生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究

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Ｘ７０３．１公开密级：中图分类号：ＵＤＣ：：本校编号硕士学位论文论文题目：生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究１４０研究生姓名：权海荣学号：０２７５学校指导教师姓名：周岳溪／王亚娥职称：研贫究员／教授工：市政工程申请学位等级：学硕士专业２０１７年６月论文提交曰期：２０１７年４月论文答辩日期： 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作和取得的研宄成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研也不包含获得ｔ州夺通大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。宄成果，与我一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了樹意。学位论文作者签名：私签字日期：年６月日；学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解３州夺通大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权Ｓ州夺通±学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。）（保密的学位论文在解密后适用本授权说明导师签名：学位论文作者签名：签字日期签字日期：年月日：以７年＆月９日以＾ｙ７ 硕士学位论文生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究IsolationandEnrichmentofAerobicDenitrifyingBacteriafromBiologicalSpongeIronSystemanditsDenitrificationPerformance作者姓名：权海荣学科、专业：市政工程学号：0214075指导教师：周岳溪/王亚娥完成日期：2017.04兰州交通大学LanzhouJiaotongUniversity 兰州交通大学硕士学位论文摘要氮污染是一类重要的污染物，它对人体健康及环境均有非常大的危害，主要存在形式有有机氮和无机氮两种。生物法脱氮是目前污水脱氮最常用且最经济的方法，然而由于参与各脱氮步骤中的各种菌群对营养物质和溶解氧的要求不同，这就产生了生物脱氮法工艺复杂的缺点，这很大程度上限制了它在实际工程中的应用。本实验组在前期的研究过程中发现生物海绵铁体系较普通活性污泥体系具有更加良好的脱氮效果，同时发现在此生物海绵铁体系中存在大量的铁细菌和好氧反硝化细菌。本文以本实验组前期的研究和发现为切入点，首先考察了海绵铁及NO-3-N对SBR反应器处理效果的影响，并就其对微生物（铁细菌和好氧反硝化菌）数量的影响进行研究。之后对各反应器中具有铁氧化功能的好氧反硝化菌进行分离、筛选，并对其中的一株具有高效脱氮能力的好氧反硝化菌2-5进行生理生化和16SrDNA鉴定。考察了碳源、C/N、海绵铁投加量、初始pH值及温度等因素对好氧反硝化菌株2-5生长特性和脱氮性能的影响。最后本文进行了2-5菌株强化普通SBR反应器的研究。研究结果表明：（1）同时投加海绵铁和NO-3-N的SBR反应器（生物海绵铁体系）脱氮效果明显优于普通活性污泥系统。前者TN去除量为33.54mg/L约为后者TN去除量的2倍。通过对各反应器中铁细菌和好氧反硝化菌的测定证实了海绵铁和NO-3-N会促进体系中铁细菌及好氧反硝化菌生长的猜测，正是由于此类微生物的大量存在促进了SBR反应器对TN的降解效果的提高。（2）实验筛选出19株好氧反硝化菌，经过反硝化性能的测定，其中菌株2-5脱氮效果相对最好，在培养48h时能将体系中NO--N从126.79mg/L降至37.12mg/L,去除3率为70.72%，整个过程中NH+-N始终保持在较低水平。菌株2-5的生理生化实验和416SrDNA分析结果显示，2-5属于反硝化无色杆菌，同源性达到99%。（3）考察碳源对菌株的生长特性及脱氮性能时，发现菌株2-5以甲醇为碳源时较其他碳源取得较大的生长量及生长速率，同时碳源结构越简单，菌株的生长速率越快。同时以甲醇为反硝化电子供体时NO-3-N的降解速率和去除率均为最大，但其TN的去除率并非最大，而以酒石酸钾钠为碳源时TN去除率最大，达到70%。同时，可以发现NO-3-N去除率与TN去除率的一致性上产生一定差别，而产生这种差别的主要原因是NO-2-N的积累量不同。（4）考察了C/N、海绵铁加量、初始pH值、温度等生态因子对2-5脱氮效果的影响，结果显示最佳C/N为17，海绵铁投加量为1g/L。在初始pH值为7时TN的降解率最高，为93%。温度为20℃时，菌株的脱氮效果较差，硝氮仍有大量残余。当温度-I- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究为30℃-35℃时，菌株2-5TN去除率可达到90%以上。（5）将好氧反硝化菌株2-5应用于SBR反应器的强化实验中。不同NO-3-N进水负荷下，各反应器脱氮效果发生规律性的变化，这种变化可以通过调整反应器的C/N使之发生改善。但相比之下在整个运行过程中同时投加60%好氧反硝化菌2-5菌液和90g/L海绵铁的4#活性污泥反应器具有较好的抗高氮负荷的能力，这可能与该反应器中加入海绵铁具有密切的关系。实验同时考察了4#反应器不同阶段一个周期内TN、NO-3-N的变化情况。实验结果显示4#反应器各阶段都能在短时间内快速的将TN和NO--N降解3到较低水平。关键词：生物海绵铁体系；好氧反硝化菌；影响因素；强化论文类型：应用研究II 兰州交通大学硕士学位论文AbstractNitrogenisaclassofimportantpollutants,whichharmtohumanhealthandenvironment.Thepresenceofnitrogenismainlyorganicnitrogenandinorganicnitrogen.However,duetotheparticipationofvariousdenitrificationinthevariousfloraofnutrientsanddissolvedoxygenrequirementsaredifferent,whichproducednitrogenremovalprocesscomplex.anditlargelylimitsitsapplicationinpracticalengineering.Inthepreviousstudy,wefoundthatthebio-spongeironsystemhadbetternitrogenremovaleffectthantheordinaryactivatedsludgesystem,andfoundthattherewerealotofironbacteriaandaerobicdenitrifyingbacteriainthebio-spongeironsystem.TheeffectofspongeironandNO-3-NonthetreatmentefficiencyofSBRreactorwasinvestigatedinthispaper.Anditseffectonthenumberofmicrobes(ironbacteriaandaerobicdenitrifyingbacteria).Theaerobicdenitrifyingbacteriawithironoxidationfunctionineachreactorwereseparatedandscreened,andOneofthehighlyefficientdenitrificationabilityofaerobicdenitrifyingbacteria2-5forphysiologicalandbiochemicaland16SrDNAidentification.Theeffectsofcarbonsource,C/N,spongeirondosage,initialpHvalueandtemperatureonthegrowthcharacteristicsanddenitrificationperformanceofaerobicdenitrifyingstrain2-5wereinvestigated.Attheendofthispaper,wecarriedoutthestudyof2-5straintostrengthenordinarySBRreactorResearchindicates:（1）TheeffectofaddingspongeironandNO-3-NSBRreactor(biologicalspongeironsystem)wasbetterthanthatofordinaryactivatedsludgesystem.TheformerTNremovalrateof33.54mg/Lisabout2timestheamountofTNremoval.ThedeterminationofironbacteriaandaerobicdenitrifyingbacteriaineachreactorconfirmedthatspongeironandNO-3-Ncouldpromotethespeculationofthegrowthofironbacteriaandaerobicdenitrifyingbacteriainthesystem.ItispreciselybecauseofthelargepresenceofsuchmicroorganismsthatpromotesthedegradationofTNbySBRreactors.（2）19aerobicdenitrifyingbacteriawerescreened,ThroughtheseparationandscreeningofaerobicdenitrifyingbacteriainthreeSBRreactors.Theresultsshowedthatthestrain2-5hadthebesteffect,TheNO-3-Ndecreasedfrom126.79mg/Lto37.12mg/Landtheremovalratewas70.72%at48hafterculture.NH+4-Nremainedatalowlevelduringthewholeprocess.Thephysiologicalandbiochemicalexperimentsand16SrDNAanalysisofstrains2-5showedthat2-5belongedtodenitrifyingnonferrousbacteriaandreached99%homology.（3）Whenthecarbonsourcewasusedtostudythegrowthcharacteristicsanddenitrificationpropertiesofthestrain,itwasfoundthatthestrain2-5hadhighergrowthandgrowthratethantheothercarbonsourceswhenmethanolwasusedasthecarbonsource.Atthesametime,-III- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究thecarbonsourcestructurewasmoresimple,thegrowthrateThefaster.Atthesametime,thedegradationrateandremovalrateofNO-3-Nwerethehighestwhenmethanolwasdenitrifiedelectrondonor,buttheremovalrateofTNwasnotthelargest,andtheremovalrateofTNwasthehighestwhenpotassiumtartratewascarbonTheThisismainlyduetothedifferentdenitrificationpathwaysunderdifferentcarbonsources,resultingindifferentamountsofnitriteaccumulation,resultinginNO-3-NremovalrateandTNremovalrateontheconsistencyofacertaindifference.Atthesametime,thesimplerthestructureofthecarbonsource,thefasterthegrowthrateofthestrain.（4）TheeffectsofC/N,spongeironaddition,initialpHvalueandtemperatureonthedenitrificationeffectof2-5wereinvestigated.TheresultsshowedthattheoptimumC/Nwas17andthespongeirondosagewas1g/L.Thedenitrifyingeffect(denitrificationrate59%-93%)wasbetterforthestrains2-5undertheconditionsofneutralandalkali(pH7-9).ThedegradationrateofTNwas93%attheinitialpHvalueof7.Whenthetemperatureis20℃,thenitrogenremovalefficiencyofthestrainispoor,andthereisstillalotofresidual.Whenthetemperatureis30℃-35℃,thestrain2-5TNremovalratecanreachmorethan90%.（5）Theaerobicdenitrifyingstrains2-5wereappliedtotheintensificationexperimentsoftheSBRreactor.UnderdifferentNO-3-Ninfluentload,thedenitrificationeffectofeachreactorchangesregularly,andthischangecanbeimprovedbyadjustingtheC/Nofthereactor.However,comparedwiththe4#reactorinthewholeprocesshasagoodabilitytoresisthighnitrogenload,whichmaybeaddedtothereactorwithspongeironhasacloserelationship.ThechangesofTNandNO-3-Ninacycleof4#reactorwereinvestigatedatthesametime.TheexperimentalresultsshowthatTNandNO-3-Ncanbedegradedtoalowlevelinashorttime(240min)ateachstageofthe4#reactor.KeyWords:biologicalspongeironsystem;aerobicdenitrifyingbacteria;influencingfactors;strengtheningTypesofPapers:AppliedResearchIV 兰州交通大学硕士学位论文目录摘要.............................................................................................................................IAbstract.............................................................................................................................III第一章绪论...............................................................................................................11.1生物脱氮理论与工艺...........................................................................................11.1.1传统生物脱氮理论与工艺........................................................................11.1.2新型生物脱氮工艺....................................................................................11.2生物海绵铁体系及特征.......................................................................................21.3好氧反硝化作用以及在水处理中的应用...........................................................31.3.1好氧反硝化作用的概念............................................................................31.3.2好氧反硝化作用机理................................................................................31.3.3好氧反硝化相关酶类................................................................................41.3.4好氧反硝化菌及其影响好氧反硝化的因素............................................51.3.5好氧反硝化细菌在水处理中的应用........................................................61.4论文研究目的及研究内容...................................................................................71.4.1论文研究目的............................................................................................71.4.2论文研究内容............................................................................................7第二章海绵铁及NO-3-N对SBR反应器中好氧反硝化菌的富集影响.......................82.1实验材料与方法...................................................................................................82.1.1实验材料....................................................................................................82.1.2实验方法....................................................................................................82.1.3分析测试方法............................................................................................92.2实验结果与讨论...................................................................................................92.2.1海绵铁及NO-3-N对SBR反应器处理效果的影响................................92.2.2海绵铁及NO-3-N对SBR反应器中微生物数量的影响......................122.3本章小结.............................................................................................................13第三章间歇式生物海绵铁反应器（SBSI）中好氧反硝化菌的分离筛选................153.1实验材料与方法.................................................................................................153.1.1实验材料..................................................................................................153.1.2实验方法..................................................................................................153.1.3分析方法..................................................................................................183.2结果与讨论.........................................................................................................183.2.1好氧反硝化菌的分离、纯化..................................................................18-V- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究3.2.2分离菌株的好氧反硝化性能测定..........................................................183.2.3具有铁氧化功能的好氧反硝化菌的筛选..............................................203.2.4具有铁氧化功能的好氧反硝化菌株2-5的鉴定..................................213.3本章小结.............................................................................................................21第四章碳源对好氧反硝化细菌2-5生长特性及脱氮性能影响研究.........................234.1实验材料与方法.................................................................................................234.1.1实验材料..................................................................................................234.1.2实验方法..................................................................................................234.1.3分析方法..................................................................................................234.1.4数据统计方法..........................................................................................234.2结果与讨论.........................................................................................................244.2.1不同碳源下pH和ORP的变化.............................................................244.2.2碳源对好氧反硝化菌生长影响..............................................................254.2.3碳源对NO-3-N降解的影响...................................................................284.2.4碳源对TN及NO-2-N的影响................................................................304.3本章小结.............................................................................................................32第五章好氧反硝化细菌2-5脱氮影响因素研究.........................................................335.1实验材料与方法.................................................................................................335.1.1实验材料..................................................................................................335.1.2实验方法..................................................................................................335.1.3分析方法..................................................................................................345.2结果与讨论.........................................................................................................345.2.1C/N比对好氧反硝化细菌2-5生长特性及脱氮性能的影响...............345.2.2海绵铁加量对好氧反硝化细菌2-5生长特性及脱氮性能的影响.....385.2.3初始pH值对好氧反硝化细菌2-5生长特性及脱氮性能的影响......425.2.4温度对好氧反硝化细菌2-5生长特性及脱氮性能的影响.................445.3本章小结.............................................................................................................46第六章好氧反硝化细菌2-5强化SBR反应器研究..................................................476.1实验材料与方法.................................................................................................476.1.1实验材料..................................................................................................476.1.2实验方法.................................................................................................476.1.3分析测试方法..........................................................................................486.2结果与讨论.........................................................................................................486.2.1好氧反硝化细菌2-5强化SBR反应器脱氮性能研究........................48VI 兰州交通大学硕士学位论文6.2.2不同NO-3-N进水负荷下好氧反硝化细菌2-5强化SBR反应器脱氮性能研究.......................................................................................................................536.2.3不同阶段4#反应器一个周期内各指标变化.........................................556.3本章小结.............................................................................................................56结论...............................................................................................................................57致谢...............................................................................................................................58参考文献.....................................................................................................................59攻读学位期间的研究成果...............................................................................................64-VII- 兰州交通大学硕士学位论文第一章绪论1.1生物脱氮理论与工艺1.1.1传统生物脱氮理论与工艺传统生物法脱氮过程主要包含氨化、硝化和反硝化三个过程。硝化作用是指在有氧条件下，硝化细菌将氨态氮转化为硝酸盐的过程，该过程需要在好氧环境中进行。主要分为两个步骤，首先在亚硝化菌的作用下，将氨转化为亚硝酸盐氮，反应式为：NH+-+4-N+3/2O2→NO2+H2O+2H之后，亚硝酸盐氮通过硝酸菌的作用，进一步将亚硝酸盐氮转化为硝酸盐氮。NO--2+1/2O2→NO3反硝化作用是反硝化菌将亚硝酸盐氮及硝酸盐氮还原为气态氮。反硝化细菌为异养型兼性厌氧菌，厌氧时，它们营厌氧呼吸，可以以硝酸盐氮为电子受体，以有机物作为电子供体进行反硝化。目前国内大多采用传统硝化-反硝化生物脱氮工艺处理含氮废水[1]。但在实际应用过程中发现较多问题[2]，如硝化细菌数量增长较慢而且很难维持较高的生物浓度，尤其是在气候严寒的冬季，致使系统的水力停留时间增长，这就需要较大的曝气池，无疑增加工程的投资、运行费用。因此，学者、专家们正在积极研究开发高效率、低能耗的生物脱氮新工艺。1.1.2新型生物脱氮工艺随着科学技术的不断进步，经过数代水处理人的共同努力，在传统硝化-反硝化工艺基础上研究出的一些新型生物脱氮工艺，这些处理工艺的出现在很大程度上改善了传统脱氮工艺的不足，广泛得到大家的认可和使用[3]。这些工艺中较为典型的工艺有短程硝化反硝化(shortcutnitrification-denitrification）、同时硝化反硝化(simultaneousnitrificationdenitri-fication)等。（1）短程硝化反硝化短程硝化反硝化是指通过对硝化反应条件的控制，将氨氮的氧化停留在NO-2阶段，--N还原为N[4]之后进行反硝化将NO22，此工艺的优点为：(1)减少投加碱度和外加碳源的量，剩余污泥量减少24-33%；(2)相比之下，HRT较短，反应器的容积可缩小30%-40%[5]；(3)缩短反应时长，提高了氮的去除率。但是在实际中发现很难将硝化反应停留在NO-2阶段，因此限制了该工艺的发展。SHARON工艺在短程硝化反硝化工艺中较为典型[6]，它是处理高浓度、低碳氮比含氨废水的一种新型脱氮技术。这种技术根据亚硝酸菌和硝酸菌的生长条件不一样，通过-1- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究控制反应器的HRT和pH，使亚硝酸菌在反应器中成为占优势的菌属,这样就可以将氨氮的氧化控制在亚硝化阶段，之后再进行反硝化。（2）同时硝化反硝化同时硝化反硝化(simultaneousnitrifieationDenitrification-SND)，即硝化与反硝化反应在同一个反应器中同时完成[7]。目前关于同时硝化反硝化理论，主要包括物理和微生物两个方面的解释。目前较被认可的解释为：絮体中溶氧（DO）梯度是产生这一现象的主要因素。絮体外表面DO较高，好氧菌、硝化菌占据主导地位；相反的，絮体内部，反硝化菌占优势[8]。就是因为这种缺氧环境的存在，致使SND的产生。（3）厌氧氨氧化细菌以NH+--+--4为电子供体，以NO2或NO3作为电子受体，将NH4、NO2或NO3转变成N[9]2的过程称为厌氧氨氧化。如图1.2所示，现阶段研究发现厌氧氨氧化有多种途径[10]。图1.1厌氧氨氧化的可能代谢途径Figure1.1possiblemetabolicpathwaysofanaerobicammoniumoxidation1.2生物海绵铁体系及特征海绵铁是由精矿粉和氧化铁磷经过多重工序加工制得的一种价格低廉的多孔状颗-2- 兰州交通大学硕士学位论文粒物，因其在显微镜下观察时形似海绵而得名[11]。与普通铁屑滤料比较，具有比表面积大、比表面能高、有较强电化学富集、氧化还原、物理吸附以及絮凝沉淀性能良好的优点。物化性能详见表1.1。表1.1海绵铁的组成及各项性能指标Table1.1compositionofspongeironandtheperformanceindicators组成全铁金属铁锰铬镍CaOMgO碳及其他杂质(%)96-97900.200.0100.09<0.010.0513～4物理堆积密度3）指标密度（g/cm（g/cm3）粒径（mm）外观2.3～2.71.7～1.880.5～3.0灰黑色有亮点、疏松海绵状将海绵铁以一定方式介入到活性污泥中便形成了生物海绵铁体系，它是建立在零价铁基础上的铁炭微电解法与活性污泥法的有机结合。海绵铁作为生物固定化载体填料的三个优点：首先，它可以为细菌的富集生长提供足够的空间，为生化反应器中各种好氧、兼氧和厌氧微生物的协同共生提供良好的“微环境”；其次，因为其特殊的化学成分，内部能形成大量原电池，电极反应产生的新生态的Fe2+和其氧化生成的Fe3+以及它们的水化物，在沉淀、絮凝、吸附和卷扫等作用下，出水中的P浓度大程度的降低；最后它也有生物铁的功能，能够增强活性污泥的净化功能。生物海绵铁体系也可增强其对污水COD、NH3-N的去除效果。1.3好氧反硝化作用以及在水处理中的应用1.3.1好氧反硝化作用的概念近年来，人们对好氧反硝化的研究还不够深入，主要集中在好氧反硝化菌的分离筛选和脱氮性能研究以及好氧反硝化菌的应用潜力分析和机理研究[12]。Robertson和Kuenen[13]最早提出了好氧反硝化，在实验室他们观察到了有氧条件下的反硝化现象。最近几年，人们也不断的在实际工程中发现好氧条件下的氮去除现象，Pochana[14]在序批式生化反应器中观察到了94%的总氮降解率。在很多实际运行的好氧硝化池中也常常存在30%的TN损失[15-16]，此类现象均充分证实了好氧反硝化的存在。1.3.2好氧反硝化作用机理目前为止，好氧反硝化菌的作用机理主要是通过研究经典好氧反硝化菌株Thiophaerapantotroph所得到的[17]，大多数学者对好氧反硝化机理的解释主要从生物学理论和微生物学理论两个方面进行。（1）生物学理论-3- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究近年来生物学上的发现和进展已经可以对好氧反硝化现象给出令人相对信服的答案。刚开始，人们认为反硝化是一个严格的厌氧过程。反硝化菌为兼性厌氧菌的这个特点阻挡了了利用亚硝酸盐和硝酸盐作为最终的电子受体。正是由于80年代人们发现了好氧反硝化菌的存在，好氧反硝化的解释就有了生物学上的根据。有学者研究认为[18]厌氧反硝化时电子在向氧原子传递的过程中，细胞色素Cytc和Cytaa3之间存在一个瓶颈，然而在好氧反硝化反应中，电子能在细胞色素aa3(Cytaa3)和细胞色素c(Cytc)之间传递，解除了O2对反硝化电子呼吸链途径的抑制，硝酸盐和氧分子作为最终的电子受体，也就是反硝化菌能够把电子从被还原的物质传递给O2，同时也能够将电子传递给硝酸盐。但是，现阶段，人们对于好氧反硝化过程机理的理解和细菌什么时候能从利用氧转变为利用硝酸盐仍不深入，还有待更深的研究。图1.2好氧反硝化菌的反硝化作用过程及途径Figure1.2Denitrificationprocessandrouteofaerobicdenitrifyingbacteria（2）微环境理论活性污泥菌胶团和生物膜内会产生各种微环境类型[19]。有机碳源和电子受体决定不同微生物的环境状况。好氧性微环境下，好氧菌活动剧烈，当氧消耗速率较氧传递速率高时，好氧性微环境就转换成了厌氧性微环境；类似的，在某些条件下，厌氧性微环境也可以转换为好氧性微环境。一般情况下，即便在活性污泥系统中，好氧性微环境占主导地位，也会存在少量微氧、缺氧、厌氧等各种状态微环境的情况。生物膜法中，基质浓度以及生物膜厚度的变化也会对厌氧微环境产生的较大影响[20]。高溶解氧浓度可以增强微生物穿透生物絮体的能力，因而可以提高硝化反应速度，但另一方面会降低反硝化速率。生物絮体内的微环境状态，不仅受溶解氧影响，还与有机负荷(F/M)和搅拌程度有着密切的关联[21]。1.3.3好氧反硝化相关酶类好氧环境下的反硝化过程和传统的厌氧反硝化过程相似。反硝化过程的主要作用酶有四种。-4- 兰州交通大学硕士学位论文（1）硝酸盐还原酶好氧反硝化菌的硝酸盐还原酶也被称作周质硝酸盐还原酶(periplasmicnitrateredu-ctase)；厌氧反硝化菌的硝酸盐还原酶也被称作膜结合硝酸盐还原酶（membrane-boundnitratereductase)。对脱氮副球菌的研究结果显示[22]:好氧反硝化中优先起作用的是周质硝酸盐还原酶，该酶对氧分子不敏感，因而它既能在好氧环境下生长，也能在厌氧环境下生长。当周质硝酸盐还原酶受到到抑制时，它仍具有还原硝酸盐的能力；相反的，膜结合硝酸盐还原酶只能在厌氧环境表达，进行厌氧反硝化[23]。（2）亚硝酸盐还原酶反硝化中存在细胞色素型亚硝酸盐还原酶和可溶性含铜蛋白酶。前者由nirs基因编码，二聚体结构，为一种双功能酶，能催化亚硝酸盐得到1个电子还原为一氧化氮，同时使氧得到4个电子生成水；第二种由nirk基因编码，含Cu催化中心。有研究发现在任何情况下，亚硝酸盐还原酶对氧均较其他类型酶敏感。（3）一氧化氮还原酶一氧化氮还原酶非常不稳定，这也是为什么长时间以来它仍没有被鉴定的原因之一。一氧化氮还原酶对NO的亲和力较高，能够使NO浓度保持始终在非常低的水平。（4）一氧化二氮还原酶FergusonS.J.等[24]认为，氧存在情况下脱氮副球菌细胞一氧化二氮还原酶含有活性，可以同时把NO和N2O还原。通过氧化还原特性分析及光谱学分析，学者们将一氧化二氮还原酶分为I型purple型和II型pink型，其中II型来自于有氧状态下的培养物中。1.3.4好氧反硝化菌及其影响好氧反硝化的因素1988年RobertsonandKuene[10]在除硫和反硝化处理系统中首次分离出好氧反硝化菌Thiosphaerapantotropha(现更名为脱氮副球paracoccusdenitrifcans)，Pseudmonassp.和Alcaligenesfaecalsi可以在有氧的条件进行反硝化，并报道了好氧反硝化酶系的存在，也证明脱氮副球菌在生长过程中，假如NO-3和O2同时存在，好氧反硝化菌的生长速率会较它们单独存在时高。Meiberg等[25]发现好氧情况下HyphomicrobiumX也能进行反硝化。现阶段，很多研究也表明了好氧反硝化菌的存在[26-28]。近几年来，人们甚至发现了一些具有特殊功能的好氧反硝化菌[29]。大多数的好氧反硝化菌适合于在中性pH，30℃中温下生存，但研究发现一些好氧反硝化菌种经过驯化表现出对温度、高盐、溶解氧、重金属等较强的适应能力。郝敏娜等[30]从污水处理厂的曝气池中分离筛选出了一株好氧反硝化菌-波茨坦短芽孢杆菌，该菌能在50℃，C/N比为12下，48小时内基本完成脱氮作用。宋宇杰等[31]从焦化废水的活性污泥中筛选分离出一株耐高浓度废水的好氧反硝化菌，经过鉴定该菌属于不动杆菌属。李静等[32]从某味精厂的污水处理厂的活性污泥系统中筛选分离出一株蜡状芽孢杆菌，该好氧反硝化菌在盐浓度为150g/L的条件下对硝酸盐的去除率达到90%以上。耐重金属方面，肖先念等[33]-5- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究筛选分离出一株恶臭假单胞杆菌，该好氧反硝化菌耐受汞的质量浓度可高达7mg/L。郭岩等[34]从碱厂污泥中筛选分离出一株施氏假单胞菌菌，该菌高效嗜碱，对烟道气脱硝具有良好的处理效果。现已发现的好氧反硝化菌大多存在于假单胞菌属、副球菌属和芽抱杆菌属[35-37]。相比于传统的反硝化细菌，好氧反硝化菌含有的生长特性为:①有氧条件下生长，少数可耐受5-6mg/L溶解氧浓度[38-40]；②大多数的好氧反硝化菌都具有异养硝化和代谢难降解有机物的能力[41-44]；③生长周期短[45]；④适应环境的能力强(pH,DO等条件)，承受高浓度[46];⑤反硝化气态产物一般为氧化亚氮(N有机物及氮的耐力强2O)和氮气(N2)。1.3.5好氧反硝化细菌在水处理中的应用作为生物脱氮新技术之一的好氧反硝化，好氧反硝化与传统的反硝化相比具有如下优势:好氧反硝化菌生长速度快、产量高，大多具有同步异养硝化功能，可在同一个系统内实现硝化、反硝化，实现脱氮，极大程度上减少了碱度的投加量和构筑物的占地面积，经济性较高。而且，大部分好氧反硝化菌具有很高的适应能力，对氧浓度要求低，反硝化速率快而且彻底，在实际反应器系统运行中较易被调控。（1）废水生物处理Pai等[47]将筛选出的好氧反硝化菌和活性污泥混合后进行实验处理污废水，获得了良好的处理效果。Bouchez等[48]使用海藻酸包埋技术成功的将Microvirgulaaerodenitricans在连续流反应器(CSTR)上接种，由于菌体有效的保留在了絮体中，因而其对污水具有良好的处理效果。Gupta等[49]采用T.pantotropha强化的三阶旋转生物接触器(Rotatingbiologicalcontactor,RBC)处理高浓度硝氮受污染地水，碱度消耗低，因而节省了运行费用。马放等[50,51]利用好氧反硝化菌强化处理高浓度硝氮废水，系统稳定运行后处理效果良好。Patureau等[52]用Microvirgulaaerodenitricans来强化除磷系统，以及对投加策略与菌体持留进行了实验研究，研究显示添加最初碳源和控制菌体的加入量对除磷效果的优劣产生了关键作用。Barak等[53]研究了有氧条件下Pseudomonasdenitricans细胞内聚磷酸盐(Polyphosphate)的生成情况。而且，大多数研究证明好氧反硝化菌降解难降解有机物的能力较高。Seung等[54]分离的好氧反硝化菌株AlcaligenesPS可以以苯酚作为电子供体进行反硝化脱氮，可以同时降解污水中的苯酚和硝态氮。（2）养殖废水净化BaekSH等[55]将好氧反硝化菌应用于水产养殖废水的处理中，研究表明0.067hm2鱼塘只需投放1kg该菌液就能使该养殖水体完全脱氮。Joo等[56]利用好氧反硝化菌处理养猪废水，氨氮降解率为30mgL-1h-1，其中65%以上进行了反硝化，而普通自养细菌由-6- 兰州交通大学硕士学位论文于生长缓慢，活性低，很难用来处理此类废水而且需要更长的处理时间。（3）废水有机污染物降解好氧反硝化菌在处理有毒、难降解等有机物方面表现出巨大的潜力。王国英等[57]研究了好氧反硝化菌Diaphorobactersp.PDB[58]3，它对苯酚的降解率达94.9%。葛启隆等从驯化菌群中筛选分离出一株好氧反硝化菌，该菌株能以苯酚为唯一碳源进行反硝化。1.4论文研究目的及研究内容1.4.1论文研究目的近年来我国水环境污染日益严重，氮素污染为主要诱因。然而传统的生物脱氮技术存在工艺复杂、脱氮效果差等问题。生物海绵铁体系与普通活性污泥体系相比具有较好的脱氮效果，而目前对于生物海绵铁体系的脱氮机理及具有良好脱氮效果的原因，尤其从微生物层面的研究较少。生物海绵铁体系的主体是微生物，为了寻求更加有效的脱氮方法，更高效的脱除废水中的氮，需要不断驯化、分离、筛选适应各类水体环境的菌种或菌群。加之，对于好氧反硝化细菌的脱氮机理有待进行更为深入和严密的研究，所以分离出更多、更高效的好氧反硝化细菌，将有利于进一步丰富和发展好氧反硝化，加深和完善人们对好氧反硝化作用的认识。本论文的研究目的是通过对生物海绵铁体系脱氮效果的研究，从该体系中筛选出脱氮性能较高的好氧反硝化菌并通过菌落形态、生理生化特性、16SrDNA的测定将其鉴定到属，并进行脱氮效果优化研究，为高浓度硝酸盐氮废水的处理提供高效菌，同时为好氧反硝化菌强化活性污泥法在工程及实际应用提供技术支撑，为日益紧迫的水环境形势提供更加经济有效的解决方法。1.4.2论文研究内容（1）通过平行对比试验考察海绵铁及硝酸盐对SBR反应器中好氧反硝化菌富集的影响。首先考察海绵铁及NO--N对SBR反应器对脱氮效果的影响，并测定不同时期各3反应器中微生物的数量分析海绵铁及NO--N对SBR反应器中微生物的影响。3（2）以生物海绵铁铁泥和普通活性污泥为材料，利用BTB酸碱指示剂法初筛其中的好氧反硝化菌，并进一步对初筛的好氧反硝化菌进行反硝化性能鉴定，同时对复筛的好氧反硝化细菌进行生理生化鉴定和分子生物学鉴定，以确定出具有高效脱氮能力的好氧反硝化菌。（3）以摇瓶实验研究纯培养条件下，考察不同碳源、C/N及海绵铁投加量、初始pH值等对好氧反硝化菌生长特性及脱氮性能的影响。为优化培养条件和今后的试验研究提供理论支持和研究方向。（4）好氧反硝化菌2-5强化序批式活性污泥反应器（SBR）研究。为好氧反硝化菌剂在强化污水脱氮处理中的应用及相关强化工艺的开发提供理论基础和实验依据。-7- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究第二章海绵铁及NO-3-N对SBR反应器中好氧反硝化菌的富集影响通过第一章的实验发现生物海绵铁体系较普通活性污泥体系具有良好的生物脱氮作用。同时，通过对其中的微生物种群结构分析发现该体系中存在一定量的好氧反硝细菌。因此，本实验平行启动3个SBR反应器，考察海绵铁及NO--N对SBR反应器处3理性能的影响，并深入研究海绵铁及NO--N对SBR反应器中好氧反硝化菌的富集影响。32.1实验材料与方法2.1.1实验材料接种活性污泥:实验接种污泥取自兰州市某污水处理厂的二沉池，驯化后方可进行下一步的实验。海绵铁：试验用海绵铁购自北京某海绵铁厂，海绵铁为疏松海绵状、多孔,呈灰黑色。主要成分全铁约占96%，碳占3%，粒径范围0.5～3.0mm。模拟废水1：每升普通自来水中加3.1ml营养盐储备液和3ml牛奶。营养盐储备液具体配方见表2.1。表2.1营养盐储备液（储备液）配方Table2.1reservefluidformulation(NH4)2SO4K2CO3NaHCO3K2HPO4KH2PO464g/L64g/L32g/L9.728g/L3.84g/L模拟废水2：在上述模拟废水1的基础上外加20mg/LNO-3-N配水。0.85%生理盐水：将0.85g氯化钠加入到装有100ml去离子水的250ml锥形瓶中，加棉塞、包扎、高压灭菌20min备用。无菌水：实验室无菌水为将9ml去离子水加入到洁净试管中，加棉塞、包扎、高压灭菌20min制得。2.1.2实验方法实验按表2.2给出的控制条件平行启动1#、2#、3#三个SBR反应器，各反应器每周期按进水（15min）-曝气（11h）-沉淀（30min）-出水（15min）的顺序连续运行,每天运行2个周期，换水比为1/2。反应器启动后，每两天测定各反应器进、出水TN浓度，并分别在运行的第0、7、14、21等天测定分析各反应器中铁细菌的数量。同时测定第21d时各反应器中好氧反硝化菌的数量。-8- 兰州交通大学硕士学位论文表2.2不同反应器控制条件Table2.2Controlconditionsfordifferentreactors反应器编号1#2#3#反应器有效容积4L实验水质模拟废水1模拟废水1模拟废水2接种活性污泥浓度2.5（g/L)控制条件海绵铁（g/L）09090海绵铁粒径（mm）/3～5mm3～5mm其它条件控制曝气（2～3mg/L)实验温度室温2.1.3分析测试方法常规指标测试：TN的测定采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(GB11894-89)微生物指标测试：铁细菌的测定依据«工业循环冷却水中铁细菌的测定MPN法»进行测定[59]（GB/T14643.6-93）。好氧反硝化菌的测定采用酸碱指示剂法[60]。具体操作步骤为：取从1、2、3#三个不同反应器中采取的污泥样品各5g加入到50ml生理盐水中，置于摇床上于160r/min的转速下震荡30min。之后采用梯度稀释法对经过摇床震荡的样品进行稀释。具体做法为：首先往第一支装有9ml无菌水的试管中加入1ml样品经充分摇匀后即稀释10倍，再从此试管取1ml混合液加入邻近的一个试管，此即稀释100倍，以此类推，稀释至平板上长出的菌落很稀少为止。选取适宜稀释度下的样品分别接种于装有铁细菌培养基的洁净试管中，每个稀释度做4个平行样，之后每个试管接种1ml稀释样。另取一组试管培养基不种稀释水样，当做空白对照组。之后在生化培养箱中29±1℃下培养14d。培养4d后，计算出阳性试管的个数，并以阳性组合指数进行记录。最后此阳性组合指数查表[54]得出最大可能的菌数(MPN），再用最大可能的菌数除以阳性组合指数的第一位数字的稀释度数，即为每毫升水样中铁细菌的个数。2.2实验结果与讨论2.2.1海绵铁及NO-3-N对SBR反应器处理效果的影响实验连续测定了360个运行周期内各反应器对模拟废水的处理效果。各反应器进水COD平均浓度为550mg/L，进水NH+4-N平均浓度约为45mg/L，1#、2#反应器TN进水-9- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究平均浓度约为50mg/L,3#反应器TN进水平均浓度约为90mg/L，各反应器对COD、NH+4-N、TN的降解效果分别见图2.1、2.2和2.3。图2.1各反应器COD降解效果Figure2.1CODdegradationeffectofeachreactor图2.2各反应器NH+4-N降解效果Figure2.2EffectofNH+4-Ndegradationineachreactor-10- 兰州交通大学硕士学位论文图2.3各反应器对TN的降解效果Fig2.3DegradationofTNinvariousreactors由图2.1、2.2、2.3可以发现，在实验条件下，添加海绵铁对SBR反应器COD及NH+4-N的处理效果影响相对较小，而对TN处理效果影响较大。由图2.1可以发现，3个反应器对COD的去除率均大约为90%，差距较小，这主要是由于试验采用的模拟生活污水的碳源主要来源于易降解的牛奶，且运行周期为12h，使得不同反应器的碳化及硝化过程均进行的比较彻底，从而导致不同反应器COD去除率相差不大。由图2.2可以发现，2#和3#反应器对NH+4-N的去除率略低于1#反应器。对比图2.3中各反应器对-11- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究TN的降解效果，可以发现TN去除率3#>2#>1#。其中1#反应器对TN的去除量为11.40mg/L，3#反应器对TN的去除量达到33.54mg/L，约为1#反应器的3倍。分析原因可能是因为试验过程中，污水净化中起主要作用的是微生物，而铁作为微生物生长过程的必要元素[61]，海绵铁的加入促进了反应器中各种微生物的生长，很大程度上增强了体系中微生物的多样性。加之，海绵铁本身就具有一定的去除氧作用，使得海绵铁载体表面与内部氧分布不均，营造了不同微生物的生长环境，从而使得微生物的种类和数量更为丰富[62]。又由于反应器中海绵铁会不断的溶出Fe2+,而Fe2+在氧存在情况下会快速被氧化成Fe3+，Fe3+在水解过程中会产生Fe(OH)3，这种物质对悬浮物及胶体均有着良好的吸附凝聚性能。再者3#反应器进水加入了一定量的NO--N配水，这也可能会对反应3器中的好氧反硝化菌的生长起到一定的促进作用，同时加快反硝化的进程。在铁和微生物共同的作用下，使得絮凝、吸附、氧化和沉淀分离得到了进一步的强化[63]，从而提高了污水的处理效果，出水TN得到了进一步改善。2.2.2海绵铁及NO-3-N对SBR反应器中微生物数量的影响已有研究发现铁细菌在生物海绵铁体系中大量存在，同时为了深入探究2.2.1中2#、3#反应器较1#反应器对TN降解效果优异的原因，本实验拟从微生物层面进行研究，分别在各反应器运行的第0、7、14、21等天测定各反应器中铁细菌及好氧反硝化菌的数量，分析此类菌的存在对SBR反应器TN降解效果的影响。实验结果见图2.4、2.5。图2.4各反应器中铁细菌数量的变化Fig2.4changesofironbacteria-12- 兰州交通大学硕士学位论文图2.5各反应器中好氧反硝化菌数量Fig2.5aerobicdenitrifyingbacteriaineachreactor图2.4和2.5分别为各反应器中铁细菌数量随反应器运行时间的变化及第21d时各反应器中好氧反硝化菌数量的差异。由图2.4可以看出，随着反应器的运行，2、3#反应器中铁细菌数量随时间呈增长趋势，而1反应器铁细菌数量与2、3#存在较大差异且数量始终基本维持在较低水平，这主要是因为2#、3#反应器中投加了适量的海绵铁，铁是微生物生长的基本元素，它的加入有助于微生物，尤其是铁细菌的快速生长。1-7d时，各反应器中铁细菌数量差距较小，7-14d时2、3#反应器铁细菌数量差距较大，但到第21d时2、3#反应器铁细菌数量几乎相同。由图2.5可以看出第21d时，3个反应器中好氧反硝化菌数量显示出较大差异，1#反应器中好氧反硝化菌数量为1.68*107个/ml,3#反应器中好氧反硝化菌数量达到4.7*107个/ml,约为1#反应器的3倍。可以发现海绵铁的加入有利于好氧反硝化菌的生长，而NO-3-N的加入更加刺激和促进了好氧反硝化菌数量的增长，可以说明通过对各反应器中铁细菌和好氧反硝化菌的测定证实了海绵铁和NO-3-N会促进体系中铁细菌及好氧反硝化菌生长的猜测，说明海绵铁的加入的确有助于反应器中微生物，尤其是铁细菌及好氧反硝化菌的生长，而正是由于此类微生物的大量存在促进了SBR反应器对TN的降解效果的提高。2.3本章小结通过实验发现，同时投加海绵铁和NO-3-N的3#SBR反应器脱氮效果明显优于1#的普通活性污泥系统，1#反应器对TN的去除量为16.40mg/L,3#反应器对TN的去除量达到33.54mg/L，约为1#反应器的2倍。通过对各反应器中铁细菌和好氧反硝化菌的测-13- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究定证实了海绵铁和NO-3-N会促进体系中铁细菌及好氧反硝化菌生长的猜测，说明海绵铁的加入的确有助于反应器中微生物，尤其是铁细菌及好氧反硝化菌的生长，而正是由于此类微生物的大量存在促进了SBR反应器对TN的降解效果的提高。-14- 兰州交通大学硕士学位论文第三章间歇式生物海绵铁反应器（SBSI）中好氧反硝化菌的分离筛选生物法脱氮是目前水处理领域的热点[64]，得到了人们的广泛关注和研究。随着近代生物学的发展及人们对生物技术的不断研究和掌握，为了达到高效低耗的处理水平，生物脱氮技术正逐渐从单纯的工艺改革向着以生物学特性研究并促进工艺改革的方向发展。越来越多的好氧反硝化菌被人们所发现，这一发现，是对传统反硝化理论的丰富和突破。目前已有研究证实，好氧反硝化细菌因其好氧反硝化作用，而能在好氧条件下将NO--2-N和NO3-N还原成气态氮而去除。因此，本实验以取自2.1中SBR反应器中的活性污泥为材料，对在好氧条件下能高效脱氮的好氧反硝化细菌进行了筛选，以期得到在好氧条件下能高效脱氮的脱氮微生物，为以后生物修复尤其是污水处理的实际应用及理论研究奠定基础。3.1实验材料与方法3.1.1实验材料（1）分离材料好氧反硝化菌分离源来自实验2.1中3个SBR反应器。即2.1中1、2、3#三个SBR反应器中的活性污泥。（2）培养基细菌营养琼脂培养基（/L）：蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl5g，1L去离子水，pH调至7.4-7.6，于121±1℃高温灭菌20min。BTB选择性培养基（/L）：KNO31g，磷酸二氢钾1g,Fecl2·6H2O0.5g,CaCl2·7H2O0.2g,MgSO4·7H2O1g,琥珀酸钠8.5g,1ml溴百里酚蓝BTB试剂（0.1g溴百里酚蓝溶于10ml酒精），1L去离子水，用1mol/LNaOH调pH至7.0-7.3。121±1℃灭菌20min，备用。DM反硝化培养基（/L）：KNO30.72g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O1g，琥珀酸钠2.8g，1L去离子水，121±1℃灭菌20min，备用。3.1.2实验方法3.1.2.1好氧反硝化细菌的分离、纯化好氧反硝化菌分离原理：BTB培养基含有溴百里酚蓝（BTB显色剂），而反硝化过程NO-3的还原为碱增加过程，如果接种后培养基平板出现了由于pH增加引起的蓝色晕圈或菌落，暂可认为该菌为好氧反硝化菌。具体实验步骤为：将从1#、2#、3#各反应器中采取的污泥样品各5g,加入到装有50ml生理盐水的锥形瓶中，然后将其置于摇床上160r/min震荡30min。之后采用梯度稀-15- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究释法对上步样品进行稀释，具体做法为：往第一支装有9ml无菌水的试管中加入1ml样品经充分摇匀后即稀释10倍，再从此试管取1ml混合液加到邻近的一个试管，此即稀释100倍，以此类推，至平板上长出的菌落很稀少为止。然后取0.5ml稀释完成的菌种液接种在BTB培养基平板上，之后采用涂布棒均匀涂抹。每个稀释度下做3个平行。最后将平板置于微生物培养箱，30±1℃恒温培养2-3d后，用接种环挑取周围培养基出现蓝色晕圈的单菌落，并在BTB固体培养基平板上进行划线分离，30±1℃，恒温培养2-3d,反复重复上述步骤，直至得到纯种的单菌落为止。最后将分离纯化的细菌接种至细菌营养琼脂培养基斜面上，30±1℃下恒温培养箱培养2-3d后置于冰箱4℃下低温保存。3.1.2.2分离菌株的好氧反硝化性能测定要想筛选出具有高效脱氮性能的好氧反硝化菌，还需对分离纯化出的好氧反硝化细菌进行进一步的实验，通过对其反硝化性能的测定，以确定出具有良好脱氮性能的好氧反硝化菌株。更确切的说即通过DM反硝化培养基将经过BTB培养基初筛的好氧反硝化菌进行复筛，考察所筛菌株的反硝化能力，筛选出兼具NO-3-N还原率高且TN去除率高的好氧反硝化菌株。一般而言，溶液中的反硝化脱氮过程包括两部反应，其中NO-3-N的还原是首要的，但如果只是将NO--3-N还原为NO2-N存在于溶液中，那么脱氮仍未完--N的去除率和NO--成。因此菌株的反硝化性能由NO3X-N的去除率表示：NO3-N的去除率表示菌株对NO--N还原能力的强弱[65]--N的去除率表示菌株对TN的去除能3。NOX力。可采用这两项综合指标来表示菌株整体的反硝化能力，即脱氮能力。实验的具体操作过程为：从经过初筛的好氧反硝化纯菌培养基斜面取一环接种于新的细菌营养琼脂培养基斜面，然后置于生化培养箱30℃恒温培养12h进行活化，活化完成后取一环接种于100ml细菌营养琼脂液体培养基，30℃，160r/min下摇床培养24h后，以1ml的接种量接种到装有50ml反硝化培养基的100ml锥形瓶中。为增加锥形瓶中的溶解氧含量，可以用8层纱布来替代瓶盖封口，在30℃下，水浴恒温摇床上以160r/min（可保证培养液DO为66%-92%的饱和度[66]）进行摇瓶实验。每株菌同时进行两组平行实验。培养0时、24时、48时、72时、96时取样，考察其TN、NO--N、3NO-2-N各氮素的变化。3.1.2.3具有铁氧化功能的好氧反硝化菌的筛选具有铁氧化功能的好氧反硝化菌的筛选方法同2.1.3中《工业循环冷却水中铁细菌的测定MPN法》。3.1.2.4具有铁氧化功能的好氧反硝化细菌2-5的鉴定为了鉴定筛选出的具有高效脱氮性能的好氧反硝化细菌的种属，本实验分别考察了好氧反硝化菌株2-5的菌落形态及生理生化特性，同时进行了16SrDNA测序。1.好氧反硝化菌2-5菌落形态观察-16- 兰州交通大学硕士学位论文从斜面上，挑取适量的菌苔划线于DM平板，在30℃下恒温培养24h，分离出纯种单菌落并观察菌落形态。2.生理生化特性实验(1)氧化酶实验取数滴二甲基对苯撑二胺溶液于置有一张滤纸的洁净培养皿上，使滤纸润湿。之后用洁净的玻璃棒挑取培养了24h的菌苔涂抹在滤纸上，观察显色反应。(2)接触酶实验将菌株接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，之后把适量H2O2滴于细菌上，3min后观察气泡的产生。(3)葡萄糖氧化发酵实验将培养了24h的菌株穿刺接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中，接种4支。将其中两枝用灭菌的凡士林注入试管来阻绝氧气；其余2支不封油为开管。置于30℃下恒温培养并在接种后的第1d，2d，4d，7d，14d各观察一次。(4)糖或醇类发酵实验接菌于培养基中，30℃恒温培养72h，同时以不接种为对照组。(5)淀粉水解实验用接种环挑取适量菌苔平板上划十字。30℃下恒温培养5d后在划线处滴加适量碘液，转动培养皿，观察显色反应。(6)甲基红实验将经过24h培养的菌株接种于葡萄糖蛋白胨培养基中，设置2组空白对照。37℃下恒温培养6d后往培养液中加入2滴甲基红试剂，观察显色反应。(7)乙酞甲基醇实验在每只接种完适量菌株的葡萄糖蛋白胨培养基试管中加入20滴40%的NaOH溶液，之后加入等量α-萘酚溶液。取下棉塞并用力振荡，置于37℃恒温培养0.5h，观察显色反应。(8)产吲哚实验将好氧反硝化菌接种后培养24h，同时做空白实验。37℃下培养7d。于第1d，2d，4d，7d取样，加入1ml左右的乙醚，将其振荡均匀直到吲哚完全溶于乙醚中，静置片刻，待乙醚层浮于培养液的表面后沿管壁慢慢加入吲哚试剂10滴，观察显色反应。(9)硝酸盐还原反应接菌于培养基中。在比色磁盘反应室中加入少许培养液，再滴格里斯氏试剂A液和B液各1滴。观察结果。(10)柠檬酸盐利用实验挑取适量菌在斜面上划线，30℃下培养5d后进行显色反应观察。-17- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究(11)明胶液化实验将经过培24h培养的菌种穿刺接种于培养基中并做空白对照。20℃下恒温培养30d，于第2d，4d，7d，14d，30d观察液化结果。(12)产硫化氢实验将细菌穿刺接种于培养基，30℃下恒温培养14d，并于第3d，7d及14d观察是否有黑色沉淀产生。(13)尿素水解实验将菌接种于含尿素的培养基中，30℃培养并于第2h、4h及12h观察一次。(14)氰化钾实验将菌接种于含氰化钾和空白对照的培养基中，观察其能否生长。3.1.3分析方法各指标的测定方法均采用国标方法。具体方法如表3.1。表3.1各指标测定方法Table3.1Determinationoftheindicators测定指标方法NO-3-N麝香草酚分光光度法TN碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法NH4+-N纳氏试剂分光光度法NO-2-N盐酸萘乙二胺分光光度法3.2结果与讨论3.2.1好氧反硝化菌的分离、纯化由于反硝化过程为碱增加过程，当采用含有产碱指示剂溴百里酚蓝的BTB初筛培养基进行好氧反硝化菌的初筛时，经过涂布接种的BTB培养基平板在30±1℃下恒温培养2-3d后，用接种环小心挑取周围培养基出现蓝色晕圈的单菌落并在BTB固体培养基平板上划线，30±1℃，恒温培养。反复重复上述步骤，直至得到纯种的单菌落为止。最终从3个SBR反应器中共筛选出19株好氧反硝化细菌。3.2.2分离菌株的好氧反硝化性能测定为了进一步筛选出具有高效脱氮能力的好氧反硝化菌。针对筛选出的19株BTB阳性菌分批进行了反硝化性能的测定。溶液中反硝化脱氮包括2步反应，NO-3-N还原是-18- 兰州交通大学硕士学位论文首要的，但如果只是将NO--3-N还原为NO2-N而存在于溶液中，那么脱氮仍然未完成。因而反硝化性能由2项指标表示:以NO--3-N还原率表示好氧反硝化菌对NO3-N的还原能力；以NO-X-N的去除率表示细菌对TN的降解能力。19株菌株的反硝化性能的测定实验中NO--3-N、NOX-N等数据均以2个平行样品的均值表示，具体实验结果见表3.2。表3.2好氧反硝化菌反硝化性能测定Table3.2DeterminationofDenitrificationPerformanceofAerobicDenitrifyingBacteria菌初始培养基培养结束时ρ/(mg·L-1)去除率（%）株ρ（NO--3-N）NOX-NO----2-NNO3-NNO3-NNOX-N号/(mg·L-1)N1-1101.7837.1847.4784.6553.3616.831-2102.668.4865.9374.4135.7827.521-3117.2621.9531.5358.9473.0557.061-4118.899.2148.8666.7358.5951.951-5105.086.0878.6784.7520.6014.461-6130.4960.372.162.4798.3952.131-7136.3856.4210.7667.1892.1150.742-2118.846.7554.3361.0845.0338.202-3128.0211.3253.7165.0358.0549.202-4119.7122.8056.7479.5441.3317.752-5126.7923.6437.1260.7670.7252.082-6125.965.9057.8063.7054.1149.432-7102.392.2477.7880.0224.0421.852-8114.741.1368.6669.7940.1639.182-10117.657.4248.2555.6750.5942.993-1121.2319.0851.5070.5957.5241.783-2126.6522.3639.4061.7659.2336.103-3104.151.6568.2669.9134.4632.883-5109.4115.3851.6867.0647.4931.86由表3.2可见，以硝酸钾为惟一氮源、琥珀酸钠为碳源条件下，进行反硝化实验，所分离出的19株好氧反硝化菌株均在有氧条件下具有一定还原NO--3-N和NO2-N的能力，其中有11株菌在4d内对NO-3-N的还原率超过50%，有5株菌对TIN的去除率超过50%。其中菌株2-5在培养48h时能将体系中NO-3-N从126.79mg/L降至37.12mg/L,去除率为70.72%，对NO-+X-N的去除率达到52.08%，整个过程中NH4-N始终保持在较低水平。另外通过实验过程中对菌株2-5的生长情况的监测，发现该菌株生长速度较快，-19- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究菌株OD600值在培养初期24h增长迅速，在培养的第48hOD600值达到最大。因此可以判断菌株2-5不仅为一株具有较高脱氮能力的好氧反硝化细菌，它十分适合应用实际工程中，用来对生活及工、农业废水的脱氮处理。但对于实际应用而言其脱氮性能并未得到很好的体现，因此需要对其脱氮条件进行优化，以使菌株的脱氮性能得到进一步的提高，以满足实际生产生活应用的需要。3.2.3具有铁氧化功能的好氧反硝化菌的筛选第2章实验中发现生物海绵铁体系较普通活性污泥体系中存在大量的铁细菌及好氧反硝化细菌，因此有必要也有意义进行下一步实验，以筛选出兼具铁氧化功能的好氧反硝化细菌将为生物海绵铁体系性能的提高及工程推广提供更多的技术支持。铁细菌的筛选采用MPN法铁细菌培养基中凡产生褐色或者黑色沉淀且原培养基中棕色消失变为透明状着，表明该菌株为铁细菌[59]。实验对所筛选出的所有好氧反反硝化细菌进行了鉴定，实验结果见图3.1。图3.1铁细菌鉴定结果Fig3.1Ironbacteriaidentificationresults由图3.1可以看出，参照未加入细菌样品的纯铁细菌培养基空白对照，其余试管中铁细菌培养基均产生了不同程度的黑褐色沉淀且原培养基中棕色消失。但通过对比发现菌株1-1、1-2、1-6、1-7、1-8、2-1、2-3、2-6、2-8、2-10号试管培养基中不如其余组变化明显。可以得出结论：菌株1-3、1-4、1-6、2-1、2-2、2-4、2-5、2-7、3-2、3-3、-20- 兰州交通大学硕士学位论文3-5，11株菌株为具有铁氧化功能的好氧反硝化细菌。3.2.4具有铁氧化功能的好氧反硝化菌株2-5的鉴定1.菌落形态观察从斜面上挑取适量菌落划线于DM平板，30℃下恒温培养24h，分离出单个菌落。观察菌落形态为圆形、凸起，表面光滑，直径约为7mm的菌落。2.生理生化鉴定结果生理生化实验结果见表3.3。表3.3好氧反硝化菌株2-5生理生化鉴定结果Table3.3AerobicDenitrifyingBacteria2-5PhysiologicalandBiochemicalIdentificationResults实验革兰氏染氧化酶接触酶葡萄糖糖发酵淀粉水甲基红色实验试验实验氧化发解实验酵-+++---结果G实验柠檬酸盐明胶液产硫化尿素水产吲哚硝酸盐氰化钾利用化氢解实验还原实实验验结果+----+-3.16SrDNA将分离出来的菌株2-5送样至甘肃金博研生物科技有限公司，菌种纯化后的PCR产物，使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序。通过16srDNA测序，测定结果为AchromobacterdenitrificansstrainTB16SribosomalRNAgene,completesequence，同源性为99%。因此，可认为菌株2-5为一株好氧反硝化无色杆菌。3.3本章小结本实验是从本实验室的3个SBR反应器中采集的菌样进行的好氧反硝化菌株的筛选，首先通过对好氧反硝化菌的初筛，三种菌样总共分离、纯化出19株好氧反硝化菌，通过分离菌株的反硝化性能的测定，其中有11株菌在4d内对NO--N的还原率超过50%，3有5株菌对TIN的去除率在50%以上。通过生理生化鉴定，查阅伯杰氏细菌鉴定手册[67]，将菌株2-5鉴定到属。菌株2-5属于无色杆菌属。为了进一步鉴定该菌株，提取其DNA，对其中的16SrDNA进行扩增，并进行测序。提交GeneBank，将其鉴定到种，菌株2-5为反硝化无色杆菌。通过与其他一些典型的-21- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究脱氮细菌的16SrDNA比较，得出菌株2-5与其他已报道的好氧反硝化菌在进化上具有很高的同源性，同源性达到99%，为一株好氧反硝化无色杆菌。-22- 兰州交通大学硕士学位论文第四章碳源对好氧反硝化细菌2-5生长特性及脱氮性能影响研究有机碳源在脱氮过程中具有非常重要的地位。研究表明，好氧反硝化菌进行反硝化时可利用的碳源类型较广，包括一些常见有机物及某些难降解有机物[68-70]。4.1实验材料与方法4.1.1实验材料（1）好氧反硝化菌株2-5菌株2-5为从兰州交通大学环境与市政工程学院实验室生物海绵铁体系中分离纯化所得，通过前期形态观察、生理生化鉴定及16SrDNA序列比对鉴定该菌株为好氧反硝化菌，菌株采用斜面低温保存于实验室冰箱，使用前需进行活化和富集培养。（2）培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，H2O1000ml,pH7.0。DM反硝化培养基：KNO30.72g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O1g，丁二酸钠2.8g，121±1℃灭菌20min，备用。4.1.2实验方法试验开始前将存于冰箱的好氧反硝化菌2-5斜面取出置于生化培养箱30℃下恒温培养24h，待菌株活化完成后，从斜面上取一环用牛肉膏蛋白胨液体培养基进行富集培养。之后以DM反硝化培养基（液体)为基础培养基，初始硝酸盐浓度控制在120mg/L左右,调整培养基中的碳源种类，分别以丁二酸钠、乙酸钠、柠檬酸三钠、酒石酸钾钠、甲醇、葡萄糖为唯一碳源，碳源量0.83g/L（以碳计），培养基其他成分不变。将经过富集培养后的菌液以1ml的接种量接入150ml已灭菌的DM反硝化培养基，于140r/min，30±1℃条件下恒温培养，定时取样测定样品OD600值（样品在波长600nm下的吸光度）及氨氮、总氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮等水质指标，考察不同碳源对好氧反硝化细菌生长特性及脱氮性能的影响。4.1.3分析方法NH+--4-N、NO3-N、NO2-N、TN均采用国标法测定。4.1.4数据统计方法在种群增长的各种模型中，Logistic模型是最基本和最重要的[71]。它是1838年荷兰生物数学家P.F.Verhulst在修正表征人口特征的Malthus模型的基础上提出的描述种群增长方程，它主要描述了食物、空间等资源、环境条件以及种群竞争等对种群增长率影响[72]。因此可以采用表征微生物生长的Logistic方程对不同碳源下好氧反硝化菌2-5的增-23- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究长情况进行拟合，以描述不同碳源下好氧反硝化菌2-5的生长快慢。Logistic方程：y=A2+（AP1-A2)/(1+（x/x0）),式中：x为累积反应时间（h），y为微生物的光密度（OD600）值，A1为趋于无穷小时的OD600值，A2为趋于无穷大时OD600的最大值，x0为OD600max/2时的时间，p为幂。实验数据采用Origin8.5进行拟合处理。4.2结果与讨论4.2.1不同碳源下pH和ORP的变化ORP值（氧化还原电位）的大小能反映水溶液中所有物质表现出的宏观氧化-还原性，pH的变化可以侧面反映反硝化的进程。为了考察不同碳源下好氧反硝化菌反硝化过程中pH及ORP值的变化，试验测定了0h、6h、12h、24h等不同时间点不同碳源体系pH及ORP值，结果见图4.1。由图4.1可以看出，不同碳源下好氧反硝化菌反硝化过程pH及ORP值呈规律性变化。以葡萄糖以外的各有机物为碳源时，0-6hpH及ORP绝对值增长较慢。6-24hpH及ORP的绝对值均快速增长，到36h两者均达到最大，36h之后基本稳定。分析原因为反应初期好氧反硝化菌初入新环境，处于适应阶段，数量及活性均较小，反硝化水平低，6-24h好氧反硝菌快速增值，反硝化效率增强，反硝化过程为产碱过程，因而系统pH逐渐升高，对应ORP绝对值逐渐增大，系统还原性增强。由于反硝化的最适pH值为7.5-8.5，pH值过高或过低都将影响反硝化速率，而36h时各体系pH值已接近9.0，对好氧反硝化菌的生长及反硝化过程的顺利进行均会产生一定影响，致使反应后期pH值及ORP值基本保持不变。而以葡萄糖为碳源时，前12hpH值降低，对应ORP值增大，分析原因可能是因为在生物氧化过程中，经过糖酵解，葡萄糖分解为丙酮酸，之后在有氧条件下分解为H2O和CO2，而CO2水解后会产生酸性物质H2CO3，使得溶液pH值降低。后期随着反硝化过程的进行，pH值逐渐升高最后达到稳定。-24- 兰州交通大学硕士学位论文图4.1pH和ORP值的变化Figure4.1changespHandORP4.2.2碳源对好氧反硝化菌生长影响细菌的生长速度和碳源有着非常密切的关系[73]，不同碳源下微生物的生长性能有所差异。本试验考察了利用甲醇、葡萄糖、酒石酸钾钠等六种不同碳源时，好氧反硝化菌株2-5的生长情况及对COD的降解情况影响。不同碳源下，好氧反硝化菌株的增长曲线及COD的降解情况如图4.2所示。同时采用logistic模型对不同碳源下细菌生长OD600-25- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究值进行曲线拟合，考虑到菌株在实际工程中应用的时效性，并对X0时刻（OD600max/2对应的时间）对应的点做拟合曲线的切线，以便判断在何种碳源下菌株能在较短的时间内取得较好的生长效果。结果见图4.2。图4.2好氧反硝化菌生长曲线及以葡萄糖为碳源时菌株生长拟合曲线Fig4.2Curvesofaerobicdenitrifyingbacteriagrowthcurveandgrowthcurveofglucoseascarbonsource通过不同碳源下菌株的生长性能考察发现菌株2-5以葡萄糖为碳源时较其他碳源取得较大的生长量。图4.2为以葡萄糖为碳源时菌株的生长及COD随时间的变化图，由图4.2可以发现菌株2-5随时间的生长变化可采用logistic模型进行拟合，拟合方程相关-26- 兰州交通大学硕士学位论文性的决定系数R2为0.98648，拟合结果良好。由图4.2微生物生长拟合曲线可以发现，0-6h为该好氧反硝化菌的适应期，该时期为好氧反硝化菌细胞内各种酶系统对培养基环境的适应过程，表现为初期细菌不裂殖，数量不增加，仅表现出细菌菌体的增大，酶系统不断适应新的环境，后期细菌个体发育达到一定程度，细胞开始分裂和增殖。6-24h为对数增殖期，由图4.2中COD降解曲线可以看出这一时期里培养基内营养物质（有机物)充足，它不是微生物增殖的控制因素。24-72h为减速增长期，这一时期内COD经过对数增长期已被大量消耗，此时有机物变成微生物生长的控制因素，增殖速度减慢，几乎与细胞衰亡同速，微生物活体数量达到最大值，并趋于稳定。72h后为内源呼吸期，这一时期可供微生物利用的有机物已几乎耗尽，细菌开始利用自身体内储存的物质或死亡菌体，进行内源代谢完成生理活动。采用logistic模型对甲醇、酒石酸钾钠、丁二酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠五种碳源下菌株2-5的生长变化进行拟合时也均能得到良好的拟合生长曲线，拟合方程相关性的决定系数R2为分别为0.99349、0.90095、0.91711、0.9692、0.97059。对不同碳源下菌株2-5生长OD600值进行曲线拟合，并对不同碳源下X0时刻（OD600max/2对应的时间）对应点处做微生物生长拟合曲线的切线，拟合结果各参数见表4.1。由表4.1可以看出，A2的大小顺序依次为丁二酸钠(1.08176)>葡萄糖(0.90815)>酒石酸钾钠(0.90501)>甲醇(0.86989)>柠檬酸钠(0.83168)>乙酸钠(0.69375)，即当时间x趋于无穷大时不同碳源下好氧反硝化细菌OD600的最大值的大小顺序，可见当时间x趋于无穷大时菌株2-5以丁二酸钠为碳源时可取得较大的生长量，其次为葡萄糖。同时，由表4.1可以发现，不同碳源下拟合曲线切线斜率值从大到小排列依次为柠檬酸钠（0.0982088）>葡萄糖（0.068822）>甲醇（0.052333）>乙酸钠（0.034906）>酒石酸钾钠（0.028282）>丁二酸钠（0.0115873）。从此顺序可以看出以柠檬酸钠为碳源时菌株2-5生长最快，其次为葡萄糖。从各有机物的分子层面进行分析，通过分子量分析发现，造成这一现象的主要原因并非有机物的分子量不同，通过分子结构分析这有可能是因为这五种有机物中所含的C=O不同，C=O的键能728/(KJ/mol)为最大，C-O为326/(KJ/mol)，C-H为414/(KJ/mol)，OH-为414/(KJ/mol)。而甲醇、葡萄糖、柠檬酸钠、乙酸钠、酒石酸钾钠、丁二酸钠分子中所含C=O的个数分别为0、0、3、1、2、2，除过柠檬酸钠外，其余有机物下的菌株增长速率与这一发现相符，柠檬酸钠下的菌株增长估计与其他原因关系更大，还有待进一步研究。-27- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究表4.1微生物生长拟合曲线各参数值Table4.1microbialgrowthcurvefittingparametersofthevalue碳源kA1A2x0p柠檬酸钠0.0982880.052290.8316612.44695.88909葡萄糖0.0688220.029420.9081513.69024.0802甲醇0.0523330.039150.8698915.00004.50667乙酸钠0.0349060.048160.6937517.05994.85853酒石酸钾钠0.0282280.00430.9050117.67152.03358丁二酸钠0.0115870.024111.0817627.90421.128064.2.3碳源对NO-3-N降解的影响为了考察碳源种类对NO-3-N降解的影响，试验以不加碳源为空白对照组，连续测定了96h内不同碳源下好氧反硝化过程NO-3-N的浓度变化情况。结果见图4.3。图4.3不同碳源下NO-3-N的还原Fig4.3ReductionofNO-3-Nunderdifferentcarbonsources图4.3为以葡萄糖、甲醇等作为电子供体时对菌株2-5的好氧反硝化性能影响。由图4.3可以看出，不同碳源下NO-3-N的降解效果存在差异，同时结合图4.2可以发现，碳源对NO-3-N的降解影响与好氧反硝化菌2-5的生长密切相关。图4.3显示，除了乙酸钠，其他碳源下的反硝化均在24h内基本完成，NO-3-N浓度基本趋于稳定。其中，0-6h-28- 兰州交通大学硕士学位论文内，各碳源下NO-3-N的降解量均较小，分析原因可能是因为在这一时期菌株刚进入新的培养基环境，尚处于适应期，菌量较小，2.1中实验结果便可印证这一原因。6-24h内，以各碳源为电子供体时，由于细菌处于对数增长期，微生物量快速增大，NO-3-N的降解量在这一时期快速增长，其中以葡萄糖为碳源时，NO-3-N浓度可以由119.65mg/l降到3.68mg/l，而以丁二酸钠为电子供体时，NO-3-N浓度由121.4mg/l仅降到29.79mg/l，两者的反硝化率分别为96.92%和75.46%，差别较大。以柠檬酸钠、甲醇等其他四种碳源为电子供体反硝化率均在前两者之间。可见，以不同碳源为电子供体进行反硝化时，反硝化效率存在较大差异，而这种差异与微生物的增长速率有关。根据一级反应动力学模型，参考图4.3不同碳源下的NO--N的降解曲线，对不同碳3源下不同时间段（0-12h,12-96h）硝酸盐氮降解的实验数据进行分析，结果见图4.4。图4.4以甲醇为碳源时的NO-3-N降解的线性回归结果Fig4.4LinearregressionofNO-3-Ndegradationwithmethanolascarbonsource图4.4为以甲醇为碳源时NO--N降解的线性回归结果。由图4.4可以看出以甲醇为3碳源时的NO-3-N降解过程可以分为两个阶段，0-12h为第一阶段，该阶段的降解速率常数为-0.18558，12-24h为第二阶段，该阶段的降解速率常数为-0.0148，结合图4.3可以发现NO--N的降解主要集中在第一阶段，且该阶段降解速率大于第二阶段。以其他五3种有机物作碳源时第一阶段的降解速率快慢顺序依次为分别为葡萄糖（-0.36186）、柠檬酸钠（-0.24301）、丁二酸钠（-0.17189）、酒石酸钾钠（-0.17189）、乙酸钠（-0.07063），可以发现当以葡萄糖为碳源时好氧反硝化细菌2-5具有较好的NO--N降解效果。3-29- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究4.2.4碳源对TN及NO-2-N的影响试验连续测定了96h内不同碳源下NO-2-N及TN的浓度变化情况，为了更加清楚的对比分析不同碳源下TN的去除率，TN的降解中进、出水及去除率均采用平均值表示，结果见图4.5。图4.5不同碳源下的TN及NO2--N的变化Fig4.5VariationofTNandNO-2-Nunderdifferentcarbonsources图4.5为不同碳源下TN及NO--N的降解情况。由图4.5可以看出，碳源对TN的2降解效果影响较大。其中以酒石酸钾钠为碳源时，TN的降解率最大，可达到68%,而以-30- 兰州交通大学硕士学位论文乙酸钠为碳源时，TN的降解率最小，仅仅为40%。结合图4.4和图4.5发现TN的降解率与NO-3-N降解结果存在一定差异，分析原因不难发现这主要是由于不同碳源下反硝化过程中硝酸盐氮被还原为NO--2-N时产生了不同量的NO2-N积累。由图4.5可以看出，以乙酸钠为碳源，反应稳定时NO-2-N的积累量最大，可达到90mg/L，其次为柠檬酸钾钠、葡萄糖和丁二酸钠，反应后期NO-2-N积累量分别稳定在80mg/L、55mg/L和50mg/L。而当以酒石酸钾钠为碳源时，NO-2-N积累量仅为20mg/L左右。这是因为碳源不同，则它对系统反硝化过程的影响也会有所不同，即便碳源的投加量相同，处理效果也不完全相同[74-75]，而且反硝化菌以不同碳源作为电子供体时，呼吸途径不一样，不仅产生不同量的能量，同时细胞的产率也大不相同[76]。同时可以发现，该菌株以不同碳源为电子供--N转化为NO---体进行反硝化反应将NO32-N，由于NO3-N的降解速率远高于NO2-N的--N逐渐积累，NO--降解速率，因此随着反应进行NO23-N降解完全后NO2-N浓度才开始降低。在这一过程中，不同碳源下出现NO--2-N减少量不同的现象，最终NO2-N积累量有所差别，导致TN的去除率不同。据此，我们推测好氧反硝化菌株2-5的反硝化途径分为两步，第一步菌株以碳源为电子供体，以硝酸盐为电子受体，将硝酸盐氮转化为亚硝酸盐氮；第二步为将亚硝酸盐氮还原为N2O或N2,排出系统外。第二步亚硝酸盐氮的还原是TN降解的限制性因素。而这一现象也说明好氧反硝化和厌氧反硝化过程基本一致，好氧反硝化过程中氧不会对反硝化还原酶产生抑制，好氧反硝化菌不仅可以把电子从被还原物质传递给O--N。2，同时也可以通过硝酸盐还原酶将电子传递给NO3关于反硝化过程出现亚硝酸盐氮积累的报道较多，产生这一现象的原因多种多样。本试验中出现的亚硝酸盐氮积累可以看成是反硝化过程中第一步与第二步反应之间的速率差造成[77]。在亚硝酸盐氮积累阶段，亚硝酸的增加(来自硝酸盐氮还原)与减少(由于亚硝酸盐氮被还原为氮气)同时存在，加之硝酸盐氮的存在可能对亚硝酸盐氮还原产生影响，因而很难直接得到亚硝酸盐氮在这一过程中的还原速率。而当硝酸盐氮反应结束时，系统内仅仅存在亚硝酸盐氮的还原过程，因而能够利用此阶段亚硝酸盐氮的变化得到亚硝酸盐的还原速率。不同碳源下硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的还原速率(V1为硝酸盐氮还原成亚硝酸盐氮的速率、V2为亚硝酸盐氮还原成氮气的速率)见表4.2。-31- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究表4.2亚硝酸盐氮积累阶段的反硝化速率Tab.4.2Denitrificationrateduringnitriteaccumulation碳源V1V2V2-V1葡萄糖3.320.61-2.71乙酸钠3.411.69-1.72甲醇2.931.29-1.64柠檬酸三钠3.320.61-2.71酒石酸钾钠2.851.35-1.5丁二酸钠2.760.03-2.73注1V-1-11、V2单位均为mg·L·h由表4.2可以看出，正是两步反应的速率差造成了硝酸盐氮还原阶段会产生亚硝酸盐氮积累的现象。从表4.2还可以看出，不同碳源作为反硝化的电子供体时，硝酸盐氮还原速率或亚硝酸盐氮还原速率均不同，这说明碳源种类是影响反硝化速率的因素之一。4.3本章小结本章主要考察了碳源对好氧反硝化菌株2-5的生长特性和脱氮性能的影响。1.不同碳源下好氧反硝化菌反硝化过程pH及ORP值呈规律性变化，pH值过高或过低都将影响反硝化速率。2.菌株2-5以甲醇为碳源时较其他碳源取得较大的生长量及生长速率，同时碳源结构越简单，菌株的生长速率越快。3.碳源对NO-3-N的降解影响与好氧反硝化菌2-5的生长密切相关。以甲醇为反硝化的电子供体时NO-3-N的降解速率和去除率均为最大，但其TN的去除率并非最大，而以酒石酸钾钠为碳源时TN去除率最大，达到70%。这主要是由于不同碳源下的反硝化途径不同，以致产生不同量的亚硝酸盐积累，以致NO-3-N去除率与TN去除率的一致性上产生一定差别。-32- 兰州交通大学硕士学位论文第五章好氧反硝化细菌2-5脱氮影响因素研究传统观点认为反硝化反应仅能在厌氧环境下完成，原因是氧会和硝酸盐竞争成为电子受体，阻碍硝酸盐向膜结合硝酸盐还原酶的传递。相反的好氧反硝化被认为不受氧的影响，原因是好氧反硝化菌中同时存在周质硝酸盐还原酶和膜结合硝酸盐还原酶的关系，因而菌株可利用硝酸盐氮及氧的共呼吸完成反硝化过程。上一章我们已对好氧反硝化细菌2-5做了分离鉴定以及初步的脱氮性能研究，本章着重研究了好氧反硝化细菌2-5脱氮过程所需的最佳碳源、最适pH、最适温度和最佳C/N等特性，以期对好氧反硝化细菌2-5的好氧反硝化能力及其脱氮机理进行研究，使得菌株2-5具备更加高效的脱氮性能。5.1实验材料与方法5.1.1实验材料（1）菌株好氧反硝化细菌2-5（2）培养基细菌营养琼脂培养基（/L）：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，pH7.4-7.6。DM反硝化培养基：KNO30.72g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O1g，琥珀酸钠2.8g，121±1℃灭菌20min，备用。5.1.2实验方法（1）C/N对好氧反硝化细菌2-5生长特性及脱氮性能的影响本实验以反硝化培养基为基础培养基，保持氮源浓度不变，以最佳碳源实验中确定的最佳碳源作为电子供体，通过调整体系中碳源浓度来改变体系的C/N比，使得体系中C/N质量比分别为1、5、8、11、14、17、20、25。之后取菌株2-5培养12h后的菌液以1ml的接种量接种到150ml反硝化培养基中，于120r/min，30±1℃培养下进行摇床实验，于0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h时刻对各系统的pH值和ORP值进行测定并取样，每次取样5ml，首先对各样的OD600值测定，然后将样品采用0.45µm有机滤头过滤样品中的微生物有机残留，最后对各样品的氨氮、总氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、COD等指标进行测定，分析C/N比对好氧反硝化菌株2-5生长特性及脱氮性能的影响，并确定体系最佳碳氮比。（2）海绵铁投加量对好氧反硝化细菌2-5生长特性及脱氮性能的影响以反硝化培养基为基础培养基，以最佳碳源实验中确定的最佳碳源为反硝化电子供体，保持碳氮比与不同C/N的影响实验中的C/N一致，考察海绵铁投加量分别为0、0.3、-33- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究1.0、3g/L时对好氧反硝化菌株2-5生长特性及脱氮性能的影响，从而确定该体系中最佳的海绵铁投加量。（3）初始pH值对好氧反硝化细菌2-5生长特性及脱氮性能的影响以反硝化培养基为基础培养基，以酒石酸钾钠为反硝化电子供体，保持C/N为17，海绵铁投加量为1.0g/L，考察培养基初始pH值分别为5、6、7、8时对好氧反硝化菌2-5生长特性及脱氮性能的影响。具体试验方法同最佳碳源实验相同。（4）温度对好氧反硝化细菌2-5生长特性及脱氮性能的影响以反硝化培养基为基础培养基，以酒石酸钾钠为碳源，保持C/N为17，海绵铁投加量为1.0g/L，维持培养基初始pH为7，考察温度分别为20、30、35℃时对好氧反硝化菌生长特性及脱氮性能的影响。具体试验方法同最佳碳源实验相同。5.1.3分析方法NH+--4-N、NO3-N、NO2-N、TN采用国标法测定。菌体生长量采用比浊法测定，也就是利用分光光度计测定菌株培养液在600nm处的吸光值(简称OD2+600)。Fe和TFe的测定均采用邻菲罗啉分光光度法[78]。5.2结果与讨论5.2.1C/N比对好氧反硝化细菌2-5生长特性及脱氮性能的影响对于好氧反硝化菌而言，碳源量是重要的影响因素，如果碳源不足，脱氮就会不充分，影响反硝化效果，就要补充外加碳源。因此，在脱氮过程中，C/N的控制对好氧反硝化菌来说非常重要。有文献报道，发现C/N对好氧反硝化菌的影响范围为2-25之间，范围相对较广[79-80]。分析原因，高C/N能够保证体系反硝化所需的碳源，使得反硝化作用更彻底。同时相对较高的C/N促进了好氧反硝化菌相关反硝化基因的表达。相反的，低C/N下，碳源消耗速度快，这就产生了硝化和反硝化间不均衡性[81]。另有部分研究结果表明，对特定菌株，其最佳C/N的范围很小，在较小的碳源浓度恰好能诱导产生足够反硝化酶，而继续增大碳源它的反硝化活性却不再增大[82]。5.2.1.1C/N比对好氧反硝化细菌2-5生长特性影响图5.1为不同C/N下好氧反硝化菌2-5的OD600值随时间的变化。由5.1可以看出，不同初始C/N下，好氧反硝化菌生长曲线即OD600值变化规律基本一致，生长过程均可分为适应期、对数增长期和稳定期三个阶段，但不同C/N下到达稳定期的时间及稳定期时的OD600值有所差异，可以发现C/N小于20时，C/N越大,达到稳定期的时刻越晚且稳定期OD600值越大，C/N大于20时两者均有下降。即当C/N为20时，稳定期OD600值最大，也就是说在C/N为20时，好氧反硝化菌2-5具有较好的生长。-34- 兰州交通大学硕士学位论文图5.1C/N对菌体生长的影响Fig5.1EffectofC/Noncellgrowth5.2.1.2C/N比对好氧反硝化细菌2-5脱氮性能影响（1）C/N比对好氧反硝化细菌2-5去除TN的影响试验连续测定了96h内不同碳源下TN的浓度变化情况，为了更加清楚的对比分析不同碳源下TN的去除率，TN的降解采用柱状图表示，结果见图5.2。从图5.2中可以看出，各C/N比下初始TN浓度基本维持在100mg/l左右，在C/N为1.0时，TN降解率为13.53%；而C/N为14时，TN去除率为74.79%。在C/N小于14时，氮的去除率随着C/N比的增加而快速增长。菌体的生长速度也就越快。当C/N为17时，脱氮率增加到最大值80.07%。进一步增加碳氮比，氮的去除率变化不大。可见当C/N大于17时，基本能够进行完全的反硝化。-35- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究图5.2C/N对菌株TN去除率的影响Fig.5.2EffectofC/NonRemovalRateofTNinStrain（2）C/N比对好氧反硝化细菌2-5还原NO--N的影响3图5.3为不同C/N下好氧反硝化菌2-5对NO-3-N的还原情况。从图5.3中可以看出，不同C/N下硝酸盐的还原率差别较大。在C/N为1.0时，硝酸盐去除率仅为28%；当C/N增加到17时，硝酸盐积累量为0，硝酸盐几乎可以全部被还原。在C/N小于17的情况下，硝酸盐还原率随着C/N的增加而快速增长，而当进一步增加碳氮比时，硝酸盐还原率略有下降。可见，当C/N为17时，好氧反硝化菌株2-5具有较好的硝酸盐还原效果。综合考虑不同C/N下好氧反硝化菌2-5对硝酸盐的还原效果及最终的TN去除率，当C/N为17时更适合好氧反硝化菌2-5进行好氧反硝化。-36- 兰州交通大学硕士学位论文图5.3C/N对菌株NO-3-N还原率的影响Fig5.3EffectofC/NonNO-3-Nreductionofstrain（3）不同C/N下好氧反硝化细菌2-5反硝化途径推测有学者指出，不同C/N下好氧反硝化菌的脱氮途径会有所差别。图5.4、5.5为不同碳源下好氧反硝化菌2-5反硝化过程中NO--3-N和NO2-N随时间的变化情况。通过分析可以发现菌株2-5不同C/N下的反硝化途径一致，均是首先把NO--3-N还原为NO2-N，最后再将NO-2-N转化为N2排出体系外。图5.4C/N对菌株2-5去除NO3--N影响Fig5.4EffectofC/NonremovalofNO3-Nfromstrainprocessofstrai-37- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究图5.5C/N对菌株2-5去除NO2--N影响Fig5.5ChangesofNO-2-Nindenitrification5.2.2海绵铁加量对好氧反硝化细菌2-5生长特性及脱氮性能的影响铁是多种酶的激活剂或辅助因子，微生物的很多酶需要和铁离子结合才能发挥生物活性[83]更重要的是它为生物氧化酶系中细胞色素的重要组成部分，在生物氧化中通过Fe3+及Fe2+的氧化还原实现电子间的传递，它也能用于过氧化氢物酶和过氧化氢酶产生，进而加速反应的进行。海绵铁是一种以Fe0为主要成分的新型水处理材料，它和一般的铁屑滤料类似[84]。因此本实验考察了海绵铁对菌株2-5生长性能及其脱氮性能的影响，以期进一步提高菌株2-5的菌体生长速度和反硝化能力。5.2.2.1不同海绵铁加量下铁溶出影响为考察海绵铁加量对培养基中铁溶出的影响，实验测定了96h内培养基内Fe2+、TFe浓度随运行周期的变化。实验结果见图5.6。-38- 兰州交通大学硕士学位论文图5.6海绵铁投加量对铁溶出影响Figure5.6spongeirondosageofirondissolution由图5.6可以看出，各反应器内Fe2+始终保持较低水平，各反应器内TFe溶出量随着海绵铁投加量的增大而增大。分析原因主要是由于实验系统中培养基上清液的Fe2+浓度受反应器溶解氧及运行条件的影响，在好氧环境中，Fe2+快速转化为Fe3+[85]，致使各反应器内上清液中只能检测到少量的Fe2+。5.2.2.2海绵铁加量对好氧反硝化细菌2-5生长特性的影响为了考察海绵铁加量对好氧反硝化菌2-5的生长特性影响，实验测定了96h内不同海绵铁加量下好氧反硝化菌2-5OD600随时间的变化情况，结果如图5.7。-39- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究图5.7海绵铁加量对菌株2-5菌体生长影响Fig.5.7Effectofadditionofspongeirononthegrowthofstrain2-5由图5.7可以发现，不同海绵铁加量下好氧反硝化菌株2-5的OD600值有所差异。当海绵铁加量为1g/L时，好氧反硝化菌2-5OD600值增长最快，且最大值可以稳定在1.7左右。当海绵铁加量为0.3g/L时，好氧反硝化菌2-5OD600值增长最慢，且最大值仅稳定在1.3左右。分析原因为，铁是微生物生长的基本元素，一般情况下海绵铁投加量越大，溶出的铁离子量越多，好氧反硝化菌的生长性能越好。这和研究发现的一些金属离子比如Fe2+的加入可大程度的提高菌体对NH+-[86]4和NO3-N的利用效率一致。不同海绵铁加量菌株的生长量不同，适宜于好氧反硝化菌2-5生长的最佳海绵铁加量为1g/L。5.2.2.3海绵铁加量对好氧反硝化细菌2-5脱氮率的影响为了考察海绵铁加量对好氧反硝化菌2-5脱氮性能的影响，实验测定了96h内不同海绵铁投加量下各反应器TN、NO-3-N随时间的变化，为了更加清楚的表现不同海绵铁投加量下的脱氮情况，实验结果采用去除率表示，如图5.8、5.9所示。-40- 兰州交通大学硕士学位论文图5.8海绵铁加量对菌株2-5脱氮效果影响Fig.5.8Effectofadditionamountofspongeironondenitrificationefficiencyofstrain2-5图5.9不同海绵铁加量下菌株2-5对硝酸盐氮去除影响Figure5.9ReductionofNitrateNitrogeninStrain2-5byadditionofspongeiron由图5.8、5.9可以发现，不同海绵铁加量下好氧反硝化细菌2-5对NO-3-N的还原能力均表现出较高水平。而不同海绵铁加量下好氧反硝化菌2-5的TN去除率略有差异，当海绵铁加量为1g/L时，菌株2-5较其他海绵铁投加量下的TN去除率高出将近5个百分点。分析原因为铁作为生命基本元素可以通过促进生物活性而加强生物作用[87]，因而-41- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究适宜的海绵铁加量下，好氧反硝化细菌2-5能获得较大生长量和较好的活性，因而TN的去除率较适宜的海绵铁投加量下也会有所差异。而且研究发现，海绵铁也有化学除氮作用，Fe0在被氧化为Fe2+的同时，硝酸盐会被Fe0还原，一定程度上降低水中氮的浓度[88]。因此，海绵铁投加量为1g/L时，菌株2-5具有较好的生长能力和脱氮能力。5.2.3初始pH值对好氧反硝化细菌2-5生长特性及脱氮性能的影响研究发现，好氧反硝化菌Pseudomonassp.C[89]3的反硝化能力受pH值影响较大。在中性至偏碱(pH7-9)环境下菌株C3具有较好的脱氮效果，氮的去除率为59%-93%。而酸性(pH≤6)和强碱性(pH≥10)时，菌株生长状况较差，硝酸盐去除率较小。5.2.3.1初始pH值对好氧反硝化细菌2-5生长特性影响实验考察初始pH值对好氧反硝化细菌2-5的生长特性影响，连续测定了96h内不同初始pH下好氧反硝化细菌2-5OD600值随时间的变化。实验结果如图5.10。图5.10pH对菌体生长影响Figure5.10EffectofpHoncellgrowth由5.10可以看出，菌株2-5在中性、偏酸和偏碱性条件下均生长良好。不同初始pH下，好氧反硝化菌生长曲线即OD600值变化规律基本一致，均为0-6h为微生物适应期，6-12h为其对数增长期，12h后为稳定期。然而，不同初始pH下稳定期OD600值存在一定差异，当初始pH为7时，稳定期OD600值最大，也就是说在菌株2-5的适宜初始pH为7。5.2.3.2初始pH值对好氧反硝化细菌2-5脱氮性能的影响为了考察初始pH值对好氧反硝化菌2-5脱氮性能的影响，实验测定了96h内不同-42- 兰州交通大学硕士学位论文初始pH值各反应器TN、NO-3-N随时间的变化，为了更加清楚的表现不同初始pH值下的脱氮情况，实验结果采用去除率表示，如图5.11所示。图5.11不同pH下脱氮效率对比Fig5.11ComparisonofdenitrificationefficienciesatdifferentpH如图5.11所示，不同初始pH下硝酸盐均能完全被还原。相比之下，在初始pH值为7时TN的降解率最高，达到96%。这说明好氧反硝化菌2-5的脱氮性能受初始pH值影响较小，在稍偏酸或偏碱的条件下均能取得较好的脱氮率。-43- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究分析其原因为pH值可能会直接影响微生物酶的活性，当环境中的氢离子浓度如果超过了微生物酶pH值范围，那么微生物对有机物的吸收和酶的活力都会产生很大的影响。因此微生物生长的pH值有一定的范围，一些微生物对pH的变化反应很灵敏，也就是其适应的范围较窄，相反的一些微生物对pH的变化不敏感，也就是其适应的范围较宽。因此，必须在适宜的pH值下进行硝酸盐氮降解。最终确定试验菌株2-5的最适pH值为7.0。5.2.4温度对好氧反硝化细菌2-5生长特性及脱氮性能的影响微生物的生长繁殖除了受营养因子的影响外，还与其他环境因子有着密切的联系，其中受物理因素中的温度影响最大。当微生物处在它的最适生长温度时，温度会促进微生物的生长；不适宜的温度导致微生物的活性降低，最终导致死亡。研究表明温度对好氧反硝化菌株Pseudomonassp.C3的反硝化效率的影响并不明显，在25-35℃之间，该菌株都具有较好的氮去除率。实验考察了20-35℃之间，温度对好氧反硝化菌株2-5生长特性和脱氮性能的影响。5.2.4.1温度对好氧反硝化细菌2-5生长特性影响实验首先考察了温度对好氧反硝化菌2-5菌体生长的影响。实验结果见图5.12所示，从图中可以看出2-5在30℃和35℃时均能得到良好的生长，在图中可以清晰看出适应期、对数期和稳定期的形成，而在20℃时2-5菌体生长缓慢且菌体增长量小，到24h时才基本处于稳定期。说明好氧反硝化菌2-5的适宜生长温度为30℃-35℃左右，考虑到菌株实际工程的应用及能源节约角度考虑，最终选取30℃为菌株2-5的最佳生长温度。图5.12温度对菌体生长的影响Fig5.12Effectoftemperatureoncellgrowth-44- 兰州交通大学硕士学位论文5.2.4.2温度对好氧反硝化细菌2-5脱氮性能影响图5.13温度对菌株的好氧反硝化效果影响Fig5.13EffectofTemperatureonAerobicDenitrificationofStrain由图5.13可知，试验菌株在实验温度下都具有一定的脱氮性能，但当温度过低时菌株的脱氮效果受到抑制。菌株在30℃-35℃培养条件下反硝化效果明显，对硝氮的去除率达到90%以上，30℃下硝氮去除率最高，24h已达到100%。温度为20℃时，菌株的脱氮效果较差，硝氮仍有大量残余。分析原因为温度过低条件下菌株并不会死亡，只是-45- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究它的酶活性受到抑制，代谢速度减缓，因此硝酸盐和总氮的去除率较低。随着温度的升高，菌体活性增强，代谢加快，外在表现为硝酸盐和总氮的去除效果增强。实验充分证明30℃-35℃好氧反硝化菌2-5生长旺盛，反硝化效果显著，脱氮效果较理想。5.3本章小结本章主要考察了C/N、海绵铁加量、初始pH值及温度等条件对好氧反硝化菌菌株2-5生长特性及脱氮能力的影响。（1）C/N是影响菌株2-5生长和脱氮的关键因素。C/N为20时菌株2-5的生长曲线达到稳定期时，生长量最大。当C/N为17时，2-5对NO-3-N去除率为100%，TN去除率达到最大值80.07%。进一步增大碳氮比，氮的去除率率略有下降。综合考虑好氧反硝化菌2-5的生长性能和脱氮效果，认为适宜菌株2-5脱氮的最佳C/N为17。（2）铁是微生物生长的基本元素，海绵铁加量过大或过小都不利于菌株的生长，适宜于好氧反硝化菌2-5生长的最佳海绵铁加量为1g/L。不同海绵铁加量下好氧反硝化细菌2-5对NO--3-N的还原能力均表现出较高水平，各反应器中NO3-N的去除率均能基本达到100%。而不同海绵铁加量下好氧反硝化菌2-5的TN去除率有所差异，当海绵铁加量为1g/L时，菌株2-5对TN的去除率可达到95%，较其他海绵铁投加量下的TN去除率高出将近5个百分点。（3）不同pH值下，反硝化的效果有所不同。在中性、偏碱(pH7-9)的条件菌株2-5具有较好的反硝化效果(氮的去除率为59%-93%)。在初始pH值为7时TN的降解率最高，为93%。（4）菌株2-5在30℃和35℃时均能得到良好的生长。温度为20℃时，菌株的脱氮效果较差，硝氮仍有大量残余。当温度为30℃-35℃时，菌株2-5TN去除率可达到90%以上。可见，菌株2-5脱氮的适宜温度为30℃-35℃。最终确定菌株2-5脱氮的最适温度为30℃。-46- 兰州交通大学硕士学位论文第六章好氧反硝化细菌2-5强化SBR反应器研究实验室条件下菌株、菌群具有良好的处理能力，但接种到普通活性污泥后有时并不能得到预期的处理效果[90]。然而不可否认，在实验室条件下表现优异的菌株及菌群在实际中也拥有很大的应用潜力。在好氧反硝化菌2-5反硝化特性及脱氮影响因素研究的基础上，本章进一步研究试验菌株的强化效果。将试验菌株扩大培养后，以菌泥直接投放的方式对SBR反应器的强化效果进行试验研究，并与未加试验菌、不同接种量试验菌及同时投加海绵铁的反应器的处理效果进行比较，以便分析试验菌株2-5强化SBR反应器的实际可行性。6.1实验材料与方法6.1.1实验材料好氧反硝化菌：好氧反硝化菌2-5来自本论文2.1节中实验中2#SBR反应器，具有良好的脱氮能力。且经过鉴定同时为铁细菌。接种活性污泥：接种污泥取自筛选好氧反硝化菌2-5的活性污泥。经驯化后使用。海绵铁：试验用海绵铁购自北京某海绵铁厂，海绵铁为疏松海绵状、多孔，呈灰黑色。主要成分全铁约占96%，碳占3%，粒径范围0.5～3.0mm。模拟废水：模拟废水由3ml/L储备液（表6.1）、3ml/L牛奶、硝酸盐氮配水（浓度根据实验实际进行调整）及葡萄糖配水（浓度根据实验实际进行调整）。表6.1储备液Table6.1Formulationofstocksolutions(NH4)2SO4K2CO3NaHCO3K2HPO4KH2PO464g/L64g/L32g/L9.728g/L3.84g/L6.1.2实验方法将2.1中2#SBR反应器脱水污泥置于锥形瓶中，在室温下用生活污水进行驯化。经过7d的驯化后活性污泥呈黄褐色，出水清澈，即认为活性污泥驯化完毕。按表6.2给出的控制条件平行启动1-4#四个SBR反应器，除1#反应器外，2、3、4#三个已驯化好的活性污泥系统反应器中需接种分离筛选的反硝化菌液，待活性污泥系统强化完毕。之后反应器每周期按进水（15min）-曝气（11h）-沉淀（30min）-出水（15min）的顺序连续运行,每天运行2个周期，换水比为1/2。反应器启动后，每两天测定各反应器进、出水COD、TN、NO--+3-N、NO2-N、NH4-N浓度。-47- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究表6.2各反应器控制条件Table6.2Controlconditionsfordifferentreactors反应器编号1#2#3#4#反应器有效容积250（mL）实验水质人工配水接种活性污泥2.52.502.5（g/L）接种菌液060%60%60%海绵铁（g/L）00090其他曝气（2-3mg/L）实验温度室温6.1.3分析测试方法COD、TN、NO--+3-N、NO2-N、NH4-N均依照国标(GB11894-89)进行测定。6.2结果与讨论6.2.1好氧反硝化细菌2-5强化SBR反应器脱氮性能研究采用菌株2-5强化活性污泥反应器处理模拟废水TN的降解效果如图6.1、6.2。以下各图中，1#反应器为投加2.5g/L活性污泥的反应器，2#反应器为投加2.5g/L活性污泥和60%接种菌液，3#反应器为60%接种菌液，4#反应器为2.5g/L活性污泥+60%接种菌液+90g/L海绵铁。-48- 兰州交通大学硕士学位论文图6.1各反应器下TN的变化Fig.6.1ThechangeofTNunderdifferentamountofbacteria图6.2TN的去除率比较Figure6.2ChangesinTNunderDifferentBacteria图6.1为不同反应器TN浓度随运行周期的变化。由图6.1可以看出随着运行周期的变化进水TN浓度呈增长趋势，但各反应器出水均能取得较低浓度。1-100周期，TN进水浓度相对较小，最大约为200mg/L，出水1、2、4#反应器TN浓度均维持在较低水平，且处理效果差距不大，而3#反应器出水浓度略高于1、2、4#反应器。分析原因可-49- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究能是因为3#反应器相比其余三个反应器未加入活性污泥，在该TN浓度下，活性污泥中微生物适应能力强，能起到较好的脱氮作用，而纯好氧反硝化菌由于刚进入到新的环境，还未适应此环境，因而反硝化能力未能完全发挥，脱氮效果相比之下较差。160-192周期，3#反应器TN降解效果较好。192-256周期，该阶段由于TN浓度浓度较大为1000mg/l，因而各反应器首先TN的降解效果变差，至第224周期增大碳源量后，各反应器处理效果又逐渐回升，并最终保持平稳。在这一阶段4#反应器始终较其余反应器具有较好的处理效果，分析原因首先可能是因为海绵铁的加入一方面促使反应器具有较好的抗高负荷的能力，另一方面海绵铁是微生物生长过程的必要微量元素，它的加入促进了好氧反硝化菌活性的增强，反硝化能力得以加强，因而取得了较好的脱氮效果。为了更加清楚明了的表达各反应器处理效果的差异，我们采用平均进水浓度、平均出水浓度和去除率来表示处理效果，结果如图6.2。由图6.2可以发现，1#-4#各反应器在进水TN浓度约为400mg/L时出水浓度逐渐降低，去除率分别为73.56%、78.01%、80.04%、87.06%，可以发现相比之下反应器中只投加活性污泥的1#反应器去除率最低，而同时投加活性污泥接种菌液的2#反应器去除率比1#反应器高出5个百分点，虽然在一些周期内仅投加菌液的3#反应器去除率略低于其余反应器，但从整个实验结果的平均出水来看，3#反应器较2#反应器高出2个百分点的去除率。由本实验来看，对于2#、3#和4#反应器而言，由于好氧反硝化菌2-5的投加，能有效地分解废水中的有机碳源以获取能量，体现明显的脱氮效果。其中，同时投加活性污泥、接种菌液和海绵铁的4#反应器的TN去除率最高，可见当同时存在这三种物质时反应器中好氧反硝化菌活性增强，脱氮效果良好。图6.3不同菌量下NO-3-N的变化Fig.6.3ThechangeofNO3--Nunderdifferentamountofbacteria-50- 兰州交通大学硕士学位论文图6.4不同菌量下COD的变化Fig.6.4ThechangeofCODunderdifferentamountofbacteria图6.4为整个实验阶段进水及各反应器COD的变化情况。整个实验阶段进水COD浓度的变化可以分为五个阶段。反应器开始启动的前8个周期，各反应器对COD的去除率不高，原因可能是因为好氧反硝化菌2-5投入到SBR反应器后，和原有活性污泥中微生物存在一个竞争关系，同时对废水有一个适应过程。之后，COD去除效果逐渐好转。在前160个周期，尽管COD浓度逐渐增大，由500mg/L左右增大至2500mg/L左右，但各反应器中COD均能降解到较低水平，去除率均为90%左右。实验后期开始出现了COD的积累，可以看出此时碳源已不是限制脱氮的主要因素，这也可能是试验后期TN基本不变的原因之一。-51- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究图6.5不同菌量下NO2--N的变化fig.6.5ThechangeofNO2--Nunderdifferentamountofbacteria图6.6不同菌量下NH+4-N的变化Fig.6.6ThechangeofNH4+-Nunderdifferentamountofbacteria图6.5、6.6为各反应器在整个实验阶段NO-+2-N及NH4-N的变化情况。在整个运行阶段，除3#反应器外，其余反应器出水氨氮均保持在较低水平。相比之下1#反应器处理效果劣于2#和4#反应器。3#反应器在1-100周期NH+4-N降解效果差，说明纯菌液的3#反应器对新环境的适应能力不如同时投加活性污泥的其余反应器，这也可能是造成3#-52- 兰州交通大学硕士学位论文反应器这一时期TN降解效果差的主要原因。100周期以后，3#反应器已完全适应新的环境，降解效果逐渐变好且趋于稳定。整个实验阶段，NO-2-N浓度相对保持在较低水平。6.2.2不同NO-3-N进水负荷下好氧反硝化细菌2-5强化SBR反应器脱氮性能研究实验过程中，各反应器进水浓度在呈增长趋势，根据NO-3-N浓度的变化可将整个实验过程分为第一阶段（1-23）、第二阶段（23-43）、第三阶段（43-105）、第四阶段（105-163）、第五阶段（163-191）、第六阶段（191-256）共六个阶段，每个阶段平均进水NO--3-N浓度不同。考察不同进水负荷下各反应器对TN及NO3-N的降解效果。结果见表6.3。表6.3反应器不同运行阶段TN降解效果Table6.3TNdegradationofthereactoratdifferentoperatingstagesTN(mg/L）阶段进水1#2#3#4#第一阶段（1-23)C/N=8.662.0222.0617.4637.9212.71第二阶段（23-43)C/N=5.2111.566.185.9835.43.3643-73(C/N=3.98）156.4927.0434.2471.0719.62第三阶段（43-105)73-105（C/N=5.98)161.810.158.5437.946.37105-127(C/N=3.79）298.3930.2730.7527.2153.44第四阶段（105-163)127-163（C/N=7.48)321.0514.6817.1714.3516.91第五阶段（163-191)C/N=6.24498.2752.8351.221.6548.36191-235(C/N=3.26）954.25366.97418.84317.86190.15第六阶段（191-256)235--256（C/N=4.46)998.31189.78190.4138.1633.32-53- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究表6.4反应器不同运行阶段NO-3-N降解效果Table6.4NO3-NdegradationeffectatdifferentoperatingstagesofthereactorNO-3-N(mg/L）阶段进水1#2#3#4#第一阶段（1-23)C/N=8.616.855.396.361.530第二阶段（23-43)C/N=5.244.620.621.7710.260.0843-73(C/N=3.98）72.7614.5625.5928.866.75第三阶段（43-105)73-105（C/N=5.98)87.080.753.798.852.52105-127(C/N=3.79）194.328.616.230.4215.85第四阶段（105-163)127-163（C/N=7.48)239.093.295.970.025.78第五阶段（163-191)C/N=6.24393.889.636.9505.09191-235(C/N=3.26）899.89190.6132.21240.4375.03第六阶段（191-256)235-256（C/N=4.46)908.508174.2387124.3214.1表6.3和6.4为各反应器不同运行阶段TN及NO-3-N的降解效果。由表可知，第一阶段，TN为62.02mg/L，C/N比为8.6，此时各反应器TN降解效果均良好，NO-3-N、TN基本能降解完全。第二阶段仅提高TN浓度至111.56mg/L,相应的C/N减小为为5，可以发现NO--N的增大并未影响各反应器的脱氮效果，除3#反应器TN有部分剩余外，3其余三个反应器TN基本降解完全。第三阶段继续增大TN浓度为160mg/L左右，该阶段前期C/N比约为4，各反应器TN浓度均有部分剩余，因此，后期提高C/N比约为6，此时NO--3-N和TN降解效果较前期均有所升高。第四阶段增大NO3-N浓度为300mg/L左右，相应的该阶段前期C/N变为4左右，此时，各反应器NO-3-N基本能够全部降解，TN浓度约有30mg/l左右的剩余，后期增大C/N为7左右，此时TN能得到继续降解。第五阶段TN浓度增至500mg/L左右，此时3#反应器降解效果最好，剩余TN仅为1.65mg/l。最后一阶段第六阶段TN浓度为1000mg/L左右，TN浓度的大量增长使得各反应器降解效果变差，分析原因为各反应器C/N过小，仅为3。该阶段后期增大各反应器C/N至5左右，此时各反应器处理效果得到大幅度回升，3#、4#反应器TN降至30mg/L左右，处理效果较其余反应器良好。可以看出在整个实验过程中随着TN浓度的增大各反应器的处理效果会随之发生规律性的变化（TN降解效果会变差），而这种变化可以通过调整反应器的C/N使之发生改善。最终通过比较，我们可以发现在整个运行过程中4#反应器，不仅表现出良好的脱氮效果，且具有较好的抗高氮负荷的能力，这与该反应器中加入好氧反硝化菌和海绵铁具有密切的关系。-54- 兰州交通大学硕士学位论文6.2.3不同阶段4#反应器一个周期内各指标变化由6.2.2我们已经发现4#反应器具有良好的抗负荷能力，为了能将该菌株更好的应用于实际工程中，我们对4#反应器在运行的不同阶段一个周期内的降解情况进行了考察，图（a）（b）（c）为4#反应器运行第二、三、六阶段的一个周期内TN和NO--N3的变化情况。（a）（b）-55- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究（c）图6.7反应器运行各阶段一个周期内TN和NO-3-N的变化Figure6.7ChangesinTNandNO-3-Ninonecycleofeachstageofthereactoroperation图6.7为4#反应器运行的第二、三、六阶段的一个周期内TN和NO--N的变化情3况。由图可以发现4#反应器在各阶段一个周期内均能将TN和NO--N基本完全降解。3由图3（a）可以看出4#反应器第二阶段初始TN浓度为100mg/L，在第180min时TN和NO--N均能完全降解，用时仅为3h。当第三阶段时初始TN浓度为150mg/L，在第3120min时TN和NO--3-N的降解已趋于稳定，至240min时NO3-N完全降解，300min时TN基本上完全降解。第六阶段初始TN浓度为1050mg/L，在第240min时TN和NO-3-N的降解已趋于稳定，至360min时两者的降解基本完全。可以发现4#反应器在各运行阶段均能快速的完成脱氮，快速且高效。同时可以看出，随着TN浓度的升高降解稳定时刻推后，达到完全降解所用的时间增长。6.3本章小结本章将所筛选到的具有好氧反硝化作用的好氧反硝化菌株2-5应用于SBR反应器中。不同NO--N进水负荷下，各反应器脱氮效果发生规律性的变化，这种变化可以通3过调整反应器的C/N使之发生改善。但相比之下在整个运行过程中4#反应器具有较好的抗高氮负荷的能力，这可能与该反应器中加入海绵铁具有密切的关系。实验同时考察了4#反应器不同阶段一个周期内TN、NO-3-N的变化情况。实验结果显示4#反应器各阶段都能在短时间内（240min）快速的将TN和NO-3-N降解到较低水平。-56- 兰州交通大学硕士学位论文结论本实验首先采用了3个不同的SBR反应器对模拟废水进行脱氮处理，实验结果显示同时投加海绵铁及NO--N的3#反应器对TN的去除率为1#普通活性污泥反应器的23倍，通过对其中铁细菌和好氧反硝化菌的测定，正是这主要是由于3#反应器中海绵铁及NO-3-N的加入增强了3#反应器中微生物尤其是铁细菌和好氧反硝化菌的数量，正是由于这些微生物的增多，增强了反应器的反硝化效果，促进了脱氮效果的增强。最终同时从3个反应器中共筛选出11株兼具铁氧化和好氧反硝化作用的株。（1）从11株兼具铁氧化和好氧反硝化的菌株中挑选出具有代表性的好氧反硝化菌株2-5进行菌落形态观察、生理生化鉴定及16SrDNA测序，最终确定好氧反硝化菌株2-5属于反硝化无色杆菌属。（2）考察了碳源对好氧反硝化菌株2-5的生长特性和脱氮性能的影响。当菌株2-5利用甲醇、葡萄糖及酒石酸钾钠等六种碳源为电子供体进行反硝化时，反硝化过程pH及ORP值呈规律性变化。以甲醇为碳源时较其他碳源取得较大的生长量及生长速率，同时碳源结构越简单，菌株的生长速率越快。碳源对NO-3-N的降解影响与其的生长密切相关，因此以甲醇为反硝化电子供体时NO-3-N的降解速率和去除率均为最大，但其TN的去除率并非最大，而以酒石酸钾钠为碳源时TN去除率最大，达到70%。分析原因为不同碳源下的反硝化途径不同，以致产生不同量的亚硝酸盐积累，以致NO-3-N去除率与TN去除率的一致性上产生一定差别。（3）接着对C/N、海绵铁加量、初始pH值及温度等影响因子做了研究：C/N是影响菌株2-5生长和脱氮的关键因素。C/N为20时菌株2-5的生长曲线达到稳定期时，生长量最大。当C/N为17时，2-5对NO--N去除率为100%，TN去除率达到最大值80.07%。3综合考虑好氧反硝化菌2-5的生长性能和脱氮效果，认为适宜菌株2-5脱氮的最佳C/N为17。铁是微生物生长的基本元素，适宜于好氧反硝化菌2-5生长的最佳海绵铁加量为1g/L。在初始pH值为7时TN的降解率最高，为93%。菌株2-5在30℃和35℃时均能得到良好的生长。温度为20℃时，菌株的脱氮效果较差，硝氮仍有大量残余。菌株2-5脱氮的适宜温度为30℃。（4）将所筛选到好氧反硝化菌株2-5应用于SBR反应器中。通过实验不难看出，混合有活性污泥的菌液处理生活污水的效果要高于单纯活性污泥和单纯菌液的处理效果，总氮去除率较高，不同硝氮负荷下，各反应器脱氮效果发生规律性的变化，这种变化可以通过调整反应器的C/N使之发生改善。但相比之下在整个运行过程中4#反应器具有较好的抗高氮负荷的能力，这可能与该反应器中加入海绵铁具有密切的关系。实验同时考察了4#反应器不同阶段一个周期内TN、NO-3-N的变化情况。实验结果显示4#反应器各阶段都能在短时间内（240min）快速的将TN和NO-3-N降解到较低水平。-57- 生物海绵铁体系好氧反硝化菌分离富集及其脱氮性能研究致谢三年的研究生生涯马上就要结束了，在此衷心感谢所有在我学习和生活中无私给予我帮助的亲人、老师和同学。经过导师王亚娥和李杰教授的耐心指导，我的论文才得以顺利完成。他们不仅教给我专业知识，而且培养了我严谨的科研态度和怎样做一个真正的科学人。在此，我向导师表示最衷心的谢意!三年学习过程中还得到了赵炜老师、周岳溪教授的细心指导和帮助。同时，在整个实验过程中，得到了白帆、柴志龙、宋森等同门和李晓艳、卢小燕、吴祯娥、宋乐园等其他师兄、师姐、师弟、师妹们的帮助，表示深深的谢意。-58- 兰州交通大学硕士学位论文参考文献[1]沈同，王镜岩，生物化学(第二版)[M]北京:高等教育出版社，2000.[2]张自杰，顾夏声，张荣忱等.排水工程(第四版)[M]北京：中国建筑工业出版社，2000.[3]JungJ,YeomJ,HanJ,etal.Seasonalchangesinnitrogencyclegeneabundancesandinbacterialcommunitiesinacidicforestsoils[J].JournalofMicrobiology，2012,50(3):365-373.[4]周少奇.环境生物技术（第一版）[M]北京：科学出版社，2003.[5]高大文，彭永臻，王淑莹.控制pH实现短程硝化反硝化生物脱氮技术[J].哈尔滨工业大学学报，2013，37(12):1664-666.[6]李松良，林华东，王鹏.生物脱氮的短程硝化反硝化及影响因素[J].能源环境保护，2012，21（4）:10-22.[7]郭冬艳，李开蓓，刘莉如，等.同步硝化反硝化生物脱氮技术[J].安全与环境保护，2014,16（3）:41-44.[8]StrousM,VanGervenE,ZhengP.Ammoniumremovalfromconcentratedwastestreamswiththeanaerobicammoniumoxidation(Anammox)processindifferentreactorconfigurations[J].WaterRes,2013,31:1955-1962.[9]闫志英，廖银章，等.新型废水生物脱氮的微生物学研究进展[J].应用与环境生物学报，2006，12（2）:292-296.[10]RobertsonLA,KuenenJG.AerubicDenitrification:aControversyRevived[J].ArchMicrobiol，2014,139(5):351-354.[11]马宁，王亚娥，李杰.新型水处理材料海绵铁在废水处理中的应用研究[J].环境科学与管理，2014,39（8）:71-73.[12]郭焱，张召基，等.好氧反硝化微生物学机理及应用研究进展[J].微生物学通报（网络版），2016，DOI:10.13344/.microbiol.china.160001[13]RobertsonLA,KuenenJG.AerubicDenitrification:aControversyRevived[J].ArchMicrobiol，1984,139(5):351-354.[14]pochana,B.C.Berks,D.J.Rchardson,C.Robinson,etal.PyrificationandCharacterizationofthePeriplasmicNitrateReductasefromThiosphaerapantotropha.BiochemJ,2005,309:983-992.[15]KlangduenPochana,JurgKeller.StudyofFactorsAffectingSimulltaneousNitrificationandDenitrification(SND)[J].WatSciTech,2013,39(6):61-18.[16]VannielEWJ,TorremansRAM,KuenenJG.SimultaneousnitrificationanddenitrificationinaerobicchemostatculturesofThiosphaerapantotropha.ApplEnvironMicrobiol,2011,54(11):2812-2818.[17]Richardson，S.J.Ferguson.TheinfluenceofcarbonsubstrateontheactivityoftheperiplasmicnitratereductaseinaerobicallygrownThiosphaerapantotropha[J].Archivesofmicrobiology,2012,157(6):535-537.[18]马放，王弘宇，周丹丹.好氧反硝化生物脱氮机理分析及研究进展[J].工业用水与废水，2005,36(2):11-14.[19]王永刚，王旭，张俊娥，等.好氧反硝化细菌研究及应用进展[J].工业水处理，2017,37（2）:12-17.[20]SrinandanCS，ShahM，PatelB，etal.Assessmentofdenitrifyingbacterialcompositioninactivatedsludge[J].BioresourceTechnology,2011,102(20):9481-9489.[21]李平，张山，刘德立.细菌好氧反硝化研究进展[J].微生物学杂志，2015,25(001):60-64.[22]HuangYing,YuLeilei，WangRuihui，etal.Pilotstudyofintensedewateringofurbansewagesludge.J.Mater[J].CyclesWasteManag,2015,17(4):1-14.-59- 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