生化分离工程_苏海佳_第三章细胞破碎

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1、Chapter3CellDisruption第三章细胞破碎微生物的代谢产物多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，氨基酸等目标产物存在于在发酵液中。有些目标产物存在于生物体中。尤其是由基因工程菌产生的多数蛋白质不会被分泌到发酵液中，而是在细胞内沉积。脂类和一些抗生素也是包含在生物体中。目标产物就是细胞本身，如面包酵母。胞外胞内细胞细胞破碎是指：选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。胞外物质胞内物质发酵液预处理——澄清液收集菌体——细胞破碎——转入液相——碎片分离主要划分为两大类:化学法和机械法3·1细胞壁结构和化学组

2、成1.细菌的细胞壁所有的细菌细胞壁由坚固的骨架——肽聚糖组成1、肽聚糖由聚糖链借短肽交联而成，网状结构，使细胞有一定的形状和强度；2、短肽一般由4-5个氨基酸组成，常含有D-氨基酸与二氨基庚二酸；3、聚糖链由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸交替通过（1-4）糖苷健连接而成。短肽接在N-胞壁酸上，相邻的短肽交叉相连，形成网状。所有细菌都含有肽聚糖的网状结构。革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，约15-50nm，肽聚糖含量占40%一90%。其余是多糖和磷壁酸；革兰氏阴性菌的肽聚糖层约，外有一外壁层约8-l0nm，由脂蛋白和脂多糖及磷脂构成的

3、两层外壁层。革兰氏阳性菌的细胞壁比革兰氏阴性菌坚固，较难破碎。特点：破碎阻力：肽聚糖的网状结构网结构的致密程度和强度，与肽键的数量和交联度有关。Gram-negativeprocaryotes革兰氏阴性原核生物（E.coli）1、里层葡聚糖的细纤维——细胞壁的刚性骨架；2、覆盖在细纤维上的是一层糖蛋白；3、外层是由1，6—磷酸二脂键共价连接而成的网状结构的甘露聚糖；4、其内部有甘露聚糖—酶的复合物。2、酵母的细胞壁组成：由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质构成，比革兰氏阳性菌的细胞壁厚，更难破碎。例如，面包酵母的细胞壁厚约70nm。特点：

4、破壁阻力：壁结构交联的紧密程度和壁厚。植物细胞壁的主要组成成分是纤维素在初生壁上还有半纤维素和果胶质纤维素是由链状结构的-D-葡萄糖以1，4-葡萄糖苷键结合，纤维素分子束聚集——微纤丝——植物细胞壁的框架，而其他物质填充在微纤丝之间的空隙中——植物细胞壁的基本结构。在干燥植物体中纤维素约占总重的1/3一1/2。就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏(增大通透性)或破碎，释放其中的目标产物。细胞的大小，形状、聚合物的交联程度破碎细胞的目的影响破碎的因素：※3.2细胞破碎和产物释放原理利用化学、生化试剂或酶改变细胞壁或细胞膜的结

5、构，增大胞内物质的溶解速率，或完全溶解细胞壁，形成原生质体，在渗透压作用下，细胞膜破裂释放胞内物质。化学法压缩力和剪切力——高压匀浆、珠磨、撞击破碎、超声波破碎机械法主要有：酸碱处理、化学试剂处理、酶溶渗透压冲击法和冻结—融化法物理渗透法细胞破碎机理※3.3mechanicaldisruption机械破碎1、处理量大，破碎快，时间短，效率较高，工业规模的重要手段；2、作用力：挤压，剪切和撞击作用；3、在许多情况下，细胞内含物全部释放出来；4、由于机械搅拌产生热量，破碎要采用冷却措施。机械法破碎特点机械破碎主要的方法有珠磨法、高压

6、匀浆法、撞击破碎法和超声波等方法。1.高压匀浆法（high-pressurehomogenization）原理：利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速撞击造成细胞破裂，在高压匀浆器中，细胞经历了高速造成的剪切、碰撞和由高压到常压的突变，从而造成细胞壁的破坏，细胞膜随之破裂，胞内产物得到释放。高速匀浆破碎的动力学方程为：细胞破碎率S与操作压力P和循环次数N之间的关系。k为破碎速度常数上述参数随微生物种类和培养条件的不同而有所差异压力P可用动能表达：影响因素：细胞破碎率用包内产物释放率表示：1、压力、温度和通过匀浆器阀

7、的次数，操作压力影响最大。工业生产中常采用的压力为55－70Mpa。2、不同菌种，不同生长期以及不同培养条件。优点：1、操作参数少，且易于确定；2、样品损失量少，在间歇处理少量样品方面效果好3、适用于酵母和大多数细胞的破碎。适用范围：1、适用于酵母和大多数细菌细胞；2、细胞浓度可达20%；3、团状或丝状真菌易造成堵塞，一些易损伤匀浆阀，质地坚硬的亚细胞器一般不适用；4、需设置冷却装置。原理：细胞悬浮液与玻璃珠（或石英砂，或氧化铝）一起高速搅拌，研磨使细胞达到某种程度破碎，2.珠磨法（Beadmilling）作用力：剪切力层之间的

8、碰撞和磨料的滚动WSK卧式高效全能珠磨机ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机两种情况下，细胞破碎动力学可近似表示为：t：为细胞悬浮液在破碎室内的平均停留时间其中V为悬浮液体积m3，Q为悬浮液流量m3/S，S为破碎率，k为破碎速率常数，与许多因素有关。可采用间歇式与连续操