外泌体提取方法总结

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1、细胞培养上清:即在4℃下,首先300×g离心10min，吸取上清液,然后2000×g离心10min;吸取上清液后,10000×g高速离心30min，吸取上清液;140000×g超速离心90min;除去上清液,所获得的沉淀即为外泌体。用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140000×g再次离心90min,100μLPBS缓冲液重悬沉淀，冻存于—80℃备用。2、将小鼠或人血收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小时而不进行抗凝。此后，将其以2，000×g离心持续10分钟获得血清。接着将血清以3，000×g离心10分钟。将上清液以无菌PBS以1：1的比例稀释并离心再次以10,000×g保持30分钟,然后以200，000×g进行2小时超速离心。将颗粒在a中洗涤大量PBS,通过0.2—μm注射器过滤器过滤,并以200，000×g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液,血清,血浆,肿瘤腹水）中纯化外泌体,只需通过常规方法收集液体即可.血浆用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心.在4°C下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化。外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度,必须稀释它们，并增加离心的速度和长度.该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（

1Caby等，2005)。基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。材料液体（例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离；淋巴，血清，尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录）2A）冷冻离心机50毫升聚丙烯离心管0。22微米过滤装置（如Steritop,Millipore）超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表3。22。1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶(见表3.22）0.1）注意：所有离心均应在4℃下进行。1.用等体积的PBS稀释液体。将稀释的液体转移到50毫升管中。在2，000×g，4℃下离心30分钟。2。将上清液转移到超速离心管或瓶中,没有颗粒污染（参见基本方案1,步骤3注释）。在12，000×g，4℃下离心45分钟。3。小心地将上清液转移到超速离心管或瓶中（根据处理的液体体积，可参见表3。22.1中的管）。在110,000×g，4℃下离心2小时.4。将沉淀重悬于1mlPBS中,并将其在其中一个管中汇集.用PBS填充管以大量稀释再悬浮液。5.通过0。22-μm过滤器过滤悬浮液，并收集在新鲜的超速离心管或瓶中。6。在110，000×g，4℃下离心70分钟。倒出上清液。7.将沉淀重悬于1mlPBS中,然后用PBS填充管。在110，000×g，4℃下离心70分钟。倒出上清液。8。将沉淀重悬于50至200μlPBS中。在—80℃下储存长达1年。