细胞培养(二)

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细胞培养

1一、细胞培养基础知识二、细胞培养准备技术三、细胞培养基本技术四、细胞培养的污染及控制五、细胞培养常见问题解答

2二、细胞培养准备技术（一）细胞培养室的设备（二）培养用品的清洗和消毒灭菌（三）细胞培养用液制备

3超净工作台，CO2培养箱，倒置显微镜干燥箱，滤器，自动双重纯水蒸馏器，纯水仪，压力蒸汽消毒器离心机及天平冰箱，细胞冷冻存储器(液氮容器或低温冰箱)常用培养器皿：培养瓶，培养皿，多孔培养板，吸管，加样器其它用品：离心管，冻存管，酸缸，烧杯，注射器，量筒等（一）细胞培养室的设备

4利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。超净工作台

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7电热干燥箱：用于烘干和干热消毒玻璃器皿（160℃，2小时）。

8滤器Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌

9自动双重纯水蒸馏器纯水仪

10紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒

11大容量高压灭菌器全自动手提式灭菌器

12培养板

13培养瓶

14移液器

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16酶标仪微孔板震荡器

17高速离心机超速离心机

18液氮罐

19NEXT（二）培养用品的清洗和消毒灭菌玻璃器皿的清洗胶塞的清洗塑料制品的清洗培养用品的消毒灭菌

20培养用品的清洗在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长微生物产品附带杂物上次细胞残留物非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品玻璃器皿的清洗胶塞的清洗塑料制品的清洗

21玻璃器皿的清洗清洗步骤：浸泡→刷洗→流水冲洗10次以上→烘干→浸酸(24h)→流水冲洗10次以上→沥水→蒸馏水漂洗2～3次→烘干，待包装清洗后的玻璃器皿干净透明无油迹不能残留任何物质

22新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干涸灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质再次使用的玻璃器皿，则附有大量刚使用过的蛋白质，干涸后不易洗掉用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上玻璃器皿的清洗----浸泡

23用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度玻璃器皿的清洗----刷洗

24玻璃器皿浸泡到清洁液中清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面浸泡时间：一般为过夜，不应少于6小时玻璃器皿的清洗----浸酸

25清洁液的配制配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择陶瓷或塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色

26胶塞的清洗新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理常规清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用

27塑料制品的清洗塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品若需反复使用，清洗步骤：（1）流水充分冲洗→晾干→浸酸(24h)→流水充分冲洗→沥水→蒸馏水漂洗2～3次→晾干备用（2）流水充分冲洗→晾干→2%NaOH浸泡过夜→流水充分冲洗→5%盐酸溶液浸泡30分钟→流水充分冲洗→沥水→蒸馏水漂洗2～3次→晾干备用

28培养用品的消毒灭菌细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染常见原因：操作间或周围空间的不洁培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染

29消毒灭菌方法物理消毒灭菌法紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，30min湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃，20min干烤：160℃,2小时过滤：0.22μm化学消毒灭菌法70%酒精主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理1‰新洁尔灭主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒抗生素主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染

30（三）细胞培养用液制备

31水水的制备：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水

32平衡盐液体平衡盐溶液（BSS）主要是由无机盐和葡萄糖组成，其中无机离子是细胞生命的必要成分；在维持渗透压、缓冲和调节溶液pH方面也起着重要作用。Ca2+、Mg2+能为酶系统的活化提供条件，也是细胞膜的重要组成成分。葡萄糖等可为细胞代谢提供能量。BSS内还含有少量的酚红，作为pH变化的指示剂，溶液变酸性时呈黄色，变碱性时呈紫红色，中性时呈桃红色。在细胞培养中，BSS用途如下：（1）配制各种试液：如配“胰酶”消化液。（2）用于洗涤组织和细胞。

33PBS（Phosphate-BufferedSallines）KCl0.20gKH2PO40.20gNaCl8.00gNa2HPO4·7H2O2.16gDPBS（Dulbecco’sPhosphate-BufferedSallines）标准型CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙)0.10gKCl0.20gKH2PO40.20gMgCl2·6H2O0.10gNaCl8.00gNa2HPO4·7H2O2.16g

34D-Hanks’平衡盐溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS)KCl0.40gKH2PO40.06gNaCl8.00gNaHCO30.35gNa2HPO40.048gPhenolRed0.02g

35消化液常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠（EDTA）和胶原酶等在制备原代细胞时可消化组织、分散细胞，在传代细胞时使细胞脱离生长表面（瓶壁）和使细胞团离散成单个细胞。单独或混合使用

36消化液--胰蛋白酶液主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用

37常用浓度为0.25%（0.1%-0.5%）称取所需胰蛋白酶，用少许D-Hanks液调成糊状再补足D-Hanks液，搅拌混匀，置室温4小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡次日，滤过除菌，分装，-20℃冻存胰蛋白酶液配制

38消化液--EDTA·4Na溶液一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便常用工作液浓度为0.02%。注意：使用EDTA处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA会影响细胞生长EDTA溶液配制：用D-Hanks液溶解后，高压蒸汽灭菌，小瓶分装，4℃保存

39pH调整液为了营养成分稳定和延长贮存时间，在配制营养液时一般不预先加入NaHCO3，而在使用前再加入。故NaHCO3都是单独配制，高压灭菌。此外，为了维持培养液恒定的pH，以利于细胞的生长和增殖，还可利用Hepes强缓冲液。

40pH调整液---NaHCO3溶液常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，滤过除菌或高压灭菌，分装，4℃保存调节pH时，NaHCO3要逐滴加入，并不时摇动培养液，以防止加入过量。当pH值过高后，可用灭菌的10％醋酸溶液或通入CO2气体调节。

41pH调整液---Hepes液一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，分子式为：C8H18O4N2S，分子量为238.31。主要作用:防止培养基pH迅速变动。使用终浓度一般为10-50mmol/L常配成1M储存液：用100ml双蒸水溶解23.8gHepes，滤过除菌或高压灭菌，分装小瓶，4℃保存。使用时可向100ml培养液中加入1mlHepes储存液，终浓度为10mmol/L

42酚红大多数培养液中使用酚红作为pH指示红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫色表示碱性pH0.4％酚红溶液：称取0.4g酚红，置玻璃研钵中细研，逐渐加入0.1mol/LNaOH边滴边研至酚红完全溶解，记好加NaOH的量，共加至11.28ml为止，将研好的酚红液用吸管移入烧瓶中加三蒸水88.72ml，高压灭菌。在一些特殊培养液中不含酚红因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用

43抗生素液在离散细胞或培养细胞过程中，液体中加入适量抗生素，可预防操作不慎而产生的污染。常用的有青霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、二性霉素等。常配成100x或200x于使用浓度的盐溶液内，分装小瓶，冷冻保存。使用前加入到培养液内，每小瓶最好一次用完。

44抗生素溶液抗生素使用种类与浓度：工作浓度储存温度杀灭细菌penicillin100u/ml-20℃G(+)streptomycin100ug/ml-20℃G(+)、G(-)gentamicin50ug/ml-20℃G(+)、G(-)、支amphotericinB2.5ug/ml-20℃真菌nystatin50ug/ml-20℃真菌

45抗生素溶液--青、链霉素液配制（100X）：青霉素100万u链霉素l.0g溶于无菌三蒸水100ml，每毫升含青霉素10000u，链霉素10000µg;分装小瓶，－20℃冻存。使用：99ml培养液中加入青、链霉素液lml，终浓度为青霉素100u／ml，链霉素100µg／ml。

46细胞培养基天然培养基：主要来自动物体液或从组织分离提取制备的，其营养成分较高，但成分复杂，个体差异较大，来源也有一定的限制合成培养基：根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成的，具有一定的组成，是较理想的培养基。合成培养基尚未成为十分完全的培养基，它只能维持细胞不死，而不能促进细胞增殖生长，使用时尚需添加天然培养基，主要是牛血清。

47天然培养基包括：血清、组织提取液等。血清是细胞培养中最常使用的天然培养基。血清中含有许多能维持细胞生长增殖不可缺少的成分，如蛋白质、多肽、激素及各种氨基酸、葡萄糖、酮酸等营养成分。

48血清热灭活：56℃,30分钟加热已完全解冻的血清热灭活目的：灭活血清中的补体成分。如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活。因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量。灭活后会影响细胞生长速度，降低细胞贴壁率。血清中的沉淀物絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm,5分钟去除，也可不用处理显微镜下“小黑点”：有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清

49合成培养基市场上可提供干粉培养基和液体培养基干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便常用的培养基种类主要是MEM、Eagle、RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys5A、M199、F10培养液等

50MEM（MinimumEagleMedium）仅含12种必需氨基酸、谷氨酸胺和8种维生素，成分简单，适合各种已建成细胞系的培养，同时宜于添加或减少某些成分，也特别适于特殊研究的细胞培养工作。

51--增加了各成分的用量（双倍），葡萄糖用量可选择低糖（1000mg／L）或高糖（4500mg／L），对于生长速度较快，附着性较差的肿瘤细胞生长有利。特别应用在附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养时，采用高糖的培养液效果较好。常用于杂交瘤技术中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。DMEM（Dulbecco’sModifiedEagleMedium）

52RPMl-l640也是一种常用的培养液，最初是针对淋巴细胞的培养而设计的，问世后发现能广泛适应许多种类的细胞，包括正常细胞和肿瘤细胞的培养，而且成分简单，和MEM一样应用十分广泛。

53细胞培养基应用选择选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考：(1）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。(2)其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。(3)根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选RPMI1640。(4)用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。

54制备1000mlRPMI 1640培养基RPMI 1640 干粉培养基10.4g（1包）蒸馏水 400ml　　　↓　磁力搅拌至完全溶解 　　　↓　加三蒸馏水定容至1000ml↓滤过除菌，并分装成200ml/瓶，-20℃冻存

55谷氨酰胺补充液谷氨酰胺（分子量146．15）在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4℃下放置7天即可分解约50%，所以可在使用前添加。配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内。使用终浓度为1-4mmol/L一般配制成浓度为200mmol/L浓缩液，配制方法为：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30℃），滤过除菌，分装小瓶，-20℃保存使用时向100ml培养液中加入1ml浓缩液，终浓度为2mmol/L

56维持液与生长液维持液：合成培养基中不加血清或加低浓度（如2％）血清，仅能维持细胞生存，细胞不能很好生长。生长液：合成培养基中加入10％－20％血清，有利于细胞生长。

57［附］RPMI—1640生长液和维持液配法；生长液：RPMI-164088％小牛血清10％谷氨酸胺（100X）1％双抗（100X）1％用5.6％NaHCO3调pH至7.0-7.2。维持液：RPMI-164095％小牛血清2％谷氨酸胺（100X）1％双抗（100x）1％用5.6％NaHCO3调pH至7.0-7.2。

58无血清培养基无血清培养基主要由基础培养液和附加成分两部分组成。基础培养液：大多数仍采用合成培养基作为基础溶液，常用的是F12和DMEM，二者按1:1混合补加15mmol/LHEPES等附加成分：根据不同细胞的要求，附加特异性生长因子、激素、细胞附着蛋白、金属离子转移蛋白、细胞结合蛋白、脂蛋白、脂肪酸、酶抑制剂和微量元素等。

59激素类：胰岛素三碘甲状腺原氨酸生长激素（G）氢化可的松维生素A酸生长因子：上皮生长因子（EGF）成纤维生长因子（FGF）神经生长因子（NGF）

60金属离子转运蛋白：转铁蛋白（transferrin）微量元素：硒酸钠（Na2SeO3）酶抑制剂：大豆胰酶抑制剂（soybeantrypsininbibitor）抑蛋白酶肽（aprotinin）

61培养基质：纤维连结素（fibronecti）多聚赖氨酸（poly－lysine）胶原（collagen）细胞结合蛋白：牛血清白蛋白（BSA）脂肪酸：乙醇胺油酸或亚油酸