据统计。经过精心筛选，实验最后选取91例壹期CWP患者(CWP组)，其中包括无并发症17例，并发COPD15例，并发肺气肿59例，其中从事井下采煤エ22人、掘进エ57人、开拓エ10人、瓦斯监测エ1人・地质测量エ1人，吸烟者54例，饮酒者41例。在问卷调查表中，记录肺功能相关指标"包括FEV1(%)'FVC(%)'FEV1/FVC(%)及MVV(%)等。具备与病例组相同接尘条件的40例健康井下接尘矿エ(接尘组)和33例幵滦非接尘井上健康查体工人(正常对照组)。所选对象均为男性，且无肝脏疾病、心脑血管病、糖尿病、肾病史及近期肺部感染史・无免疫系统疾病，未接受过影响免疫功能及内分泌功能的治疗。病例资料均分批详细查阅录入excel表。三组间临床资料见表1。表1三组间临床资料Table1Clinicaldatabetweenthethreegroups组别性别例數年龄(岁)平均年龄(夕)接尘年限(午)接尘年限(年MQCWP组男9153〜6960.09±3.738〜3829.008.00接尘组男4053〜7059.40±5.577〜3731.003.00对照组男335〇〜7960.55±9.31——经统计学分析，各组年龄差异无统计学意义(F=0.383■P=0.683)，接尘年限差异无统计学意义(Z=-1.726，と0.084)具有可比性。1)2009年国家尘肺病诊断及分期标准(GBZ70-2009)

16诊断原则:依据可靠的生产性粉尘接触史，以技术质量合格的X射线后前位胸片表现为主要依据，联合现场职业卫生学、尘肺流行病学考察材料和健康监护资料・参考临床表现和实验室检查•排除其余的肺部类似疾病后・对照尘肺病诊断标准片小阴影总体密集度至少达到1级•分布范围最少达到两个肺区，方可做出尘肺病的诊断。X射线胸片表现分期:壹期尘肺:有总体密集度1级的小阴影，至少达到两个肺区的分布范围。贰期尘肺:有总体密集度2级的小阴影，超过4个肺区的分布范围;或有总体密集度3级的小阴影，超过4个肺区的分布范围。叁期尘肺有下列三种表现之一者:（1）有大阴影出现，其长径不小于20mm，短径不小于10mm；（2）有总体密集度3级的小阴影，超过4个肺区的分布范围，并有小阴影聚（3）有总体密集度3级的小阴影，超过4个肺区的分布范围，并有大阴影。1.1.1标本的采集与处理患者于凌晨8-10时空腹抽取肘静脉血4ml，室温状态下静置1小时•放在低温离心机中，以3000转/分，离心!0分钟，取血清放入EP管中，储存在-20℃的冰箱中保存，待测。1.1.2主要检测指标1）人血清中HO-1浓度2）人血清中Nrf2浓度3）人血清中ATOC浓度4）人血清中8-iso-PGF2a浓度5）人血清中LPO浓度1.1.4所需仪器及设备1）酶标仪美国StatFax-21002）洗板机美国StatFax-26003）37℃水浴箱北京SHH.W214）漩涡振荡器姜堰XK96-B

175）离心机北京6）冰柜海尔BD388A7）冰箱海尔8）微量可调加样器芬兰9）722分光光度计10）量筒、烧杯11）玻璃棒12）定时器13）一次性吸头14）蒸储水15）比色杯16）吸水纸17）试管18）计算器1.1.5主要试剂HO-1酶联免疫试剂盒、Nrf2酶联免疫试剂盒、T-AOC比色法试剂盒、8-iso-PGF2a酶联免疫试剂盒和LPO比色法试剂盒均购自南京建成生物研究所1.1.6实验操作方法1）HO-1的测定（1）原理应用EL1SA方法测定标本中人HO-1水平。向预先包被了人HO-1单克隆抗体的酶标孔中加入HO-1-温育;温育后加入生物素标记的抗HO-1抗体・再与链霉亲和素-HRP结合・形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物AヽB■产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中人HO-1的浓度呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值）,通过标准曲线计算样品中人HO-!浓度。（2）试剂］准备①5号标准品:将1203的标准稀释液加入到120ul原倍标准品（48ng/ml），配制成24ng/ml的标准品

18②4号标准品:将120ul的标准稀释液加入到!20ul5号标准品（24ng/ml）•配制成12ng/ml的标准品③3号标准品:将120ul的标准稀释液加入到120ul成6ng/ml的标准品④2号标准品:将120ul的标准稀释液加入到120ul成3ng/ml的标准品⑤1号标准品:将120ul的标准稀释液加入到120ul4号标准品(12ng/ml)•配制3号标准品(6ng/ml),配制2号标准品(3ng/ml)•配制成1.5ng/ml的标准品⑥洗涤液稀释:将浓缩稀释液20ml用蒸禰水580ml稀释30倍后，备用(3)检测①将所需试剂盒和待测样品平衡至室温。②确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目。③1孔设为空白对照孔,2-6孔分别设为1-5号标准品孔，6孔以后设为待测样品孔。于2-6孔中分别加入对应标准品50ul于待测样品孔中加入待测样品40ul,然后加抗-HO-1抗体10ul于待测样品孔・再向标准品孔和待测样品孔中分别加入链酶亲和素-HRP50U1。盖上封板膜，轻轻振荡混勻・37℃温育60分钟。④小心揭掉封板膜，洗板机将酶标板用制备好的稀释洗涤液洗涤5次，吸水纸上拍干。⑤每孔(包括空白孔、标准品孔和待测样品孔)先加入显色剂A50ul-再加入显色剂B50ul，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。⑥然后再向每孔加入终止液50ul以终止反应(此时蓝色立即转变为黄色)。⑦10分钟之内，于450nm波长处依次测量各孔的吸光度值(OD值)。(4)结果计算依据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程・再依据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。2)Nrf2的测定(1)原理同HO-1原理(2)试剂准备①5号标准品:将120ul的标准稀释液加入到120ul原倍标准品(16ng/ml)•配制成8ng/ml的标准品

19②4号标准品:将120ul的标准稀释液加入到120ul5号标准品(8ng/ml)•配制成4ng/ml的标准品

20第1章实验研究-7-

21③3号标准品:将120ul的标准稀释液加入到120ul成2ng/ml的标准品④2号标准品:将120ul的标准稀释液加入到120ul成lng/ml的标准品⑤1号标准品:将120ul的标准稀释液加入到120ul成0.5ng/ml的标准品4号标准品(4ng/ml)1配制3号标准品(2ng/ml),配制2号标准品(lng/ml)•配制⑥洗涤液稀释:将浓缩稀释液20ml用蒸储水580ml稀释30倍后，备用(3)检测①将所需试剂盒和待测样品平衡至室温。②确定本次检测所需要的已经包被好抗体的酶标板孔数目。③1孔设为空白对照孔,2-6孔分别设为1-5号标准品孔，6孔以后设为待测样品孔。于2-6孔中分别加入对应标准品50ul于待测样品孔中加入待测样品40ul,然后加抗-Nrf2抗体10ul于待测样品孔・再向标准品孔和待测样品孔中分别加入链酶亲和素一HRP50ul。盖上封板膜・轻轻振荡使之混匀,37て温育60分钟。④小心揭掉封板膜，洗板机将酶标板用制备好的稀释洗涤液洗涤5次，吸水纸上拍干。⑤每孔(包含空白孔、标准品孔和待测样品孔)先加入显色剂A50ul-再加入显色剂B50ub轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。⑥每孔加入终止液50ul以终止反应(此时蓝色立即转变为黄色)。⑦10分钟之内，于450nm波长处依次测量各孔的吸光度值(OD值)。(4)结果计算依据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程-再依据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。3)T-AOC的测定(1)原理机体中有很多抗氧化物质,能使Fe?+还原成Fe2;后者可与菲琳类物质形成稳固的络合物，经过比色可测出其抗氧化能力的高低。(2)试齐リ准备①试剂二应用液配制:两支粉剂加240ml蒸储水充分溶解②试剂三应用液:3m)贮备液用稀释液57ml以1:19稀释

22③混合试剂的配制:将试剂ー120ml，试剂二240ml•试剂三60ml混合配制

23(3)检测①将所需试剂盒和待测样品平衡至室温。②测定管中加入待测样品!00ul然后加入混合试剂3.5ml于对照管和测定管1|1〇③漩涡混勻器充分混匀，37て水浴30分钟。④分别向对照管和测定管中加入lOOul试剂四，然后再向对照管中加入待测样品lOOul。⑤充分混勻放置10分钟・蒸储水调零，520nm波长・光径1cm•测定各管吸光度值。(4)结果ヨ尸ハヒ+测定OD值对照OD值反应液总量・セOifilHTざ7モ至双"立卅,ハ息抗理化龍カ=+30^x杆ロロ测试刖稀释倍数(1)0.01取样量4)8-iso-PGF2a的测定(1)原理同HO-1(2)试剂!准备①5号标准品:将120ul的标准稀释液加入到120ul原倍标准品(240pg/ml)•配制成120ng/ml的标准品②4号标准品:将120ul的标准稀释液加入到120ul配制成60ng/ml的标准品③3号标准品:将120ul的标准稀释液加入到120ul制成30ng/ml的标准品④2号标准品:将120ul的标准稀释液加入到120ul制成15ng/ml的标准品⑤1号标准品:将120ul的标准稀释液加入到120ul制成7.5ng/ml的标准品5号标准品(120ng/ml)14号标准品(60ng/ml)•配3号标准品(30ng/ml)•配2号标准品(15ng/ml)•配⑥洗涤液稀释:将浓缩稀释液20ml用蒸储水580ml稀释30倍后•备用(3)检测①将所需试剂盒和待测样品平衡至室温。②确定本次检测所需要的已包被好抗体的酶标板孔数目。③1孔设为空白对照孔-2-6孔分别设为1-5号标准品孔，6孔以后设为待测样品孔。于2-6

24孔中分别加入对应标准品50ul•于待测样品孔中加入待测样品40ul,然后加

25-9-

26抗ー8-iso-PGF2a抗体10ul于待测样品孔，再向标准品孔和待测样品孔中分别加入链酶亲和素一HRP50ul。盖上封板膜，轻轻振荡混勻，37℃温育60分钟。④小心揭掉封板膜，洗板机将酶标板用制备好的稀释洗涤液洗涤5次,吸水纸上拍干。⑤每孔(包含空白孔、标准品孔和待测样品孔)先加入显色剂A50ul-再加入显色剂B50ul-轻轻震荡混匀，37て避光显色10分钟。⑥每孔加入终止液50ul以终止反应(此时蓝色立即转变为黄色)。⑦10分钟以内，于450nm波长处依次测量各孔的吸光度值(OD值)。(4)结果计算依据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程-再依据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。5)LPO的测定(1)原理LPO在45て反应60分钟的条件下，一分子LPO和两分子的显色试剂反应，产生ー种稳定的生色团，在586nm下有最大吸收峰。通过作标准曲线对照，或通过公式计算可得到检测物中LPO的含量。(2)试剂准备①5号标准品:即原倍标准品(lOumol/1)②4号标准品:将500ul的乙醇加入到500ul原倍标准品(10umol/l)•配制成5umol/l的标准品③3号标准品:将400ul的乙醇加入到100ul原倍标准品(lOumol/1)配制成2umol/l的标准品④2号标准品:将9003的乙醇加入到100ul原倍标准品(10umol/l)，配制成lumol/1的标准品⑤1号标准品:将500ul的乙醇加入到500ul2号标准品(lumol/1),配制成0.5umol/l的标准品⑥试剂ー应用液的配制:30ml贮备液与10ml稀释液混合，备用(3)检测①将所需试剂盒和待测样品平衡至室温。②确定本次检测所需的96孔板的板孔数目。将1孔设为空白孔,2-6孔设为标准孔•6孔以后为测定孔。③向空白管中加入200ul无水乙醇•标准管中加入1-5号标准品200ul，测定管中

27河北联合大学硕士学位论文-10-

28加入200ul待测样本。④每管（包括空白管，标准管和测定管）中加入650ul试剂ー应用液・盖上盖•充分混勻。⑤每管中加入试剂二150ul。盖上盖充分混匀，45て孵育60分钟,4000转/分，离心10分钟，取上清液200ul加入到96孔板中，586nm波长，测定各孔OD值。（4）结果计算根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程-再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。统计学分析运用SPSS13.0统计学软件进行统计学分析。计量资料进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以均数土标准差（x±s）表示,两均数比较采用t检验;偏态分布的计量资料以中位数（M）、四分位数间距（Q）表示，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验，多组间两两比较Nemenyi检验，Mann-WhitneyU检验用于两组间的比较•采用Spearman方法进行相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。质量控制1）严格按操作规程统ー采集、储存标本。2）所选研究对象严格按照2009年国家尘肺病诊断及分期标准（GBZ70-2009）并经钱营职业病医院确诊后，进行分类、分期。3）选取无黄疸、溶血和脂血的标本进行统ー测定。4）所有试剂及标本使用前均平衡至室温，用前摇勻。5）试验前检查和调试仪器，使之状态良好，运转正常，并严格按照说明操作。6）加样器每次加不同的标品时需要更换吸嘴•吸取及加样时，保证垂直地吸取及加入微孔板，避免触碰孔的上部边缘•以避免交叉污染。7）使用分光光度计时，不检测的情况下，将试样室盖子打开;拿取比色杯时，只能触碰毛玻璃面，不能碰光学表面;比色杯外壁附着的液体用软的吸水纸吸干，避免擦拭，以免损伤光学表面;检测完一个样本后，应将比色杯用蒸储水冲洗干净，以免影响检测结果。结果1.1.1壹期CWP组、接尘对照及正常对照组血清中H0-1'Nrf2ヽT-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化三组间的Kruskal-WallisH检验结果显示•Nrf2ヽT-AOC和LPO各组间有统计学差异(?=8.809、34.075、55.462-P=0.012'0.000、0.000)，而HO-1和8-iso-PGF2a无明显差异(/=2.657、2.705，P=0.265、0.259)。Nemenyi检验结果显示，与正常对照组相比，壹期CWP组LPO含量明显升高(ズ

29=34.813•P=0.000)，Nrf2和T-AOC有升高趋势(ノ=1.004'4.645-P=0.605'0.098)-HO-1和8-iso-PGF2a有降低趋势,但均无明显差异;与接尘组比较，血清T-AOC含量明显降低・差异有统计学意义(？=21.029-P=0.000)-Nrf2和LPO含量降低(7=5.720'4.415•P=0.057'0.110)■HO-I和8-iso-PGF2a含量也降低•但均无明显差异。接尘组与正常对照组相比，Nrf2、T-AOC和LPO含量明显升高(7.812'30.931'51.064-P=0.020'0.000'0.000)而HO-1和8-iso-PGF2a也升咼，但变化不明显,见表2，图1。表2壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化Tabei2ThechangesofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswithstageICWP,—-8-iso-PGF2a组别例数HO-l(ng/ml)Nrf2(ng/ml)T-AOC(u/ml)LPO(umol/l)(pg/ml)MQMQMQMQMQCWP组918.249.151.943.434.193.08*29.8254.886.243.77.接尘组4012.2416.693.896.24*8.764.75,44.9681.109.609.02*正常对照组338.3013.581.523.032.225.8639.8065.160.731.13X2值2.6578.80934.0752.70555.462产值0.2650.0120.0000.2590.000注:与接尘组比较■*P<0.05•尸<0.01♦与正常对照组比较」尸<0,05■P<0.011.1.1不同接尘年限壹期CWP患者血清中HO-1、Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化接尘年限~25年、25~30年和30年~3组Kruskal-WallisH检验结果显示-壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2ヽT-AOC'8-iso-PGF2a和しPO浓度均无明显改变，差异无统计学意义(？=2.024'3.769'1.216'1.671'2.530-P=0.363'0.152'0.544'0.434、0.282)-见表3，图2。表3不同接尘年限壹期CWP患者血清中HO-1'Nrf2'T-AOC-8-iso-PGF2a和LPO含量变化Tabei3ThechangesofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswithstageICWPindustexposureyears组别例数HO-l(ng/ml)8-iso-PGF2aNrf2(ng/ml)T-AOC(u/ml)LPO(umol/l)(pg/ml)MQMQMQMQMQ~25年267.8416.292.176.165.004.4732.2084.796.153.48

3025〜30年269.7616.991.916.074.132.4435.5283.915.055.8730年〜397.686.231.662.364.193.2026.1340.446.494.53x2值2.0243.7691.2161.6712.530P值0.3630.1520.5440.4340.2821.1.1壹期CWP并发肺部疾病组与单纯壹期CWP组血清中HO-1'Nrf2ヽT-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化壹期CWP并发肺部疾病组与单纯壹期CWP组Kruskal-WallisH检验结果显示，HO-1、Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO血清含量无明显变化，差异无统计学意义(メ=1.940'1.864'4.356'1.290'3.498-P=0.379'0.394'0.113'0.525'0,174)•见表4、图3。表4壹期CWP并发肺部疾病组与单纯壹期CWP组血清中HO-1'Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化Tabei4ThechangesofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswithstageICWPwithcomplication例8-iso-PGF2a组别数HO-l(ng/ml)Nrf2(ng/ml)T-AOC(u/ml)(pg/ml)LPO(umol/l)MQMQMQMQMQCWP并发慢性阻塞性肺疾病组156.756.921.422.844.195.1821.7938.766.303.22表4(续)组别例数HO-l(ngZml)Nrf2(ng/ml)T-AOC(u/ml)8-iso-PGF2a(pg/ml)LPO(umol/l)MQMQMQMQMQCWP并发肺气肿组598.8211.202.193.854.693.7035.6861.067.103.81单纯CWP组178.247.222.092.313.702.2827.1138.395.495.26X2值1.9401.8644.3561.2903.498「值0.3790.3940.1130.5250.1741.1.2壹期CWP吸烟与非吸烟患者血清中H0-1、Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化壹期CWP吸烟与非吸烟患者两组之间进行Mann-WhitneyU检验，结果显示，两组CWP患者血清中HO-1'NH2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量无显著性差异(Z=-0.990'-1.216'-0.315'-1.333、-0.969-P=0.322'0.224、0.753'0.182'0,332)•见表5、图4。表5壹期CWP吸烟患者血清中HO-1'Nrf2ヽT-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化

31Tabei5ThechangesofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2cxandLPOinsmokingpatientswithstageICWP组别例HO-l(ng/ml)Nrf2(ng/ml)T-AOC(uZml)8-iso-PGF2aLPO(umol/l)数(pg/ml)MQMQMQMQMQ吸烟组547.546.691.662.754.323.4226.2345.996.186.10非吸烟组3710.5513.242.484.274.072.7141.4670.246.303.19Z值-0.990-1.216•0.315-1.333-0.969「值0.3220.2240.7530.1820.332壹期CWP饮酒与非饮酒患者血清HO-1、Nrf2'T-AOC、8-iso-PGF2a和LPO含量变化壹期CWP饮酒与非饮酒患者两组之间进行Mann-WhitneyU检验，结果显示，饮酒的壹期CWP患者血清中HO-1'Nrf2和8-iso-PGF2a含量降低，差异有统计学意义(Z=■2.122'-2.138'-2.253-P=0.034ヽ0.033'0.024)-T-AOC和LPO也有降低趋势,但无显著性差异(Z=-0.582、ー0.311-P=0.560'0.756)•见表6、图5。

32表6壹期CWP饮酒患者血清中H0-1'Nrf2ヽT-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化Tabei6ThechangesofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOindrinckingpatientswithstageICWP组别例数HO-l(ng/ml)MQNrf2(ng/ml)MQ8-iso-PGF2aT-AOC(u/ml)LPO(umol/l)MQMQ(pg/ml)MQ饮酒组417.294.30*1.571.68*4.193.8225.0528.88*6.147.62非饮酒组509.9515.682.405.214.262.7735.9777.416.493.15Z值-2.122-2.138-0.582-2.253-0.311产值0.0340.0330.5600.0240.756注:与非饮酒组比较•*P<0.05壹期CWP患者血清HO-l、Nrf2、T-AOCヽ8-iso-PGF2a和LPO的相关性分析壹期CWP组相关分析结果显示，HO-1与Nrf2、8-iso-PGF2a-8-iso-PGF2a与Nrf2、LPO-T-AOC与LPO均呈明显正相关(rs=0.840、0.882'0.885'0.292'0.316■P=0.000'0.000'0.000'0.026'0,016)•其余各指标之间均不相关(P>0.05)•见表7。表7壹期CWP患者血清中HO-1'Nrf2ゝT-AOC'8-iso-PGF2a和LPO相关分析Tabei7ThecorrelationoftheconcentrationsofserumHO-1,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOinpatientswithstageICWP相关指标な值产值HO-!与Nrf20.8400.000*HO-1与T-AOC-0.0560.676HO-1与8-iso-PGF2a0.8820.000*HO-I与LPO0.2000.133Nrf2与T-AOC-0.0310.816Nrf2与8-iso-PGF2a0.8850.000*Nrf2与しPO0.0860.522T-AOC与8-iso-PGF2a-0.0900.500T-AOC与しPO0.3160.016*8-iso-PGF2a与LPO0.2920.026*注:Speannan相关分析,*P<0.05壹期CWP患者血清HO-l、Nrf2ヽT-AOC'8-iso-PGF2a'LPO与肺功能的相关性分析壹期CWP患者血清HO-l'Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a'LPO分别与肺功能指标FEV1(%)'FVC(%)'FEV1/FVC(%)'MW(%)无相关关系(な=-0.097'-0.076'0.122'-0.062•0.075ヽ0.020'0.327ヽ-

330.062-0,023'0.023'0.124'-0.167•0.080'0.069'0.193'-0.0240.197'0.165'0.049'-0.151-P=0.610'0.691'0.521'0.746-0.693'0.915'0.077'0.7440.903'0.906'0.513'0.3780.675'0.717'0.308ヽ0.900•0.298'0.382ヽ0.799'0.427)•见表8。表8壹期CWP患者血清中HO-l'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a、LPO与肺功能各指标相共分析Tabei8ThecorrelationoftheconcentrationsofserumHO-l,Nrf2,T-AOC,8-iso-PGF2a,LPOandpulmonaryfunctionindexesinpatientswithstageICWP相关指标厶值「值HO-!与FEV1(%)-0.0970.610HO-!与FVC(%)-0.0760.691HO-!与FEV1/FVC(%)0.1220.521HO-l与MW(%)-0.0620.746Nrf2与FEV1(%)0.0750.693Nrf2与FVC(%)0.0200.915Nrf2与FEV1/FVC(%)0.3270.077Nrf2与MVV(%)-0.0620.744T-AOC与FEV1(%)0.0230.903T-AOC与FVC(%)0.0230.906T-AOC与FEV1/FVC(%)0.1240.513T-AOC与MW(%)-0.1670.3788-iso-PGF2a与FEV1(%)0.0800.6758-iso-PGF2a与FVC(%)0.0690.7178-iso-PGF2a与FEV1/FVC(%)0.1930.3088-iso-PGF2a与MW(%)-0.0240.900LPO与FEVI(%)0.1970.298LPO与FVC(%)0.1650.382LPO与FEV1/FVC(%)0.0490.799LPO与MVV(%)-0.1510.4271.3讨论CWP是煤矿作业人员在煤炭生产中长期吸入粉尘而至的以肺结构慢性炎症、纤维化为主要病理表现的ー类疾病»它是我国职业病中发病率最高、严重危害煤矿エ人健康的主要疾病。目前，CWP的发病机制尚不明确,特别是关于促进炎症和纤维化形成的机制仍不十分清楚,也无有效的治疗手段。最近・许多研究发现肺部炎症和纤维化发病机制除与机体免疫功能有关外，氧化/抗氧化失衡起到重要作用。粉尘进入机体后,体内可产生许多抗氧化物质，如HO-1（其水平的变化受Nrf2调控）等以对抗有害刺激引起的破坏作用（T-AOC可以反应各种抗氧化作用

34总的抗氧化水平）。当抗氧化作用不充分或受到破坏时，产生细胞膜脂质过氧化反应・产生有细胞毒性的脂质过氧化产物LPO和终产物8-iso-PGF2a等，导致细胞结构和功能的破坏。ー些环境刺激因子•例如紫外线照射、丫射线照射、环境污染等可以诱导活性氧ROS的产生。活性氧主要包括过氧化氢、超氧自由基和羟基自由基,可以导致细胞内蛋白、脂质和DNA等的氧化损伤・诱发氧化应激反应，继而导致风湿性关节炎、动脉粥样硬化、肝损伤、肺损伤、中枢神经系统疾病以及各种癌症等。机体中存在很多抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等・能够清除体内产生的各种活性氧，以阻止活性氧诱导的氧化应激的产生。传统的抗氧化物如SOD、维生素E、CAT及脂质过氧化产物MDA等易受体内外许多因素影响，特异性和敏感性较差，不能准确反映体内氧化应激水平。HO-1是新近发现的ー种最普遍存在的抗氧化酶,通常呈低水平表达,在机体受到伤害性刺激后水平可明显升高，在肺的适应性和保护性反应中起着重要作用。Nrf2位于抗氧化酶的上游•起到感受器的作用，氧化应激条件下・它水平的变化可能先于SOD、CAT'GSH-Px等抗氧化酶。有研究发现，Nrfz缺乏可使鼠肺中HO-1等解毒酶的表达下降，H0-!蛋白的表达受Nrf2调控⑴。ー个体系内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平即体现了该体系内的总抗氧化能力»因此，测定血浆、尿液、唾液等各种体液、细胞或组织等裂解液中的T-AOC具有非常重要的生物学意义。矽尘可以诱导机体氧化应激的发生及脂质过氧化反应增加，造成肺组织损伤【⑺。李云晖等也证实煤烟对肺!!型细胞造成的氧化性损伤可通过产生氧自由基或脂质过氧化物等多种途径予以实现1网。本实验主要通过检测煤工尘肺患者血清HO-1'Nrf2、T-AOC、8-iso-PGF2a和LPO的浓度，探讨它们含量变化及相互作用在壹期CWP中的价值，为CWP的机制研究、临床诊断、抗氧化治疗提供依据。有研究〔ゆ发现致纤维化药物使Nrf2-/・鼠生存率降低，肺纤维化评分及氧化应激指标8ー异前列腺素水平升高■HO-1mRNA表达水平显著降低，Thl/Th2平衡向Th2方向移动，认为Nrf2可能影响T细胞的分化和细胞因子产生・并通过调节细胞氧化还原水平及Thl/Th2平衡对抗肺纤维化进程。在对特发性肺纤维化的研究中发现•患者支气管肺泡灌洗液巨噬细胞中H0-!蛋白表达及H0-!阳性巨噬细胞百分率明显降低•并且与IL-12和IL-18低表达有关•认为HO-!低表达可能与细胞内促进纤维化的微环境有关⑹。另有研究证实•HO-1水平降低可有效抑制纤维化大鼠TGF-0、总胆红素和羟脯氨酸水平，减少谷胱甘肽(Glutataione,GSH)消耗，但不能降低早期肺组织炎症细胞浸润，推测H0-1虽不参与早期炎症反应，但能通过氧化损伤和促纤维化作用推进纤维化进程。MDA是脂质过氧化后的代谢产物，参与自由基对DNA及细胞膜的损伤,可作为细胞膜损伤的指标・但不能反映氧自由基的活性如。染煤石英尘的巨噬细胞内脂质过氧化反应并不强烈，MDA

35浓度只在染尘早期升高。体外细胞培养研究发现•染煤石英尘后7天的巨噬细胞内脂质过氧化物含量增加，至30天时降低，以后与正常人水平无差异，SOD在7天时降低，GSH-Px和GSH在7和30天升高，以后均达到正常水平，染煤石英尘的巨噬细胞内脂质过氧化反应并不强烈，MDA浓度只在染尘早期升高，认为抗氧化作用有效阻碍了脂质过氧化反应对细胞的破坏作用四。我们的研究中，与正常对照组相比，CWP组中LPO含量升高，而终产物8-iso-PGF2a浓度无明显变化，认为煤エ尘肺患者体内自由基氧化强度并不高，可能与煤尘含有较低的石英尘浓度，对巨噬细胞的刺激不明显有关°有研究显ホ，矽肺病人血清中GSH'SOD及MDA含量均升高,可能是SiO2引起机体防御性反应，抗氧化物增多以对抗氧化损伤网。与正常对照组相比，我们研究的煤工尘肺患者血清T-AOC及Nrf2升高并不明显，而HO-!浓度反而有降低趋势，可能是长时间的氧化/抗氧化代谢失调•机体消耗，加速煤エ尘肺发展及HO-!与Nrf2在肺纤维化中的相互作用有关。与我们的研究结果类似，热电厂工人体内的脂质过氧化产物MDA含量升高，而SOD和GSH-Px水平降低，脂质过氧化物与抗氧化物的水平呈反方向变化，进ー步证明了抗氧化物消耗以对抗脂质过氧化的损伤作用ぴ］。研究人员对粉尘接触人群血清SOD和MDA检测时发现,轻度粉尘接触工人仅SOD活性下降，超标接触工人SOD下降而MDA升高,煤エ尘肺患者体内两项指标均升高，认为脂质过氧化程度与粉尘接触量有关の］。我们的研究中，CWP组LPO水平较正常对照组升高,HO-1、Nrf2及T-AOC无明显变化，脂质过氧化物的升高并未引起抗氧化物水平发生明显变化，认为工人发病后，脱离了煤尘持续刺激的环境，使氧化应激反应有所减弱。T-AOC对早期发现CWP患者具有非常重要的意义山］。有研究显示，矽肺患者体内抗氧化物SOD有随疾病患病年限降低的趋势网。我们的结果中，CWP组T-AOC含量较接尘组降低，另外几个指标亦均有降低趋势・认为CWP患者体内氧化反应强度较接尘组有所降低•可能是随着患病时间延长・机体对抗氧化损伤消耗的结果。在对哮喘豚鼠支气管肺泡灌洗液的研究中发现•炎症细胞中Nrf2和y-GCS的mRNA及蛋白表达均下降，而浸润的嗜酸性粒细胞和巨噬细胞增加，认为炎症细胞中Nrf2和y-GCS的表达降低促进了氧化应激进ー步恶化四】。博莱霉素诱导的肺纤维化模型中，Nrf2-/.鼠肺水肿及胶原沉积严重・肺泡灌洗液中炎症细胞及上皮细胞明显增加，纤维增生和肺损伤重塑标志物大量积聚，而肺内靶基因mRNA和蛋白表达水平经药物诱导后波动不大，提示Nrf2靶向敲除可极大提高鼠对博莱霉素诱导的肺炎症和纤维化的易感性，Nrf2调节的抗氧化防御酶可能对博莱霉素诱导的纤维化起保护作用口】。我们的研究显示，接尘组与正常对照组相比，T-AOC'Nrf2和LPO明显升高，HO-1和8-iso-PGF2a也有所升高，认为接尘工人体内存在氧化/抗氧化失衡，Nrf2在接尘组中起到保护作用。HO-1可以分解血红素生成胆绿素和胆红素，它们具有抗氧化和清除自由基的

36特性の）,可能是良好的抗自由基物质。研究人员用粉尘处理的巨噬细胞上清液刺激人胚肺成纤维细胞，发现成纤维细胞中HO-!的表达与粉尘浓度呈剂量一效应父系，认为H0-!参与矽尘引起的氧化应激，发挥抗氧化保护作用1291。迄今为止，许多研究报道了脂质过氧化物与抗氧化物之间的关系，但结果并不一致。我们的研究中，T-AOC'Nrf2和LPO的变化趋势相同，都是接尘组最高，其次是CWP组，正常对照组最低，而HO-1和8-iso-PGF2a的变化趋势相同，接尘组高于正常对照组，正常对照组又高于CWP组。与对照组相比，接尘组显示出抗氧化物与脂质过氧化物同向变化。与我们的研究结果类似，矽肺组较对照组T-AOCヽMDA及GSH-Px活力均明显升高，而SOD水平明显下降，氧化抗氧化失衡与矽肺发生发展有关网。杨晓光等人即发现不同期别矽肺病人体内T-AOC、SOD和MDA均升高，认为是矽肺发生发展过程中，不断产生自由基和LPO情况下，机体保护水平提高的结果。哮喘动物肺内H0-1蛋白及活性增加，血清及肺内MDA也增加，而血清胆红素减少，认为哮喘发作时，HO-1表达和活性增加代偿胆红素的减少，调节氧化/抗氧化失衡，减轻过敏症状或气道高反应性図】。说明在我们的接尘组中煤尘破坏巨噬细胞引起细胞膜发生脂质过氧化反应，导致H0-1随同脂质过氧化物的升高显示出升高趋势，发挥抗氧化保护作用。煤エ尘肺主要是由于工人长期吸入大量粉尘引起肺部纤维病变，减少粉尘产生量、降低粉尘浓度•提高个人意识加强防护对降低尘肺病的发生至关重要画。不同来源的粉尘对机体的危害可能是不同的即使同类粉尘・其损害效应及损伤程度也不同•这主要与其理化特性及所含的成分有关网。庞德智等网认为,粉尘浓度及游离SiO2含量高的矿,尘肺病的发病率显著增高。有研究人员发现煤エ尘肺及矽肺病人MDA含量均升高，不同期别的煤工尘肺患者体内SOD和GSH-Px活力明显低于相应期别的矽肺患者・两类患者在脂质过氧化产生机制上可能有所不同，矽尘可诱导更加强烈的过氧化作用网。煤矽肺患者体内MDA和SOD均明显升高，且不同期别和工龄患者脂质过氧化水平明显不同，接触的煤尘量可能会影响煤矽肺的发生与发展卩”。在今后的研究中,分析煤尘浓度及其组成成分，可能会对了解煤エ尘肺病人体内的氧化应激状态有更重要的意义。HO-1能够促进血清IL-10升高,发挥抗炎作用,减轻肺组织炎性细胞浸润，从而抑制气道炎症网。它还可以通过抑制肺脏IL-17A/E的分泌,减轻哮喘小鼠气道炎症细胞浸润・发挥抗炎作用网。鲍文华【他等检测纤维化大鼠模型肺组织与血清中HO-1表达时，发现H0-1激活剂可有效抑制肺纤维化，而抑制剂可加重肺纤维化，HO-1在肺纤维化形成发展中起抑制作用。与此类似，TakashiSato等⑼也证实，HO-1的诱导物氯化血红素抑制矽尘暴露后引起的急性肺炎症，而其抑制物锌原吓琳可加大肺损伤进展。博莱霉素致纤维化动物模型中・H0-1过表达可阻止肺内胶原沉积,抑制纤维化进展并使呼吸道上皮细胞的凋亡降低阳］。在体外培养的成纤维细胞・研究发现H0-1过表达能阻止TNF-a诱导的细胞凋亡，外源性给予低剂量ー氧化碳也能阻止凋亡・一氧化碳的靶酶能够去除

37H0-1抑制的凋亡作用・认为HO-1可能通过其代谢产物一氧化碳介导的抗凋亡作用保护成纤维细胞免受损伤阳］。另有研究证实•HO-I水平降低可有效抑制纤维化大鼠TGF-P、总胆红素和羟脯氨酸水平，减少GSH消耗，但不能降低早期肺组织炎症细胞浸润，推测HO-I虽不参与早期炎症反应，但能通过氧化损伤和促纤维化作用推进纤维化进程网。多数研究指出，H0-I通过降低促炎因子水平、抑制细胞凋亡等机制发挥抗炎、抗氧化、抗损伤、抗纤维化作用。也有少数研究认为，H0-1发挥氧化损伤和促纤维化作用。NH2参与抗氧化作用，与气道炎症和氧化应激有关，可以预防和阻止肺纤维化。在我们的研究中，只观察了脂质过氧化和抗氧化指标血清浓度■并未涉及纤维化及炎症相关因子的检测，在今后的研究中同时检测HO-1'Nrf2、炎症及纤维化相共因子，可能对进一步了解H0-1和Nrf2在煤エ尘肺中抗炎，抗纤维化及抗氧化间的相互作用具有重要意义。在对不同接尘年限及各种肺部并发症的壹期CWP患者血清H0-1'Nrf2ヽT-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化的研究中，发现各指标含量变化不大，证实接尘年限和肺部并发症在煤エ尘肺的发生发展过程中对氧化应激指标水平无明显影响，说明氧化损伤可能不随接尘时间延长而加重，也不受并发肺部疾病的影响。在对壹期CWP吸烟与非吸烟患者血清H0-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO水平变化进行分析时发现，两组中H0-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO无明显差异，吸烟与非吸烟并未影响患者体内HO-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO的含量变化。慢性饮酒大鼠肺组织羟脯氨酸和结缔组织生长因子含量均升高，而谷胱甘肽含量降低，认为慢性饮酒可以使抗氧化物质减少，酒精是导致肺组织产生纤维化的因素之ー，而氧化应激可能是其主要的致病机制四】。我们的研究中，对CWP饮酒与非饮酒患者血清HO-1'Nrf2、T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO水平变化进行分析时发现，饮酒者HO-1'Nrf2和8-iso-PGF2a含量显著降低，饮酒可致氧化抗氧化水平下降而失衡，进而加重病情•可能与壹期CWP患者体内纤维化程度增加有关。壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量的Spearman相关性分析中显示，煤エ尘肺组中HO-!与Nrf2ヽ8-iso-PGF2a-Nrf2与8-iso-PGF2a-8-iso-PGF2a与LPO，T-AOC与LPO•均呈明显的正相关关系。H0-!与Nrf2'8-iso-PGF2a-Nrf2与8-iso-PGF2a在患者中均相关，说明三者关系密切，而反应氧化应激和脂质过氧化强弱的两个总指标T-AOC和LPO也相关，进ー步佐证了有些研究者得出的自由基使细胞脂质过氧化物增加的同时抗氧化物水平反应性升高的结论。壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2'T-AOC、8-iso-PGF2a'LPO含量与肺功能的Spearman相关性分析中显示，煤エ尘肺组中HO-1'Nrf2ヽT-AOCヽ8-iso-PGF2a'LPO与肺功能指标FEV1(%)'FVC(%)'FEV1/FVC(%)'MVV(%)之间均无明显的相关性，提示HO-1'Nr£2'T-AOC'8-iso-PGF2a和LPO

38含量的变化与肺功能改变无关。综上所述，在我们的研究中，CWP组中T-AOC较接尘组显著降低，而Nrf2'H0-1和8-iso-PGF2a浓度无明显变化，提示T-AOC可能会成为早期煤エ尘肺患者筛选的良好指标。CWP组与正常对照组相比，LPO升高约8.55倍，T-AOC升高约1.89倍，而接尘组与正常对照组相比，LPO升高约13.15倍，T-AOC升高约3.95倍，接尘组LPO和T-AOC的变化幅度明显较CWP组升高，认为接尘组中氧化应激程度较CWP组强烈。同时，两组中LPO升高较T-AOC升高明显，说明2组中氧化损伤作用占优势，可能加速了疾病进展。饮酒的CWP患者HO-l、Nrf2和8-iso-PGF2a显著降低・饮酒可致氧化抗氧化水平下降而失衡•进而加重病情，可能与病人体内产生纤维化有一定关系。由于本次研究对象CWP标本包括了许多合并COPD和肺气肿等病例，需要我们在今后的研究中扩大样本含量及临床信息，从多方面、多层次、多角度加以分析,观察这些指标的变化及意义。另外，本次实验例数相对较少且未能涵盖贰期和叁期患者・需要我们在今后的研究中扩大标本，更多地收集贰期和叁期及接触岩尘的矽肺病例•以便进ー步明确HO-l'Nrf2'T-AOCヽ8-iso-PGF2a和LPO在CWP不同发展时期中的变化，为CWP患者疾病严重程度及其病理分期提供临床依据。1.3结论壹期CWP患者血清HO-l'Nrf2ヽT-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量较接尘组均降低，但T-AOC含量降低明显，认为T-AOC在CWP的早期筛检中可能具有重要作用。与正常对照组相比，接尘组しPO和T-AOC的升高幅度明显高于CWP组，认为接尘组中氧化应激程度较CWP组强烈。同时，2组中しPO升高幅度均高于T-AOC•说明CWP患者和接尘工人体内氧化损伤作用占优势。壹期CWP饮酒患者血清HO-l'Nrf2和8-iso-PGF2a含量显著降低，提示CWP患者体内氧化应激指标水平的变化受饮酒影响。参考文献[1]CohenRAC,PatelA,GreenFHY.Lungdiseasecausedbyexposuretocoalmineandsilicadust[C].Seminarsinrespiratoryandcriticalcaremedicine,2008,29(6):651-661.[2]FubiuiB,HubbardA.Reactiveoxygenspccics(ROS)andreactivenitrogenspccics(RNS)generationbysilicaininflammationandflbrosis[J].FreeRadicalBiologyandMedicine,2003,34:1507-1516.[3]王玉珍,赵君庸.脂质过氧化产物检测方法概述[J].陕西医学检验,1998,13(2):62.[4]SehinsRPF,BormPJA.Mechanismsandmediatorsincoaldustinducedtoxicity:areview[J].AnnalsofOccupationalHygiene,1999,43(1):7-33.

39[1]ChanK,KanYW.Nrf2isessentialforprotectionagainstacutepulmonaryinjuryinmice[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1999,96(22):12731-12736.[2]YeQ,DalavangaY,PoulakisN,etal.Decreasedexpressionofhaemoxygenase-1byalveolarmacrophagesinidiopathicpulmonaryfibrosis[J].EuropeanRespiratoryJournal,2008,31(5):1030-1036.17JKosmiderB,MessierEM,JanssenWJ,etal.Nrf2protectshumanalveolarepithelialcellsagainstinjuryinducedbyinfluenzaAvirus[J].Respiratoryresearch,2012,13(1):43.[8JMiyazakiKirinoY,TakenoM,etal.Expressionofhemeoxygenase-1inhumanleukemiccellsanditsregulationbytranscriptionalrepressorBach1[J].Cancerscience,2010,101(6):1409-1416.[9I邱俏檬,郑金韬,南超,等.NRF2基因启动子•617C/A基因多态性对内毒素介导巨噬细胞炎症反应的影响[J]中华医学杂志,2013,93(14):1114-1117.[10]ReddyNM,KleebergerSR,ChoHY,etal.DeficiencyinNrf2-GSHsignalingimpairstypeIIcellgrowthandenhancessensitivitytooxidants[J].Americanjournalofrespiratorycellandmolecularbiology,2007,37(1):3-8.[11]范红敏,袁聚祥,秦天榜,等.8项氧化损伤指标筛检煤エ尘肺患者作用比较卩].中国职业医学,2011,38(4):298-301.[12I梁芳倩,孙尧.酗酒对心功能和血清中8异前列腺素F2a及过氧化氢酶含量的影响卩].中国询证心血管医学杂志,2012,4(6):561-563.[13]谢科华,邓平.8ー异前列腺素F2a与氧化应激损伤性疾病卩].中国医药导刊,2010,12(3):429451.[14]牟海英,马静.8-异前列腺素F2a与氧化应激损伤性疾病的研究进展[J].国外医学:卫生学分册,2007,34(6):377-381.[15]李永霞,陈敏,钟红,等.支气管哮喘患者血清中8-异前列腺素水平的研究卩].中国呼吸与危重监护杂志,2010,9(6):598-601.[16]李爱敏,袁雅冬.特发性肺纤维化患者血清MDA水平与PCII!和LN的相关性卩].军医逬修学院学报,2011,32(3):261-262.[17]赵道昆,缪荣明.氧化应激反应在矽肺发病中的作用卩].职业与健康,2012,28(15):1818-182〇.[18]李云晖,浦跃朴,仲伟鉴,等.煤烟对大鼠肺细胞氧化性损伤作用途径的探讨[J].环境与健康杂志,2002,19(3):181-182.[19]KikuchiN,IshiiY,MorishimaY,ctal.Nrf2protectsagainstpulmonaryfibrosisbyregulatingthelungoxidantlevelandThl/Th2balancc[J].RcspirRes,2010,11:31.[20]管淑红,郑金旭,万兵,等.血红素加氧酶-1参与博菜霉素致大鼠肺纤维化机制卩].中国现代医学杂志,2009,19(1):50-54.

40[13]肖昕.8ー异前列腺素F2c(及其在新生儿缺氧缺血性脑损伤中的作用卩].中国小儿急救医学,2007,14(4):355-357.[14]刘保连,姚汝林,田琳,等.煤石英对大鼠肺泡巨噬细胞氧化系统的影响[J].中国公共卫生学报,1995,14(6):361-363.[15]吕国オ,姚金梅,张娟文,等.血清氧化功能检测在矽肺患者中的意义叫.中华劳动卫生职业病杂志,2010,28(1):52-53.[16]KaurS,GillMS,GuptaK,ctal.Effectofoccupationonlipidperoxidationandantioxidantstatusincoal-firedthermalplantworkcrs[J].InternationalJournalofAppliedandBasicMedicalResearch,2013,3(2):93.[25I郭维新,陈锦,李跃平.煤矿粉尘接触和人群脂质过氧化水平的观察[J].职业医学.]999,26(2):6-8.[26I陈健,戴爱国,胡瑞成,等.支气管哮喘豚鼠BALF炎症细胞中PPARy、Nrf2和y-GCS-h表达的变化[J].中国病理生理杂志,2010,26(4):760-765.[27]ChoHY,ReddySPM,YamamotoM,etal.ThetranscriptionfactorNRF2protectsagainstpulmonaryfibrosis[JJ.TheFASEBjournal,2004,18(11):1258-1260.[28]焦素敏、李云,钟礼立.血红素氧合酶-1与气道炎性反应卩].医学综述,2007,13(3):170-172.[29I张海英,邹伟明,李慧祺,等.染尘巨噬细胞上清液对人胚肺成纤维细胞应激蛋白诱导表达[J].中国职业医学,2008,35(2):105-107.[30]张颖轶,缪荣明.氧化应激反应在矽肺发病中的影响及临床研究[J].职业与健康,2012,28(6):641443.[31]杨晓光,彭珊茁,李迎旭,等.矽肺患者脂质过氧化和抗氧化能力的调查分析卩].职业与健康.2005,21(12):1895-1896.[32]王虹,王静,王艳斌,等.血红素加氧酶-1调节哮喘豚鼠的氧化-抗氧化失衡卩].中国小儿急救医学,2011,18(3):246-248.[33I曲双翼.黄文丽.煤エ尘肺防治研究进展[J].国外医学医学:医学地理分册,2012.33(3):218-22〇.[34]鲍含诚.矿山粉尘与相关疾病[M].北京:煤炭工业出版社,1999:1-5.[35]庞德智,宋志方,李少奎,等.煤矿粉尘成分与煤工尘肺的关系卩].中国煤炭工业医学杂志,2008,11(3):390-393.[36]张明先,吴顺模,张博文,等.矽肺和煤エ尘肺患者脂质过氧化状态的比较研究叫.中华劳动卫生职业病杂志,2001,19(1):68-69.[37]俞维,朱玲勤,刘志宏.煤矽肺患者红细胞脂质过氧化的研究[J].宁夏医学杂志,2002,24(12):747-748.[38]蔚京京,钟文伟,须丽清,等.血红素加氧酶-1介导Tr!细胞在哮喘动物模型中的免疫调节作用[J].临床儿科杂志,2009,27(1):67-71.[39]蔚京京,范国权.血红素加氧酶-1抑制哮喘小鼠!L-I7分泌的抗炎机制研究卩].山西医科大学学报,2012,43(6):415-419.

41[34]鲍文华,石峰,刑继强.血红素氧合酶ーl/ー氧化碳系统在肺纤维化大鼠中的表达及药物干预卩].中国实用医药,2008,3(15):39-41.[35]SatoT,rakenoM,HonmaK,etal.Hemeoxygenase-1,apotentialbiomarkerofchronicsilicosis,attenuatessilica-inducedlunginjury[J].Americanjournalofrespiratoryandcriticalcaremedicine,2006,174(8):906-914.142JTsubura】f,SuzukiM,NagashimaY,etal.Adenovirus-mediatedtransferandoverexpressionofhemeoxygenase1cDNAinlungpreventsbleomycin-inducedpulmonaryfibrosisviaaFas-Fasligand-independentpathway[J].HumanGeneTherapy,2002,13(16):1945-1960.[43]PetracheI,OtterbeinLE,AlamJ,etal.Hemeoxygenase-1inhibitsTNF-a-inducedapoptosisinculturedfibroblasts[J].AmericanJournalofPhysiology-LungCellularandMolecularPhysiology,2000,278(2):L312-L319.[44I于洪志,吴琦,杜钟珍,等.慢性饮酒引起大鼠肺组织损伤及肺纤维化身.中国呼吸与危重监护杂志,2012,11(4):367-370

42第2章综述HO-1和Nrf2在氧化/抗氧化肺部疾病中的研究进展肺部疾病发病机制复杂・最近的研究发现•除免疫反应外还存在氧化/抗氧化失衡。经典的酶抗氧化系统能够减轻氧化应激引起的肺损伤，但发挥作用的程度及方式仍不足。血红素氧合酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)是新近发现的ー种最广泛存在的抗氧化酶，通常呈低水平表达，当受到伤害性刺激后水平可明显升高，在肺的适应性和保护性反应中起着重要作用。核因子E2相关因子2(NF-E2-relatedfactor2,Nrf2)又称红系衍生核因子相关因子2，位于抗氧化酶的上游起到感受器的作用氧化应激条件下，它水平的变化可能先于超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶。有研究发现，№12缺乏可使鼠肺中HO-1等解毒酶的表达下降•HO-1的表达受Nrf2调控⑴。本文对二者在氧化/抗氧化肺部疾病中的作用作ー综述。2.1H0-1和Nrf2分子结构、来源及生物学功能人体HO-!蛋白由288个氨基酸组成，分子量为32000。HO-!基因定位于人第22号染色体长臂1区2带，包括5个外显子和4个内含子。有一个启动子、ー个近端增强子和两个远端增强子，这些区域含有许多转录因子如Nrf2的结合位生理状态下,HO-1主要分布于单核-巨噬细胞系统的微粒体中，在神经元'肝脏、脾脏中浓度较高而又以脾脏组织活动最高・约为肝脏的10倍。肺中HO-1主要在肺泡巨噬细胞中表达，在上皮细胞中偶见表达•在淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、肥大细胞及浆细胞中均未见表达⑶。HO-1亦称热休克蛋白32，属微粒体酶，是血红素氧合酶同工酶之一・为诱导型血红素氧合酶・能被多种能够产生氧化应激的因素如炎性细胞因子、高热、重金属、紫外线照射、血红素等所激活，以减轻细胞损伤、蛋白质氧化及脂质过氧化。而且•HO-1对成纤维细胞、血管内皮细胞、肝细胞、肾上皮细胞和心肌细胞等多种细胞具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗增殖的保护作用。Nrf2是ー个由2.2Kb的碱基对编码,相对分子质量为66000的蛋白。人类Nrf2基因位于2号染色体长臂3区1带，含有6个不同的同源结构域。Nrf2主要表达于如肝脏、肾脏等代谢和解毒组织中以及ー些持续暴露在环境中的组织如皮肤、消化道、肺等，普遍表达于各种细胞。Nrf2在肺中主要表达

43于巨噬细胞和上皮细胞⑶。生理条件下，胞浆中的Nrf2处于不断降解状态,以维持细胞内平衡。当受到氧化应激刺激时，Nrf2的稳定性增加并被激活，转移入核•和相应蛋白形成二聚体，这种复合物通过顺式作用DNA元件激活HO-1基因的转录⑶。体外研究称，人Nrf2基因多态性对内毒素刺激后巨噬细胞中的Nrf2蛋白和基因表达有显著影响，并对巨噬细胞炎症反应平衡有重要的调控作用⑸。在对鼠肺泡I!型上皮细胞的增殖与分化的研究中也发现，Nrf2ノー细胞中活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)水平较Nrf2+/+细胞高，而抗氧化物谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平低下，认为口型细胞中Nrf2缺陷可使ROS水平升高，GSH水平下降⑹。2.1HO-1和Nrf2在哮喘中的作用在哮喘大鼠模型研究中，通过免疫组化染色法对H0-1蛋白进行半定量分析、RT-PCR法检测HO-1mRNA水平以及测定全血碳氧血红蛋白的方法评估HO-1活性，发现哮喘大鼠肺组织HO-1阳性细胞百分比、基因表达光密度比值及全血碳氧血红蛋白的百分比含量显著增高，而且HO-1的蛋白和基因表达水平均与HO-1活性呈正相关，认为HO-1可能参与哮喘的发病⑺。小鼠哮喘模型中，HO-1通过诱导Tri细胞，上调CD4+调节性T细胞内IL-10的表达，进ー步促进血清IL-10升高，发挥抗炎作用，减轻肺组织炎性细胞浸润，从而抑制气道炎症囘，说明哮喘中HO-1发挥抗炎作用与促进抗炎因子IL-10表达增加有关。HO-1还可以通过抑制肺脏IL/7A/E的分泌,减轻哮喘小鼠气道炎症细胞浸润，发挥抗炎作用⑼。此外,在药物研究中证实，乌司他丁可能是通过HO-1下调ROS水平，提高超氧化物歧化酶、GSH'过氧化氢酶、总抗氧化能力等抗氧化指标水平，降低气道炎症反应来发挥对哮喘小鼠的治疗作用［⑼。朱云福等""在研究Nrf2调节y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(y-glutamylcysteinesynthetase,y-GCS)转录、蛋白表达和对其活性影响时发现，哮喘豚鼠肺内Nrf2的蛋白表达和y-GCSmRNA、蛋白表达及活性均升高,认为肺内Nrf2蛋白表达上调可使其下游的抗氧化基因y-GCS的mRNA和蛋白表达升高，从而提高y-GCS的活性°他们最近在〔⑵对哮喘豚鼠肺组织中激活转录因子4(activatingtranscriptionfactor4,ATF4)、Nrf2和y-GCS的蛋白及mRNA表达进行分析时又发现，肺组织中ATF4'Nrf2'y-GCS的蛋白及mRNA表达均降低,而且均与ROS含量呈负相父・认为哮喘模型中Nrf2降低后不能与ATF4形成异二聚体,进而导致y-GCS的表达降低，加重炎症反应。对哮喘豚鼠支气管肺泡灌洗液的研究中发现，炎症细胞中Nrf2和y-GCS的mRNA及蛋白表达均下降，而浸润的嗜酸性粒细胞和巨噬细胞增加,认为炎症细胞中Nrf2和y-GCS的表达降低促进了氧化应激进ー步恶化ゆ。2.2H0-1和Nrf2在慢性阻塞性肺疾病中的作用通过慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)吸烟患者支气

44管黏膜活检标本中H0-1表达及肺功能研究中发现・支气管黏膜中H0-1的表达水平升高且与一秒用カ呼气量呈负相矣・说明随着气流受限程度加重•气道黏膜HO-1的表达增加〔用。Maestrelli等【⑸却发现COPD患者肺泡巨噬细胞中H0-1表达明显降低，肺泡壁细胞中诱导型ー氧化氮合酶明显升高・且H0-!与诱导型ー氧化氮合酶呈负相关，认为它们在疾病中发挥的作用不同，二者之间的失衡与COPD患者严重损伤及发展有关。研究中H0-1表达水平不一致的原因，可能与研究对象疾病严重程度不同有关。此外高吸烟指数的COPD患者HO-1基因启动子大量重复序列的基因频率显著升高，长期大量吸烟且带有HO-1启动子大量重复序列的人群对COPD的易感性也明显增加［⑹。有报道称，带有大量重复序列的H0-!基因型个体更易发展成极为严重的COPD•而无此基因型的个体易患轻度COPD［I7］。ー些COPD患者HO-1表达下降，是由于HO-1基因启动子区域大量重复序列降低了氧化应激对H0-1基因的诱导性表达1网,从而使部分个体对氧化损伤的防御机制降低所致。肺气肿是COPD的主要病因。Rangasamy等U刃用烟雾刺激Nrf2-/-鼠研究中发现・缺陷鼠较野生鼠肺组织内皮细胞和II型上皮细胞凋亡增加，肺内氧化应激标志物增多，支气管肺泡灌洗液中炎症细胞总数增加，证明Nrf2在肺气肿的易感性方面起着关键的决定作用。有研究加用药物刺激Nri2缺陷鼠可使肺气肿明显加重・其严重程度与给药早期肺炎症程度密切相关•而且抗氧化剂和抗蛋白酶基因显著降低。当Nrf2缺陷被纠正后・能够阻碍早期肺炎症和肺气肿・发现症状的改善与巨噬细胞中抗蛋白酶及抗氧化剂基因表达升高密切相关・认为Nrf2通过上调抗蛋白酶及抗氧化基因减轻肺气肿炎症。而又有研究人员发现烟雾诱导的Nrf2缺陷鼠肺内抗氧化和抗炎基因的诱导表达降低，支气管肺泡灌洗液中炎症细胞浸润明显・巨噬细胞介导的中性粒细胞的清除作用减轻,中性粒细胞弹性蛋白酶活性增强，从而指出Nrf2不仅是通过调节氧化/抗氧化平衡，而且也调节炎症和蛋白酶/抗蛋白酶平衡来防御肺气肿的发展【2U。2.1H0-1和Nrf2在急性肺损伤中的作用有报道显示，经HO-1诱导剂预处理的急性肺损伤小鼠模型，其肺组织中HO-!蛋白高表达•TNF-a和!L-6的表达水平下降，推测急性肺损伤中HO-1通过降低相关促炎因子水平缓解肺损伤程度团。而经HO-!特异性阻断剂预处理的急性肺损伤大鼠・肺中HO-1mRNA表达受抑制，同时・血中H0-1的活性降低，组织损伤和细胞凋亡增加。HO-1表达下调可使组织损伤和凋亡加重，认为HO-1表达上调有助于抑制细胞凋亡・减轻肺损伤网。谭泽龙等凶的研究中也发现,H0-!诱导剂能减轻药物对肺泡!!型上皮细胞的损伤・其抑制剂能增加其对上皮细胞的损伤・证明肺内HO/高表达对急性肺损伤有保护效应。Reddy等財给予Nrf2缺陷鼠以GSH补充治疗时发现・GSH能显著提高其从高氧诱导的肺损伤中恢复的能力，认为Nrf2能调节转录反应尤其对GSH起作用，当Nrf2-GSH途径

45功能异常时可能会损害肺组织修复和炎症消退能力。在肺损伤模型中证实,依布硒琳可改善肺组织气体交换、减轻肺水肿、抑制脂质过氧化反应,发挥保护作用•可能是通过提高肺组织内Nrf2蛋白表达水平实现因］。此外,皂荚的果壳能降低脂多糖诱导的大量炎症细胞浸润后的肺泡壁增厚•还能降低支气管肺泡灌洗液中总炎症细胞和中性粒细胞数量，其抗炎作用可能是因为激活NH2并诱导NH2调节基因所致印1。Nrf2-/ー鼠对丁羟甲苯及其易感，即使给Nrf2-/ー鼠可耐受剂量，Nrf2-/・鼠由于Nrf2缺失，引起过氧化氢酶、血红素氧合酶ー1，超氧化物歧化酶1等解毒酶表达降低.使药物毒性得以提升,导致小鼠死亡四。2.1HO-1和Nrf2在肺癌中的作用研究发现，肺腺癌和鳞癌细胞株中H0-1表达增高，与血管内皮生长因子的表达增高相关•提示H0-1通过促进血管内皮生长因子表达而使内皮细胞增殖，促进血管生成•从而影响癌细胞生长和转移四。利用H0-1载体转染肺腺癌细胞株后，HO-1过量表达，细胞迁移和侵袭カ增强而HO-1的表达受抑制时，细胞迁移和侵袭カ下降。而且高表达H0-1的非小细胞肺癌患者较低表达H0-1的患者生存率低，提示H0-1表达升高与肺癌预后不良高度相关即］。还有报道显示，肺癌细胞经HO-!抑制剂联合X线辐射处理后，生存率显著降低且凋亡百分率增加，证明HO-1低表达可提高肺癌细胞对放射线的敏感性〔可。耐化疗药肺癌细胞中H0-1表达显著升高，认为H0-1与癌细胞耐药密切相父可能通过抑制细胞凋亡介导耐药网。在对非小细胞肺癌患者Nrf2基因外显子测序时发现・检测到的Nrf2突变与患者临床及病理学特征相关有助于癌细胞存活和生长，且Nrf2基因变种和肺癌高风险相关网。倪静等学】也认为肺癌组织NrfZ蛋白表达与有无淋巴结转移、是否侵及胸膜，临床分期等有关其异常表达与肺癌发生发展存在一定关系。药物研究中发现・耐化疗药的人肺腺癌细胞中Nrf2mRNA表达增加，其调节的抗氧化酶基因表达升高，多药耐药基因的表达下降,№£2高表达可能参与了人肺癌细胞耐药现象的产生使细胞更好的适应药物环境，介导细胞耐药図】。高Nrf2活性的肺癌细胞中，抑制Nr£2的功能，就能够抑制细胞增殖和抗癌药物的耐药性。抑制Nrf2活性同时联合抗肿瘤药物可能会成为ー种新的肺癌治疗方法阳。回顾性研究显示，晚期非小细胞肺癌患者肺组织内Nrf2蛋白表达阳性率升高与患者年龄增加、转移部位有关Nrf2表达阴性患者接受化疗方案后预后较好，认为Nrf2的表达可能是预测晩期非小细胞肺癌化疗疗效的理想指标国］。2.2HO-1和Nrf2在肺纤维化中的作用鲍文华班等检测纤维化大鼠模型肺组织与血清中ho/表达时，发现HO-1激活剂可有效抑制肺纤维化，而抑制剂可加重肺纤维化，HO-1在肺纤维化形成发展中起抑制作用。与此类似，Sato等网也证实・H0-1的诱导物氯化血红素抑制矽尘暴露后引起的急性肺炎症，而其抑制物锌原叶琳

46可加大肺损伤进展•博莱霉素致纤维化动物模型中，H0-!过表达可阻止肺内胶原沉积，抑制纤维化进展并使呼吸道上皮细胞的凋亡降低阴。在体外培养的成纤维细胞，研究发现H0-!过表达能阻止TNF-a诱导的细胞凋亡，外源性给予低剂量一氧化碳也能阻止凋亡，ー氧化碳的靶酶能够去除H0-1抑制的凋亡作用，认为H0-1可能通过其代谢产物ー氧化碳介导的抗凋亡作用保护成纤维细胞免受损伤【啊。在对特发性肺纤维化的研究中发现・患者支气管肺泡灌洗液巨噬细胞中H0-1蛋白表达及H0-1阳性巨噬细胞百分率明显降低・并且与IL-12和IL-18低表达有关，认为H0-1低表达可能与促进纤维化的细胞微环境有关⑵。另有研究证实，hO/水平降低可有效抑制纤维化大鼠TGF-Pヽ总胆红素和羟脯氨酸水平，减少GSH消耗，但不能降低早期肺组织炎症细胞浸润，推测HO-!虽不参与早期炎症反应，但能通过氧化损伤和促纤维化作用推进纤维化进程⑷1。Cho网等的研究中，博莱霉素诱导的肺纤维化模型中，发现Nrf2-/ー鼠肺水肿及胶原沉积严重，肺泡灌洗液中炎症细胞及上皮细胞明显增加，纤维增生和肺损伤重塑标志物大量积聚，而肺内靶基因mRNA和蛋白表达水平经药物诱导后波动不大，提示Nrf2靶向敲除可极大提高鼠对博莱霉素诱导的肺炎症和纤维化的易感性，N您调节的抗氧化防御酶可能对博莱霉素诱导的纤维化起保护作用。另有研究网发现致纤维化药物使Nr£2-/-鼠生存率降低，肺纤维化评分及氧化应激指标8ー异前列腺素水平升高，HO-1mRNA表达水平显著降低•IL-4和IL-13的mRNA表达明显升高，Thl/Th2平衡向Th2方向移动，认为Nrf2可能影响T细胞的分化和细胞因子产生・并通过调节细胞氧化还原水平及Thl/Th2平衡对抗肺纤维化进程。2.1%语综上所述，对于氧化/抗氧化肺部疾病,多数研究指出・H0-1通过降低促炎因子水平、抑制细胞凋亡等机制发挥抗炎、抗氧化、抗损伤、抗纤维化作用»也有少数研究认为，HO-!发挥氧化损伤和促纤维化作用。№12参与抗氧化作用，与气道炎症和氧化应激有关•可以预防和阻止肺纤维化。由于不同肺部疾病发病机制各异，氧化损伤程度不同，Nrf2和HO-1在疾病中的作用及强度也可能不同，纠正氧化/抗氧化失衡，能够减轻疾病症状。因此,明确对HO-1'Nrf2之间抑制、激活等的调控方式，可能会有助于探明氧化/抗氧化肺部疾病的发病机制.并且为疾病提供ー种理想的预防和治疗手段。参考文献[1]ChanK,KanYW.Nrf2isessentialfbrprotectionagainstacutepulmonaryinjuryinmice[JJ.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1999,96(22):12731-12736.[2]YeQ,DalavangaY,PoulakisN,etal.Decreasedexpressionofhaemoxygenase-1byalveolarmacrophagesinidiopathicpulmonaryfibrosis[J].EuropeanRespiratoryJournal,2(X)8,31(5):1030-1036.

47[1]KosmiderB,MessierEM,JanssenWJ,etal.Nrf2protectshumanalveolarepithelialcellsagainstinjuryinducedbyinfluenzaAvirus[J].Respiratoryresearch,2012,13(1):43.[2]MiyazakiT,KirinoY,TakenoM,etal.Expressionofhemeoxygenase-1inhumanleukemiccellsanditsregulationbytranscriptionalrepressorBach1[J].Cancerscience,2010,101(6):1409-1416.[3]邱俏檬,郑金韬,南超,等.NRF2基因后动子W17C/A基因多态性对内毒素介导巨噬细胞炎症反应的影响[J].中华医学杂志,2013,93(14):1114-1117.[6JReddyNM,KleebergerSR,ChoHY,etal.DeficiencyinNr£2-GSHsignalingimpairstype11cellgrowthandenhancessensitivitytooxidants[J].Americanjournalofrespiratorycellandmolecularbiology,2007,37(1):3-8,[7I徐璇,钟礼立,焦素敏,等.大鼠哮喘模型肺组织血红素氧合酶蛋白及基因表达卩].中国医师杂志,2008,10(8):1021-1024.[8I蔚京京,钟文伟,须丽清,等.血红素加氧酶ー1介导Tri细胞在哮喘动物模型中的免疫调节作用卩].临床儿科杂志,2009,27(1):67-71.[9]蔚京京,范国权.血红素加氧酶-1抑制哮喘小鼠1L-17分泌的抗炎机制研究卩].山西医科大学学报,2012,43(6):415-419.[10I宋冬梅,刘刚,牛英豪,等.乌司他丁对支气管哮喘小鼠氧化应激及血红素加氧酶ー1的影响[J].中隼结核和呼吸杂志,2013,36(3):225-226.[11]朱运福,戴爰国,胡瑞成.支气管哮喘豚鼠肺组织中Nrf2对y-GCS的作用卩].中国应用生理学杂志,2006,22(4):492-495.112]彭文芳,戴爱国,胡瑞成.激活转录因子」协同核因子相关因子-2调控ア-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚基的表达对支气管哮喘豚鼠的影响卩].中华结核和呼吸杂志,2012,35(3):216-218.[13l陈健,戴爰国,胡瑞成,等.支气管哮喘豚鼠BALF炎症细胞中PPARy'Nrf2和y-GCS-h表达的变化卩].中国病理生理杂志,201〇.26(4):760-765.[14I李巧荣,吴大玮,杨蕾,等.慢性阻塞性肺疾病患者支气管黏膜活检标本中HO-!和iNOS的表达卩].中国老年学杂志,2011,31(14):2616-2618.[15]MacstrclliP,PaskaC,SacttaM,ctal.Decreasedhaemoxygenase-1andincreasedinduciblenitricoxidesynthaseinthelungofsevereCOPDpaticnts[J].EuropeanRespiratoryJournal,2003,21(6):971-976.[116]马志明,张珍祥,韩泽民,等.HO-1基因巨动子微卫星多态性与COPD易感性的研究卩].西安外事学院学报,2007,3(1):97-101.[117]FuW,ZhaoZ,FangL,etal.Memeoxygenase-1polymorphismassociatedwithseverityofchronicobstructivepulmonarydisease卩].CHINESEMEDICALJOURNAL-BEU[NG-ENGLISHEDITION-,2007,120(1):12.

48[116]YamadaN,YamayaM,OkinagaS,etal.Microsatellitepolymorphisminthehemeoxygenase-1genepromoterisassociatedwithsusceptibilitytoemphysema[J].TheAmericanJournalofHumanGenetics,2000,66(1):187-195.[117]RangasamyT,ChoCY,ThimmulappaRK,etal.GeneticablationofNrf2enhancessusceptibilitytocigarettesmoke-inducedemphysemainmice[J].JournalofClinicalInvestigation,2004,114(9):1248-1259.[118]IshiiY,ItohK,MorishimaY,etal.TranscriptionfactorNrf2playsapivotalroleinprotectionagainstelastase-inducedpulmonaryinflammationandemphysema[J].TheJournalofImmunology,2005,175(10):6968-6975.[119]IizukaT,IshiiY,ItohK,etal.Nrf2-deficientmicearehighlysusceptibletocigarettesmoke-inducedemphysema[J].GenestoCells,2005,10(12):1113-1125.[120]张建武,邢志伟.HO-1的诱导表达对急性肺损伤小鼠TNFセ和1L-6的影响[J].现代中西医结合杂志,2010,19(22):2746-2747.[23I徐鑫荣,刘少华,马可，等.阻断血红素氧合酶ー1对急性肺损伤大鼠肺细胞凋亡及损伤的影响[J].基础与情床研究,2006,13(2):68-70.[24]谭泽龙,陈淼,曹海军,等.血红素加氧酶-1对急性肺损伤大鼠肺泡II型上皮细胞的保护作用[J].临床麻醉学杂志，2012,28(4):406408.[25]ReddyNM,KleebergerSR,KenslerTW,etal.DisruptionofNrf2impairstheresolutionofhyperoxia-inducedacutelunginjuryandinflammationinmice[Jj.FheJournalofImmunology,2009,182(11):72647271.[26I吴海青,李涛平,田芳・依布硒咻对大鼠脂多糖诱导的急性肺损伤的保护作用.国际药学研究杂志[J],2012,39(4):325-329.[27]ChoiJY,KwunMJ,KimKH,ctal.ProtectiveEffectoftheFruitHullofGlcditsiasinensisonLPS-InduccdAcuteLungInjuryIsAssociatedwithNrf2Activation[J].Evidence-BasedComplementaryandAlternativeMedicine,2012,2012:1-11.[28]ChanK,KanYW.Nrf2isessentialfbrprotectionagainstacutepulmonaryinjuryinmice[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1999,96(22):12731-12736.[29J王淑云,王玲,李栋,等.血红素加氧酶.1在人肺癌细胞中的表达及其对血管生成因子的影响[J].山东大学学报,2011,49(12):21-24.[30]TsaiJR,WangHM,LiuPL,etal.Highexpressionofhemeoxygenase-1isassociatedwithtumorinvasivenessandpoorclinicaloutcomeinnon-smallcelllungcancerpatients[J].CellularOncology,2012,35(6):461-471.[31]ZhangW,QiaoT,ZhaL.Inhibitionofhemeoxygenase-1enhancestheradiosensitivityinhumannonsmallcelllungcancera549cells[J].CancerBiotherapyandRadiopharmaceuticals,2011,26(5):639-645.[32]张凯茹,闫惠琴,王燕,等.Nrf2及其靶基因在人肺腺癌A549顺柏耐药细胞株中的表达和意义[J].中国肺癌杂志,2009,12(11):1150-1154.[33]HuY,JuYF,LinDM,etal.MutationoftheNrf2geneinnon-smallcelllungcancer[J].MolecularBiologyReports,2012,

4939(4):4743-4747.[30]倪静,秦丽娟,吴拥军,等.肺癌组织中Nrf2、Keapl和NQO1蛋白的表达[J].郑州大学学报,2012,47(4):456-459.[31]HommaS,IshiiY,MorishimaY,etal.Nrf2enhancescellproliferationandresistancetoanticancerdrugsinhumanlungcanccr[J].ClinicalCancerResearch,2009,15(10):3423-3432.[32]曹宝山,朱翔,尹文理,等.核因子E2相关因子2表达对晩期非小细胞肺癌一线含柏化疗疗效及预后影响的研究[リ.肿瘤,2012,32(11):919-924.[37I鲍文华,石峰,刑继强.血红素氧合酶ー1/ー氧化碳系统在肺纤维化大鼠中的表达及药物干预卩].中国实用医药,2008,3(15):39-41.[38]SatoT,TakenoM,HonmaK,etal.Hemeoxygenase-1,apotentialbiomarkerofchronicsilicosis,attenuatessilica-inducedlunginjury[J].Americanjournalofrespiratoryandcriticalcaremedicine,2006,174(8):906914.[39]TsuburaiT,SuzukiM,NagashimaY,etal.Adenovirus-mediatedtransferandoverexpressionofhemeoxygenase1cDNAinlungpreventsbleomycin-inducedpulmonaryfibrosisviaaFas-Fasligand-independentpathway[J].HumanGeneTherapy,2002,13(16):1945-1960.[40]PetracheI,OtterbeinLE,AlamJ,etal.Hemeoxygenase-1inhibitsTNF-a-inducedapoptosisinculturedfibroblasts[J].AmericanJournalofPhysiology-LungCellularandMolecularPhysiology,2000,278(2):L312-L319.[41]管淑红,郑金旭,万兵,等.血红素加氧酶.1参与博莱霉素致大鼠肺纤维化机制卩].中国现代医学杂志,2009,19(1):50-54.[42]ChoHY,ReddySPM,YamamotoM,etal.ThetranscriptionfactorNRF2protectsagainstpulmonaryfibrosis[J].TheFASEBjournal,2004,18(11):1258-1260.[43]KikuchiN,Ishii,匕MorishimaY,etal.Nrf2protectsagainstpulmonaryfibrosisbyregulatingthelungoxidantlevelandThl/Th2balancc[J].RcspirRes,2010,11:31.

50テー侬度TIAOC侬席will)3000-20.00-II除尘组正常对照组NN2浓度33:1)12.00-10^0-3OT-6D0-4.00—2加一OJDO-丄丄丄CIP组接尘组正禽时照组25.00-加加一15D0-10X)0-sm-OXM)-CTP组)40.00-，ゝ(d)120.00-)00.00-80JD0-600040.00-20D0-0JD0-8JSOIPGF2。浓度(pg'ml)CW悽生館正常对照俎丨ー「「隹尘组正常对照组LPO浓度(g。ー、ー)20.00-15.0010.005.00—0.00-C怔组接尘组正常对照组图1壹期CWP患者血清HO-1'Nrf2ヽT-AOC'8-iso-PGF2a和LPO含量变化

51WDQ-25JDO-20JD0-15.0010.00-12.00-5M-エDDD一Irフ年2510年30年~NX2X.厘(&L)10.00-8所6DD-4JDO-2JD0-QJOO-I-フ年-I-2510年30年~15.0010.00-5J&Q-DDD一ゝ5年2570年30年~.40JD0-hユJDO-5,您JDO-V”賦常汨期律„，施3:其如-0.00-年年(e)方5年25、0年30年~14,00-12.00-10.00—8D0-6。。ー4JDO一2130-DM-图2不同接尘年限壹期CWP患者血清中H0-1、Nrf2ヽT-AOCヽ8-iso-PGF2a和LPO含量变化

52T-AOC浓度c,ml)30D0-2500200015.00----№00ODD050Holl津度______3m皿wmmRrf2浓度15D0-10D0-5P并发!ICIP并发髄华纯Z股组用髓组气冲组DW-C股并发慢CWP并发肺单雙CRP组阴肿组气肿组8「aolpGF2”洋度行へ.ジー)C阻并发毘CWP并发肺单凭而组阴肺组气肿燃E中・裳」演・肺史境:・，切阻肺组ヘ肿更LP。涼/?(8。一Z1)HXJ0-12JOO-10D0-88600-4D0-2D0-0D0-C册并发像C联并发肺単变C管组阻肺组气肿组图3壹期CWP并发肺部疾病组与单纯壹期CWP组血清中HO-1'NrCヽT-AOCヽ8-iso-PGF2a和LPO含量变化

5330D0-25DO-20P0--ー__DDDDM母f。Holl涼度?、Ml)12D0-10D0-一ー.ーーmNmm而Nzf2浓度ャく120典r3才100闾ー::W.W

54Holl浓度f30加一25.00-20.加一15.0010.00-5D0-〇加一I-饮酒组T-I~非饮酒组NKf2em)40.00TIAOC侬度20.00-15.00-J0.00-5D0-0D0一3—isolpGF20浓度(pg'ml))20.00)00.00-30D0-60D0-40.00-20D0-〇。〇ーェ堪LPO浓度一、一)14.0012.0010.00800-6JOO-4.00—2.00000—

55饮酒组非饮酒组图5壹期CWP饮酒患者血清中HO-1'Nrf2、T-AOCヽ8-iso-PGF2a和LPO含量变化Fig.5ThechangesofserumHO-1,Nr2T-AOC,8-iso-PGF2aandLPOindrinckingpatientswithstageICWP

56致谢衷心感谢我的导师袁宝军教授!三年来在课题设计、实验实施、分析及论文撰写等方面给予的悉心指导，三年来我走的每一步都离不幵导师的支持和鼓励。导师严谨的治学态度、ー丝不苟的工作作风、开放务实的科学思维方式、坦荡的胸怀、勇于探索的开拓精神，使我感到由衷地钦佩，激励我不断进取。无论从学识上还是做人的品德方面都是我努力奋斗追求的目标。在此谨向我的导师致以最诚挚的谢意!本课题是在河北联合大学附属开滦医院完成的，感谢医院领导对本课题的大力支持。感谢我的导师袁宝军主任对我学术上的指导、工作上的支持、生活上的关心。感谢邹吉敏老师在实验过程中给予的帮助。在实验过程中以及标本的收集、保存得到了我的师姐李超、王冬梅的无私帮助，在本课题的完成过程中得到了高利常的大力支持和无私帮助•在此表示深深的谢意。同时感谢检验科全体同事给予的支持和鼓励。感谢开滦医疗集团钱营职业病医院领导及检验科马主任及科室全体工作人员的无私帮助。感谢徐厚军、武建辉老师在统计学方面给予的热心指导和帮助。感谢我的同学周春英在我最需要的时候给予我的支持与帮助。在此，衷心感谢关心和帮助过我的所有老师和同学们!谢谢!

57导师简介袁宝军:男，汉族，河北唐山人，1966年3月出生;主任技师，教授・硕士生导师;1991年7月张家口医学院医学检验专业本科毕业，获学士学位;2003年6月河北医科大学临床检验诊断学专业硕士研究生毕业，获硕士学位;2009.11-2010.11在美国约翰霍普金斯大学医学院做访问学者，主要研究尘肺纤维化的细胞免疫机制;现为华北煤炭医学院附属幵滦医院临床检验医学教研室主任，唐山市医学会检验分会主任委员，唐山市医学会第二届医疗事故技术鉴定专家库成员，河北省医学检验实验室质量管理学会常务理事、河北省医学会检验分会委员。2002年以来，共发表学术论文（前三名）41篇，其中国家级中文核心期刊27篇，SQ文章1篇。获5项市厅级科技进步奖，3项部级奖。主译《检验科与病理科值班医生手册》，参译《内科学见习实习指南》和《高血压病学》。2004年被评为幵滦医疗集团首批中青年专业技术骨干、唐山市卫生系统第四批专业技术拔尖人ォ、河北省新世纪“三三三人才工程”第三层次大选;2005年被评为河北省新世纪“三三三人才工程”第三层次人选、唐山市自然科学学科领军人物;2006年被评为开滦医疗集团级、开滦服务公司级岗位带头人;2008年被评为开滦医疗集团第三批拔尖人才、唐山市第五批市管优秀专家;2009年入选河北省出国培训优秀专家，同年11月至2010年11月在美国约翰霍普金斯大学医学院哮喘与过敏中心一过敏与临床免疫学专业做访问学者一年。联系方式:E-mail:ybi25999@163.com邹吉敏:女，1966年生，硕士，主任检验师°1987至今在幵滦总医院检验科工作・主要从事临床免疫学检验。参加国家"十一五"科技支撑计划课题"系统性红斑狼疮的临床诊断、综合治疗的研究"（课题编号:2008BAI59B02）子课题项目"SLE相关自身抗体临床检测质量控制体系的建立及临床研究课题"的研究。曾进行多种免疫分子在疾病发病机制中的作用及免疫相关基因与疾病相关性方面的研究。发表论文20余篇，参加著作编写2部。参与著作翻译1部。作为主研人参加的科研项目8项,获市（厅）级科技进步奖4项,省部级科技逬步奖4项。以第一主研人承担的课题"煤工尘肺患者血清中炎症及纤维化相关生物标志物分析"获2013年中国煤炭工业协会科技进步二等奖。

58联系方式:E-mail:jinminzou@126.com

59作者简介作者简介一般情况姓名:廉玉兰性别:女民族:汉族出生年月:1981年10月籍贯:唐山个人经历2001-2004天津医科大学全科医学（专科）2004-2007天津医科大学医学检验（本科）2011-2014河北联合大学病原生物学（硕士研究生）在学期间发表论文HO-1和Nrf2在氧化/抗氧化肺部疾病中的研究进展臼.中国实验诊断学杂志,2014,18（3）:509-511.联系方式:E-mail：amtf20061025@l63.com

60学位论文数据集cwp；ho-1；nrf2；t-aoc；8-iso-pgf2a；Ipocwp,ho-l,nrf2R135.2310.41HBLH2014-554公开河北联合大学硕士壹期煤エ尘肺患者血清氧化应激指标水平变化中文资源形式:【文本（4）］［图像（＜）］［视频()［音频（）］［其他（）］推荐形式application/msword;application/pdf廉玉兰河北联合大学10081病原生物学免疫学诊断与防治3年2014/4/27袁宝军教授河北联合大学附属幵滦总医院邹吉敏主任检验师河北联合大学附属幵滦总医院063000冯福民2014/06/07河北联合大学唐山理学硕士2014A4注:共37项,其中标明（可选）项可不填•必填数据24项。