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学校代码：10564学号：VM20110038分类号：S855.3密级：硕士学位论文一株猪源H5亚型禽流感病毒的序列分析及致病性试验徐文强第一指导教师：亓文宝教授第二指导教师：卢受昇高级兽医师学院名称：兽医学院专业学位类别：兽医硕士领域：无答辩委员会主席：马春全教授中国·广州2016年6月 华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：日期：导师签名：日期： 摘要本研究从2014年6月至2015年10月采集华南地区某些养猪场育肥猪和屠宰场待宰猪的猪鼻拭子500份和猪肺210份，将病料无菌处理后接种于9~11d龄鸡胚尿囊腔，将接种鸡胚在无菌条件下收获鸡胚液，1%的鸡红细胞测定是否有血凝活性（HA实验），有血凝活性的尿囊液用H1、H3、H5、H6、H7和H9亚型流感标准阳性血清、NDV标准阳性血清进行血凝抑制试验（HI实验）。然后进行序列测定，分离到1株猪源H5N6亚型禽流感病毒，命名为A/Avian/Huanan/C135/2015（H5N6）简称C135。测定C135毒株的全基因序列，遗传演化分析结果表明：NA基因ORF框长度为1380个核苷酸，颈部缺失33个核苷酸，该基因上不存在E119V、R152K、H275Y、R293K、N295S等耐药位点突变。HA基因全长为1776个核苷酸，含有一个完整ORF框，包含1704个核苷酸，可推导编码567个氨基酸，其5’非编码区和3’非编码区分别含有28个和44个核苷酸，未发现核苷酸的插入和缺失；裂解位点为RRRKR↓G，符合高致病性病毒的基因特点。N端糖基化位点中，26位、27位、39位、181位、302位、499位和558位存在糖基化位点。M基因经过分析后发现：H5N6亚型AIV的全长1027个核苷酸，完整的ORF框由两部分构成，M1长度为759个核苷酸，M2长度为294个核苷酸，推导能编码97个氨基酸。PB1基因系列分析发现：全长为2341bp个核苷酸，包含完整ORF框，长度为2274个核苷酸，推导编码757个氨基酸，其中5’非编码区和3’非编码区分别含有24个和43个核苷酸，无核苷酸的插入和缺失；病毒的13位均突变为P，678位没有发生突变均为S。PB2基因由2341bp个核苷酸组成，完整的ORF框长度为2280bp核苷酸，推导可编码759个氨基酸，其5’非编码区和3’非编码区分别含有27个和34个核苷酸。PB2基因分析发现，627位为E，没有发生突变；与毒力紧密相关的701位依然为D，这些基因未发生突变。PA基因片段长度为2233个核苷酸，含有一个长度为2151个核苷酸的完整ORF框，推导能编码716个氨基酸，其5’非编码区和3’非编码区分别含有24个和58个核苷酸，未发现氨基酸的插入或缺失，但发生了N615K突变，突变为K；与病毒在细胞中生长有关的638位为R、与复制有关的539位为K、与聚合酶活性相关的510位为H，与致病性相关的224位与383位分别为S和D，没有发生突变。NP基因长度为1565个核苷酸，含有一个完整的长度为1497个核苷酸的ORF框，推导可编码498个氨基酸，未发现核苷酸的插入和缺失。其5’非编码区和3’非编码区分别含有45个和23个核苷酸。毒株I 的位点分析发现，影响试验动物肺脏病毒滴度相关的479位，存在L479F突变；319位没有发生突变，仍为N。NS基因ORF框分为两个部分，ORF1从27~704位核苷酸，是一个连续的片段，包含678个核苷酸，NS1推导可编码225个氨基酸，ORF2又包含不连续的两部分，一部分是从27位~56位核苷酸，一部分是从514位~849位核苷酸，共有366个核苷酸，位于5’端的ORF1与ORF2有重叠30个核苷酸部分，间隔457个核苷酸后的336个核苷酸则是NS2第二部分OFR框，NS2推导可编码121个氨基酸，位点分析发现：C135的42位突变位S，92位突变位E，103位突变位非致病性K，106位突变位V，149位均为G；在NS1的末端为ESEV残基。6为进一步了解猪源禽流感病毒对动物的致病性试验，流感病毒C135以10EID505剂量干冰麻醉后，滴鼻的方式感染12~14g的雌性BALB/c小鼠；以10EID50剂量，通过滴鼻点眼的方式感染4~6周龄的SPF鸡。结果表明，攻毒组小鼠死亡率达到了75%。小鼠脑中没有检测到病毒，肺脏中病毒滴度较高为4.75~6.5log10EID50/mL，说明病毒可以在小鼠肺脏内增殖，但不具备入脑的能力；期间观察到小鼠出现身体消瘦、被毛凌乱、神经症状等情况，解剖发现内脏出现了病理变化，试验表明该毒株对小鼠有强致病性。病毒能够使全部SPF鸡在感染后2d内死亡，在脑、心、肝、脾、肺、肾6个组织脏器中检测到较高滴度病毒为4.91~7.08log10EID50/mL；同居组的脑、心、肝、脾、肺、肾6个组织脏器中未检测到病毒，表明该病毒对SPF鸡具有高致死率。关键词：H5亚型禽流感；分离鉴定；序列分析；致病性II TheSequenceAnalysisofaSwineH5SubtypeStrainsofAvianInfluenzaVirusesandPathogenictyTestxuwenqiang(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthchinaAgriculturalUniversityGuangzhou,510642,China)Abstract:Inthisstudy,500partsofnasalswabsand210partsoflungwerecollectedfromsomefatteningpiginpigfarmsandslaughteredpiginslaughterhousesinsouthernChinafromJune2014toOctober2015.Afterthediseasedinoculatedinasepticprocessingtheallantoiccavityofthe9to11daysagechickembryos,andthentheinoculatedchickembryoharvestedundersterileconditionssolution,1%chickenerythrocytesdetermineiftherehemagglutinationactivity,urinehemagglutinationactivitycystfluidwithH1,H3,H5,H6,H7andH9subtypesofinfluenzapositiveserum,NDVpositiveserumhemagglutinationinhibition.ThensequencedandwasisolatedasaH5N6subtypeAvianinfluenzavirus,namedA/Avian/Huanan/C135/2015(H5N6)referredC135.WholegenomesequencingC135strains,phylogeneticanalysisshowedthatNAgeneORFframeof1380nucleotidesinlength,neckdeletionof33nucleotidesonthegenedoesnotexistE119V,R152K,H275Y,R293K,N295Sandotherresistancelocusmutation.HAgenetotallengthof1776nucleotidescontainingacompleteORFboxcontains1704nucleotidesencoding567aminoacidscanbededuced,the5'untranslatedregionand3'untranslatedregions,respectivelycontaining28and44nucleotidesnotfoundinsertionsanddeletionsofnucleotides;cleavagesiteRRRKR↓G,inlinewiththecharacteristicsofhighlypathogenicvirusgene.N-glycosylationsites,26,27,39,181,302,499and558thepresenceofglycosylationsites.AftertheMgeneanalysisfound,H5N6subtypeSIVfull-length1027nucleotides,thecompleteORFframeconsistsoftwoparts,M1lengthof759nucleotides,M2lengthof294nucleotides,encodingadeduced97aminoacids.PB1geneseriesanalysis:totallengthof2341bpnucleotidescontainacompleteORFframelengthof2274nucleotidesencoding757aminoacidsdeduced,includingthe5'untranslatedregionand3'untranslatedregionseachcontaining24and43nucleotides,noinsertionsandIII deletionsofnucleotides;thevirusmutatedtoall13P,678bitisnotmutatedwereS.PB2genefromthe2341bpnucleotidesandcompleteORFframelength2280bpnucleotidesencoding759aminoacidscanbededuced,the5'untranslatedregionand3'untranslatedregions,respectivelycontaining27and34nucleotides.PB2geneanalysisfoundthat627ofE,thereisnomutation;virulenceisstillcloselyrelatedtothe701isD,thesegenesarenotmutated.PAgenefragment2233nucleotidesinlength,comprisingalengthof2151nucleotidescompleteORFframeencoding716aminoacidscanbededuced,the5'untranslatedregionand3'untranslatedregions,respectivelycontaining24and58nucleotides,insertionordeletionofaminoacidsnotfound,butithappenedN615KmutationsmutatedtoK;withthevirusinthecellgrowth-related638isR,andthereplicationof539toK,associatedwiththepolymeraseactivitythe510isH,andassociatedwiththepathogenicity224and383respectively,SandD,thereisnomutation.NPgeneis1565nucleotidesinlength,containingafulllengthORFof1497nucleotidesframeencoding498aminoacidscanbededucednotfoundinsertionsanddeletionsofnucleotides.5'untranslatedregionand3'untranslatedregions,respectivelycontaining45and23nucleotides.Strainssiteanalysis,theimpactofthetestanimalslungvirustiters479relatedtothepresenceL479Fmutation;319nomutation,stillN.NSgeneORFboxdividedintotwoparts,ORF1from27to704nucleotides,isacontinuousfragmentcontaining678nucleotides,NS1encoding225aminoacidscanbededuced,ORF2andcontainstwonon-contiguousportions,partfrom27to56nucleotides,inpart,from514to849nucleotides,366nucleotides,locatedatthe5'endofORF1andORF230nucleotidesoverlapportionsspaced457336nucleotideafterthesecondpartoftheOFRisNS2box,NS2isderivedmaybeencoded121aminoacids.SiteanalysisfoundthatC135of42mutationsS,92bitsmutationE,103bitsnon-pathogenicmutationK,106bitsmutationV,149bitsareG;attheendofNS1isESEVresidues.Tofurtherunderstandtheswineavianinfluenzaviruspathogenicitytestsonanimals,6swinewithavianinfluenzavirusC135to10EID50icedoseofanesthesia,infection5intranasalway12to14gramsoffemaleBALB/cmice;to10EID50dosebyintranasaleyeofwayinfectionin4to6weeksoldSPFchickens.Theresultsshowedthatmicepoisonattackmortalityrateof75%.MouseBrainviruswasnotdetected,thehigherthelungvirusIV titersis4.75to6.5log10EID50/mL,indicatingthatthevirusmaybeintheproliferationofmouselungs,butdonothavetheabilitytoenterthebrain;themicewasobservedduringphysicalweightloss,messyhair,andotherneurologicalsymptoms,theautopsyfoundinternalorgansappearedpathologicalchanges,testsshowedthatthestrainofmousehasastrongpathogenicity.VirusenablesallSPFchickensdiedwithin2daysafterinfection,detectedhightitersofvirusinthebrainis4.91to7.08log10EID50/mL,heart,liver,spleen,lungandkidneythesesixvarioustissues;cohabitationgroupbrain,heart,liver,spleen,lungandkidneythesetissueorgansviruswasnotdetected,indicatingthatthevirusinSPFchickenswithahighmortalityrate.Keywords:H5subtypeofavianinfluenza;Isolationandidentification;sequenceanalysis;pathogenicityV 常用英文缩略表简写英文全称中文名AIAvianinfluenza禽流感AIVAvianinfluenzavirus禽流感病毒NDVNewcastlediseasevirus新城疫病毒HAHemagglueination血凝试验dDay天minMinute分钟NANeuraminidase神经氨酸酶mLMilliliter毫升EID5050%Embryoinfectivedose鸡胚半数感染量MMatrixprotein基质蛋白HIHemagglueinationinhibitiontest血球凝集抑制试验NPNucleoprotein核蛋白NSNonstructuralprotein非结构蛋白NS2Nuclearexportprotein核输出蛋白PAPolymeraseA聚合酶APB1PolymeraseB1聚合酶B1PB2PolymeraseB2聚合酶B2PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应RRIRnasinribonucleoproteininhibitorRNA酶抑制剂LBLauriabrothLB肉汤AmpAmpicillin氨苄青霉素RTReversetranscription反转录r/minRoundperminute转速每分钟SSecond秒SPFSpecificpathogenfree无特定病原Thr(T)L-Threonine苏氨酸uLMicroliter微升Val(V)Valine缬氨酸VI 目录1绪论....................................................................................................................................11.1禽流感概述.....................................................................................................................11.2流感流行状况.................................................................................................................11.3流感病原学特点.............................................................................................................21.4流感病毒的生物学特性.................................................................................................31.4.1致病性..........................................................................................................................31.4.2血凝性..........................................................................................................................41.4.3抗原性..........................................................................................................................41.5禽流感公共卫生学意义.................................................................................................41.6研究目的与意义.............................................................................................................52材料与方法........................................................................................................................62.1材料.................................................................................................................................62.1.1相关试剂......................................................................................................................62.1.2鸡胚与实验动物..........................................................................................................62.1.3实验仪器设备和生物学软件......................................................................................62.2病毒获取.........................................................................................................................72.2.1样品采集......................................................................................................................72.2.2病毒分离和血清学鉴定..............................................................................................72.2.3H5N6亚型AIV的有限稀释法纯化...........................................................................72.2.4H5N6亚型流感HA、NA基因的分子生物学鉴定..................................................82.2.5H5N6亚型流感的全基因序列扩增............................................................................92.3H5N6亚型AIV全基因序列分子特性分析、遗传演化分析....................................132.4H5N6亚型AIV对SPF鸡致病性实验.......................................................................152.4.1病毒对鸡胚半数感染量（EID50）测定...................................................................152.4.2病毒对6周龄SPF鸡感染试验...............................................................................152.5H5N6亚型AIV对BALB/c小鼠致病性实验.............................................................163结果与分析......................................................................................................................163.1H5N6亚型AIV分离鉴定和全基因序列分析结果....................................................16VII 3.1.1H5N6亚型AIV的鉴定结果.....................................................................................163.1.2H5N6亚型AIV纯化结果.........................................................................................163.1.3分离的H5N6亚型AIV的全基因序列分析结果...................................................173.1.4AIV毒株的分离结果.................................................................................................303.2动物试验结果...............................................................................................................303.2.1鸡胚半数感染量（EID50）测定结果.......................................................................303.2.2病毒株对SPF鸡致病性实验结果...........................................................................303.2.3H5N6亚型AIV对BALB/c小鼠的致病性实验结果..............................................313.3讨论与结论...................................................................................................................34全文总结..............................................................................................................................37致谢..............................................................................................................................38VIII 1绪论1.1禽流感概述禽流感（AvianInfluenza）是禽的流行性感冒的简称，是由甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感病毒）引起的呼吸器官或全身感染的传染性疾病，被国际兽疫局定为甲类传染病。也能感染人类引起发病，成为禽流感病毒感染或禽流感病，人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡。1.2流感流行状况1878年，意大利首次报道流感，此后在欧洲、美洲、非洲、亚洲均有发生。特别是从上世纪90年代后期起，禽流感在欧亚大陆的暴发日趋频繁。流感病毒的肆虐不但给许多国家的家禽养殖业带来了沉重打击，同时也向全人类的健康提出了新的严峻挑战。1970年，人流感病毒H3N2传到猪，Kundin在香港的猪体中分离到类禽流感H3N2病毒（Kundinetal.,1972）。1979年，在意大利发现的类禽H1N1流感病毒可能比经典H1N1病毒更具有选择优势，其侵蚀力和致病性更强，它的出现替代了经典AIV，成为欧洲猪群中主要的H1N1亚型流行毒株（Pensaertetal.,1981）。此后，欧洲许多国家发现H1N2毒株的变异株，这些变异株中大部分毒株的HA和NA基因来源于类人流感，其他编码内部蛋白基因来源于欧洲类禽H1N1病毒（Balintetal.,2009；Hjulsageretal.,2006；Marozinetal.,2002；Zelletal.,2008）。1993年，类禽H1N1病毒从我国南方的表面健康猪中分离到，并和经典H1N1病毒同时流行（Guanetal.,1996；Yuetal.,2008）。该分离株在遗传进化树上独立于欧洲类禽H1N1而形成欧亚类禽的亚洲类禽分支（BrownIan,2000）。2007年，欧洲类禽H1N1猪流感病毒在我国的山东、福建和北京的猪群中被分离到（Liuetal.,2009），但是临床症状不明显。2009年4月，美国疾控中心报道两例小孩感染与墨西哥类似的新型HlNl病毒（Shuoetal.,2009）。2014年，全球发生了H5N1、H5N2、H5N3、H5N6、H5N8等亚型的高致病性禽流感疫情和H5N1、H5N2、H5N6、H7N1、H7N3、H7N7、H7N9等亚型的低致病性1 禽流感疫情，多种血清型病毒共存状况越来越明显，禽流感新毒株种类不断增加，而毒株的基因片段却来自全球不同的国家和地区（朱迪国等，2015；孙洪涛等，2015）。2014年5月9日，中国疾病控制中心卫生应急中心研究员倪大新表示，从四川一例已故重症肺炎病例中分离到H5N6病毒，经国家疾病控制中心流感中心确认，这是全球第一次从人的病例中分离到H5N6病毒（方芳，2014）。由于该病毒在世界范围内的广泛存在和其感染宿主范围的不断扩大，其致病性特点也引起了人们的关注。我国华南地区具备孕育流感病毒的自然条件和环境，在病毒起源和分子流行病学研究上，是世界新流感亚型出现和流感暴发的疫源地（于康震等，1998），因此广东地区流感毒株在未来流感病毒变异和流行中的作用值得深入研究。1.3流感病原学特点禽流感病毒(AIV)属正粘病毒科，甲型流感病毒属，该病毒的基因组为负链单股RNA，共有8个独立RNA片段，这些片段可编码10多种不同的蛋白质，由于基因组核酸在病毒增殖过程中很容易发生重组，因而使AIV的抗原性和致病性很容易发生变异。AIV可按病毒粒子表面的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的糖蛋白进行分类（AlexanderDJ,2000），分为15个H亚型和9个N亚型，可以组成几百个血清亚型，如H1N1、H2N2、H5N1、H7N7、H9N2等，其中最受关注的是含H5和H7血凝素的AIV亚型，这些病毒亚型常常表现出具有高致病性。AIV的表面糖蛋白血凝素(HA)是病毒致病。A型流感病毒是全球流感流行的元凶，已经造成了多次人流感爆发。通常野生水禽被认为是流感病毒所有HA亚型和NA亚型的储存器，但是A型流感病毒同样也能从包括人和猪等其他许多物种中分离到（Alexander,1982；Websteretal.,1992；Robertetal.,1992）。即使该病毒宿主范围广泛，但它也表现出宿主特异性，不容易发生种间传播，然而这种限制不是绝对的。全球范围内的人类、禽类、猪和其他哺乳动物都是相互关联的，病毒种间传播会影响其遗传稳定性，产生变异的毒株，这种变异的毒株能够突破种间屏障，在物种间传播。所以在自然条件下流感病毒跨种传播就有非常高的可能性。首先是A型流感病毒基因片段独立分段的特点，导致该种病毒容易发生基因重组；其次是中间宿主“猪”的参与，众所周知，猪是流感病毒种间传播的重要的中间宿主，其具有最大限度地被禽流感病毒和人流感病毒感染的能力（Toshihiroetal.,1998）。2 1.4流感病毒的生物学特性AIV是A型流感病毒属的单股负链RNA病毒。禽流感病毒(AIV)含有两个表面蛋白，它们分别是血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。根据这两个蛋白抗原性的不同，可将禽流感病毒分为16个HA亚型(H1~H16)和9个NA亚型(N1~N9)（Munsteretal.,2009）。图1A型流感病毒形态与结构（Krugetal.,2009）1.4.1致病性致病性是AIV一个非常重要的的生物学特性。由于病毒基因的重组和不断演化，畜禽群中AIV变得越来越复杂多样。目前对AIV致病性的判定还没有推荐的标准，畜禽在流感病毒种间传播链中的中间宿主和多重宿主作用和我国近年禽流感疫情的严重性与复杂性，因此充分了解流行于畜禽群中的流感病毒的生物学特性具有重要的现实意义（李海燕等，2003）。3 1.4.2血凝性血凝性是AIV的另一个重要的生物学特性，AIV具有广泛的血凝谱。位于病毒囊膜表面的血凝素蛋白HA能够吸附红细胞表面的特异性唾液酸糖蛋白受体，还能融合细胞内涵体膜，能使红细胞聚集而得名，在病毒入侵细胞的过程中起着非常重要的作用。但事实上，病毒株的血凝活性并不一样，不同毒株相同亚型、同代次病毒血凝价相差很大（王连想等，2003）。并且AIV的血凝活性容易被破坏，血凝素具有热不稳定性，60℃以上的热环境中可以被灭活。在自然条件下，具有热稳定性的毒株存活能力相对较强，在同一宿主或不同宿主之间进行传播的机会也会更多，直接影响到病毒的遗传与变异，容易引起大规模流行。虽然AIV的血凝性跟它的致病性没有直接关系，但是血凝性是目前广泛应用的诊断方法，在免疫抗体监测和病毒血清亚型鉴定中发挥了重要的作用，具有非常重要的生物学意义。1.4.3抗原性AIV是单股负链RNA病毒，由8个节段构成，分别编码10种蛋白质，其中包括影响AIV型特异性的核蛋白(NP)和基脂蛋白(M)，因为NP具有高度保守的结构蛋白，所以可作为流感病毒划分A、B、C型的主要型的主要依据，在病毒进化的过程中变异程度很低（闫若潜等，2004；Zejunetal.,2009）。病毒的核蛋白NP，作为机体细胞毒性淋巴细胞识别的主要抗原之一，具有型特异性，在确定宿主特异性方面有关键作用。M具有型特异性抗原活性，能激活HA的融合功能，控制高尔基体的pH值，保证HA的完整性。AIV与其他同型的流感病毒具有共同的型特异性NP和M抗原，性质很稳定，可用血清学方法进行区分，在补体结合试验中呈现交叉反应，HI试验、中和试验、特异性补体结合试验、ELISA法都可以检测出它们之间的表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)容易变异。表面糖蛋白的抗原性直接影响AIV的感染性、致病性、增殖传播、宿主特异性及组织嗜性，AIV产生的抗体能够中和病毒，在逃避免疫系统的免疫识别时所产生的抗原变异与的抗原性及结构密切相关，抗原性的改变常常能够引起新的AI流行。NA蛋白具有抗原性，诱导产生的抗体不能把病毒完全中和，却能够显著地抑制抗体的活性，在AIV的感染中起着重要的作用，关系着AIV的宿主特异性及病毒的致病力。1.5禽流感公共卫生学意义流感病毒一般具有宿主特异性，从一种动物跨种间感染另一种动物非常困难。但4 是研究表明，在流感病毒跨种属间障碍感染新宿主的过程中，猪起着至关重要的作用。人流感和禽流感都能以猪为储存宿主，在猪上不发病，不表现临床症状，但是猪上皮细胞具有唾液酸а-2，6半乳糖苷可与人流感病毒结合，而唾液酸а-2，3半乳糖苷与禽流感病毒结合，因此能够同时被人流感病毒和禽流感病毒感染，因此猪被认为是古老流感病毒长期存在的“贮存器”，也是流感病毒通过基因重组产生新流行毒株的“混合器”（崔建勋等，2009）。流感是畜禽养殖场普遍存在的群发性疾病，不但降低患病畜禽的生产性能，而且容易继发其他疾病的产生，对畜禽健康状态和肉品质造成较大的影响，严重危害养殖业的发展，每年给中国的养殖业造成重大的经济损失，严重制约着我国农业经济社会的发展。此外，禽流感的HA受体结合位点具有与人流感和猪流感病毒受体相同的结合特异性，决定了流感不仅可感染猪，而且也具有感染禽和人类的能力。欧洲猪群中流行的类禽型HlNl亚型流感病毒，自1979年在欧洲出现后，已被证明可感染人（Rimmelzwaanetal.,2001）。在中国出现了人、猪、禽流感病毒的交叉感染和种间的基因重组，出现了“禽-猪-禽”、“猪-人-猪”及“人-猪-人”的流感病毒种间传播途径（李海燕等，2002），猪在种间传播环节中，扮演着流感病毒中间宿主及多重宿主的角色。因此，对猪源性禽流感加强预防和监测工作，具有非常重要的兽医传染病学和兽医公共卫生意义1.6研究目的与意义华南地区位于我国候鸟迁徙路线上，地理条件特殊，具有丰富水源和典型亚热带气候，为禽流感病毒提供了天然良好繁殖条件。华南地区是个畜禽养殖重地，若暴发禽流感，没有得到及时有效的控制，不排除人被感染的可能，要高度警惕禽流感病毒可能发生抗原性变异，或它与当前人群中流行的A型流感病毒发生基因重配，形成重配株，从而造成人间流感暴发或流行，甚至大流行。畜禽混养突出，增加了人与禽类直接接触机会，增加了人感染流感病毒的机率。2015年，实验室从猪采集样品中分离到的一株猪源H5N6亚型AIV，通过对分离病毒株进行鉴定、扩增与全基因测序与序列分析，确定分离毒株所在分支，为了解病毒的病原学、流行病学与生物学特性，进行动物致病性实验，为AIV病原学、流行病学和遗传演化特性的分析以及在禽类与哺乳动物流感的病原学和流行病学提供有效的生物学依据，也对人类公共卫生方面具有深远的影响，为AIV疫情系统监测和科学防控提供有利的参考依据。5 2材料与方法2.1材料2.1.1相关试剂1%鸡红细胞(采集隔离饲养的成年SPF公鸡自行制备)、DMEM细胞培养液、流感H1、H3、H6阳性血清（本实验室自制）H5（Re-4、Re-5、Re-6）、H7N9、H9标准阳性血清（购于哈尔滨维科生物技术开发公司）、ND阳性血清（购自北京中监所）、胶回收试剂盒（OMEGABIO-TEK公司的产品）、反转录酶（MLV）（Promega公司产品）、MLV-Buffer（Promega公司产品）、pGEM-T载体（Promega公司产品）、T4连接酶（Promega公司产品）、TrizolLSReagent试剂（TaKaRa公司产品）、DNA聚合酶（PrimerStar）（TaKaRa公司产品）、RNA酶抑制剂（RibonucleaseInhibitor，RRI）（TaKaRa公司产品）、dNTP（TaKaRa公司产品）、随机引物（12bp）（TaKaRa公司产品）、DNAMarker2000（TaKaRa公司产品）、PBS缓冲液：KH2PO40.2g、Na2HPO41.15g、KCl0.2g、NaCl8g，加水定容至1L，调节PH值7.4，高压灭菌后备用。使用时无菌加入双抗（青霉素、链霉素10000U/mL），放4℃冰箱保存；其他化学试剂均为国内某试剂公司分析纯化。2.1.2鸡胚与实验动物9~11d龄鸡胚购于广东省佛山市南海种禽有限公司；4~6周龄SPF鸡购于山东省济南市斯帕法斯家禽有限公司；雌性BALB/c小鼠购于广州中医药大学。2.1.3实验仪器设备和生物学软件ZentrifugenRotofix32离心机(美国Hettich公司产品)、PTR-200型PCR仪(美国MJReSearch公司产品)、低热圆形纯水仪M-illi-Q（德国Millipore公司产品）、TgradientPCR仪（德国WhatmanBiometra公司产品）、64型高速冷冻离心机（美国BeckmanAllegra公司产品）、微量移液器（德国Eppendorf公司的产品）、高压灭菌锅LaboAutoclave（Sanyo公司产品）、凝胶成像分析系统InGeniusBioImaging（英国Gyndene公司产品）。生物学软件：引物设计软件为美国MolecularBioligyInsights公司的Oligo6软件；ORF框查找、序列比对及拼接、转换软件为美国DNAStar公司的DNAStarlesegene(version7.1)软件；系统发生分析软件MEGA（version5.0，BiodesignInstituteofCenterforEvolutionaryFunctionalGenomics，USA）等。6 2.2病毒获取2.2.1样品采集从2014年6月至2015年10月采集华南地区某些养猪场育肥猪和屠宰场待宰猪的猪鼻拭子500份和猪肺210份，将采集拭子和猪肺样品放置于冰盒保存运输，并于当天拿回华南农业大学兽医实验室保存。2.2.2病毒分离和血清学鉴定临床猪肺和猪鼻拭子采样分离的病毒样品液，接9~11d龄SPF鸡胚尿囊腔，接种0.2mL/枚，置于37℃培养箱培养36~72h，在无菌条件下收获鸡胚尿囊液，1%的鸡红细胞测定是否有血凝活性（HA实验），有血凝活性的尿囊液，用H1、H3、H5、H6、H7和H9亚型流感标准阳性血清、NDV标准阳性血清进行血凝抑制试验（HI实验）。收集HI实验中与H5亚型标准血清呈阳性，但与H1、H3、H6、H7、H9亚型标准血清反应呈阴性的鸡胚尿囊液，-80℃冰箱保存备用。2.2.3H5N6亚型AIV的有限稀释法纯化通过HA/HI实验鉴定分离的AIV的HA亚型，对用HA/HI实验仍无法鉴定亚型的流感病毒，按Axygen说明书抽提病毒RNA，以针对H5N6HA基因的亚型特异性引物，通过RT-PCR的方法进行鉴定。方法如下：-7（1）将含病毒尿囊液按照10倍稀释法用无菌的DMEM细胞培养液稀释至10倍；-3-7（2）选取10~10稀释液分别接种于9~11d龄SPF鸡胚尿囊腔，每个稀释度各3枚，放置于37℃培养箱中培养，每隔12h照胚一次，弃掉24h内死亡鸡胚，之后每12h照胚，并将死亡鸡胚放置于4℃保存。收集鸡胚尿囊液并测定每个鸡胚的血凝价，保存稀释倍数最高并且血凝价较高的鸡胚尿囊液，记为F1代病毒；-5-8-6-10（3）按照同样方法稀释F1代病毒10~10倍和10~10倍，接胚、培养、收胚、HA测定，用同样方法保存F2代、F3代；（4）F3代病毒按照1000倍稀释接种于3枚SPF鸡胚，在37℃培养箱中培养72h后收取尿囊液并测定血凝价HA，并用流感H1、H3、H6阳性血清，流感H5（Re-4、Re-5、Re-6）、H7N9、H9标准阳性血清、NDV标准阳性血清做HI实验，确定是否为混毒；（5）收集HA反应大于5的鸡胚尿囊液，并标记HA效价、日期、编号并保存。7 2.2.4H5N6亚型流感HA、NA基因的分子生物学鉴定2.2.4.1引物设计通过GenBank中已录入的H5N6亚型AIV的HA、NA序列，运用DNAStarlesegene(version7.1)软件和Oligo6软件进行基因序列分析，设计针对于H5N6亚型AIV的HA、NA的鉴定引物H5-L、H5-U以及N6-L、N6-U和反转录引物（见表1）。表1H5N6亚型流感HA、NA基因鉴定引物序列及反转录引物序列名称上游引物（5’-3’）下游引物（5’-3’）H5TGGCAGGGAATGGTAGATGTAGGGAACTCGCCACTGTTGN6AGCAAAAGCAGGGTGAAAATGAGTAGAAACAAGGGTGTTTT反转引物AGCGAAAGCAGG2.2.4.2H5N6亚型流感的RNA提取利用Trizol法提取RNA：（1）吸取纯化好的500μL病毒尿囊液加到无菌去RNA酶的1.5mL的离心管中，加750μL提前预冷的TrizolLSReagent，剧烈震荡，混匀，于室温放置5min；（2）加氯仿300μL，混匀，4℃12000r/min，15min离心，将约600μL上层液吸到另一个无菌去RNA酶的1.5mL离心管中；（3）加600μL异丙醇，混匀，-20℃放置30min后，4℃，12000r/min离心15min，弃掉上清液；（4）加入1mL提前预冷的75%乙醇，缓慢颠倒，混匀，4℃，12000r/min，离心10min，弃掉上清液；（5）风干后加入DEPC水10μL，-80℃保存或直接反转录。2.2.4.3H5N6亚型AIV的cDNA反转录参照TAKARA公司反转录酶（M-MLV）说明书，将各试剂、模板依次加入0.5mL去RNA酶离心管中，37℃水浴1h即得到cDNA，反转后的cDNA放于-20℃冰箱保存或直接用于体外PCR微量扩增，反转录体系(60μL)如下：8 5×MLV-Buffer12μLMLV1μLRNA30μLdNTP12μLRRI2μL反转引物3μL总体积60μL在0.2mLPCR管中配置20μL体系的PCR混合液，同时设置阴性对照（将体系中cDNA用水代替；P1为H5/N6鉴定上游引物；P2为H5/N6鉴定下游引物）。反应体系如下：rTaqDNA聚合酶1μLcDNA2μLdNTP(2.5mmol/uL)2μLP10.5μLP20.5μL10×rTaqbuffer2μL无菌去离子水12μL总体积20μL将20μL的PCR反应体系配好后放入PCR扩增仪中扩增，反应程序设置如下：95℃预变性5min；94℃变形30s；55℃退火30s；72℃延伸1min；72℃终延伸7min，30个循环，4℃保存。将PCR结束后的产物点样于浓度为1%的琼脂凝胶中进行电泳，100V恒压电泳25min，并观察检测阳性的目的片段大小。2.2.5H5N6亚型流感的全基因序列扩增2.2.5.1引物设计通过GenBank中已录入的H5N6亚型AIV的8个基因片段序列，利用DNAStarlesegene(version7.1)软件和Oligo6软件进行基因序列分析，设计针对于H5N6亚型AIV的8个全长扩增引物和PB1、PB2、PA中间引物（见表2）。9 表2H5N6亚型AIV全基因扩增引物引物名称上游引物（5’-3’）下游引物（5’-3’）PB21TATTAGCAAAAGCAGGTCGTCATGTCAGGYAATATTCPB22ATAAAGGCAGTCCGAGGYGAGTAGAAACAAGGTCGTTTPB11TATTAGCAAAAGCAGGCAGGTTGGTTCCTTGTGATGPB12CATACATCACAAGGAAACGAGTAGAAACAAGGCATTTPA1TATTAGCAAAAGCAGGTACTCTTTGCARTCCTCAAAGTPA2TAAGCAGGTGCTGGCAGAGAGTAGAAACAAGGTACTTHAAGCAAAAGCAGGGGTMYRATCTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAACTACANPAGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTCAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTNAAGCAAAAGCAGGAGTTYAAAATGAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTSAACMAGCAAAAGCAGGTAGATRTTKAAAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTACTCNSATTAGCAAAAGCAGGGTGGAGTAGAAACAAGGGTGTT2.2.5.2RNA提取-3-7选取10~10稀释液分别接种于9~11d龄SPF鸡胚，每个稀释度各接种3枚，放置37℃培养箱中培养，每隔12h照胚一次，弃掉24h内死亡鸡胚，之后每12h照胚，将死亡鸡胚放置4℃保存，收集鸡胚尿囊液并测定每个鸡胚的血凝价，保存稀释倍数最高且血凝价较高的鸡胚尿囊液并记为F1代病毒；2.2.5.3H5N6亚型AIV的cDNA合成-5-8-6-10按照同样方法稀释F1代病毒10~10和10~10接胚、培养、收胚、HA测定同样方法保存F2代、F3代；2.2.5.4H5N6亚型AIV全基因的PCR扩增利用50μL反应体系进行PCR扩增，同时要进行阴性对照，具体反应体系如下：10 10×buffer5μLE×TaqTMPolymerase1μLcDNA3μL上游引物1μL下游引物1μLdNTP5μL去离子水34μL总体积50μL将PCR扩增体系配好后，放置于PCR仪中进行扩增，扩增仪运行以下程序如下：95℃预变性5min，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸3min，72℃终延伸10min，30个循环，4℃保存。2.2.5.5PCR扩增产物回收及纯化将PCR扩增产物与3μLLoadingBuffer混匀，在100V恒压1%浓度的琼脂凝胶进行电泳25min，在一个点样孔中加入5μLDNAMarker2000，用凝胶成像仪观察，利用OMEGA公司E.Z.N.A.TMGelExtractionKit胶回收试剂盒进行PCR产物回收，并切取所需的目的片段DNA条带。操作过程如下：（1）在装有目的片段的离心管中加入400μLBindingBuffer溶胶液，于55℃水浴融化凝胶至完全溶解；（2）待全部溶解后转移至吸附，10000r/min离心2min，弃掉上清液；（3）重复步骤（2）一次；（4）加入700μLWashBuffer，10000r/min离心2min，弃掉上清液；（5）重复步骤（4）一次；（6）设置离心机转速10000r/min，离心3min，空离一次，弃掉多余水分，将收集管弃掉换新的1.5mL离心管；（7）向滤膜中央加入30μL无菌去离子水，在室温静止5min后12000r/min，离心3min，弃掉吸附柱，1.5mL离心管中即为PCR扩增产物。2.2.5.6目的片段与PGEM-T载体的连接与转化用微量EP管配制链接反应，进行目的片段连接反应参照PMD18-T载体说明书进行。反应体系如下：11 2×Buffer5μLpGEM-T1μLT4连接酶1μL目的基因3μL总体积10μL将反应体系配好后放入16℃恒温连接仪中进行至少4h连接，得到连接产物后直接用于转化。转化：将连接获得产物加入到DH5α感受态细胞中，轻摇混匀，冰浴30min后42℃水浴热激90s，迅速冰浴5min，结束后向离心管中加入500μL没有抗性的LB培养基，然后放置于37℃摇床中震荡45min，离心5min，转速为4000r/min，离心后弃掉200μL培养基，将离心管底的沉淀吹吸混匀后，涂在具有AMP﹢抗性LB固体培养皿中，待菌液完全吸收后，倒置于37℃恒温培养箱中，培养12~16h后挑取单菌落培养。2.2.5.7阳性菌落筛选与鉴定挑取大小适中的单菌落于1.5mL离心管中，并在每个离心管中加入500μLAMP﹢抗性LB液体培养基，离心200r/min，37℃恒温水浴摇床振荡8h后进行20μL反应体系菌液PCR鉴定，反应体系如下（上下引物参照表3）：菌液1μL上游引物0.5μL下游引物0.5μL2×rTaqPCRMix10μL去离子水8μL总体积20μLPCR扩增程序设置如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，72℃终延伸7min，25个循环，4℃保存。PCR产物经含EB的1%琼脂糖凝胶电泳，100V电压电泳15min后，用凝胶成像仪观察结果，出现与目的基因片段条带相符的的菌液可能含阳性重组质粒。2.2.5.8目的片段序列的测定与拼接鉴定出来的目的基因的序列测定由上海英淮捷基贸易有限公司完成，测序后对得12 到的基因序列进行拼接，利用美国DNAStar公司的DNAStarlesegene(version7.1)软件和GenBank数据库协同完成拼接过程。2.3H5N6亚型AIV全基因序列分子特性分析、遗传演化分析从GenBank数据库中查找H5N6亚型AIV全基因序列，利用MEGA5.05以及DNAStar软件绘制出基因遗传进化树，进行全基因序列分子特性分析和遗传演化分析。（参考序列毒株见表3）13 表3参考毒株毒株名称毒株名称A/Anas_crecca/Hubei/Chenhu1623/5/2014(H5N6)A/duck/Dongguan/2685/2013(H5N6)A/blackchicken/Jiangxi/10129/2014(H5N6)A/duck/Dongguan/3069/2013(H5N6)A/duck/Jiangxi/NCDZT1123/2014(H5N6)A/duck/Guangdong/GD01/2014(H5N6)A/chicken/Dongguan/2690/2013(H5N6)A/duck/Guangzhou/41227/2014(H5N6)A/chicken/Dongguan/3363/2013(H5N6)A/duck/Jiangxi/10160/2014(H5N6)A/chicken/Dongguan/4259/2013(H5N6)A/duck/Jiangxi/13469/2014(H5N6)A/chicken/Shenzhen/433/2013(H5N6)A/duck/Jiangxi/13475/2014(H5N6)A/chicken/Shenzhen/552/2013(H5N6)A/duck/Jiangxi/13484/2014(H5N6)A/chicken/Shenzhen/715/2013(H5N6)A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)A/chicken/Shenzhen/1061/2013(H5N6)A/chicken/Laos/LPQ001/2014(H5N6)A/chicken/Shenzhen/1395/2013(H5N6)A/duck/Laos/XBY004/2014(H5N6)A/chicken/Shenzhen/1845/2013(H5N6)A/duck/Ningbo/3262/2013(mixed)A/chicken/Shenzhen/2269/2013(H5N6)A/duck/Sichuan/NCJPL7/2014(H5N6)A/chicken/Shenzhen/2396/2013(H5N6)A/duck/Sichuan/NCXJ15/2014(H5N6)A/chicken/Shenzhen/2464/2013(H5N6)A/duck/Sichuan/NCXJ16/2014(H5N6)A/chicken/Sichuan/NCJPL1/2014(H5N6)A/duck/Sichuan/NCXJ24/2014(H5N6)A/duck/Vietnam/LBM752/2014(H5N6)A/duck/Sichuan/NCXN10/2014(H5N1)A/duck/Vietnam/LBM758/2014(H5N6)A/duck/Sichuan/NCXN11/2014(H5N1)A/duck/Vietnam/LBM759/2014(H5N6)A/duck/Zhejiang/6D2/2013(H5N6)A/environment/Jiangxi/10164/2014(H5N6)A/chicken/Zhejiang/6C2/2013(H5N6)A/environment/Jiangxi/10170/2014(H5N6)A/duck/Vietnam/LBM751/2014(H5N6)A/environment/Jiangxi/10171/2014(H5N6)A/goose/Shantou/1763/2014(H5N6)A/environment/Sichuan/NCLL1/2014(H5N6)A/goose/Shantou/1791/2014(H5N6)A/silkiechicken/Dongguan/2809/2013(H5N6)A/goose/Shantou/1806/2014(H5N6)A/duck/Vietnam/LBM360c1/4/1/2013(H5N6)A/pigeon/Sichuan/NCXN29/2014(H5N1)A/muscovyduck/Vietnam/LBM754/2014(H5N6)14 2.4H5N6亚型AIV对SPF鸡致病性实验2.4.1病毒对鸡胚半数感染量（EID50）测定-5-10将纯化好的AIV进行10倍配比稀释法稀释10~10，每个稀释度各接5枚9~11d龄非免疫胚，每枚0.2mL，进行病毒扩增，37℃培养，弃去12h内死亡鸡胚。采用HA方法测定各稀释度鸡胚是否存在病毒感染，各稀释度鸡胚分别记感染数，测定所有感染鸡胚的尿囊液血凝活性，来判断该鸡胚是否被感染。通过Reed-Muench法计算病毒EID50滴度。距离比值=（高于50%感染数-50%）/（高于50%感染数-低于50%感染数）Log10EID50=高于50%的稀释度的对数+距离比值×稀释因数2.4.2病毒对6周龄SPF鸡感染试验5病毒的攻毒剂量为10EID50/200μL（原毒稀释100倍，每只鸡200μL），10只6周龄SPF鸡（攻毒组4只，同居组6只），采取脚标编号记录。经点眼、滴鼻方法每只攻毒200μL，攻4只SPF鸡，并将攻毒当天计做0d，攻毒24h后各组放入同居组，每组6只，观察鸡的健康状况，连续观察14d，并随时记录各组鸡的临床症状和死亡情况。攻毒后2d、3d、5d、7d、9d、11d采集各组鸡的咽喉拭子和泄殖腔拭子，分装到不同离心管中，用来测定攻毒后鸡的排毒情况。将采集的咽喉拭子和泄殖腔拭子用含有10000U的青霉素与链霉素的DMEM细胞培养液震荡，采取10倍倍比稀释法，-1-2-3-4-5按照10、10、10、10、10稀释度稀释，不同稀释度各接3枚9~11d龄的非免疫胚，37℃孵化，48h后测定鸡胚尿囊液的血凝活性，来判断是否存在感染，并利用Reed-Muench法计算病毒EID50滴度。在攻毒后3d随机剖杀攻毒组和对照组鸡3只，4d随机剖杀同居组和对照组鸡各2只，分别取心、肝、脾、肺、肾、脑6个组织脏器，用于测定不同病毒感染SPF鸡后各个组织脏器中病毒复制能力及组织嗜性。在测定各组织脏器病毒滴度时，先将留取的各个不同组织进行称重、研磨，充分研磨后按照1mL/g加入相应量DMEM细胞-1培养液，混匀后转入离心管，4℃，4000r/min，离心10min，吸取上清液，按照10、-2-3-4-5-6-7-8-910、10、10、10、10、10、10、10稀释度进行10倍配比稀释，每个稀释度各接3枚鸡胚，每枚0.2mL，37℃孵化，48h后测定鸡胚尿囊液的血凝活性，以此用来判断是否存在感染，并利用Reed-Muench法计算各被测样品中病毒滴度，以此作为判断各病毒组织嗜性及不同脏器中病毒复制能力的标准。15 2.5H5N6亚型AIV对BALB/c小鼠致病性实验6将体重为12~14g的雌性BALB/c小鼠以10EID50攻毒剂量攻毒，每组11只小鼠，每组中有8只用于编号、体重称量，另外3只用于4d剖杀取肺脏和脑组织，用来测定肺脏、脑中的病毒滴度。攻毒前对每组中需要称重的小鼠进行编号、记录，实验组中每只小鼠分别用干冰麻醉后，以滴鼻方式接种H5N6亚型AIV（C135），每只接种6剂量为50μL（含10EID50病毒），对照组以同样方法麻醉后接种50μL等量的DMEM细胞培养液，之后14d每天观察记录各组小鼠状态和死亡情况，每天对编号小鼠进行体重称量、记录，并在14d后对存活小鼠采血，分离血清来测定小鼠抗体转阳情况。攻毒后4d剖杀未编号3只小鼠，分别取肺、脑2个脏器，采集的每个肺脏和脑组织用于小鼠肺脏、脑中病毒含量滴度测定。测定滴度前将脏器组织进行称重，研磨，充分研磨后按照1mL/g量加入相应量DMEM细胞培养液，混匀后转入离心管，4℃，-5-94000r/min离心，10min。肺脏按照10~10稀释度进行稀释接9~11d龄非免疫胚，每-1-5枚0.2mL，每个稀释度接3枚9~11d龄非免疫胚，37℃孵化48h；脑按照10~10稀释度进行稀释接胚，每枚0.2mL，37℃孵化，48h后测定鸡胚尿囊液的血凝活性，以此来判断各病毒感染的小鼠肺脏和脑中是否存在感染，并利用Reed-Muench法计算病毒EID50滴度。3结果与分析3.1H5N6亚型AIV分离鉴定和全基因序列分析结果3.1.1H5N6亚型AIV的鉴定结果通过血清学方法鉴定，HA实验结果为阳性，HI实验中与H5亚型标准阳性血清反应为阳性，与H1、H3、H6、H7、H9以及NDV标准血清为阴性，经分子生物学方法鉴定后HA、NA基因分别为H5、N6阳性检测结果。试验结果表明，血清学检测结果与分子生物学检测结果一致，被检测病毒为H5N6亚型AIV。3.1.2H5N6亚型AIV纯化结果经过有限稀释法纯化H5N6亚型AIV及后续检测鉴定结果：纯化后毒株用H1、H3、H6、H7、H9及NDV标准血清检测，HI结果全部为阴性，不存在交叉反应阳性现象，能抑制H5N6亚型AIV毒株的只有H5亚型标准阳性血清，实验表明所选取的H5N6亚型AIV已经完成纯化。16 3.1.3分离的H5N6亚型AIV的全基因序列分析结果3.1.3.1PB1基因序列分析结果本研究中的H5N6亚型AIVPB1系列分析发现：基因长度为2341bp个核苷酸，包含完整ORF框，长度为2274个核苷酸，推导编码757个氨基酸，其中5’非编码区和3’非编码区分别含有24个和43个核苷酸，无任何核苷酸的插入和缺失。病毒的13位均突变为P，678位没有发生突变均为S，经遗传演化分析（见图2）可以发现：本研究H5N6亚型AIV的PB1基因，位于NB-Like分支，参考A/duck/Ningbo/3262/2013毒株（Bietal.,2015）。A/chicken/Dongguan/2690/201335A/chicken/Laos/LPQ001/201439A/chicken/Shenzhen/552/2013A/duck/Vietnam/LBM758/20144096A/Guangzhou/39715/2014A/chicken/Dongguan/4259/20131435A/goose/Shantou/1763/2014GD-LikeA/chicken/Shenzhen/433/20136299A/chicken/Shenzhen/715/2013A/duck/Jiangxi/NCDZT1123/2014100A/chicken/Dongguan/3363/20131556A/duck/Guangdong/GD01/2014A/chicken/Shenzhen/1061/2013100A/duck/Zhejiang/6D2/2013100A/chicken/Sichuan/NCJPL1/2014A/duck/Sichuan/NCXJ16/2014100SC-Like100A/chicken/Zhejiang/6C2/2013A/Anascrecca-Hubei-Chenhu/1623-5/20149966A/blackA-blackchicken/Jiangxi/10129/2014A/duck/Vietnam/LBM360c1/4/1/2013VN-LikeA/Anhui/1/2005100FJ-Like96A/duck/Fujian/11094/2005A/goose/Guiyang/3422/2005100A/Bar/headedA-Bar-headedGoose/Qinghai/5/200542A/whooperA-whooperswan/Mongolia/3/2005GY-Like22A/Beijing/01/200334A/chicken/Shanxi/2/2006A/duck/Ningbo/3262/2013A/Goose/Guangdong/1/1996NB-Like51C1350.01图2H5N6亚型流感PB1基因遗传进化树17 3.1.3.2PB2基因序列分析结果利用MEGA6.0构建构建H5N6亚型AIVPB2基因的核苷酸序列遗传进化树发现，H5N6亚型AIVPB2基因由2341bp个核苷酸组成，完整的ORF长度为2280bp核苷酸，推导可编码759个氨基酸，其5’非编码区和3’非编码区分别含有27个和34个核苷酸。PB2基因分析发现，627位为E，没有发生突变；与毒力紧密相关的701位依然为D，这些基因未发生任何突变。本研究H5N6亚型AIV的PB2基因（见图3）通过遗传演化分析发现位于NB-Like分支，参考A/duck/Ningbo/3262/2013毒株（Bietal.,2015）。A/chicken/Laos/LPQ001/201458A/goose/Shantou/1763/2014A/chicken/Dongguan/2690/201338A/chicken/Shenzhen/552/201353A/Guangzhou/39715/201470A/chicken/Dongguan/4259/2013GD-LikeA/chicken/Shenzhen/433/201378100A/chicken/Shenzhen/715/2013A/duck/Jiangxi/NCDZT1123/2014100A/chicken/Dongguan/3363/20137585A/duck/Guangdong/GD01/2014100A/chicken/Shenzhen/1061/2013A/Anascrecca/Hubei/Chenhu16235/201462A/chicken/Zhejiang/6C2/2013100A/duck/Zhejiang/6D2/2013100A/blackA-blackchicken/Jiangxi/10129/201498SC-LikeA/chicken/Sichuan/NCJPL1/2014PB2.sichuan.H5N6.human10065A/duck/Sichuan/NCXJ16/2014A/duck/Vietnam/LBM360c1/4/1/2013100A/whooperA-whooperswan/Mongolia/1/2010A/Bar/headedA-Bar-headedGoose/Qinghai/5/200599A/chicken/Shanxi/2/200687A/Beijing/01/2003100GY-Like99A/goose/Guiyang/3422/2005A/Anhui/1/200591100A/duck/Fujian/11094/2005A/Goose/Guangdong/1/1996A/duck/Vietnam/LBM758/2014A/duck/Ningbo/3262/2013100NB-Like99C1350.02图3H5N6亚型AIVPB2基因遗传进化树18 3.1.3.3PA基因序列分析结果本研究中的H5N6亚型AIVPA通过基因系列分析发现：病毒株的基因片段长度为2233个核苷酸，含有一个长度为2151个核苷酸的完整ORF框，可推导编码716个氨基酸，其5’非编码区和3’非编码区分别含有24个和58个核苷酸，未发现氨基酸的插入或缺失。发生了N615K突变，突变为K；与病毒在细胞中生长有关的638位为R、与复制有关的539位为K、与聚合酶活性相关的510位为H，与致病性相关的224位与383位分别为S和D，没有发生突变。通过遗传演化分析（见图4）可以发现：本研究分离的H5N6亚型AIV的PB1基因，位于HK-Like分支，参考A/HongKong/156/97毒株（Bietal.,2015）。69A/chicken/Laos/LPQ001/2014A/duck/Vietnam/LBM758/201439A/goose/Shantou/1763/201447A/chicken/Dongguan/2690/201359A/chicken/Shenzhen/552/201345A/Guangzhou/39715/201447A/chicken/Dongguan/4259/2013GD-LikeA/chicken/Shenzhen/433/20133699A/chicken/Shenzhen/715/201383A/duck/Jiangxi/NCDZT1123/201499A/chicken/Dongguan/3363/201374A/duck/Guangdong/GD01/2014A/chicken/Shenzhen/1061/201310097A/chicken/Sichuan/NCJPL1/201463A/duck/Sichuan/NCXJ16/2014A/chicken/Zhejiang/6C2/2013100SC-Like100A/blackA-blackchicken/Jiangxi/10129/2014A/chicken/Zhejiang/6C2/2013704984A/duck/Zhejiang/6D2/2013A/duck/Vietnam/LBM360c1/4/1/2013100A-Anhui-1-2005(H5N1)A-Anhui-1-2005(H5N1)FJ-Like99A/duck/Fujian/11094/200596A/duck/Ningbo/3262/2013A/whooperA-whooperswan/Mongolia/1/201051A/chicken/Shanxi/2/2006BJ-Like91100A/Beijing/01/2003100A/goose/Guiyang/3422/2005100A/Bar/headedA-Bar-headedGoose/Qinghai/5/2005A/Goose/Guangdong/1/1996C135HK-Like100A/HongKong/156/970.01图4H5N6亚型AIVPA基因遗传进化树19 3.1.3.4HA基因序列分析结果本研究分离H5N6亚型AIV的进行HA基因测序和序列的拼接分析发现：基因包含1776个核苷酸，含有一个完整ORF框，包含1704个核苷酸，可推导编码567个氨基酸，其5’非编码区和3’非编码区分别含有28个和44个核苷酸，未发现核苷酸的插入和缺失。分析发现：N端糖基化位点中，26位为NNS、27位为NST、39位为NVT、181位为NNT、302位为NSS、499位为NGT和558位为NGS存在糖基化位点。HA受体结合位点分析发现：病毒的107位为Y，148位为S，155位为G，165位为W，195位为H，198位为N，202位为E，209位为N，233位为S，167位突变为T，205-208位突变为NLYK；237-240位为GQRG没有发生突变；毒株的228位均突变为K（见表4）。裂解位点分析发现：裂解位点为RRRKR↓G，由多个连续的碱性氨基酸K/R构成。HA基因遗传演化分析（见图5）发现：病毒的HA基因分布在2.3.4.4分支上。2.3.4.4分支包括GD-Like分支，参考A/duck/Guangdong/GD01/2014(H5N6)毒株和SC-Like分支，参考A/duck/Sichuan/NCXJ16/2014(H5N6)（Bietal.,2015）20 73A/chicken/Laos/LPQ001/2014A/goose/Shantou/1763/201422A/chicken/Shenzhen/552/201343A/chicken/Dongguan/2690/2013C13541A/duck/Vietnam/LBM758/20142250A/Guangzhou/39715/201423GD-LikeA/chicken/Dongguan/4259/2013A/duck/Jiangxi/NCDZT1123/201436A/chicken/Dongguan/3363/201388A/chicken/Shenzhen/433/20132.3.4.485A/chicken/Shenzhen/715/2013100A/duck/Guangdong/GD01/201450A/chicken/Shenzhen/1061/2013A/duck/Ningbo/3262/2013100A/Anascrecca-Hubei-Chenhu1623/5/201494A/chicken/Sichuan/NCJPL1/2014100A/duck/Sichuan/NCXJ16/2014SC-Like61A/blackA-blackchicken/Jiangxi/10129/2014A/chicken/Zhejiang/6C2/20134695A/duck/Zhejiang/6D2/2013100A/Anhui/1/2005FJ-Like2.3.4A/duck/Fujian/11094/200589A/whooperA-whooperswan/Mongolia/1/200995A/A-whooperswan/Mongolia/1/2010100VN-Like2.3.2.1A/greatA-greatcrestedgrebe/Tyva/120/2009A/duck/Vietnam/LBM360c1/4/1/201376A/goose/Guiyang/3422/2005A/Bar/headedGoose/Qinghai/5/200562A/Goose/Guangdong/1/1996GY-Like2.3.390A/chicken/Shanxi/2/2006100100A/Beijing/01/20030.01图5H5N6亚型AIVHA基因遗传进化树21 表4H5N6亚型AIVHA受体结合位点位点107148155165167195198202205-208209228233237-240H5YSGWIHNEKLYQNRSGQSGC135YSGWTHNENLYKNKSGQSG3.1.3.5NP基因序列分析结果本研究H5N6亚型AIV通过基因系列分析发现：NP基因长度为1565个核苷酸，含有一个完整的长度为1497个核苷酸的ORF框，推导可编码498个氨基酸，未发现核苷酸的插入和缺失。其5’非编码区和3’非编码区分别含有45个和23个核苷酸。毒株的位点分析发现，影响试验动物肺脏病毒滴度相关的479位，存在L479F突变；319位没有发生突变，仍为N。NP基因遗传演化分析（见图6）发现：C135位于GD-Like分支，参考A/duck/Guangdong/GD01/2014(H5N6)毒（Bietal.,2015）株。22 69A/chicken/Dongguan/3363/2013A/duck/Guangdong/GD01/2014A/chicken/Dongguan/2690/2013A/chicken/Dongguan/4259/201322A/goose/Shantou/1763/2014A/chicken/Shenzhen/433/201387A/chicken/Shenzhen/715/2013GD-Like35A/chicken/Shenzhen/552/2013A/duck/Vietnam/LBM758/20145664A/Guangzhou/39715/2014A/chicken/Laos/LPQ001/201483C13599A/chicken/Shenzhen/1061/2013A/duck/Jiangxi/NCDZT1123/201499A/chicken/Sichuan/NCJPL1/20149976A/duck/Sichuan/NCXJ16/2014A/Anascrecca-Hubei/Chenhu1623/5/2014100SC-Like99A/blackA-blackchicken/Jiangxi/10129/2014A/chicken/Zhejiang/6C2/20136787A/duck/Zhejiang/6D2/2013A/duck/Vietnam/LBM360c1/4/1/2013VN-LikeA/whooperA-whooperswan/Mongolia/1/201079A/goose/Guiyang/3422/2005GY-Like68A/Anhui/1/2005A/duck/Ningbo/3262/20130.01图6H5N6亚型AIVNP基因遗传进化树3.1.3.6NA基因序列分析结果本试验分离的H5N6亚型AIV进行基因系列分析发现：C135毒株NA基因ORF框长度为1380个核苷酸，颈部缺失33个核苷酸，NA基因序列分析中发现，其存在颈部缺失，N端缺失33个核苷酸；经耐药位点分析发现C135不存在耐药位点E119V、R152K、H275Y、R293K、N295S突变。潜在糖基化位点分析发现存在6个糖基化位点，51位为NET；59位为NIT；75位为NLT；135位为NGT；190位为NAS；39123 位为NWS。而54位NPT不是糖基化位点。NA基因经遗传演化分析（见图7）发现：C135位于GD-Like分支的不同的亚分支上，参考A/duck/Guangdong/GD01/2014(H5N6)毒株（Bietal.,2015）。24 95A/duck/Guangzhou/41227/2014C135A/chicken/Shenzhen/552/2013A/chicken/Dongguan/2690/2013A/chicken/Laos/LPQ001/20145664A/duck/Laos/XBY004/2014A/chicken/Shenzhen/2464/2013A/chicken/Shenzhen/2396/201369A/goose/Shantou/1791/2014A/goose/Shantou/1763/201495A/goose/Shantou/1806/2014A/chicken/Shenzhen/2269/2013A/Guangzhou/39715/201467A/duck/Vietnam/LBM751/2014A/duck/Vietnam/LBM752/201457A/duck/Vietnam/LBM758/2014GD-Like95A/duck/Vietnam/LBM759/2014A/muscovyduck/Vietnam/LBM754/2014A/muscovyduck/Vietnam/LBM756/201438A/chicken/Dongguan/4259/201356A/duck/Dongguan/2685/2013A/duck/Dongguan/3069/201346A/duck/Jiangxi/NCDZT1123/201471A/silkiechicken/Dongguan/2809/2013A/duck/Guangdong/GD01/201436A/chicken/Dongguan/3363/201399A/chicken/Shenzhen/1395/2013A/chicken/Shenzhen/433/20139994A/chicken/Shenzhen/715/2013A/chicken/Shenzhen/1061/2013A/duck/Ningbo/3262/201397A/duck/Vietnam/LBM360c1/4/1/201393A/chicken/Zhejiang/6C2/2013A/duck/Zhejiang/6D2/201398A/Anascrecca/Hubei-Chenhu1623/5/201467A/chicken/Sichuan/NCJPL1/20149973A/duck/Sichuan/NCJPL7/201479A/environment/Sichuan/NCLL1/2014A/duck/Sichuan/NCXJ16/2014699794A/duck/Sichuan/NCXJ24/2014A/duck/Sichuan/NCXJ15/201499A/duck/Jiangxi/13475/2014SC-Like97A/duck/Jiangxi/13484/201473A/duck/Jiangxi/13469/2014A/chicken/Shenzhen/1845/2013A/environment/Zhenjiang/C13/201388A/blackchicken/Jiangxi/10129/2014A/duck/Jiangxi/10160/2014A/environment/Jiangxi/10164/201499A/environment/Jiangxi/10170/2014A/environment/Jiangxi/10171/2014A/duck/Potsdam/2216/4/198498A/mallard/Sweden/40/2002A/environment/Maryland/2318/2006A/mallard/California/1418/20139899A/mallard/California/1500/2013A/duck/Sichuan/NCXN10/2014A/duck/Sichuan/NCXN11/201410051A/pigeon/Sichuan/NCXN29/20140.1图7H5N6亚型AIVNA基因遗传进化树25 3.1.3.7M基因序列分析结果M基因经过分析后发现：H5N6亚型AIV的全长1027个核苷酸，完整的ORF由两部分构成，M1长度为759个核苷酸，从26位~784位，推导可编码252个氨基酸，是连续的片段；M2长度为294个核苷酸，为不连续的两部分，第一部分为26位~51位，第二部分为740位~1007位，中间重叠了71个核苷酸，推导能编码97个氨基酸。经过M基因位点分析发现：C135的M1蛋白都存在N30D与T215A的突变，M2蛋白的26位为L，27位为V，30位为A，31位为S，34位为G没有存在抗金刚烷胺耐药位点的突变。从遗传演化分析结果（见图8）中可以看出：C135的M基因位于HB-Like分支上，参考A/chicken/Hubei/ZR/2010毒株（Bietal.,2015）。26 65A/chicken/Shenzhen/433/2013A/chicken/Shenzhen/715/2013A/chicken/Dongguan/4259/2013A/chicken/Shenzhen/552/201339A/duck/Guangdong/GD01/201465A/duck/Jiangxi/NCDZT1123/2014GD-LikeA/chicken/Laos/LPQ001/201460A/Guangzhou/39715/201498A/duck/Vietnam/LBM758/2014A/goose/Shantou/1763/201499A/chicken/Shenzhen/1061/2013A/duck/Vietnam/LBM360c1/4/1/2013VN-Like65A/chicken/Zhejiang/6C2/201355A/duck/Zhejiang/6D2/201339SC-Like99A/chicken/Sichuan/NCJPL1/201470A/duck/Sichuan/NCXJ16/201499A/whooperswan/Mongolia/3/2005A/Bar-headedGoose/Qinghai/5/20055467A/goose/Guiyang/3422/200533A/Beijing/01/200337A/Anhui/1/200587FJ-Like92A/duck/Fujian/11094/2005A/duck/Ningbo/3262/2013A/chicken/Shanxi/2/2006A/Goose/Guangdong/1/1996A/chicken/Hubei/ZR/2010A/chicken/Hubei/2014M99HB-LikeC1359469A/chicken/Jiangxi/18035/20140.01图8H5N6亚型AIVM基因遗传进化树27 3.1.3.8NS基因序列分析通过NS基因分析后发现，从C135基因NS的ORF分为两个部分，ORF1从27~704位核苷酸，是一个连续的片段，包含678个核苷酸，NS1推导可编码225个氨基酸，ORF2又包含不连续的两部分，一部分是从27位~56位核苷酸，一部分是从514位~849位核苷酸，共有366个核苷酸，位于5’端的ORF1与ORF2有重叠30个核苷酸部分，间隔457个核苷酸后的336个核苷酸则是NS2第2部分OFR框，NS2推导可编码121个氨基酸。位点分析发现：C135的42位突变位S，92位突变位E，103位突变位非致病性K，106位突变位V，149位均为G。在NS1的末端为ESEV残基。通过遗传演化分析发现（见图9）：C135的NS基因位于NB-Like分支上，参考A/duck/Ningbo/3262/2013毒株（Bietal.,2015）。28 94A/chicken/Dongguan/4258/2013A/chicken/Dongguan/4259/201339A/chicken/Shenzhen/552/2013A/goose/Shantou/1763/201431A/chicken/Laos/LPQ001/2014A/Guangzhou/39715/201435A/duck/Vietnam/LBM758/2014GD-LikeA/duck/Jiangxi/NCDZT1123/201446A/chicken/Shenzhen/1061/201328A/chicken/Dongguan/3363/20138987A/duck/Guangdong/GD01/2014A/chicken/Dongguan/2690/2013A/chicken/Shenzhen/433/20139795A/chicken/Shenzhen/715/201365A/chicken/Sichuan/NCJPL1/2014A/duck/Sichuan/NCXJ16/20149992A/blackchicken/Jiangxi/10129/2014SC-LikeA/Anascrecca-Hubei/Chenhu1623/5/201470A/chicken/Zhejiang/6C2/2013718588A/duck/Zhejiang/6D2/2013A/duck/Vietnam/LBM360c1/4/1/201349A/Anhui/1/2005FJ-Like99A/duck/Fujian/11094/200590A/chicken/Shanxi/2/2006BJ-Like97A/Beijing/01/200359A/whooperswan/Mongolia/3/200599A/Bar-headedGoose/Qinghai/5/2005A/goose/Guiyang/3422/2005A/duck/Ningbo/3262/2013NB-Like53C135A/Goose/Guangdong/1/19960.05图9H5N6亚型AIVNS基因遗传进化树29 3.1.4AIV毒株的分离结果通过分离鉴定从猪中分离到的H5N6亚型AIV，通过病毒的全基因序列分析后，发现病毒来自2.3.4.4分支，实验毒株名称A/Avian/Huanan/C135/2015（H5N6）。具体信息见下表5：表5实验毒株背景信息毒株名称简称分离地区宿主来源分离时间分支A/Avian/Huanan/C135/2015（H5N6）C135华南地区猪20152.3.4.43.2动物试验结果3.2.1鸡胚半数感染量（EID50）测定结果利用Reed-Muench法计算病毒EID50滴度，按照100倍稀释攻毒，测得研究毒株8.63的EID50值为10/ml。3.2.2病毒株对SPF鸡致病性实验结果（1）SPF鸡感染后存活率（见图10）。图10攻毒组和同居组SPF鸡死亡曲线图30 C135攻毒组鸡2d全部死亡，急速死亡，死亡前没有观察到明显临床症状；同居组鸡14d未发现死亡；同居组除被剖杀外，没有鸡自然死亡，说明病毒株具有急性致死能力，但是并未检测到病毒的水平接触感染能力。（2）SPF鸡感染后各组织脏器含毒量测定结果测定病毒在鸡体内不同组织脏器中的复制能力及组织嗜性，C135攻毒组鸡检测的6个组织脏器中病毒滴度都较高，log10EID50/mL值在4.91~7.08范围内；同居组鸡未检测病毒滴度，结果见表6：表6鸡的不同脏器组织病毒分离率及病毒滴度log10EID50/mL心肝脑脾肺肾感染组(6.75±0.43)(6.16±0.57)(4.91±0.52)(6.83±1.51)(7.08±0.72)(6.75+±0.65)同居组(0/3)(0/3)(0/3)(0/3)(0/3)(0/3)（3）SPF鸡感染后咽/泄殖腔拭子检测结果因SPF鸡感染后，2d内全部攻毒组鸡死亡，所以未能测定咽/泄殖腔拭子滴度，而同居组在3d，5d都未能检测到经呼吸道和消化道排毒结果见表7：表7C135咽、肛拭子滴度测定log10EID50/200ul3d3d5d5d咽喉拭子泄殖腔拭子咽喉拭子泄殖腔拭子攻毒组NDNDNDND同居组(0/3)(0/3)(0/3)(0/3)备注：ND表示未测定3.2.3H5N6亚型AIV对BALB/c小鼠的致病性实验结果（1）SPFBALB/c小鼠感染后体重变化情况SPFBALB/c小鼠感染后体重变化情况（见图11）。由图发现小鼠在攻毒后体重曲线均出现先升高后降低的变化趋势，攻毒组小鼠体重降至9d后开始回升，14d后为体重原来的1.08倍。31 图11小鼠体重变化（2）SPFBALB/c小鼠感染后存活率6以滴鼻方式感染小鼠，剂量50μL10EID50，连续14d每天观察记录不同病毒对各小鼠的致病性出现的临床症状，称量小鼠体重，记录小鼠死亡情况（见图12）：C135组7d出现死亡4只，8d死亡1只，10d死亡1只，死亡率达75%，之后再没有出现死亡。32 图12小鼠存活率曲线（3）SPFBALB/c小鼠感染后肺/脑病毒量检测结果攻毒4d后分别取未编号3只小鼠的肺、脑脏器，研磨稀释后接9~11d龄非免疫胚，，测定病毒在小鼠肺脏和脑内的病毒复制滴度（见图13）。由肺脏、脑病毒滴度测定结果可以看出，病毒在小鼠肺脏中有较高滴度，log10EID50/mL值在4.75~6.5之间，但C135攻毒组的小鼠在脑中并没有检测到病毒。图13小鼠肺、脑病毒滴度33 3.3讨论与结论AIV各个基因片段的共同作用影响着致病力强弱，其中HA基因对AIV的致病力却起到了关键性作用（Steinhauer,1999）。通过HA蛋白潜在糖基化位点突变的影响、解位点突变的影响、以及通过某些氨基酸位点突变影响等方式来改变AIV对宿主的结合及病毒复制能力，从而决定了宿主的范围；NA蛋白通过与HA蛋白构成某种相对平衡，来共同调节病毒在宿主体内的复制能力（谭伟，2014），而NA基因的颈部缺失会对病毒释放产生影响（Mariaetal.,1993）；NS1蛋白通过抑制机体免疫力来增强病毒对机体的破坏程度（Marozinetal.,2002）；聚合酶复合体在病毒复制及对宿主产生致病性过程中也发挥着重要作用，其中PB2在对不同宿主产生致病性过程中发挥着重要作用（Masatoetal.,2001；Xiaokangetal.,2012），PB1蛋白通过N端与C端在聚合酶复合体中链接着PA的C端与PB2的N端，发挥着桥梁枢纽作用，PB1-F2蛋白通过损伤机体免疫能力来促进病毒在体内的增值与扩散，PA蛋白则通过与PB1蛋白协调作用同突变来达到更强的致病力。通过对猪源H5N6亚型AIV全基因序列分析发现，通过测定病毒的全基因序列分析发现：C135毒株NA基因ORF框长度为1380个核苷酸，颈部缺失33个核苷酸，NA基因序列分析中发现，其存在颈部缺失，N端缺失33个核苷酸；经耐药位点分析发现C135不存在耐药位点E119V、R152K、H275Y、R293K、N295S突变。HA基因测序和序列的拼接分析发现：基因包含1776个核苷酸，含有一个完整ORF框，包含1704个核苷酸，可推导编码567个氨基酸，其5’非编码区和3’非编码区分别含有28个和44个核苷酸，未发现核苷酸的插入和缺失。分析发现：N端糖基化位点中，26位、27位、39位、181位、302位、499位和558位存在糖基化位点。M基因经过分析后发现：H5N6亚型AIV的全长1027个核苷酸，完整的ORF由两部分构成，M1长度为759个核苷酸，M2长度为294个核苷酸，为不连续的两部分，第一部分为26位~51位，第二部分为740位~1007位，中间重叠了71个核苷酸，推导能编码97个氨基酸。PB1基因系列分析发现：全长为2341bp个核苷酸，包含完整ORF框，长度为2274个核苷酸，推导编码757个氨基酸，其中5’非编码区和3’非编码区分别含有24个和43个核苷酸，无核苷酸的插入和缺失；病毒的13位均突变为P，678位没有发生突变均为S。PB2基因由2341bp个核苷酸组成，完整的ORF长度为2280bp核苷酸，推导可编码759个氨基酸，其5’非编码区和3’非编码区分别含有27个和34 34个核苷酸。PB2基因分析发现，627位为E，没有发生突变；与毒力紧密相关的701位依然为D，这些基因未发生突变。PA基因片段长度为2233个核苷酸，含有一个长度为2151个核苷酸的完整ORF框，推导能编码716个氨基酸，其5’非编码区和3’非编码区分别含有24个和58个核苷酸，未发现氨基酸的插入或缺失，但发生了N615K突变，突变为K；与病毒在细胞中生长有关的638位为R、与复制有关的539位为K、与聚合酶活性相关的510位为H，与致病性相关的224位与383位分别为S和D，没有发生突变。NP基因长度为1565个核苷酸，含有一个完整的长度为1497个核苷酸的ORF框，推导可编码498个氨基酸，未发现核苷酸的插入和缺失。其5’非编码区和3’非编码区分别含有45个和23个核苷酸。毒株的位点分析发现，影响试验动物肺脏病毒滴度相关的479位，存在L479F突变；319位没有发生突变，仍为N。NS基因ORF框分为两个部分，ORF1从27~704位核苷酸，是一个连续的片段，包含678个核苷酸，NS1推导可编码225个氨基酸，ORF2又包含不连续的两部分，一部分是从27位~56位核苷酸，一部分是从514位~849位核苷酸，共有366个核苷酸，位于5’端的ORF1与ORF2有重叠30个核苷酸部分，间隔457个核苷酸后的336个核苷酸则是NS2第二部分OFR框，NS2推导可编码121个氨基酸。位点分析发现：C135的42位突变位S，92位突变位E，103位突变位非致病性K，106位突变位V，149位均为G；在NS1的末端为ESEV残基。本研究选取了从华南地区猪群中分离的一株猪源H5N6亚型AIVC135，分别感染4~6周龄SPF鸡和体重为13~14g的雌性BABL/c小鼠。其中对鸡在攻毒的第二天就全部死亡，没有观察到明显的临床症状，同居组鸡14d中未发现有死亡鸡，未出现明显的临床症状，可以推断所分离毒株具有较强的致病性，但没有水平传播能力。通过对鸡组织脏器检测情况表明：病毒在鸡的脑、心、肝、脾、肺、肾6个脏器中均能良好繁殖，且有较高的病毒滴度，而同居组鸡中各个脏器中的病毒滴度均未检出，说明该病毒水平传播能力相对较弱；拭子检测只检测同居组，结果为检出。而攻毒鸡在2d全部死亡，所以未检测拭子；病毒对小鼠实验可以看出，病毒具有较强的致病性，能够导致大部分小鼠死亡，并且对小鼠的体重的增长产生较大影响，由肺、脑病毒滴度检测结果可以看出，毒株在小鼠肺脏内有检测到较高病毒滴度，但是在脑中未检测出病毒滴度。猪是禽流感和人流感的共同易感中介宿主，AIV又与猪、人流感有着密切的联系，鉴于猪和AIV在流感的流行与传播过程中的特殊地位及中国养殖业的特殊性（李海燕35 等，2003），及目前全球多个国家暴发禽流感疫情，并出现人感染高致病性禽流感的病例，故对猪源禽流感进行及时监测和研究具有重要意义（Choietal.,2002）。鉴于华南地区是畜禽的大规模养殖地区，流感的存在一直以来都威胁畜禽业的发展，给农业经济社会造成了不可估量的损失。现阶段预防流感的发生和流行较为有效的方法是给畜禽接种疫苗，接种疫苗降低畜禽发病的风险，但是随着AIV流感病毒的抗原漂移、病毒重组、转变容易造成疫苗的保护性能降低或失效（张明明等，2009）。所以仅仅靠免疫的方法很难达到防控目的。只有加强饲养管理，保持栏舍清洁、通风、干燥、特别注意加强饲养管理，提供充足干净的饮用水。寒冷季节要做好防寒保温，建立健全卫生消毒制度，定期消毒和驱虫，减少环境中可能潜在的病原微生物，在疾病高发季节在饲料或水中加入适量的预防流感药物来预防流感病情的发生。加强外来引种防控，高发季节尽量避免外来引进，不从流感高发的地区购买生畜禽，避免了传染源的传入。综上所述，由于猪是流感病毒的易感宿主，在病毒跨种间传播中扮演着桥梁的角色。在AIV重组与变异的方式多样，各种条件的变化都会影响到AIV的复制与增殖，从而导致基因重组和突变，进而对AIV的致病性产生重要影响，促使AIV发生快速的遗传演化。实验分离出的病毒具有较强的致病性，但是水平接触传播能力较弱。本研究对华南地区AIV感染进行了流行病学调查，涉及了屠宰场和养殖场，虽然没有涉及所有县市，但是所采集样品的猪都是来自规模化较为集中的地区，具有较好的代表性，能够客观反映华南地区AIV在畜禽中的感染情况，并提供了重要数据，为该病的预防控制提供了重要的科学依据。36 全文总结1、本研究H5N6亚型AIV通过基因系列分析发现，分离病毒株C135位于2.3.4.4分支。2、病毒株对SPF鸡致病性实验结果表明，分离的病毒在鸡脑、心、肝、脾、肺、肾6个脏器中均检测到较高病毒滴度，具有良好的组织嗜性及病毒复制能力。3、病毒株对SPF鸡致病性较强。4、对小鼠具有中等毒力。在小鼠肺脏内均有检测到病毒，有较强病毒复制能力；在脑内并没有检测到病毒，不具备入脑的能力。37 致谢本论文是在导师亓文宝教授的悉心指导和亲切关怀下完成的，在论文选题、论文实施以及论文撰写等方面给予孜孜不倦的细心指导。亓老师不仅在科研、学习生活上给予了我极大的帮助，老师严谨细致、实事求是的治学态度，认真勤奋、不知疲倦的工作作风，渊博的学识、豁达宽广的胸怀以及对科研的不懈追求，使我终身难忘，并时刻鞭策我努力工作，奋发向上。在论文完成之际，在此向恩师表达最衷心的感谢与最崇高的敬意！在此特别感谢曾昭勇、孙娜、李倩和郭彩云实验员在整个实验与论文完成过程中全力支持与协助，更在遇到困难时提供无私的帮助！衷心感谢我的指导老师卢受昇高级兽医师在论文的立题、构思、技术路线、论文撰写等各方面给予的精心指导。他认真负责、严谨细致的工作态度，豁达宽广的胸怀和高尚的人格为我树立了学习的榜样。感谢华南农业大学兽医学院动物传染病教研室的廖明教授、任涛教授、张桂红教授、樊惠英教授、宁章勇教授、罗开健副教授、曹伟胜副教授、焦培荣副研究员、徐成刚高级实验师、贾伟新高级实验师、张建民副教授在学习和生活中给予的大力指导与帮助，在此表达衷心的感谢！感谢张灶月、温毅骏、黄丽红、李华楠、郑译、肖陈城、余远迪、张旭、胡平生、刘墅楷、李波、朱旭辉、邢金超、张又月、瞿孝云、梁嘉琪等同学在本论文实验过程中给予的大力帮助与支持，在此表示感谢！感谢黄越亮、唐金明等共同学习、生活的同学们，对论文实验完成的帮助，在此表示衷心的感谢！向兽医学院各位领导和老师们给予我的关心与帮助致以衷心的感谢！最后，还要特别感谢这么多年来一直关心我、爱护我的家人和朋友，感谢他们在我求学生涯中给我提供物质条件和精神帮助，是他们的无私奉献与鼓励支持，使我顺利毕业！38 参考文献崔建勋,杜红丽,凌飞.H1N1亚型流感的公共卫生意义与防疫检疫措施[J].广东农业科学,2009(07):152-155.记者方芳.我国现全球首例人感染H5N6个案[N].北京日报.李海燕,辛晓光,于康震,等.H3N2亚型猪流感病毒中国分离株的克隆纯化及生物学特性[J].中国兽医学报,2003(06):560-563.李海燕,于康震,杨焕良,等.中国猪流感病毒分离株HA1基因序列同源性及遗传演化研究:中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第五届理事会第二次全体会议暨防检疫专业委员会第7次学术交流会[C],中国重庆,2002.孙洪涛,宋建德,朱迪国,等.2014年全球禽流感流行状况[J].中国动物检疫,2015(07):13-16.谭伟.禽流感病毒研究概述[J].基因组学与应用生物学,2014,33(1):194-199.王连想,毕英佐,曹永长.6株猪流感病毒分离株HA部分基因的克隆和序列分析[J].中国兽医学报,2003(05):438-441.闫若潜,杜向党.流感病毒基因组结构及其编码蛋白研究进展[J].动物医学进展,2004(01):32-35.于康震,陈化兰,唐秀英.97香港禽流感[J].中国畜禽传染病,1998,20(3):187-191.张明明,王强,王小辉.猪流感研究进展[J].安徽农业科学,2009,16(37):7450-7453.朱迪国,宋建德,黄保续.当前全球禽流感流行概况及特点分析[J].中国动物检疫,2015(03):41-47.AlexanderDJ.EcologicalaspectsofinfluenzaAvirusesinanimalsandtheirrelationshiptohumaninfluenza:areview[J].JRSocMed,1982,75(10):799-811.BalintA,MetreveliG,WidenF.ThefirstSwedishH1N2swineinfluenzavirusisolaterepresentsanuncommonreassortant[J].2009(6):180.BiY,ChenJ,ChenQ,etal..TwonovelreassortantsofavianinfluenzaA(H5N6)virusinChina[J].JournalofGeneralVirology,2015,96(5):975-981.BiY,MeiK,ShiW,etal..TwoNovelReassortantsofAvianInfluenzaA(H5N6)VirusinChina[J].JournalofGeneralVirology,2015.BrownIanH.Theepidemiologyandevolutionofin¯uenzavirusesinpigs[J].2000(74):29-46.ChoiYK,GoyalSM,JooHS.PrevalenceofswineinfluenzavirussubtypesonswinefarmsintheUnitedStates[J].ArchivesofVirology,2002,147(6):1209-1220.GuanY,ShortridgeFK,KraussS.EmergenceofAvianH1N1InfluenzaVirusesinPigsinChina[J].39 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