生物物理学报第二十二卷第六期二!!六年十二月

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1、生物物理学报第二十二卷第六期二!!六年十二月ACTABIOPHYSICASINICAVol.22No.6Dec.2006利用FRET技术在活细胞内研究红景天甙对A!25-35诱导PC12细胞凋亡的抑制作用陈妙娟，邢达，陈同生（华南师范大学激光生命科学研究所暨激光生命科学教育部重点实验室，广州510631）摘要：为研究红景天甙（salidroside）对-淀粉样肽25-35（.amyloidpeptide25-35,A/25-3）5诱导PC12细胞凋亡的抑制作用，采用CellCountingKit-8（CCK-8

2、）分析细胞的存活率，通过光镜检测细胞形态并配以Hoechst染色检测细胞核固缩，利用荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）技术在单个活细胞中检测caspase-3和caspase-8活性的动态变化。结果表明，红景天甙可剂量依赖性抑制A025-35引起的细胞凋亡，提高细胞的存活率；红景天甙对caspase-3的活性有明显的抑制作用，而且A125-35诱导细胞凋亡不依赖于caspase-8的激活。这些结果提示抑制caspase-3的活性是红景天甙抑制A2

3、25-35诱导PC12细胞凋亡的机制之一。关键词：红景天甙；PC12细胞；细胞凋亡；A325-35；荧光共振能量转移中图分类号：Q924.70引言FRET）技术在活细胞实时检测红景天甙对PC12细胞凋亡的抑制作用，探讨红景天甙抑制A+25-35诱细胞凋亡在神经系统的正常发育过程中起着重导PC12细胞凋亡的机理。要作用。当神经细胞凋亡发生紊乱，会出现病理性神经元凋亡，如帕金森氏病（Parkinson'sdisease,1材料和方法PD）、阿尔茨海默病（Alzheimer'sdisease,AD）和肌萎缩性侧素硬化

4、症（amyotrophiclateralscle-1.1材料rosis,ALS）等[1]。AD是以进行性痴呆为特征的神1.1.1药物和试剂经系统退行性疾病，其病理改变除经典的老年斑和PC12细胞（大鼠肾上腺嗜铬细胞株）来源于神经元纤维缠结之外，还有神经元的丢失。AD神广州中山医科大学细胞培养中心；红景天甙由中山经元的丢失以凋亡的形式发生[2,3]。近年来的研究表大学广州现代中药质量研究开发中心提供；胎牛血明，!淀粉样肽（"amyloidpeptide,A#）是各种清和马血清购自Hyclone公司；DMEM购自因

5、素诱发AD的共同通路，是AD形成和发展的关GIBCO公司；CellCountingKit-8（CCK-8）购自键因素[4]。A$可能通过激活细胞自身基因程序引日本同仁化学研究所（DojindoLaboratories,起神经元凋亡。A%是由&淀粉样前体蛋白（APP）Kumamoto,Japan）；荧光染料Hoechst33258和代谢而来的’淀粉样肽，其中第25~35位氨基酸A,25-35购自Sigma公司；转染试剂Lipofectin构成的肽——A(25-35在体外水溶液中可形成稳定的reagent购自Inv

6、itrogen公司，质粒pSCAT3由Dr.聚集，呈)-片层状二级结构，具有神经毒作用，Miura惠赠[9]，pFRET-Bid由Dr.Onuki惠赠[10]。常用来构建AD模型。红景天甙（salidroside，1.1.2仪器Sal）是藏药红景天属植物的主要成分之一[5,6]。近使用的仪器有酶联免疫检测仪（DG5032,中年来的药理学研究表明，红景天甙具有较强的抗氧国南京华东电子集团医疗装备有限责任公司），激化性和明显的抗衰老、抗病毒、抗辐射作用[7,8]，已运用于临床并取得较好的治疗效果，但对其作用机收稿日

7、期:2006-06-24理缺乏深入研究。基金项目：国家自然科学基金面上项目（60378043，30470494，30670507），广东省自然科学基金项目本文利用30μmol/LA*25-35诱导PC12细胞凋（015012，04010394）及广东省科技计划项目（2004B10401011）亡以建立阿尔茨海默病细胞模型，采用荧光共振能通讯作者：邢达，电话：(020)852110089，量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer，E-mail：xingda@scnu.edu.

8、cn416生物物理学报2006年光共聚焦显微镜（LSM510/ConfoCor2,Zeiss,Ger-1.2.4CellCountingKit-8测定红景天甙提高many），微型CO2细胞培养箱（Tempcontrol37-2A&25-35处理PC12细胞的存活率digital，Zeiss，Germany）和数码相机（Nikon用0.25%胰蛋白酶消化PC12细胞，用含10%coolp