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《银屑平丸对小鼠银屑病样模型血清中TGF-β、IL-10表达的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
抑太十净＿ＨＵＮＡＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＣＨＩＮＥＳＥＭＥＤＩＣＩＮＥ硕士学位论文、＾学科专业：中医外科学研究方向：皮肤病与性病学研究生姓名：谢敬‘，元教授导师姓名：席建、职称学位类型：专业学位 分类号：R26学校代码：10541密级：公开学号：20153101湖南中医药大学硕士学位论文银屑平丸对小鼠银屑病样模型血清中TGF-β、IL-10表达的影响学科专业：中医外科学研究方向：皮肤病与性病学研究生姓名：谢敬导师姓名、职称：席建元教授学位类型：专业学位中国·湖南·长沙二零一八年五月 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文中不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南中医药大学或其他单位学位、证书而使用过的材料。与我共同对本研究所作过重要贡献的单位及个人均已在论文中作了明确说明并致谢。卜作者签名：１ｂ年月曰关于学位论文使用授权说明本人完全了解湖南中医药大学有关收集、保留及使用学位论、文的规定，即：学校可以采用复印缩印或其它手段保存学位论文可以公布学位论文的全部或部分内容，允许学位论文被查阅；和借阅学校可根据囯家或湖南省有关部门规定送交学位论文或？；通过国内有关权威机构收录论文全文，向社会提供信息服务。（保密论文在解密后守此规定）作者签名导师签名：、－ｉ以年月曰 中文摘要目的：观察银屑平丸对BALB/c小鼠背部银屑病样模型在皮损、组织病理、血清中转化生长因子-β（TGF-β）和白细胞介素-10（IL-10）表达上的影响，探讨银屑平丸治疗银屑病的可能作用机制。方法：将48只健康的BALB/c雄性小鼠随机分为6组，8只/组，分别记为空白组、模型对照组、雷公藤组、银屑平丸高、中、低剂量组。另取同批次4只小鼠先进行预实验造模，小鼠银屑病样模型成功后开始正式实验。所有6组小鼠背部脱毛后，给予空白组小鼠背部皮肤外涂凡士林，其余5组小鼠背部皮肤外涂咪喹莫特乳膏，均1次/d，连续外涂8d；同时予以相应药物进行灌胃干预，空白组及模型对照组予以生理盐水灌胃，雷公藤组、银屑平丸高、中、低剂量组则分别予以相应药物溶液进行灌胃，均1次/d，连续灌胃8天。末次给药24h后，观察并记录小鼠背部皮肤进行皮损面积和严重程度指数（psoriasisareaandserentyindex,PASI）评分；用ELISA法检测小鼠外周血清中TGF-β、IL-10水平；取小鼠背部皮肤组织做病理切片进行组织病理比较；在实验过程中观察并记录小鼠的一般情况。结果：（1）银屑平丸高、中、低剂量组、雷公藤组及模型对照组小鼠背部皮损PASI评分较空白组均有明显差异（P＜0.05）；银屑平丸高、中、低剂量组及雷公藤组小鼠背部皮损PASI评分较模型对照组均有明显差异（P＜0.05）；（2）银屑平丸高、中、低剂量组小鼠背部的皮损组织病理变化不同程度地轻于模型对照组；（3）银屑平丸高、中、低剂量组、雷公藤组及模型对照组小鼠外周血TGF-β、IL-10含量明显高于空白组（P＜0.05），差异有统计学意义；雷公藤组、银屑平丸高、中、低剂量组小鼠外周血TGF-β含量明显低于模型对照组（P＜0.05），差异有统计学意义；雷公藤组、银屑平丸高、中、低剂量组小鼠外周血IL-10含量明显低于模型对照组（P＜0.05），差异有统计学意义。结论:（1）银屑平丸可降低小鼠银屑病样模型皮损的PASI评分，可起到改善银屑病皮损的治疗作用；（2）模型对照组中小鼠外周血TGF-β、IL-10含量明显高于空白组，提示I 外周血清中TGF-β和IL-10与银屑病的发病有关；（3）银屑平丸能降低银屑病样模型小鼠外周血TGF-β、IL-10的表达，这可能是银屑平丸治疗银屑病的作用机制之一。关键词：银屑病；银屑平丸；TGF-β；IL-10；小鼠银屑病样模型II EffectsofYinxiepingPillsonTGF-β、IL-10ExpressionofinSerumofPsoriasis-likeBALB/cMiceModelsAbstractObjective:ToobservetheeffectwhichYinxiepingpillsonpsoriasis-likeBALB/cmicemodelsinskinlesions,histopathology,transforminggrowthfactorbetaaswellasinterleukin-10expressionandtoexplorethepossiblemechanismoftheYinxiepingpillsontreatingpsoriasis.Methods:Forty-eighthealthfulmaleBALB/cmicewererandomlydividedinto6groupswhichrespectivelywereblankgroup,modelcontrolgroup,Tripterygiumwilfordiigroup,YinxiepingPillshigh,middleandlowdosegroups,eightmiceineachgroup.Inaddition,4miceofthesamebatchareusingforpreexperimentfirst.Untilthemodelsuccessfullyconstructed,theexperimentbegins.Afterallthemiceweredepilatedontheback,thebackskinweregivenwithimiquimodcreamexcepttheblankgroupwithvaseline,1times/d,for8days.Atthesametime,thecorrespondingdrugsweregivenbygavage.Theblankgroupandthemodelcontrolgroupmiceweregivenphysiologicalsalinebygavage.Tripterygiumwilfordiigroup,YinxiepingPillshigh,middleandlowdosegroupsmiceweregiventhecorrespondingdrugsolutionbygavage1times/d,for8days.Afterthelastadministrationfor24hours,thepsoriasisareaandseverityindex(PASI)scoreoftheskininthebackofmicewasobserved；ThelevelsofTGF-βandIL-10inserumweredetectedbyELISAmethod.Theskintissueofthebackweretakenaspathologicalsectionstocomparethehistopathology.Andinthewholeexperiment,recordthegeneralsituationofmice.Results:(1)ThePASIscoreoftheskininthebackofpsoriasis-likeBALB/cmiceofYinxiepingPillshigh,middle,lowdosegroups,tripterygiumwilfordiigroupandmodelcontrolgroupcomparedwithblankgrouphadsignificantdifferences(P<0.05).ThePASIscoreoftheskininthebackofpsoriasis-likeBALB/cmiceofYinxiepingPillshigh,middle,lowdosegroupsandtripterygiumwilfordiigroupcomparedwithmodelcontrolgrouphadsignificantdifferences(P<0.05).(2)ThehistopathologicalchangesinskinlesionsofYinxiepingPillshigh,middleandlowdosegroupstovaryingdegreestolighterthanthemodelcontrolgroup.(3)ThecontentofTGF-betaandIL-10inYinxiepingPillshigh,middle,lowdosegroups,tripterygiumwilfordiigroupandmodelcontrolgroupmice’speripheralbloodwassignificantlyhigherthantheblankgroup(P<0.05).ThecontentofTGF-βinYinxiepingPillshigh,middle,lowdosegroupsandtripterygiumwilfordiigroupmice’speripheralbloodwassignificantlylowerthanthemodelcontrolgroup(P<0.05),thedifferencewasstatisticallysignificant.ThecontentofIL-10inYinxiepingPillshigh,middle,lowdosegroupsandtripterygiumwilfordiigroupmice’speripheralIII bloodwassignificantlylowerthanthemodelcontrolgroup(P<0.05),thedifferencewasstatisticallysignificant.Conclusion:(1)YinxiepingpilslcanreducethePASIscoreofpsoriasis-likemicemodelsinskinlesions,anditcanimprovepsoriaticskinlesions.(2)ThecontentofTGF-βandIL-10inmodelcontrolgroupmice’speripheralbloodwassignificantlyhigherthantheblankgroup,itshowsthatTGF-betaandIL-10inperipheralbloodareassociatedwiththepathogenesisofpsoriasis.(3)YinxiepingPillscanreducethecontentofTGF-βandIL-10inpsoriasis-likemice’speripheralblood,itisprobablyoneofthemechanismsofYinxiepingpillsinthetreatmentofpsoriasis.Keywords:psoriasis;Yinxiepingpills;TGF-β;IL-10;psoriasis-likeBALB/cmicemodelIV 目录中文摘要.........................................................................................................................IAbstract.......................................................................................................................III引言............................................................................................................................1正文............................................................................................................................3第一部分实验材料......................................................................................................31.1实验动物..........................................................................................................31.2实验药物..........................................................................................................31.3实验主要试剂与仪器......................................................................................3第二部分实验方法......................................................................................................42.1分组..................................................................................................................42.2造模与给药......................................................................................................42.3模型评价.........................................................................................................42.4标本与取材.....................................................................................................52.5观测指标.........................................................................................................52.6制作皮肤组织石蜡切片.................................................................................52.7统计学方法.....................................................................................................6第三部分实验结果与分析........................................................................................73.1小鼠一般情况.................................................................................................73.2模型组BALB/c小鼠皮损随时间变化情况...............................................73.3各组小鼠皮损PASI评分的比较...................................................................73.4组织病理观察..................................................................................................83.5各组小鼠血清中细胞因子TGF-β、IL-10表达的比较...............................9第四部分讨论........................................................................................................114.1银屑病动物模型............................................................................................114.2中医对银屑病的认识及治疗.......................................................................124.3现代医学对银屑病的认识及治疗................................................................144.4导师对于银屑病的认识................................................................................174.5银屑平丸现代药理学研究............................................................................18 4.6银屑平丸作用机制的研究............................................................................184.7问题与展望....................................................................................................21结论......................................................................................................................22致谢..........................................................................................................................23参考文献......................................................................................................................24综述..............................................................................................................................31 引言银屑病是一种皮肤表现为红斑、鳞屑为主的病程长易反复发作的免疫性炎症性皮肤病，中医称之为“白疕”，也俗称“牛皮癣”。临床上把该病常分为四种类型，即寻常型、脓疱型、关节型和红皮病型。寻常型银屑病是银屑病中最常见的一类，以急性发病、呈点滴状、斑块状为特点，损害可发生于全身各处，波及范围可局部或广泛，头皮、四肢伸侧皮肤多见，指（趾）甲及粘膜亦可侵及。典型皮损为红色或棕红色斑块，边界清楚，基底部浸润明显，表面覆盖多层干燥银白色鳞屑，将表层鳞屑轻轻刮除后，可见底部一层半透明薄膜，继续刮除薄膜则出现点状出血。世界各地对银屑病发病率的统计分析显示，不同人种之间患病率有差异性，相较而言，白种人患病率高于黑种人，欧洲国家患病率约为1.1%～1.5%[1]，美国1996年报道的银屑病患病率为2.6%[2]，而中国、日本等亚洲国家则相对较低。我国1984年进行的全国银屑病流行病学调查显示，标化患病率为0.123%，在2008年的又一次大规模调查中，则显示患病率达到0.47%，这表明我国银屑病的患病率在逐渐升高。[3]而寻常型银屑病因其影响个人外观、易反复发作，并有可能转化为另外三种类型，给患者的身体及心理带来极大痛苦。国内外对该病病因及发病机理仍处于研究阶段，暂未能完全阐明。寻常型银屑病组织病理表现为皮肤的角质增厚，角化不全、细胞中夹杂空气间隙，角化过度、颗粒层变薄或消失，棘层增厚，真皮上端毛细血管向表皮游走、血管迂曲扩张，并伴有炎细胞的浸润。大量的研究表明，银屑病的发病与多因素密切相关，主要为遗传、免疫、感染、内分泌、神经精神因素、生活习惯、药物、环境因素等。其中，免疫因素参与了银屑病的发生、发展过程。在早期研究中认为，银屑病存在T淋巴细胞亚群Thl/Th2的失衡，Thl型细胞及其细胞因子在免疫中占优势，而Th2则功能相对减弱。随着研究的深入，逐渐发现更多的T淋巴细胞亚群也参与到了银屑病的发病过程中，Th17/Treg的失衡是当今研究热点。调节性T细胞（Treg）是最新发现的一类具有免疫抑制功能和调节功能的细胞群，对于体内免疫稳态的维持至关重要。银屑病至今尚无确切根治方法，现代医学治疗手段主要有外用药物、物理治疗、系统用药、生物制剂等，尽管治疗有多样化，但仍无法彻底治愈，易复发，1 免疫抑制剂的使用则有较大副作用。我国古今医家经过长期对该疾病的观察、分析，对银屑病有着出丰富的理论及治疗经验，银屑平丸是我院长期临床治疗银屑病的经验总结，并结合现代药理学研究的最新成果筛选组方研制而成。其功效主要为凉血养阴、活血解毒。导师在多年临床治疗银屑病中运用本方及本方加减，取得了较好的疗效，并且不良反应少，安全性可靠。在我们前期研究中，银屑平丸不仅可以改善患者临床症状，还可调节细胞免疫水平。本实验在前期研究基础上，通过建立咪喹莫特乳膏诱导的小鼠银屑病样模型，观察银屑平丸对其在皮损、组织病理、血清中转化生长因子-β（TGF-β）和白细胞介素-10（IL-10）表达上的影响，探讨银屑平丸治疗银屑病的可能作用机制，为中医药治疗银屑病提供一定的实验依据。2 正文第一部分实验材料1.1实验动物选取52只SPF级BALB/c雄性小鼠，体质量18~20g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK(湘)2016-0002。小鼠饲养于湖南中医药大学SPF级动物实验中心，小鼠喂养的普通饲料及饮用水均由实验中心提供，饲养温度为18-24℃，予以定期投食、更换垫料，笼具定期换洗消毒。本实验过程符合动物伦理学标准。1.2实验药物①银屑平丸，规格：60g/瓶，药物组成：生地黄、牡丹皮、紫草、丹参、白花蛇舌草、半枝莲、大青叶、山药、女贞子、旱莲草、白鲜皮、甘草，为湖南中医药大学第一附属医院医院制剂，批号20170605；②雷公藤多苷片，规格：10mg/片，为湖南千金协力药业有限公司生产；③生理盐水，规格：100ml/瓶，为湖南中医药大学第一附属医院提供；④5%咪喹莫特乳膏，规格：5g/支，为湖北科益药业股份有限公司生产；⑤凡士林，为湖南中医药大学第一附属医院提供；将银屑平丸及雷公藤多苷片分别粉碎后，用蒸馏水溶散（详见造模与给药）。1.3实验主要试剂与仪器TGF-β、IL-10的ELISA试剂盒（江苏晶美生物科技有限公司，批号20170710008）；10%多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司）；酶标仪(芬兰LabsystemsMultiskanMS)；Shandon325型石蜡切片机（Shandon公司）；LEICADMLB2型双目显微镜（LEICA公司产）；MIAS医学图像分析系统（北航公司产）；亚甲蓝（湖南中医药大学第一附属医院提供）。3 第二部分实验方法2.1分组将48只BALB/c小鼠随机分为6组，8只/组，用亚甲蓝分别标记每组小鼠的头部、左耳、右耳、左前腿、右前腿、左后腿、右后腿、尾部以区分。分别为空白组：生理盐水灌胃+凡士林乳膏外涂；模型对照组：生理盐水灌胃+5%咪喹莫特乳膏外涂；雷公藤组：雷公藤多苷溶液灌胃+5%咪喹莫特乳膏外涂；银屑平丸高剂量组：银屑平丸高剂量溶液灌胃+5%咪喹莫特乳膏外涂；银屑平丸中剂量组：银屑平丸溶液中剂量灌胃+5%咪喹莫特乳膏外涂；银屑平丸低剂量组：银屑平丸溶液低剂量灌胃+5%咪喹莫特乳膏外涂。2.2造模与给药预实验：4只小鼠背部去毛后予以咪喹莫特乳膏外涂，自由取食、饮水，无其他特殊处理，8天后观察背部皮损，处死小鼠后取皮损做组织病理切片，查看造模是否成功。正式试验：48只小鼠均予以背部去毛约2cm×3cm，空白组予凡士林外涂，其余5组小鼠均予5%咪喹莫特乳膏外涂，均1次/d，每次62.5mg，连续8d。同时，空白组及模型对照组予以生理盐水灌胃；雷公藤组予以灌服浓度为10mg/kg的雷公藤多苷溶液；银屑平丸高、中、低剂量组分别予以灌服浓度相应高、中、低剂量的银屑平丸溶液，均1次/d，每次0.4ml，连续8d。银屑平丸人临床日用量为45g生药，按60kg体质量计算，用药量为0.75g/kg，按照动物实验剂量与体表面积折算，小鼠的银屑平丸药物等效剂量为6.49g/kg，此为中剂量。高剂量则是中剂量两倍，低剂量则为中剂量的一半，分别为12.98g/kg、3.25g/kg。雷公藤多苷片，换算为小鼠临床等效剂量是10mg/kg。2.3模型评价观察并拍照记录小鼠背部皮损，通过PASI评分法、光镜下查看小鼠皮损组织病理切片的病理表现来评价。4 2.4标本与取材末次给药24h后，各组小鼠予以摘除眼球取血，每只收集0.8~1mL血液，取血后立即予2000r/min离心10分钟，吸取上层血清保存在-20℃环境，用于本实验细胞因子的检测。并断颈处死小鼠，用九宫格法取1cm*1cm面积大小背部皮损置于10%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，用于本实验行组织病理切片。2.5观测指标2.5.1小鼠一般情况包括小鼠精神状态、活跃程度、进食量、存活率等。2.5.2皮损PASI评分依据PASI评分标准，因皮损面积均为背部，不予考虑面积百分比，记录小鼠皮损处红斑、鳞屑及浸润肥厚程度分别记0～4分，三者得分相加记为总积分。标准如下：0分，无红斑、鳞屑或与皮肤平齐；1分，轻度，见淡红斑、少许细微鳞屑或皮损稍高于皮肤；2分，中度，见红色斑块、皮损表面覆有呈片状的鳞屑或皮损中度隆起；3分，重度，见深红色斑块、几乎全部皮损表面覆有较厚呈层状的鳞屑或皮损明显隆起；4分，极重度，见极深红色斑块、全部皮损表面均覆很厚呈层状的鳞屑或皮损增厚隆起极为明显。2.5.3组织病理观察观察小鼠皮损组织病理切片经HE染色后在光镜下的病理表现，若出现过度角化、角化不全，颗粒层变薄或消失，棘层增厚，表皮突延长，炎性细胞浸润，毛细血管扩张，或角质层可见Munro微脓肿，类似银屑病样的组织病理形成则提示造模成功。2.5.4各组小鼠血清中细胞因子TGF-β、IL-10的检测按照ELISA试剂盒操作说明检测小鼠血清TGF-β、IL-10的含量，酶标仪检测。2.6制作皮肤组织石蜡切片（1）固定：取小鼠皮损组织尽快置于10%多聚甲醛中固定，时间至少24小时。5 （2）经梯度乙醇脱水：由低浓度开始，顺序为70％乙醇4小时、80％乙醇2小时、90％乙醇2小时，95％乙醇4小时、100％乙醇1小时。（3）透明：放入二甲苯中4小时。（4）浸蜡：放入熔化的54℃软蜡内浸渍半小时，54℃硬蜡浸渍1小时。（5）包埋：将包含组织的熔化状石蜡缓缓倒入包埋框，可用镊子轻轻压平使其不留气泡，待石蜡凝固后投入冷水中加速冷却。（6）切片：用切片机切至厚为5-7μm。（7）染色：采用常规HE染色，二甲苯脱蜡两次各15分钟、等比的二甲苯和无水乙醇中2分钟、100%乙醇两次各5分钟、80%乙醇5分钟、蒸馏水5分钟、苏木精染色5分钟、水洗10分钟、1%盐酸乙醇30秒、水洗30秒、蒸馏水过洗5秒、0.5%伊红液染色3分钟、蒸馏水稍洗30秒、80%乙醇稍洗30秒、95%乙醇两次各1分钟、100%乙醇两次各3分钟、二甲苯两次各3分钟，用中性树胶封固。（8）在光镜下观察，并选取典型组织病理图片。2.7统计学方法本实验数据采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。符合正态分布和方差齐性的计量资料采用多样本单因素方差分析，不满足正态分布和方差齐性则采用Kruskal-WallisH检验进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。6 第三部分实验结果与分析3.1小鼠一般情况各组小鼠实验完毕均存活，空白组小鼠精神状态可，活跃度高，饮食正常。模型对照组小鼠对比可见精神状态较差，活跃度一般，进食量减少。雷公藤组及银屑平丸各组小鼠则基本介于空白组及模型对照组之间。3.2模型组BALB/c小鼠皮损随时间变化情况实验过程中，观察并记录模型对照组小鼠第1、3、5、8天背部皮肤皮损变化，第8天皮损处皮肤可见明显红斑、鳞屑及肥厚的银屑病样改变。见图1。第1天第3天第5天第8天图1模型组BALB/c小鼠外涂5%咪喹莫特乳膏后皮肤形态变化图3.3各组小鼠皮损PASI评分的比较本数据空白组不满足正态分布，使用Kruskal-WallisH检验，结果为X2=33.152,P=0.00＜0.05，各样本对应的总体均数不全相等。除空白组外，第2至6组数据满足正态分布，方差齐性检验P=0.516＞0.05，满足方差齐性条件。方差分析结果为F=8.386，P=0.00＜0.001，各样本对应的总体均数不全相等，采用SNK-q检验进行多重比较。（1）与空白组比较，模型对照组、雷公藤组、银屑平丸各组差异均具有统7 计学意义（P＜0.05），提示外涂咪喹莫特乳膏的5组小鼠皮损PASI评分均明显高于外涂凡士林乳膏的空白组PASI评分。（2）与模型对照组比较，雷公藤组、银屑平丸各组差异均具有统计学意义（P＜0.05），提示雷公藤组、银屑平丸各组小鼠皮损PASI评分较之模型对照组均下降。（3）雷公藤组与银屑平丸高、中、低剂量组进行两两比较，PASI评分差异均无统计学意义（P＞0.05），提示雷公藤组与银屑平丸各组对小鼠皮损PASI评分的改善情况无明显差别。见表2。表2各组小鼠皮损PASI评分的比较（x±s）组别例数（n）PASI评分空白组80模型对照组85.88±0.835▲雷公藤组83.50±0.926▲银屑平丸低剂量组84.38±0.744▲银屑平丸中剂量组83.63±0.916▲银屑平丸高剂量组84.00±1.195▲注：雷公藤组、银屑平丸各组与模型对照组比较，p＜0.05。3.4组织病理观察空白组小鼠皮损表皮平坦，角质层较薄，颗粒层1~3层，棘层为3~5层多角细胞，基底层为单层柱状细胞。模型对照组表皮规则性向下延伸，其下部增厚，整体呈棒状，并伴有不同程度角化过度、角化不全，颗粒层减少或消失，棘层增厚，真皮中有轻度至中度的淋巴细胞浸润。见图2。8 图A-F分别为空白组、模型对照组、雷公藤组、银屑平丸低、中、高剂量组图2各组小鼠皮肤病理切片光镜图(HE染色×200)3.5各组小鼠血清中细胞因子TGF-β、IL-10表达的比较（1）各组小鼠血清中细胞因子TGF-β含量满足正态分布，方差齐性检验P=0.544＞0.05，满足方差齐性条件。方差分析结果为F=25.265，P=0.00＜0.001，各样本对应的总体均数不全相等，采用SNK-q检验进行多重比较。与空白组比较，模型对照组、雷公藤组、银屑平丸各组差异均有统计学意义（P<0.05）；与模型对照组比较，雷公藤组、银屑平丸各组差异均有统计学意义（P<0.05）；雷公藤组与银屑平丸高、中剂量组进行两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型对照组中小鼠外周血TGF-β含量明显高于空白组，提示外周血清中TGF-β与银屑病的发病有关；银屑平丸高、中剂量与雷公藤多苷片均能降低银屑病样模型小鼠外周血TGF-β的含量。（2）各组小鼠血清中细胞因子IL-10含量满足正态分布，方差齐性检验P=0.332＞0.05，满足方差齐性条件。方差分析结果为F=30.564，P=0.00＜0.001，各样本对应的总体均数不全相等，采用SNK-q检验进行多重比较。与空白组比9 较，模型对照组、雷公藤组、银屑平丸各组差异均有统计学意义（P<0.05）；与模型对照组比较，雷公藤组、银屑平丸各组差异均有统计学意义（P<0.05）；雷公藤组与银屑平丸高、中、低剂量组进行两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型对照组中小鼠外周血IL-10含量明显高于空白组，提示外周血清中IL-10与银屑病的发病有关；银屑平丸高、中、低剂量与雷公藤多苷片均能降低银屑病样模型小鼠外周血IL-10的含量。见表3。表3各组小鼠血清中细胞因子TGF-β、IL-10的含量（x±s）组别例数（n）TGF-β(ng/L)IL-10(pg/mL)空白组8212.97±17.81870.65±40.00★●模型对照组8310.63±16.981301.32±55.65★■●◆雷公藤组8255.17±26.911090.54±71.74★■●◆银屑平丸低剂量组8289.89±17.981081.88±96.73★■●◆银屑平丸中剂量组8277.33±13.651051.34±87.29★■●◆银屑平丸高剂量组8275.43±17.001050.26±53.33F值25.26530.564注：★TGF-β组其他各组与空白组比较，P＜0.05；雷公藤组、银屑平丸各组与模型■对照组比较，P＜0.05。●IL-10组其他各组与空白组比较，P＜0.05；雷公藤组、银屑平丸各组与模型对◆照组比较，P＜0.05。10 第四部分讨论4.1银屑病动物模型4.1.1生物医学型动物模型某些动物在正常生理状态下，部分组织表现出类似人银屑病样的组织学改变，如小鼠尾部的鳞片表皮自身结构缺乏颗粒层，与银屑病的表皮类似有角化不全的特点[4]，根据该特性，研究者[5,6]认为若药物可促进鼠尾表皮细胞颗粒层生成，则可能改善银屑病皮损症状。以此来评价药物疗效。有学者[7,8]利用该模型分别进行维甲酸软膏和卡泊三醇外涂的干预实验，组织病理切片分析表明两种药物均可促进颗粒层生成，改善表皮细胞的角化不全。4.1.2药物诱发性动物模型利用某些药物人工外涂至动物皮肤，使其诱发银屑病样改变。该类模型常用的有咪喹莫特乳膏外涂小鼠背部皮肤、普萘洛尔外涂豚鼠耳部及背部皮肤诱发病变。咪喹莫特是Toll样受体的激动药，可诱导产生多种如干扰素、肿瘤坏死因子等细胞因子，使表皮产生炎性鳞屑性皮损，病理表现为角化过度或不全、表皮异常分化、炎细胞浸润等类银屑病样改变。[9]4.1.3异种移植动物模型将银屑病患者的皮损以手术方式移植于先天性无胸腺的裸鼠背部构建动物模型。该模型较好的展现了银屑病的组织病理学特点和皮损特征，但移植皮肤的表皮增殖及炎性浸润等特点仅能维持一段时间，并且存在排异反应、可能感染、价格昂贵等局限性。[10,11]4.1.4自发性动物模型指因自身突变产生与人类银屑病类似的皮损特征的动物模型，如缺皮脂突变鼠、鳞片状皮肤突变鼠[12]。但该模型皮损处缺乏T淋巴细胞，并且使用免疫抑制剂治疗症状无改善，故而临床实验研究中有局限性。4.1.5转基因动物模型指通过转基因技术将外源基因与受体动物基因整合而培育出的动物模型。如11 角蛋白5-STAT3（K5-STAT3）转基因模型[13]、角质形成细胞-血管紧张素受体（KC-Tie2）转基因模型[14]，均能从不同方面模拟出人类银屑病的病理生理，对于银屑病与靶向药物、细胞因子的相关研究有重要意义。4.1.6鼠皮肤三维模型由Soboleva[15]等从小鼠的皮肤中提取出表皮细胞构建该模型。在模型中加入肿瘤坏死因子、干扰素等促炎细胞因子后，模型可出现类似银屑病的组织病理改变，对研究银屑病的发病机制有积极作用。上述的主要几种动物模型均能从不同方面展现银屑病的某些特征，但迄今为止，并没有一种模型能完全模拟出人类银屑病的自然发生、发展过程。本实验中采用咪喹莫特乳膏诱发小鼠表皮产生银屑病样改变，因该建模方法较可靠、所需时间短、操作方便，且组织病理与人类银屑病接近，适用于普通实验[16]。近期也有较多利用该模型评价药物疗效的研究[17-20]，但该模型有时间窗的限制，在造模第6至8天时表现出最为典型的银屑病样病理学改变，但8天后继续外涂咪喹莫特皮损可自行逐渐消退，故实验中均采用造模与药物干预同时进行。4.2中医对银屑病的认识及治疗4.2.1古代中医对银屑病的认识银屑病相当于中医学的“白疕”，银屑病一词正式作为该病病名是由1940年上海医科大学杨国亮教授提出并被公认的，在此之前，查阅大量文献可知银屑病在古籍中有“白疕”、“干癣”、“蛇虱”、“风癣”、“顽癣”等异名。最早有类似银屑病记载的出处如《诸病源侯论·卷三十五·干癣侯》[21]中：“干癣，但有匡郭。皮枯索，痒，搔之白屑出是也。”《证治准绳》中首次记载有白疕：“遍身起风疹疥丹之状，其色白不痛，但搔痒，抓之起白疕，名曰蛇虱。”但白疕单独作为病名则出现于清代祁昆的《外科大成》[22]中：“白疕：形如疹疥。色白而痒。搔起白疕。俗呼蛇风。由风邪客于皮肤。血燥不能荣养所致”。在早期医家认为本病主要由外因引起，局限于“六淫”中“风”、“寒”、“湿”邪合而为病。到了明清时期，中医学理论经历了快速发展，逐渐认识到本病是由内外因共同作用所致。如明代陈实功认为本病病因外因有“风、热、湿、虫”，内因12 为“血燥”，述于《外科正宗·卷之四·顽癣第七十六》[23]中：“顽癣，乃风、热、湿、虫四者为患……风癣如云朵，皮肤娇嫩，抓之则起白屑……总皆血燥风毒克于脾、肺二经”。4.2.2近现代中医对银屑病的认识近现代医家在继承了前人对银屑病病因病机认识的基础上，经过了长期对该疾病的观察、分析及临床治疗经验的总结，不断发展、完善，使该病理论逐渐趋于成熟。现多认为血分有热是银屑病发病的主要内因，兼以风、寒、湿、燥诸邪或禀赋不足、饮食失节、七情内伤，相搏于肌表化热化毒而发病。目前多以血热、血燥、血虚、血瘀四种证型为主，多数医家从血热立说，血热论也得到较多中医名家的一致认同。朱仁康先生认为“血分有热”是银屑病的主要发病原因，患者素体血中蕴热，加之复感风热毒邪，阻于肌肤，郁而化热，内入营血，外发体肤而致红斑、鳞屑[24]。赵炳南先生认为血热是银屑病发病的关键，多因情志内伤致气机壅滞，郁久化火；或饮食失节致脾胃受损，郁久化热；或外感风热燥邪客于肌肤所致，病程日久，邪热稽留，则耗伤阴血，以致阴虚血燥[25]。医家张志礼及庄国康教授均认同该学说[26,27]。从血燥立论的医家杨嘉鑫认为，风寒湿热等各种原因可引起五脏功能的失调，伤营耗血，营血亏虚，生风生燥而致肌肤失养发为本病[28]。从血虚立论的医家顾伯华则认为本病初起多因风寒或风热之邪侵袭肌表，病久则气血耗伤营血亏损，而致血虚生风肌肤失养；或肝肾亏虚，冲任失调，营血亏虚则更甚[29]。从血瘀而论的医家丁履伸认为外来风热之邪侵袭肌肤，邪气结聚，气血运行不畅而致气滞血瘀，肌肤失养从而发生皮疹鳞屑等改变。禤国维教授在银屑病的临床治疗过程中则强调血瘀病机贯穿银屑病发展的始终[30]。此外，还有医家金起凤提出的血热毒盛证型[31]；杨志波教授认为本病与精神因素、情志刺激密切相关；许铣教授提出的血瘀风燥[32]；李相玉等从卫气营血理论辨证施治[33]；以及从“玄府”论治等方法。均是对以上几种主要学说的补充，丰富了银屑病的中医理论。4.2.3银屑病的中医治疗（1）内治法中医内治法原则[34]为辨证论治，根据银屑病的发生、发展特点及临床症状体征，可分为三种基本证型：血热证、血燥证和血瘀证，在此基础上可加用其他多13 种辨证方法，如夹杂外感因素者，可对应予以祛风散寒法或疏风清热法。血热证相关证型有：风热证、风热血燥证、血热内蕴证，主症见皮损颜色鲜红、皮疹有新发不断增多或迅速扩大，相当于银屑病的进行期。血热证治以应清热凉血解毒，代表方犀角地黄汤加减。血燥证相关证型为血虚风燥证，主症见皮损颜色淡红、鳞屑较干燥，相当于银屑病的稳定期。血燥证治以宜养血润燥解毒，代表方当归饮子加减。血瘀证相关证型有：瘀滞肌肤证、气滞血瘀证，主症见皮损颜色暗红、皮损肥厚浸润、经久不消，多见于银屑病的稳定期或消退期。血瘀证治以应活血化瘀解毒，代表方桃红四物汤加减。根据辨证的不同，名老中医创建了几种在临床中疗效较好的组方[35]，赵炳南先生用于治疗血热型银屑病的白疕1号方有清热凉血活血之效；用于治疗血燥型银屑病的白疕2号方可养血润肤、活血祛风。朱仁康先生治疗血热型银屑病使用可清热凉血、祛风解毒的土茯苓汤；治疗血燥型银屑病则用可养血活血、滋阴润燥的克银一方；治疗红皮病型银屑病的皮炎汤可清营凉血、解毒消斑。张志礼教授治疗血热型银屑病，用凉血活血汤以清热凉血、活血解毒。禤国维教授治疗血虚风燥型银屑病用银屑灵片以养血润燥、凉血解毒。另外，中成药克银丸、银屑胶囊、消银颗粒、银屑灵颗粒等，均有一定的临床疗效[36]。（2）外治法银屑病的中医外治主要有中药治疗、针灸治疗以及综合治疗[37]。中药治疗包括涂擦疗法、中药熏蒸、熏药疗法、中药封包、中药溻渍、中药药浴等，应根据病情的不同选择，如皮损面积较小，可选用膏剂和霜剂的外用药涂擦，如具有清热凉血解毒等功效的紫连膏、普连膏、青黛散油膏；中药熏蒸、熏药疗法不适用于急性期以免加重皮损；中药封包适用于皮损较厚的静止期以利于药物吸收。针灸治疗包括火针疗法、针刺、刺血拔罐、火罐、穴位埋线、放血疗法等，对于改善银屑病皮损均有一定疗效。4.3现代医学对银屑病的认识及治疗4.3.1病因及发病机制（1）遗传因素国内有对1043例寻常性银屑病患者及其家族成员进行的遗传流行病学调14 查，显示一、二级亲属的患病率分别是7.24%、0.95%，明显高于一般人群[38]。Farber[39]等对双生子的银屑病患者调查发现，同卵双生子的患病率为63%，异卵双生子患病率为23%，并且同卵双生子在发病症状及年龄上相近。大量临床研究都证实遗传是银屑病发病的重要因素之一，并且该病符合多基因遗传病模式[40]。近年来，国内外学者利用全基因组关联研究（Genome-WideAssociationStudy，GWAS）技术，一种在全基因组范围内开展的大样本、多中心、反复验证的基因与疾病的关联研究，先后鉴定了21个银屑病易感基因。关于遗传因素对于银屑病发病机制的研究仍在不断深入并时有进展。（2）免疫因素银屑病的皮损处有大量的炎性细胞及T淋巴细胞的浸润，Littman等[41]将银屑病皮损区分离出的T淋巴细胞注入至非皮损区后，可出现银屑病的病理表现，这均表明免疫因素也是银屑病发病的重要原因之一。目前对银屑病的免疫学研究主要集中在辅助性T细胞（Thelpercell，Th）如Th1、Th2、Th17、Th22和调节性T细胞（Tregulatorycell，Treg）及其细胞因子网络等方面。抗原被表皮中朗格汉斯细胞识别后被内化，与淋巴结中初始T细胞相互作用，使其转化为效应T细胞进入循环至皮肤，分泌一系列炎症性细胞因子如IL-1、TNF-α等，同时血管内皮黏附因子表达增加，使炎细胞聚集在损害处。激活的T细胞分泌IFN-γ促进角质形成细胞进一步产生血管内皮黏附因子及其他炎症因子的分泌如IL-1、IL-6、IL-8等，其中IL-1又可反馈活化T细胞、诱导其他细胞因子的产生，放大炎症免疫级联反应。[42]Treg细胞是一类具有抑制免疫和调节功能的细胞，不仅有助于防止自身免疫疾病的发生，还能够减轻病原体引起的炎症和损害。Treg细胞主要分泌TGF-β、IL-10等细胞因子，最新研究表明银屑病患者外周血存在Treg细胞及相关因子数量的异常或Treg细胞功能的异常及Th17/Treg失衡。而进一步通过治疗干预，如对银屑病患者分别使用窄谱紫外线疗法、308nm准分子激光均能够显著减少循环中的Th1和Th17细胞水平，增加Treg细胞水平，并缓解临床症状[43,44]；而一些靶位特异性的生物制剂如依那西普，属于肿瘤坏死因子拮抗剂，可以逆转Th1/Th17的活化，随之上调Th2和Treg细胞亚群，对银屑病起到治疗作用[45]。（3）感染因素15 目前从多项研究中证实，链球菌的感染与银屑病的发病和病程迁延反复有关[46,47]；金黄色葡萄球菌是一种普遍存在于人体皮肤的条件致病菌，研究发现银屑病患者皮肤表面较正常人有更多的金黄色葡萄球菌定植，而长期大量的金黄色葡萄球菌定植会增加皮肤炎症的可能性并且加重银屑病[48,49]。学者对幽门螺杆菌感染与寻常型银屑病的相关性研究显示，对寻常型银屑病伴有幽门螺杆菌感染阳性的患者，加用抗Hp治疗可提高疗效，这也提示幽门螺杆菌感染与寻常型银屑病是密切相关。[50]其他还有真菌如马拉色菌、病毒与银屑病的相关性研究。（4）内分泌因素国内对银屑病患者临床诱因的分析中发现，有63.3%女性患者在妊娠期间自觉病情好转，87.7%的女性患者在产后病情复发或加剧。这种现象被认为是妊娠期间激素水平的变化对机体免疫系统造成了影响所致。[51]（5）其他因素杨森用Logistic回归方法分析显示吸烟、饮酒是寻常型银屑病的危险因素，精神因素则包括精神紧张、抑郁、失眠、过度疲劳[52]。上述遗传因素中提到，同卵双生子的银屑病患病率并非为百分之百，这也说明了环境因素对于银屑病发病的影响。此外，银屑病也有冬春季节病情加重、夏季病情好转的特点。某些药物如阿司匹林、糖皮质激素等也可诱发或加重银屑病。傅超华等对银屑病与代谢综合征相关性的研究也表明两者有着密切相关性[53]。其他几项银屑病与代谢性疾病相关性的研究也支持此结论[54,55]。4.3.2现代医学治疗方法（1）外用药单独使用外用药治疗适用于皮损面积较小的银屑病患者，若病情严重、皮损面积大者应联合系统治疗和物理疗法。临床用于治疗银屑病的一线外用药物主要有：糖皮质激素类（卤米松、地奈德、氢化可的松）、维生素D3衍生物（卡泊三醇）和维A酸（他扎罗汀），在治疗中可采用序贯疗法或替换疗法，如先使用超强效糖皮质激素卤米松等，待皮肤炎症好转后可换用低级别的糖皮质激素。但在银屑病的急性期不建议使用刺激性的外用药，应以温和为主；还可以加用润肤剂缓解干燥和减轻刺激症状。[56]另外还有钙调磷酸酶抑制剂他克莫司，临床上也有一定疗效。16 （2）物理治疗物理疗法包括窄波UVB、光化学疗法（PUVA）和308nm准分子激光，近期研究表明其可能是通过调节免疫细胞因子的表达达到治疗银屑病的目的[44,57]。需要注意的是，长期应用PUVA可以导致皮肤的老化、色素沉着和皮肤癌，也会增加白内障的风险。（3）系统治疗系统治疗的一线用药有：甲氨蝶呤（MTX）、环孢素、维A酸类。甲氨蝶呤与环孢素同属免疫抑制剂，MTX具有免疫抑制、抗炎、抑制角质细胞增殖等作用，可适用于各型银屑病，包括广泛性斑块状银屑病、急性泛发性脓疱型银屑病及关节型、红皮病型银屑病等，对于银屑病的治疗疗效确切，但对其适应症需严格筛选并定期检测患者血常规、肝肾功能及肝脏弹性检查等，MTX轻度不良反应包括恶心、呕吐等胃肠道反应，严重者可引起肝脏纤维化、骨髓抑制、咳嗽、呼吸困难、肺纤维化、蛋白尿、血尿甚至中枢神经系统毒性。传统治疗失败或效果不佳者可选用环孢素，其具有抑制T细胞增殖、抑制细胞因子产生等作用，治疗中需监测患者肾功能防止该药肾毒性的副作用，病情严重的患者在停药后有复发的可能性。维A酸类主要指阿维A，阿维A无骨髓抑制、肝肾毒性等优点，其通过调控相关基因的表达从而抑制表皮角质形成细胞的过度增殖，并具有调节免疫及抗炎作用，长期使用安全且有效[58,59]。其他治疗有效的药物还有麦考酚酸吗乙酯、来氟米特、柳氮磺吡啶、糖皮质激素、硫唑嘌呤等。近年研发出的生物制剂，如肿瘤坏死因子α拮抗剂依那西普、英夫利西单抗、阿达木单抗等，也均被证实有较好的疗效和安全性[60-62]。4.4导师对于银屑病的认识在临床治疗中，寻常型银屑病是银屑病中最为常见的类型，因病情反复或失治误治可转变为其他三种类型，因此导师认为积极治疗寻常型银屑病，控制其病情的复发至关重要。导师总结了古今医家的丰富经验并结合多年的临床观察及治疗经验认为，寻常型银屑病的发生主要内因是血分有热，兼以风、寒、湿、燥、热、毒诸邪或禀赋不足、饮食失节、七情内伤，相搏于肌表化热化毒而发病。主要与“血热”、“热毒”、“血瘀”、“阴虚”四个方面相关，血分有热是基础，17 内外合邪，化热化毒，热毒外壅肌肤而致。热毒炽盛，则斑色鲜红，鳞屑浸润肥厚，病情发展迅速。病程迁延反复，邪热稽留，则耗伤营阴，以致阴虚血燥，肌肤失养，则鳞屑干燥脱屑甚至皮肤皲裂，伴有瘙痒。或气滞血瘀，瘀阻肌表积久难化而致病情反复，表现为斑色暗红或紫红，皮肤粗糙，难以根治。据此，研制成银屑平丸用以凉血养阴、活血解毒治疗寻常型银屑病。方药组成有生地黄、牡丹皮、紫草、丹参、白花蛇舌草、半枝莲、大青叶、山药、女贞子、墨旱莲、白鲜皮、甘草。方中重用生地黄清热凉血、养阴生津，牡丹皮、紫草、丹参凉血活血化瘀，丹参还可清心安神，白花蛇舌草、半枝莲、大青叶清热解毒，淮山药、女贞子、旱莲草滋补肝肾、凉血养阴、生津润燥，白鲜皮清热祛风止痒，引诸药达皮，甘草清热解毒、调和诸药。全方可起到凉血养阴，活血解毒之功效。该方特点是清热为主辅以养阴，凉血配伍活血之品并用，养阴清热润燥的同时又不至过凉而留瘀。4.5银屑平丸现代药理学研究现代药理学快速发展，中医中药现代化的研究也逐渐深入，银屑平丸中的生地黄、牡丹皮、丹参、白鲜皮可显著抑制小鼠阴道上皮细胞的有丝分裂[63]，其中生地黄、丹参的抗炎、抑菌、改善循环等作用也被得到证实[64-66]，丹参另一方面还可促进鼠尾表皮颗粒层形成。牡丹皮还具有抗菌消炎、增强免疫力作用[67]。紫草醇提取物对小鼠表皮过度增殖模型有较好的抑制作用[68]，紫草与山药同可调节免疫，并对多种细菌有抑制作用[69,70]。半枝莲、白花蛇舌草、大青叶的研究表明其具有抗炎、抑菌以及提高机体免疫功能的作用[71-73]。女贞子中的有机提取物可抗炎、抗菌、对激素进行双向调节，与旱莲草同用时，则能互相协调加强发挥免疫调节作用[74,75]。对甘草的药理研究则更多，国内外均证实其具有抗菌、抗病毒、调节机体免疫功能等作用[76-81]。本方可通过抑制表皮细胞增殖、抗炎、免疫调节等多方面治疗银屑病。4.6银屑平丸作用机制的研究在我们前期研究中，银屑平丸不仅可以改善患者临床症状，还可调节细胞免疫水平[82-85]。实验证明银屑病患者在经银屑平丸治疗8周后皮损中STAT3、18 Survivin的表达都显著降低[86]；银屑平丸可降低患者外周血清中IL-8、IL-2、INF-γ的表达水平[87,88]；可以降低豚鼠耳部组织匀浆中VEGF和TNF-α的表达水平[85]；降低银屑病样小鼠外周血IL-17、IL-23、IL-18和IL-22水平[84,89]。这些都表明银屑平丸可能通过调节免疫、抑制炎症因子产生、抗炎、改善微循环等作用起到治疗效果。最早在Sakaguchi的实验中，出生3d切除胸腺的小鼠会发生多种自身免疫性疾病，而向该小鼠输注同种正常小鼠的调节性T细胞（Treg）后，症状可以得到缓解。而最近在银屑病小鼠模型中，实验也表明局部回输Treg细胞同样能够明显缓解小鼠银屑病样皮损的严重程度[90]。目前研究表明其功能的实现主要通过细胞与细胞间的接触依赖性抑制或释放抗炎性细胞因子如白细胞介素10（IL-10）和转化生长因子β（TGF-β)对其他免疫细胞发挥抗炎效应。转化生长因子β是一类具有调节细胞生长、分化的细胞因子，能抑制炎性因子如IFN-γ、TNF-α的产生，抑制具有免疫活性的细胞增殖，阻断树突状细胞的成熟过程，抑制淋巴细胞的分化并能诱导Treg细胞的外周分化等。白细胞介素10则是一类具有免疫抑制作用的细胞因子，来源于多类细胞，如单核细胞、巨噬细胞、辅助性T细胞、树突状细胞(dendriticcells，DC)、Treg细胞等，IL-10能降低抗原提呈细胞（APC）对抗原的提呈能力及诱导DC细胞的凋亡，对APC起到明显抑制作用；并能抑制DC和巨噬细胞分泌促炎因子如IL-1、IL-6、TNF等，从而可导致T细胞活性和免疫应答能力的降低；IL-10还可以维持Treg细胞的免疫抑制功能。在皮肤炎症性疾病银屑病中，外周炎症性细胞因子的增加可能导致抑炎因子TGF-β、IL-10的增加。最新研究表明银屑病患者外周血存在Treg细胞及相关因子数量的异常或Treg细胞功能的异常及Th17/Treg失衡。根据近年银屑病患者与健康对照组外周血对比分析，Treg细胞在T细胞中所占比例下降，或与健康对照组差异无意义。如在熊国欣等[91]研究中，未治疗前的银屑病患者较之健康对照组外周血中TREG百分比明显降低，且Th17/Treg明显上升，而在经308nm准分子激光治疗后，与治疗前对比患者组Treg百分比上升，TGF-β1含量上升，且Th17/Treg明显降低，患者临床症状得到缓解；这与后来张玉丽、韩凌、梅沉成等[92-94]的研究结果相吻合。也有对儿童银屑病进行的类似研究，患者组外周血中较健康对照组Th17/Treg同样明显上升[95]。但结果目前并不是统一的。在Yun等[96]研究中发现，银屑病19 患者进展期外周血Treg细胞数目较之健康对照组明显下降，但处于静止期的患者该值与对照组却无明显差异；在同年Zhang的研究中[97]显示，患者组外周血Th17细胞与其相关因子IL-17均升高，而Treg细胞数量无明显差异。Treg细胞在T细胞中比例与正常组无差异这一结论并不少见，在李冰[90]的初步研究中同样得出这一结果，而在进一步的实验中发现患者组Treg细胞的增殖能力比健康人明显下降，而将患者组Treg细胞与第三方健康人的TEFF细胞（效应T细胞）共培养，结果显示患者组Treg细胞的免疫抑制功能较之健康人同样下降；不仅如此，在患者组的Treg细胞中还显现出了异常的表达，较之健康人更多的表达Th1类细胞相关炎症因子和转录因子，从而推测这可能是Treg细胞免疫抑制功能缺陷的原因。与上述结论不一致的是，部分研究表明在银屑病患者组皮损中Treg细胞数目却是增加的[98,99]。在近年胡文娟的小鼠银屑病模型中[100]，小鼠小肠组织TGF-β1含量同样是上升的，但Treg细胞表达与对照组差异无统计学意义。在本实验中，使用咪喹莫特乳膏对小鼠背部皮肤进行造模，模型组的类银屑病样皮损红斑、鳞屑增多，斑块较肥厚，能部分显示出人类银屑病样特征。在各组小鼠经不同处理8d后PASI评分表明，银屑平丸各组、雷公藤组较之模型组均能降低小鼠银屑病样PASI评分，改善皮损红斑、鳞屑、肥厚情况。对小鼠外周血的分析显示，模型对照组小鼠血清中细胞因子TGF-β、IL-10的含量与空白组比较，差异具有统计学意义，提示TGF-β和IL-10与银屑病的发病有关。对各组TGF-β的含量进行分析，与模型对照组比较，雷公藤组、银屑平丸各组差异均有统计学意义（P<0.05）；雷公藤组与银屑平丸高、中剂量组两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示雷公藤组与银屑平丸高、中剂量组均能降低TGF-β的含量，三组降低TGF-β含量的程度无明显差别。对各组IL-10的含量进行分析，与模型对照组比较，雷公藤组、银屑平丸各组差异均有统计学意义（P<0.05）；雷公藤组与银屑平丸各组两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示雷公藤组与银屑平丸各组均能降低IL-10的含量，四组降低IL-10含量的程度无明显差别。20 4.7问题与展望此实验小鼠样本量较少，且咪喹莫特银屑病样小鼠模型与人类银屑病仍有较大差异，实验中未能检测BALB/c小鼠背部皮肤中TGF-β、IL-10的表达水平，不够全面；Treg细胞主要分泌TGF-β、IL-10，但此两种细胞因子不具备唯一性，无法代表银屑病样模型中Treg数量的改变；在模型对照组中尽管TGF-β、IL-10含量上升，还需考虑Th17/Treg是否失衡；而Treg细胞功能是否受损则有待进一步研究。在该银屑病样小鼠模型的实验中，模型组小鼠血清的TGF-β、IL-10表达水平升高，通过银屑平丸进行干预可降低TGF-β、IL-10的表达，但银屑病病因及发病机制复杂，仍需进一步深入的研究及探索。21 结论（1）银屑平丸可降低小鼠银屑病样模型皮损的PASI评分，可起到改善银屑病皮损的治疗作用；（2）模型对照组中小鼠外周血TGF-β、IL-10含量明显高于空白组，提示外周血清中TGF-β和IL-10与银屑病的发病有关；（3）银屑平丸能降低银屑病样模型小鼠外周血TGF-β、IL-10的表达，这可能是银屑平丸治疗银屑病的作用机制之一。22 致谢本实验来源于导师席建元教授课题：基于Th17/Treg信号通路介导的细胞免疫失衡研究“热、虚、瘀”病机寻常型银屑病的分子机制及中药干预。三年的研究生生活在学习与成长中飞速而过，谨在本论文完成之际，向我敬爱的导师席建元教授致以深深的敬意和衷心的感谢。本论文从选题、设计到实验开展，从论文的撰写到修改的一系列过程中，导师席建元教授都给予了耐心的指导和无私的帮助，并倾注了大量的心血。正是由于他在百忙之中多次审阅全文，对细节进行修改，本文才得以成型。导师在日常繁忙的工作中仍坚持不辍的阅读大量文献、书籍，时常教诲我们站在巨人的肩膀上砥砺前行，为解除患者痛苦及为中医药的事业而奋斗。老师无可挑剔的敬业精神、严谨认真的治学态度、深厚的专业修养和平易近人的待人方式，都将成为我今后工作生活中的榜样，导师对我的理解与支持使我终生难忘！衷心感谢湖南中医药大学第一附属医院的所有带教老师在临床实习中对我的指导和帮助。衷心感谢湖南中医药大学第一附属医院动物实验中心所有老师在动物实验方面给予的指导和帮助。衷心感谢师兄李小鹏，师姐谢汶芳、彭丹、蒋宁兰、冯瑞瑶，同门徐文静、范浚，师弟彭礼真、黄剑秋，师妹谢娟、张元瑜等在我实验中给予的无私的帮助。衷心感谢我的家人多年来给予的无微不至的关心、理解和帮助，他们的支持和鼓励给了我完成学业的动力和信心。衷心感谢实验研究中的小鼠，如果不是你们的无私奉献，研究也就无法进行。在此表示最崇高的敬意！最后，还要感谢参加本人论文评审和答辩的各位专家教授，感谢你们在百忙之中抽出宝贵的时间给予我耐心细致的评判和指导。谢谢！23 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综述银屑病与Treg细胞相关因子的研究近况【摘要】银屑病是一种皮肤表现为红斑、鳞屑为主的病程长易反复发作的免疫性炎症性皮肤病。银屑病的发病与多因素密切相关，主要为遗传、免疫、感染、内分泌、神经精神因素、生活习惯、药物、环境因素等。银屑病的皮损处有大量炎细胞和T淋巴细胞的浸润，本文就Treg细胞及其相关因子，在银屑病发病机制中作用的研究进展作一综述。【关键词】银屑病，调节性t细胞银屑病是一种皮肤表现为红斑、鳞屑为主的病程长易反复发作的免疫性炎症性皮肤病，典型皮损为红色或棕红色斑块，边界清楚，基底部浸润明显，表面覆盖多层干燥银白色鳞屑，将表层鳞屑轻轻刮除后，可见底部一层半透明薄膜，继续刮除薄膜则出现点状出血。寻常型银屑病组织病理表现为皮肤的角质增厚，角化不全、细胞中夹杂空气间隙，角化过度、颗粒层变薄或消失，棘层增厚，真皮上端毛细血管向表皮游走、血管迂曲扩张，并伴有炎细胞的浸润[1]。大量的研究表明，银屑病的发病与多因素密切相关，主要为遗传、免疫、感染、内分泌、神经精神因素、生活习惯、药物、环境因素等，并且该病符合多基因遗传病模式[2]。有关T细胞及其效应因子在银屑病发病机制中的作用是当今研究热点之一[3]。1.调节性t细胞调节性t细胞是一类具有免疫调节功能的T细胞亚群，可有效抑制效应性t胞的过度增殖与活化，目前已发现多种自身免疫疾病存在Treg细胞的数量和（或）功能异常[4-5］。根据来源和分化的不同调节性T细胞可为两大类：一类是来源于胸腺的天然Treg细胞，称为自然Treg细胞（naturalregulatoryTcell，nTreg），特征标志为其高表达转录因子Foxp3，约占外周血CD4+T细胞的5%～10%，nTreg在胸腺由幼稚T淋巴细胞发育成熟后迁移至外周，具有免疫抑制性[6]；另一类［7］是外周诱导的诱导性Treg细胞（inducedregulatoryTcell，iTreg），是在小31 剂量抗原或免疫抑制性细胞因子诱导下由外周幼稚型T细胞发育而成。nTreg和iTreg在体内免疫调节中的作用机制是否有差异，目前不很清楚。当有外界的病原微生物入侵机体时，效应性T细胞和天然免疫系统会采取一系列的免疫反应来清除病原体。如果产生的免疫反应过强，在清除病原体的同时也可能会导致组织损伤。Treg细胞能够通过抑制效应性T细胞的过度反应从而达到对机体的保护。Treg细胞防止自身免疫病的发生体现在，如出生3d切除胸腺的小鼠会发生多种自身免疫性疾病，向该小鼠输注同种正常小鼠的CD4+CD25+调节性T细胞后，症状可以得到缓解[8]。而最近在银屑病小鼠模型中，实验也表明局部回输Treg细胞同样能够明显缓解小鼠银屑病样皮损的严重程度[9]。目前研究表明其功能的实现主要通过细胞与细胞间的接触依赖性抑制或释放抗炎性细胞因子如白细胞介素10（IL-10）和转化生长因子β（TGF-β)对其他免疫细胞发挥抗炎效应。生长因子-β(TGF-β)是最早发现的、能诱导Treg细胞外周分化的细胞因子之一。2003年，Chen等[10]发现，在体外用TGF-β联合T细胞抗原受体TCR激动刺激的CD4+CD25－T细胞，可以转化成CD4+CD25+T细胞，且其具有体内和体外的免疫抑制功能，这种作用依赖于foxp3的诱导表达。2005年Kretschmer等[11]在外源加入TGF-β及敲除TGF-β受体两个层面，进一步印证了TGF-β在iTreg分化过程中的重要作用，并初步确定了iTreg在体外诱导分化的条件。Marie等的体内和体外实验还证明TGF-β能调节FOXP3的持续表达，稳定nTreg数目及其免疫抑制功能[12]。TCR信号对nTreg的胸腺发育也有重要促进作用。例如，在Treg中特异性敲除TCR的直接下游激酶Lck后，Treg胸腺分化被明显减弱，导致Treg分布不均一，丧失免疫抑制功能等不正常的表型[13]。除此之外，许多T细胞表面受体共刺激分子对nTreg的发育也有重要的调节作用，例如CD28、IL-2R、GITR（肿瘤坏死因子受体）、RA等等。在缺失CD28或者CD80/CD86的小鼠中，nTreg的数量都显著减少[14]。没有CD28的表达，总IL-2分泌也会减少，导致FOXP3所需的IL-2R信号不足而表达降低。CD28共刺激也是Treg前体细胞发育所必需的。CD28基因缺失的小鼠其Treg32 细胞减少且功能也减弱[15]。有研究发现，IL-2受体β链(interleukin-2receptorβ，IL-2Rβ)敲除的小鼠，其胸腺中的Treg分化水平明显低于野生型小鼠。体内无论IL-2或是IL-2R缺失都会导致胸腺中成熟Treg数目的减少[16]。不仅如此，IL-2Rβ的缺失不仅导致Treg的胸腺分化能力丧失，而且有诱发自身免疫的倾向[17]。而Bayer[18]在研究中进一步明确，IL-2Rβ敲除的小鼠nTreg细胞比例明显降低，且其表达Treg特征分子(如CD25和Foxp3水平)的数量相对于普通的Treg细胞都要低很多，这种细胞在维持自身免疫耐受功能和存活能力，都明显不如野生型小鼠的nTreg细胞，而这个过程可以被胸腺中特异性转染IL-2Rβ纠正[19]。协同刺激分子GITR信号也可以促进Treg细胞的增殖，其原因可能是GITR信号能够帮助Treg细胞抵抗凋亡[20-21］。事实上其他与凋亡有关的分子如凋亡前基因Bim和Bcl2在Treg细胞的分化发育中也发挥着重要的作用［22］，Bim基因敲除小鼠Treg细胞的总数量明显增加，而Bcl2转基因小鼠其FOXP3+Treg细胞的比例明显增加。RA是一种由肠系膜淋巴结树突状细胞(dendriticcell，DC)分泌的免疫系统调控物质，在TGF-β信号存在条件下，RA同样可以促进天然T细胞向FOXP3+Treg诱导分化[23-24]。在最新的研究中发现IL/Lag3轴在体内外能够提高Foxp3+Treg细胞从而抑制由T细胞诱导的结肠炎的功能[25]。目前已经证实的是在Th1细胞分化过程中，IL-12、IFN-γ、STAT4以及STAT1等关键分子均能够抑制Treg细胞体外分化，除此之外，IFN-γ的功能性下游转录因子干扰素调控因子-1(IFNregulatoryfactor-1，IRF-1)同样可抑制Treg的分化[26]；肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导Foxp3去磷酸化，抑制Treg的合成[27-28]。2.银屑病发病机制研究进展以往的研究认为，在银屑病中存在Thl/Th2失衡，Thl型细胞及其细胞因子占优势，而Th2功能减低，故银屑病和许多常见的自身免疫性疾病如类风湿性关节炎等，同属于Th1型反应模式[29-30]。近年的研究逐步认识到Thl/Th2失衡不能用来完全解释银屑病的发病和病理损伤[31-32]。随着免疫学的进展和研究的深入，银屑病的皮损处有大量的炎性细胞及T淋巴细胞的浸润，Littman等[33]将银屑病皮损区分离出的T淋巴细胞注入至非皮损区后，可出现银屑病的病理表现，33 这均表明免疫因素也是银屑病发病的重要原因之一。目前对银屑病的免疫学研究主要集中在辅助性T细胞（Thelpercell，Th）如Th1、Th2、Th17、Th22和调节性T细胞（Tregulatorycell，Treg）及其细胞因子网络等方面。研究表明T细胞异常活化是导致银屑病发生的重要因素，有活化T细胞产生的细胞因子刺激表皮增殖，而增殖角质形成细胞能释放其他细胞因子进而增强活化T细胞[34]。Th1细胞通过分泌IFN-γ、IL-12等细胞因子，在抗感染、抗肿瘤反应中发挥重要作用；Th2细胞则通过分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子促进机体的体液免疫应答，另一方面也参与了哮喘、系统性自身免疫病的发病过程；调节性T细胞则在维护机体免疫平衡中发挥了重要作用。具体过程可能是：在抗原(包括外源性和内源性自身抗原)等因素的诱导下，抗原呈递细胞(APC)将抗原呈递给CD4+T细胞，使其转化为效应T细胞进入循环至皮肤，分泌一系列炎症性细胞因子如IL-1、TNF-α等，同时血管内皮黏附因子表达增加，使炎细胞聚集在损害处。激活的T细胞分泌IFN-γ促进角质形成细胞进一步产生血管内皮黏附因子及其他炎症因子的分泌如IL-1、IL-6、IL-8等，其中IL-1又可反馈活化T细胞、诱导其他细胞因子的产生，放大炎症免疫级联反应。[35]在银屑病皮损及外周血中，Th1细胞因子白细胞介素2（IL-2）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）高表达而Th2细胞因子IL-4、IL-10低表达[36-37]，包括T淋巴细胞、树突细胞和不同的免疫相关细胞因子的活化形成复杂的细胞因子网络，促进角质形成细胞的过度增殖。而其中的某些细胞因子有增强活化T细胞的作用，如此一来形成了由T细胞介导的恶性循环，皮肤便出现片状红斑并脱屑的病理表现[38-39］，使银屑病的病程反复迁延。3.银屑病与Treg的关系Treg细胞由于其抗炎效应在自身免疫性疾病中受到日益关注，之前的研究证实Treg的缺失可导致自身免疫病，学者们对银屑病中Treg细胞的数量及功能进行了一系列相关研究。3.1Treg细胞及相关因子数量的异常何荣国等[40]用流式细胞仪检测48例寻常型银屑病患者和32例正常人外周血Treg比例，结果显示，银屑病患者外周血Treg比例低于正常人，用ELISA法检测Treg相关因子IL-10的表达水平时发现银屑病患者血清IL-10水平低于正常34 人。在王忠永等[41]研究中同样发现，银屑病患者外周血Treg细胞比例较正常人低。Wanq[42]及陆家睛等[43]则发现对银屑病患者分别使用窄谱紫外线疗法、308nm准分子激光能够显著减少循环中的Th1和Th17细胞水平，增加Treg细胞水平，改善循环中CD4+T淋巴细胞亚群以缓解症状。3.2Treg细胞功能的异常Sugiyama等[44]在研究中采用交叉实验，将银屑病体内的Treg细胞与健康者体内的效应T细胞共培养，结果发现银屑病患者体内的Treg无法抑制健康效应T细胞的增殖，而健康者的Treg与银屑病患者的效应T细胞共培养，效应T细胞却可被抑制。这证明银屑病患者体内的效应T细胞不受Treg的抑制在于Treg的功能异常，而非效应T细胞自身的改变。3.3Th17/Treg失衡已经得到证实，在炎性条件（IL-6、IL-23和TGF-β存在）下，Treg能产生IL-17并转换成Th17细胞，致使Th17细胞/Treg失衡[45－47］。而进一步实验表明天然调节性T细胞可以转化为Th17细胞，而诱导性调节性T细胞不能，iTreg可抑制Th17细胞的分化[48－50］。Zhang等[51]则在银屑病儿童患者中发现在疾病发作期Th17和Foxp3+Treg细胞以及Th17/Treg细胞比值明显增加，且和疾病的炎症程度正相关。总而言之，可以明确Treg细胞比例的降低或者其抑制功能的减弱及Th17/Treg比例的失衡参与到了银屑病发病机制中，而改善或调节这一细胞群数量、表达及比值可能对银屑病的治疗起到积极作用，随着人们对Treg细胞及相关细胞因子更深入研究，临床上对银屑病的诊断和治疗也有望得到新的指导。参考文献：[1]赵辨．中国临床皮肤病学［M］．南京：江苏科学技术出版社,2010:1008-1025．[2]CaponF,DallapiccolaB,NovelliG.Advancesinthesearchforpsoriasissusceptibilitygenes.MolGenetMetab,2000,71(1-2):250-255.[3]王刚．银屑病研究热点[J］.中华皮肤科杂志,2013,46(3):153-156.[4]GRANTCR,LIBERALR,MIELI-VERGANIG,etal．RegulatoryT-cellsinautoimmunediseases：challenges,controversiesand--yet—unansweredquestions[J]．AutoimmunRev,2015,14(2):105-116．35 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文明求實繼承創新
