22 莱克多巴胺检测细则

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福建森宝食品集团股份有限公司企业标准Q/JCWI0222—2013动物性食品中莱克多巴胺药物残留检测酶联免疫吸附法2013-08-01发布2013-08-01实施福建森宝食品集团股份有限公司发布

1Q/JCWI0222—2013前言本标准按照GB/T1.1《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草本标准由公司检测中心提出并审核本标准起草单位：检测中心本标准起草人：张丽丽本标准批准人：黄金兰本标准于2013年8月1日首次发布。I

2Q/JCWI0222—2013修改履历表章节修改人修改日期版本修改内容或记录号批准人实施日期条款（起草人）（发布日期）A/0全新发布张丽丽黄金兰2013.8.12013.8.1II

3Q/JCWI0222—2013动物性食品中莱克多巴胺药物残留检测酶联免疫吸附法1范围本标准规定了动物可食性组织中沙丁胺醇药物残留量，酶联免疫检测方法的制样和检测方法.本标准适用于适用于定量检测动物尿液样品中的莱克多巴胺。2试验原理样品中游离的莱克多巴胺与酶标记物竞争结合微孔中固相包被的莱克多巴胺特异性抗体，经过孵育后进行清洗，所有未与抗体结合的药物在清洗步骤中被清除，与抗体结合的酶标记物由显色剂显示出来，因为酶可以使无色的显色剂转变成蓝色，终止液的加入可以终止反应，蓝色转变成黄色，吸收值可以在450nm处进行测定，颜色变化的程度反映样品中莱克多巴胺的含量。3交叉反应率沙丁胺醇…………………………………………………100%克伦特罗…………………………………35%特布他林………………………………………22%齐帕特罗………………………………………9%西玛特罗………………………………………2%班布特罗………………………………………小于0.1%莱克多巴胺………………………………………小于0.1%4设备及试剂以下所用材料，除特别注明者外，均为分析纯；水为符合GB/T6682规定的二级水。4.1设备┅┅微孔板酶标仪（有450nm滤光片）┅┅离心机┅┅刻度移液管：10ml┅┅洗耳球┅┅容量瓶：500ml┅┅玻璃试管：10ml┅┅玻璃烧杯：1000ml1

4Q/JCWI0222—2013┅┅玻璃棒┅┅离心管┅┅微量移液器：单道20～200l、100～1000l多道250l5试剂盒提供的材料与试剂包被有抗体的微孔板：1块（12条×8孔，可拆分）酶标物冻干粉：1瓶酶标物溶解液：1瓶（13ml）清洗液20×：1瓶（25ml）显色剂：1瓶（13ml）终止液：1瓶（13ml）标准品：8×1ml/瓶（0ppb,0.15ppb,0.3ppb,0.6ppb,1.25ppb,2.5ppb,5ppb,10ppb）6溶液的配制配液1:酶标物工作液使用时精确加入12mL酶标物溶解液到酶标物冻干粉充分溶解约1小时，使用前摇匀，切勿涡旋振荡，回温后即可使用。配液2:清洗液用蒸馏水按1：20（1+19）稀释7样本前处理步骤7.1处理任何样本时，都必须注意：a)实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。b）实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。c）终止液具有刺激性，显色剂具有毒性，切勿接触皮肤。d）不要在有效期过后使用试剂。e）不同批号的试剂不得混用。7.2样本前处理方法尿液：可以直接进行检测或者在样品比较混浊时，5000rpm离心5min或过滤，取50μL上清液检测。稀释倍数：18检测步骤8.1测定前应须知：测定前应须知：2

5Q/JCWI0222—20131、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25℃/68-77℉）。回温1小时以上，一定保证回温充分，否则影响检测的精确度和准确度。2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃（36-46℉）。3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。4、加样时请勿让吸头接触微孔中的溶液或内表面。8.2操作步骤：8.2.1将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20-25℃/68-77℉）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。8.2.2取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃（36-46℉）。8.2.3尿样稀释液在使用前也需按上述方法回温。8.2.4编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。8.2.5加标准品/样本和酶结合物工作液：加标准品/样本50l到对应的微孔中，然后加入酶结合物工作液100l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min。8.2.6洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入去清洗液250l/孔，充分洗涤3－4次，每次间隔10s，泼掉板孔内液体，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用吸耳球吹破）。8.2.7显色：加入显色剂100l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境反应10min。8.2.8测定：加入终止液100l/孔，轻轻振荡混匀，在450nm下检测吸光度，结果在10min内读取最佳，30min内有效。9结果计算9.1百分吸光率的计算,标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的平均吸光度值（双孔）除以第一个标准（0标准）的平均吸光度值,再乘以100%，即百分吸光率（%）=B×100%B0B—标准品或样本溶液的平均吸光度值B0—0ppb标准溶液的平均吸光度值9.2标准曲线的绘制与计算将每个标准的B/B0值输入半对数系统中，对应于各自的莱克多巴胺标准的浓度可以获得一个标准曲线。以标准品百分吸光率为纵坐标，以标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中,从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中莱克多巴胺的实际浓度，用ppb（µg/kg或µg/L）表示。10检测方法灵敏度、准确度、精密度试剂盒灵敏度：0.5±0.2ppb样本最低检测限：3

6Q/JCWI0222—2013尿液……………………………………………0.3ppb回收率：尿液…………………………………………………90±10%11注意事项11.1室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。11.2在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。11.3每加一种试剂前需要将其摇匀。11.4反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。11.5不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。11.6保存试剂盒于2-8℃（36-46℉），不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。11.7在22-25℃条件下Bo吸光度应大于0.8。11.8该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化会直接影响检测结果。12贮藏条件及保存期贮藏条件：保存试剂盒于2-8℃(36-46℉)环境中。保存期：该产品有效期为12个月。_________________________________4