HS∕T 13-2006 牛、羊、鹿源性成分鉴定方法 实时荧光PCR方法

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1、FICS65.120B40/49HS中华人民共和国海关行业标准HS/T13-2006牛、羊、鹿源性成分鉴定方法实时荧光PCR方法Identificationofbovine,sheep,goatanddeer-derivedmaterialsReal-timefluorescencePCRmethod2007-03-28发布2007-04-01实施中华人民共和国海关总署发布55HS/T13-20(施前昌本标准的附录A为贵料性附景.本标准囱中华人民共和国海关且署提税怔曹司提出.本标准囱中华人民共和国海关且署

2、政策法规司归口.本标准起草单位中华人民共和国大量海关.本标准主要起尊人z尹兵、李大志、孙刺.'HS/T13-2006牛、羊、鹿源性成分鉴定方法实时荧光PCR方法1范围本标准规定了牛、羊、鹿〈指牛、羊和鹿种属〉源性成分产品使用实时荧光PCR定性卦析方法的DNA的提取、事时荧光PCR方法.本标准适用于迸出口宫牛、羊、鹿源性成分产品的SYBR.GreenJ实时荧光PCR定性分析.2凰则按照本方法规定提取样品的DNA，应用~时荧光PCR技术针对特异性牛、羊、腹动物源性成分基因片段进行扩增，对目的基因进行扩增，反应

3、体系中加入SYBR.Green1醒合荧光!I;料.通过撞测目的基因是否有荧光信号的增幅来判断样晶中是否存在牛、羊、鹿动物lIl:性成分.井通过测量扩增产物的DNA融解温度判断li~主动物源性成分的种类.3术语、定义和缩醋语3.1术语和建立下歹rJ术语和定且适用于本标准3.,.1牛、草、醒理性成分bovine,sheep,90atanddeer.derivedmaterials牛、羊、鹿种属特异性DNA片段.3.1.2E时黄先PCRReal.TimeFluorescencePCR通过在PCR扩增过程中检测产

4、物的荧光信号积罩实时监测整个PCR进程.3.2组黯语下列缩略语适用于本标准BSA牛血清白蛋白(bovineserumalbumin)ddHrQ双蒸水(doubledistil1edwater)DNTP脱氧核糖核苦三碗酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)EDTA乙二胶四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacicl)GuSCN异硫辄酸肌(guanidiniumisothiocyanate)PCR章含酶链式反应(Polymerasechainreact盼的

5、Taq水生栖热菌(Tht!rmusaqualÍcu)TETris.CJ、EDTA缰冲液Tris三〈经甲基〉氨基甲烧(tri-hydroxymelhylaminomethane)TritonX-l00辛基茸氧基罪己氧乙醇4试剂和仪器4.1试荆和材料本标准使用下列试剂和材料:.)牛、草、鹿动物源性成分检测用引物〈对〉序列为正向引物S'-GATGCTCCGTTTGCGTGTA-3'E向引物S'-ACAGGCCTATTCCTAGCAAT-3'57HS/T13--<号006b)氯仿0)异丙醇d)70%乙醇e)裂解液

6、5mol!LGuSCN♂0.05mol!LTris-HCI,pH6.4;0.02mol!LEDTA.pH8.0;1.3%TritonX-IOO.。TE缓冲液10mmol/LTris-HCI,pH8.0;1mmol!LEDTA.pH8.O.g)ddH,Oh)TaqDNA噩告酶。dNTP"dATP、dTTP、dCTP、dGTPj)10XPCR缓冲撞100mmol!LKCI.160mmol/L(NH.):SO~，20mmol!LMgSO..200mmol!LTris-HCI(pH8剖.1%TritonX-lOO

7、.1mg/mLBSA.k)SYBReGreen1f在古荧光m料除另有规定外，其他试剂为分析纯或生化试剂，水为页菌去离于水.量童提ffi本标准使用的霸仿和异丙醇为有害和JJ摔在试剂.使用者应当在无明虫、通凤良好的环境中进行躁作。4.2恤器和世蔷本标准使用下列仪器和设备的离心帆，b)pHit,,)移液辑10严L、20μL、100μL、1000μhd)实时荧光PCR仪.5测定步禀5.1模桓DNA提取称取50mg经精畔的试样于1.5mL离心营中，加入200严LTE，泡匀6加入400μL裂解液，加400μL扭仿，混

8、匀10000rpm离心5min，取上清液ÞOo.8倍体飘异丙醇，沉淀10000rpm离心5min.奔上清液70%乙醇洗曲一眈，隙干;加入50μLTE，榕解沉淀.也可用市曹DNA提取试剂盒提取DNA模植.5.2l1;时黄先PCR扩增和检测且应悻事实时荧光PCR反应体巫见表1.理1离时荧光PCRIi应体罪试剂名称试剂成分加入量lμL)总反应体职20DNA模板{甜-200咱)11取的样品DNA2T呵DNA黯舍酶dNTPMixture