王昕医械内毒素初菌实验课件

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医疗器械细菌内毒素检查法无菌医疗器械细菌内毒素检验王昕2017.10

1热原及内毒素定义来源热原任何可以引起发热的物质。热原可分为两类：微生物热原（如，细菌、真菌、病毒）和非微生物热原（如，药物、器械材料、类固醇、血浆制品等）已发现的热原大多数为革兰氏阴性细菌的内毒素。虽然革兰氏阳性细菌、真菌和病毒可能致热原，但它们的致热机理不同（系统作用）并且作用程度低于革兰氏阴性细菌。本课件只包括革兰氏阴性细菌内毒素试验。不适用于细菌内毒素以外热原的评价。内毒素革兰氏阴性细菌细胞外壁的高分子量脂多糖（LPS）成分，如感染人体血液或组织，内毒素可导致发热、脑膜炎和血压迅速降低等。当革兰氏阴性细菌分解或裂解时，主要由蛋白、磷脂和脂多糖组成的细菌外壁成份不断释放入环境中。内毒素污染难以预防，因为其广泛存在于自然界中、性质稳定并且体积较小可通过常规的除菌滤膜。

2细菌内毒素试验本法系利用鲎试剂（LAL）来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法.细菌内毒素国家标准品自大肠埃希菌提取精制而成.用于标定复核仲裁鲎试剂灵敏度,标定细菌内毒素工作标准品的效价.干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备,凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验,光度测定法中标准曲线可靠性试验.细菌内毒素工作标准品以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价用于标定复核仲裁鲎试剂灵敏度,标定细菌内毒素工作标准品的效价.干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备,凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验,光度测定法中标准曲线可靠性试验.细菌内毒素国家标准品自大肠埃希菌提取精制而成.用于标定复核仲裁鲎试剂灵敏度,标定细菌内毒素工作标准品的效价.干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备,凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验,光度测定法中标准曲线可靠性试验.细菌内毒素国家标准品自大肠埃希菌提取精制而成.用于标定复核仲裁鲎试剂灵敏度,标定细菌内毒素工作标准品的效价.干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备,凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验,光度测定法中标准曲线可靠性试验.细菌内毒素国家标准品自大肠埃希菌提取精制而成.用于标定复核仲裁鲎试剂灵敏度,标定细菌内毒素工作标准品的效价.干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备,凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验,光度测定法中标准曲线可靠性试验.细菌内毒素国家标准品自大肠埃希菌提取精制而成.用于标定复核仲裁鲎试剂灵敏度,标定细菌内毒素工作标准品的效价.干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备,凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验,光度测定法中标准曲线可靠性试验.细菌内毒素国家标准品自大肠埃希菌提取精制而成.用于标定复核仲裁鲎试剂灵敏度,标定细菌内毒素工作标准品的效价.干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备,凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验,光度测定法中标准曲线可靠性试验.

3内毒素单位endotoxinunit（EU）内毒素活性测定的标准单位，最初建立的活性相当于0.2ng的美国参照内毒素，批号EC-2（美国药典标准参照材料）。注：FDA参照内毒素EC-6、美国药典批G和世界卫生组织的国际基准内毒素标准品(IS)都是从同一内毒素批中分出来的，使EU和IU相等（Pooleetal.,1997）。

4细菌内毒素检查用水及器皿要求细菌内毒素检查用水指内毒素含量小于0.015EU/ml(用于凝胶法)或小于0.005EU/ml(用于光度测定法)且对细菌内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水.试验所用器皿需经处理,以去除可能存在的外源性内毒素.耐热器皿常用干热灭菌法(250℃,30分钟以上)去除,也可采用其它确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法.若使用塑料器械,如微孔板和与微量加样器配套的吸头等,应选用标明无内毒素且对试验无干扰的器械.

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6定义和术语增强enhancement非内毒素相关因素（通常由试验样品的特性所致）导致的细菌内毒素试验异常现象，使试验反应高于实际存在的内毒素总量。非内毒素相关因素（通常由试验样品的特性所致）导致的细菌内毒素试验异常现象，使试验反应低于实际存在的内毒素总量。抑制inhibition抑制/增强试验inhibition/enhancementtest用于确定某一特定细菌内毒素试验样品是否含有减小试验准确性的因素,即是否对试验系统产生抑制或增强作用的试验

7定义和术语最大有效稀释倍数(MVD)是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数,在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测.鲎试剂LAL反应材料（LALreactivematerial(LAL-RM)任何激活鲎试剂LAL并引起增强的非内毒素成分灵敏度lambda(λ)鲎试剂LAL凝胶试剂的标称灵敏度，以EU/mL表示。或，对于显色法和浊度法，为参照标准曲线的最低点（内毒素浓度）。

8定义和术语鲎氏剂（LAL）从鲎（horseshoecrab）[美国鲎（Limuluspolyphemus）或中国鲎（Tachypleustridentatus）]的循环血变形细胞中提取的试剂，与内毒素相互反应产生凝胶，用于细菌内毒素试验测定细菌内毒素水平。试验内毒素限值testendotoxinlimit浸提液中所允许的最大内毒素浓度，该确定的限值用于计算样品浸提（多个单位和一个单元）的最大有效稀释倍数鲎氏剂（LAL）从鲎（horseshoecrab）[美国鲎（Limuluspolyphemus）或中国鲎（Tachypleustridentatus）]的循环血变形细胞中提取的试剂，与内毒素相互反应产生凝胶，用于细菌内毒素试验测定细菌内毒素水平。试验内毒素限值testendotoxinlimit浸提液中所允许的最大内毒素浓度，该确定的限值用于计算样品浸提（多个单位和一个单元）的最大有效稀释倍数

9需控制内毒素的医疗器械直接或间接与血管内、淋巴内或鞘内接触的产品，或是可能与类似系统接触的产品（如输液器、输移器、导管、植入物和输液组件）、或是眼内使用的眼科产品（如硅油、黏弹性产品、眼内透镜）应评价内毒素。满足内毒素要求的产品可给出声称非致热性的标签。注：国外产品通常不标示无热原，因为无热原意味着绝对不含细菌内毒素。而所有BET方法的固有检出限都无法使试验证实绝对不含有细菌内毒素。

10检验实验室当前有三种细菌内毒素检验技术可供选择。每一技术的选择宜建立在实验室技能、经验、样品量要求、数据处置要求和试验样品性质之上的充分评定。当前技术和方法包括当前技术和方法凝胶技术：限值试验和测定方法；显色技术：动力学和终点方法；浊度技术：动力学和终点方法

11将试验样品稀释至确认过的浓度在10mm×75mm玻璃试管内与鲎试剂等体积混合不能保持完整者为阴性试验凝胶坚实并保持完整者为阳性试验当前技术和方法——凝胶技术—限值试验和分析方法孵育后将各试管从孵育器中小心地取出，缓慢倒转180º凝胶法无论是在所需进行确认分析的技术技能方面，还是在数据解释/分析方面，都是最简便的BET技术。设备投资很小，仅需一台适宜的鉴定的维护的和性能合格的水浴箱或加热器（heatingblock）及辅件。

12当前技术和方法——显色和浊度技术—终点方法原理基于内毒素浓度和产色（显色）或浊度之间的线性关系，显色或浊度是通过给定波长（在相对小的标准系列稀释液范围内被评价）下测量光密度来测量。通过测定用细菌内毒素检查用水（用于光度测定法）制备的内毒素标准系列稀释液的光密度，绘制出内毒素浓度标准曲线。进行线性回归分析，形成的“最适宜”的标准曲线覆盖约1个log内毒素范围，一般为1.0EU/mL～0.1EU/mL或0.1EU/mL～0.01EU/mL。相关系数是所观察的各点相对离开回归线的统计学测量，线性被定义为相关系数的绝对值≥0.980。通过测定样品的光密度并插入标准曲线，计算出未知的内毒素水平。终点法一般使用酶标板，还需要一台加热器和一台经鉴定的酶标仪，酶标仪配有建立标准曲线和样品分析的统计学软件包（线性回归分析）。显色和浊度方法与凝胶试验相比要更多地依赖于良好的分析技术，在分析和解释数据时要应用统计学知识。

13当前技术和方法——显色和浊度技术—动力学方法原理测定系列标准稀释液到达预先确定的光密度程度（动力学浊度）或显色程度（动力学显色）所耗用的时间量，有时称为启动OD（onsetOD）或反应OD(reactionOD)。通过绘制启动或反应时间（即每一标准或样品达到启动OD的所耗用的时间）的log值与内毒素浓度的log值有函数关系，建立标准曲线。该数据经log/log处理的建立了一条线性标准曲线。为动力学分析所建的曲线范围可高达4个log，而终点分析的所建曲线范围只有1个log，除非使用其他经批准回归分析方法（目前FDA受权的都是基于一家生产商的试剂），用横跨各观察点的线性回归分析来建立标准曲线，动力学方法最小线性要求为相关系数≥0.980。与终点方法一样，可将样品的onset时间的对数值插入从标准曲线被计算出未知的细菌内毒素含量。动力学方法可使用酶标板、玻璃管或其他确认过的技术。这些方法都需经确认的读取结果的设备并配备建立标准曲线和样品分析的统计学软件包（回归分析）。在这些方法专用电子表格或数据基础软件包的使用，可极大地便利数据的即时分析和走势分析。与终点方法一样，证实一个好的、恒定的实验，实验室技术主要取决于分析人员，在分析和解释数据时还要用到基础统计学知识。

14资料介绍--确定产品内毒素限值USP34<161>中规定的医疗器械的内毒素限值对于医疗器械而言，每件器械内毒素限值不超过20.0USPEU。然而，与脑脊液接触器械的内毒素限值为每件器械不超过2.15USPEU。FDA指南（1987）中规定的医疗器械的内毒素限值器械内毒素限值为0.5EU/mL，与脑脊液接触器械的内毒素限值为0.06EU/mL。内毒素限值这些限值是建立在每件器械40mL冲洗液的基础之上。对于与病人接触表面积特别小或大型器械，可使用一个调节因子来选择冲洗或浸提体积。内毒素限值可相应调整。注意：

15资料介绍--确定产品内毒素限值成套器械成套器械被定义为在一个初包装内多组件的集合，成套器械在使用地点装配成医疗产品。在这种情况下规定的内毒素限值是针对组装后器械的，而非各组件的内毒素限值（见表1）。当检验一个成套器械的分组件时，可以使用混合的浸提液，前提是要保留各成套器械浸提液的比例。比如，某一器械可能有3个组件，各组件所用的浸提液总体积应不超过MVD。这可以用一份浸提液对所有3个组件浸提，也可将三个组件各用一部分液体分别浸提然后混合，还可将这两种方法组合起来。当组合后样品出现结果不确定时，就需要分别检验各组件，以研究各组件的污染源。器械包器械包被定义为在一个初包装内或各种医疗器械过程中多个医疗产品的集合。各器械可以有各自的产品内毒素限值，且宜分别进行试验和评价（见表1）。

16产品单元检验项目基于非致热性声称说明a)初包装中独立的医疗器械独立医疗器械独立医疗器械各医疗器械在临床应用中独立使用b)初包装中成套组件组件的组合组件的组合在临床应用中组件被装配成一套产品并一起使用。c)初包装中若干相同的医疗器械取自初包装的单一医疗器械取自初包装的单一医疗器械在临床应用中各医疗器械独立使用d)医疗过程相关的含多个器械包声称无致热性的每种医疗器械声称无致热性的每种医疗器械在临床应用中每种医疗器械独立使用，可有不同的产品内毒素限值表1检验产品单元的选择资料介绍--确定产品内毒素限值

17供试品溶液的制备医疗器械在水性溶液中浸提制成供试品溶液,必要时可调节被测溶液(或其稀释液)的pH值,一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0-8.0的范围内为宜,可用适宜的酸或碱溶液或缓冲液调节pH值.酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器内配制.缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子.

18医疗器械产品试验内毒素限值一旦确定了产品内毒素限值，试验内毒素限值可按下式计算：试验内毒素限值（EU/mL）＝K*N/VK=每一器械内毒素允许量（产品内毒素限值）；N=供试器械数量；V=样品组合中的浸提液总量（mL）。

19确定最大有效稀释倍数(MVD)MVD=试验内毒素限值/λλ—经认定的鲎试剂标示灵敏度（凝胶法）或用于绘制参照标准曲线（显色和浊度）的最低内毒素浓度。该MVD值表示了基于鲎试剂灵敏度的克服抑制/增强作用所能进行的稀释倍数。如MVD为4，即按不大于1：4的比例稀释样品浸提液不影响检测产品内毒素限值的能力。如可行，宜在低于最大有效稀释的稀释度下对产品进行确认。

20凝胶法定义：凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量检测内毒素的方法。标示灵敏度：在本检查法规定的条件下,使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度,即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/mL表示.当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时,应进行鲎试剂灵敏度复核试验.注意：

21凝胶法——鲎试剂灵敏度复核试验实验操作细菌内毒素标准溶液的制备待复核鲎试剂的准备将已充分溶解的待复核鲎试剂18支放在试管架上，排成5列，其中4列4支，1列2支。4支4列每列每支分别加入0.1ml2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；另2支加入0.1ml检查用水。加样结束后保温60min±2min将每管拿出缓缓倒转180°观察，若管内形成凝胶，且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）1.细菌内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置漩涡混合器混合15min。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、1λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在漩涡混合器上混合30秒钟。2.待复核鲎试剂的准备取待复核的鲎试剂，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入规定量的检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，并避免产生气泡。然后每0.1ml分装到18支管备用。细菌内毒素标准溶液的制备待复核鲎试剂的准备将已充分溶解的待复核鲎试剂18支放在试管架上，排成5列，其中4列4支，1列2支。4支4列每列每支分别加入0.1ml2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；另2支加入0.1ml检查用水。细菌内毒素标准溶液的制备待复核鲎试剂的准备加样结束后保温60min±2min将已充分溶解的待复核鲎试剂18支放在试管架上，排成5列，其中4列4支，1列2支。4支4列每列每支分别加入0.1ml2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；另2支加入0.1ml检查用水。细菌内毒素标准溶液的制备待复核鲎试剂的准备将每管拿出缓缓倒转180°观察，若管内形成凝胶，且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）加样结束后保温60min±2min将已充分溶解的待复核鲎试剂18支放在试管架上，排成5列，其中4列4支，1列2支。4支4列每列每支分别加入0.1ml2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；另2支加入0.1ml检查用水。细菌内毒素标准溶液的制备待复核鲎试剂的准备

22凝胶法鲎试剂灵敏度复核试验实验操作1.细菌内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置漩涡混合器混合15min。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、1λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在漩涡混合器上混合30秒钟。

23凝胶法鲎试剂灵敏度复核试验实验操作2.待复核鲎试剂的准备取待复核的鲎试剂，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入规定量的检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，并避免产生气泡。然后每0.1ml分装到18支管备用。

24凝胶法——鲎试剂灵敏度复核试验实验结果计算当最大浓度2λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时，试验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。λc=lg-1(∑X/4)式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰试验和供试品细菌内毒素检查，并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。

25凝胶法——干扰试验干扰试验目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。

26凝胶法——干扰试验目的：是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、1λ、0.5λ、0.25λ。2.用供试品溶液将内毒素标准品稀释成4个浓度即2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液。3.准备鲎试剂：轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，每支加入规定容量的检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡，按0.1mL/支的规格分装36管备用。加样：将准备好的鲎试剂取其中18支放在试管架上，排成5列，4列4支，1列2支。其中的4支4列每列每支分别加入0.1mL的2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液，另一列2支加入0.1mL检查用水作为阴性对照。将另外18支鲎试剂排成5列，4列4支，1列2支。其中的4支4列每列每支分别加入0.1mL的2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的供试品溶液，另一列2支加入0.1mL供试品溶液作为样品阴性对照。4.

27凝胶法干扰试验溶液的制备编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素浓度平行管数AB无/供试品溶液2λ/供试品溶液-供试品溶液-1248-2λ1λ0.5λ0.25λ24444C2λ/检查用水检查用水12482λ1λ0.5λ025λ4444D无/检查用水---2

28凝胶法干扰试验溶液的制备注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。

29凝胶法干扰试验只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。当系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。其它情况则认为供试品在该浓度下有干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重新干扰试验。

30凝胶法干扰试验可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其它适宜的方法（如过滤,中和,透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效的排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先填加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。当进行新产品的内毒素检验试验前，须进行干扰试验。或无内毒素检验项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。当鲎试剂，供试品的处方，生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。

31凝胶法——干扰试验5.试验结果计算如两组最大浓度2λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照4管均为阴性时，按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）。Es=lg-1(∑Xs/4)Et=lg-1(∑Xt/4)式中Xs和Xt分别为检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。当Es在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，且Et在0.5Es～2Es（包括0.5Es和2Es）时，则认为供试品在该浓度下不干扰试验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。当Et不在0.5Es～2Es（包括0.5Es和2Es）时，则认为供试品在该浓度下干扰试验，应使用适宜方法排除干扰。

32供试品细菌内毒素检查1.供试品溶液的制备首先计算MVD=CL/λ，然后将供试品进行稀释，稀释倍数不得超过MVD。2.阳性对照溶液的制备用检查用水将标准品稀释制成2λ浓度的内毒素标准溶液。3.供试品阳性对照溶液的制备用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。4.阴性对照液即细菌内毒素检查用水.5.鲎试剂的准备取若干支鲎试剂轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，每支加入规定容量的检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡，按0.1mL/支的规格分装8管备用。

33凝胶限度试验溶液的制备编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数A无/供试品溶液2B2λ/供试品溶液2C2λ/检查用水2D无/检查用水2

34凝胶法干扰试验溶液的制备注：A为供试品溶液;B为供试品溶液阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照。

356.加样取8支溶解好的鲎试剂，其中2支加入0.1mL供试品溶液或其稀释液作为供试品管，2支加入0.1mL阳性对照溶液作为阳性对照管，2支加入0.1mL检查用水作为阴性对照，2支加入0.1mL供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照。（37±1）℃，（60±2）min保温后，观察并记录结果。供试品细菌内毒素检查

367.结果判断当阳性对照、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照为阴性时，试验方为有效。若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定；如供试品2管均为阳性，应认为不符合规定；如2管中一管为阳性，一管为阴性，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中如有1管为阳性，即认为不符合规定。若第一次试验时供试品的稀释倍数小于MVD而结果出现2管均为阳性或2管中1管为阳性时，按同样方法重新进行试验，试验时要求将其稀释至MVD。供试品细菌内毒素检查

37内毒素试验实例展示凝胶限度法

38内容试验设备123试验过程2试验耗材23

39试验设备振荡培养箱试管恒温仪漩涡振荡器电热恒温干烤箱

40试验耗材内毒素检查用水(<0.015EU/ml,<0.005EU/ml)0.9%氯化钠注射液鲎试剂(0.25EU/ml～0.03EU/ml）无热原吸头内毒素工作标准品：中国食品药品检定研究院

41试验过程1.制备供试品溶液，以一次性使用血液回收罐装置为例，根据药典的规定，每套器材加100ml氯化钠注射液，在37℃恒温培养箱中浸提1h。

42试验过程2.制备阳性对照溶液。取一支细菌内毒素工作标准品，加入规定量的细菌内毒素检查用水进行溶解，用封口膜将瓶口封严，置漩涡混合器混合15min。然后将工作标准品稀释到2λ浓度。

43试验过程每稀释一步均应在漩涡混合器上混合30秒钟。

44试验过程3.制备供试品阳性对照溶液用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。例如：100ul待测的供试品溶液+100ul4λ浓度的内毒素溶液=200ul2λ浓度的供试品阳性对照溶液。4.阴性对照液即细菌内毒素检查用水

45试验过程3.制备供试品阳性对照溶液用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。例如：100ul待测的供试品溶液+100ul4λ浓度的内毒素溶液=200ul2λ浓度的供试品阳性对照溶液。4.阴性对照液即细菌内毒素检查用水

46试验过程5.准备鲎试剂每支鲎试剂加入规定容量的检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡，按0.1mL/支的规格分装。

47试验过程6.加样取8支溶解好的鲎试剂，其中2支加入0.1mL供试品溶液或其稀释液作为供试品管，2支加入0.1mL阳性对照溶液作为阳性对照管，2支加入0.1mL检查用水作为阴性对照，2支加入0.1mL供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照。（37±1）℃，（60±2）min保温后，观察并记录结果。

48试验过程7.结果判断阳性阴性

49凝胶半定量试验本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按下表制备溶液A,B,C和D。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

50凝胶半定量试验溶液的制备编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素浓度平行管数A无/供试品溶液检查用水1248----2222B2λ/供试品溶液12λ2C2λ/检查用水检查用水12482λ1λ0.5λ025λ2222D无/检查用水---2

51凝胶半定量试验注：A为不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1倍，2倍，4倍，8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD。B为2λ浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）。C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。D为阴性对照。

52凝胶半定量试验结果判断若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5-2λ，试验有效。系列溶液A中每一系列的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点浓度。如果检验的是经稀释的供试品，则将终点浓度乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数，即得到每一系列内毒素浓度c.若每一系列内毒素浓度均小于规定的限值，判定供试品符合规定。每一系列内毒素内毒素浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度（cE=lg-1(∑c/2)）。若试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于λ（若检验的是稀释过的供试品，记为小于λ乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数）。若任何系列内毒素浓度不小于规定的限值时，则判定供试品不符合规定。当供试品溶液的所有平行管均为阳性，可记为内毒素浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。

53供试品细菌内毒素检查细菌内毒素测定仪——动态浊度法试管恒温仪——凝胶法电热恒温干烤箱

54实例产品一次性使用输液器要求内毒素限量不大于20EU/套，现使用内毒素灵敏度为0.25EU/mL的鲎试剂进行试验，计算最多使用多少体积的浸提液进行试验。浸提液体积计算公式为：20EU/套÷0.25EU/mL=80mL浸提液体积应不大于80mL/套

55注意热原试验中，初试3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔升温总和低于1.3℃可判定为供试品的热原检查符合规定。热原试验是按照国家标准GB/T16886.11-2011《医疗器械生物学评价第11部分：全身毒性试验》的规定，按中华人民共和国药典2015年版四部通则1142热原检查法的方法进行的。

56初始污染菌检验

57现行国标GB/T19973.1-2015医疗器械的灭菌微生物学方法第一部分：产品上微生物总数的测定ISO11737-1:2006Sterilizationofmedicaldevices-Microbiologicalmethods-Part1:Determinationofapopulationofmicroorganismsonproducts2016-9-1实施

58初始污染菌检验依据GB15980规定了一次性使用医疗用品灭菌、消毒前、后的卫生标准。本标准对一次性使用医疗用品(包括灭菌的和消毒的一次性使用医疗用品)生产企业中生产、装配、包装车间等生产过程和生产工人手提出卫生要求的质量控制。其适用于各类一次性使用医疗用品生产企业，也适用于灭菌与消毒服务单位。

59初始污染菌检验依据GB15980规定了一次性使用医疗用品灭菌、消毒前、后的卫生标准。本标准对一次性使用医疗用品(包括灭菌的和消毒的一次性使用医疗用品)生产企业中生产、装配、包装车间等生产过程和生产工人手提出卫生要求的质量控制。其适用于各类一次性使用医疗用品生产企业，也适用于灭菌与消毒服务单位。

60初始污染菌检验指标GB15980中给出的灭菌与消毒产品的微生物指标——产品初始污染菌数：灭菌产品管道类内腔≤10cfu/件次，外部≤100cfu/件次非管道类≤100cfu/件次敷料类≤100cfu/g消毒产品≤1000cfu/件次或重量(g)灭菌与消毒产品均不得检出致病菌

61初始污染菌检验指标GB15980中给出了灭菌与消毒产品生产、装配、包装车间的微生物指标：空气细菌总数，灭菌与消毒产品分别≤500cfu和2000cfu/m3物体表面细菌总数分别≤10和20cfu/cm2生产工人手细菌总数≤300cfu/每只手

62初始污染菌数检测（GB15980附录C）常用采样方法对可用破坏性方法取样的医疗用品，如输液(血)器、注射器、注射针、透析器及各类导管等，按中华人民共和国药典规定执行对不能用破坏性方法取样的特殊医疗用品可用浸有生理盐水的棉拭子涂抹采样，被采表面＜100cm2取全部表面；被采表面≥100cm2取100cm2敷料类可无菌操作续取10g，放入100mL灭菌生理盐水中，充分振荡后取样常用采样方法对可用破坏性方法取样的医疗用品，如输液(血)器、注射器、注射针、透析器及各类导管等，按中华人民共和国药典规定执行对不能用破坏性方法取样的特殊医疗用品可用浸有生理盐水的棉拭子涂抹采样，被采表面＜100cm2取全部表面；被采表面≥100cm2取100cm2常用采样方法对可用破坏性方法取样的医疗用品，如输液(血)器、注射器、注射针、透析器及各类导管等，按中华人民共和国药典规定执行敷料类可无菌操作续取10g，放入100mL灭菌生理盐水中，充分振荡后取样对不能用破坏性方法取样的特殊医疗用品可用浸有生理盐水的棉拭子涂抹采样，被采表面＜100cm2取全部表面；被采表面≥100cm2取100cm2常用采样方法对可用破坏性方法取样的医疗用品，如输液(血)器、注射器、注射针、透析器及各类导管等，按中华人民共和国药典规定执行

63初始污染菌检测方法产品采集与样品处理于同一批号的三个包装中抽取,抽样的包装不应有破裂，检验前不得启开在100级净化条件下用无菌方法打开用于检测的至少3个包装，从每个包装中取样，准确称取10g±1g样品。剪碎后加人到200mL灭菌生理盐水中，充分混匀，得到一个生理盐水样液。液体产品用原液直接做样液。（在chp2015版及GMP2010中所要求的洁净级别已变化，以最新版本为准）如被检样品含有大量吸水树脂材料而导致不能吸出足够样液时，稀释液量可按每次50mL递增，直至能吸出足够测试用样液。在计算细菌菌落总数与真菌菌落总数时相应调整稀释度。

64初始污染菌检测方法——操作步骤取上清液作菌落计数接种至5个平皿每个平皿中加入1ml样液将冷却至45℃左右的熔化的营养琼脂培养基（国外采用TSA，这次chp2015微生物限度的修订也采纳了此培养基）15-20mI,倒入每个平皿内混合均匀待琼脂凝固后翻转平皿置35℃士2℃培养48h计算平板上的菌落数本方法适用于产品初始污染菌与细菌菌落总数(以下统称为细菌菌落总数)检测。

65初始污染菌检测方法——结果报告注：当菌落数在100以内，按实有数报告，大于100时采用二位有效数字如果样品菌落总数超过本标准的规定，应进行复检和结果报告。菌落呈片状生长的平板不宜采用；计数符合要求的平板上的菌落，按下式计算结果:Xi=A*K/5Xi——细菌菌落总数，cfu/g或cfu/ml；A——5块营养琼脂培养基平板上的细菌菌落总数;K——稀释度。

66初始污染菌检测方法——复检将留存的复检样品依前法复测2次，2次结果平均值都达到本标准的规定，则判定被检样品合格;其中有任何1次结果平均值超过本标准规定，则判定被检样品不合格。

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