国家标准：gbt 14926.46-2008 实验动物 钩端螺旋体检测方法

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1、ICS65．020．30B44囝宦中华人民共和国国家标准GB／T14926．46—2008代替GB／T14926．462001实验动物钩端螺旋体检测方法Laboratoryanimal--MethodforexaminationofLeptospiraspp．2008-12-03发布2009—03—01实施宰瞀粥紫瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会议19刖罱GB／T14926．46—2008GB／T14926《实验动物》共54个部分，为不同微生物和病毒检测技术方法。本部分自实施之日起代替GB／T1492

2、6．46—2001《实验动物钩端螺旋体检测方法》。本部分与GB／T14926．46—200l相比主要技术差异如下：a)原理部分增加显微镜凝集试验原理；b)原标准中“6．1试管凝集实验”修改为“显微镜凝集实验”；“6．1．2．2表1钩端螺旋体定量显凝试验操作方法”更改为“钩端螺旋体定量显微镜凝集试验操作方法”；c)修改原标准中所有关于酶联免疫吸附试验的内容；d)在原标准中增加了“7结果判定”。本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口。本部分由全国实验动物标准化技术委员会负责起草。本部分主要起草人：范薇、

3、田克恭、贺争鸣。本部分所代替标准历次版本发布情况为：——GB／T14926．46—2001。实验动物钩端螺旋体检测方法GB／T14926．46—20081范围GB／T14926的本部分规定了实验动物钩端螺旋体的检测方法。本部分适用于犬钩端螺旋体的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB／T14926的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用

4、文件，其最新版本适用于本部分。GB／T14926．42实验动物细菌学检测标本采集GB／T14926．43实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂GB／T14926．50实验动物酶联免疫吸附试验3原理钩端螺旋体抗原与相应特异性抗体相遇，在适宜的电解质存在下发生凝集现象，此种凝集一般须用暗视野显微镜检查。钩端螺旋体抗原与待检血清中的特异性抗体结合，形成抗原抗体复合物。此抗原抗体复合物仍保持其抗原活性，可与相应的第二抗体酶结合物结合。在酶的催化作用下底物发生反应，产生有色物质。颜色反应的深浅与待检血清中所含有的特异

5、性抗体的量成正比。4主要设备和材料4．1普通恒温培养箱。4．2实体显微镜。4．3恒温水浴箱。4．4高速离心机。4．5超声波细胞粉碎器。4．6酶标仪。4．7微量加样器，容量5pL～50pL和50pLy200pL。5培养基及试剂5．1犬型钩端螺旋体标准抗原。5．2标准阳性血清。5．3标准阴性血清。5．4生理盐水。5．5显微镜凝集抗原：各群钩端螺旋体标准株接种Korthof培养基，28℃培养5d～7d。取样作暗视野显微镜检查，每400倍视野不少于50条，运动活泼并无自凝现象者，可作为抗原。5．6ELISA抗原5．

6、6．1钩端螺旋体培养：各群钩端螺旋体标准株接种Korthof培养基，28℃培养5d～7d。】GB／T14926．46—20085．6．2生长良好的培养物用10000r／min离心30min，沉淀用PBS在相同条件下洗2次。5．6．3上述沉淀用PBS悬浮，超声波打碎后，10000r／min离心20rain，上清即为ELISA抗原。5．7酶结合物：辣根过氧化物酶标记羊或兔抗犬IgG抗体，辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A(SPA)。5．8阳性血清：钩端螺旋体免疫SPF犬所获得的血清，或自然感染犬后所获得的血清。5

7、．9阴性血清：无钩端螺旋体感染犬血清。5．10培养基和试剂溶液的配制：参照GB／T14926．43和GB／T14926．50执行。6检测方法6．1显微镜凝集实验6．1．1检测程序检测程序见图1。图1检测程序6．1．2操作步骤6．1．2．1采样采血、分离血清。采样方法参照GB／T14926．42执行。6．1．2．2血清稀释参照表1进行。表1钩端螺旋体定量显微镜凝集试验操作方法凹孔板编号123456789101l12生理盐水／mL0．160．1O．10．1待检血清／mL0．04／0．1夕0．1，0．1夕0．1／

8、0．1夕0．1≯弃去0．1阴性血清／mL0．1阳性血清／mL0．1标准抗原／mL0．1010．1O．1血清最终稀释度1／101／Z01／401／801／1601／320l／6401／12801／Z560GB／T14926．46—20086．1．2．2．1待检血清灭活：将待检血清以56℃水浴灭活30rain后备用。6．1．2．2．2取96孔板，第1孔加人生理盐水0．16mL，以后每孔加入生理盐水0．1mL，一直加到