陇西县奶牛子宫内膜炎流行病学调查与主要致病菌分离鉴定和药敏试验

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分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学兽医硕士学位论文陇西县奶牛子宫内膜炎流行病学调查与主要致病菌分离鉴定和药敏试验InvestigationontheprevalenceofendometritisindairycowsandisolationandidentificationofmajorpathogensanddrugsusceptibilitytestinLongXiCounty孟彦军指导教师姓名薛慧文教授（甘肃农业大学兰州730070）学科专业名称（学位名称）兽医硕士研究方向（专业领域）兽医学申请学位级别硕士论文提交日期2017年12月01日论文答辩日期2017年12月02日学位授予日期2017年12月20日答辩委员会主席陈智华教授评阅人陈士恩教授高明清副教授康文彪研究员2017年12月02日 GansuAgriculturalUniversityDissertationfortheMasterDegreeinAgricultureInvestigationontheprevalenceofendometritisindairycowsandisolationandidentificationofmajorpathogensanddrugsusceptibilitytestinLongXiCountyCandidate：YanjunMengAdvisor：Prof：HuiwenXueAcademicDegreeAppliedfor：MasterofVeterinarySpecialty：ClinicalVeterinaryScience 摘要奶牛子宫内膜炎是奶牛最常见的产科疾病之一，对奶牛生产性能影响较大。为了解陇西县奶牛子宫内膜炎的发病规律，并为其防治提供有效措施，进行了本次调查研究，并对主要病原菌进行分离鉴定和药敏试验，旨在为临床防治本病提供依据。从2016年1月—2016年12月间从陇西县12个乡（镇）随机挑选10头2~8岁产后奶牛进行调查，根据奶牛临床症状、直肠检查、实验室子宫颈口粘液白细胞检查和精液生物学诊断等方法诊断奶牛子宫内膜炎的发病率，分析发病率与季节、乡（镇）、饲养方式、奶牛年龄等因素之间的关系；选择25例确诊为子宫内膜炎的奶牛，采集其子宫颈口分泌物送至实验室进行主要病原菌分离鉴定，确定引起陇西县奶牛子宫内膜炎的主要病原菌的种类，并选择氨苄西林、头孢氨苄、多西环素等14种药敏纸片进行药敏试验，筛选出对细菌具有敏感性的抗微生物药物。结果显示：①陇西县奶牛养殖以传统粗放管理模式为主，2016年奶牛子宫内膜炎的平均发病率为12.71%，奶牛子宫内膜炎发病率存在季节差异，7月最高，5月最低，不同乡（镇）每月发病率在0.00%~30.00%之间；巩昌镇和文峰镇发较高，宏伟乡、和平乡和碧岩镇相对较低，养殖场奶牛子宫内膜炎的发病率明显低于散养户，差异具有统计学意义（P＜0.05）；4岁奶牛子宫内膜炎发病率最低，8岁发病率最高，各年龄阶段奶牛子宫内膜炎发病率比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；②25头患病奶牛的宫颈口粘液共分离到63个菌株，生化鉴定为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓链球菌、大肠杆菌、变形杆菌、克雷伯氏菌、绿脓杆菌等；药敏试验结果显示革兰氏阳性球菌类对红霉素高度敏感，革兰氏阴性菌如大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌以及绿脓杆菌等病原菌对庆大霉素、阿米卡星等药物高度敏感。结论：陇西县奶牛养殖业存在子宫内膜炎的流行，发病与葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌等有关，可根据药敏试验使用庆大霉素、红霉素、阿米卡星等药物进行临床治疗。关键词：奶牛；子宫内膜炎；流行病学调查；病原菌分离与鉴定；药敏试验I SummaryDairycowendometritisisoneofthemostcommonobstetricdiseasesintheprocessofdairyfarming.Therearesignificantdifferencesintheincidenceofvariousregions.InordertounderstandtheincidenceofendometritisinLongxiCounty,andtheeffectivemeasures,thisinvestigationwascarriedout.Toselsctedtwo-eight-years-oldpostpartumcowstoinvestigatefromJanuarytoDecember2016in12townshipsLongXiCounty,theincidenceofendometritisindairycowswasdiagnosedaccordingtotheclinicalsymptoms,rectalexamination,mucosalleukocytetestinthecervixofthecervix,andthebiologicaldiagnosisofsemen.Theincidencesofthediseasewerecomparedwiththoseoftheseasons,townships(towns),breedingmethods,cowageTherelationshipbetweenthefactors;choose25casesofendometritisdiagnosedcow,collectingthesecretionofthecervixtothelaboratoryforisolationandidentificationofthemajorpathogenstodeterminethecauseofLongxiCountycowendometritisthemainpathogens,Ampicillin,cephalexin,doxycyclineandother14susceptibilitydiskswereselectedforsusceptibilitytesting.Anti-microbialagentsthatweresensitivetothebacteriawerescreenedout.Theresultsshow:①LongxiCountydairyfarmingisdominatedbythetraditionalextensivemanagementmode.Theaverageincidenceofendometritisindairycowsin2016was12.71%.Therewasaseasonaldifferenceintheincidenceofendometritisindairycows,thehighestinJulyandthelowestinMay.Town)monthlyincidenceof0.00%to30.00%;GongchangZhenandWenfenghighertown,HongweiTownship,TownshipandBiyanrelativelylow,theincidenceofdairycowendometritiswassignificantlylowerthantheThedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).Theincidenceofendometritisin4-year-oldcowwasthelowest,andthehighestincidencewasfoundin8-year-oldcow.Theincidenceofcowendometritiswasstatisticallysignificantinallagegroups(P<0.05);Therewere63strainsisolatedfrommucosaofcervicalmucosaof25cows,whichwerebiochemicallyidentifiedasStaphylococcusaureus,Staphylococcusepidermidis,Streptococcuspyogenes,Escherichiacoli,Proteus,Klebsiella,PseudomonasII aeruginosaandsoon.Sensitivitytestresultsshowedthatgram-positivecoccihighlysensitivetoerythromycin,gram-negativebacteriasuchasE.coli,Shigella,SalmonellaandPseudomonasaeruginosaandotherpathogensongentamicin,amikacinandotherdrugsHighlysensitive.Conclusion:ThereisaprevalenceofendometritisindairycattlebreedingindustryinLongxiCounty.Theincidenceisrelatedtostaphylococci,streptococciandEscherichiacoli.Accordingtodrugsusceptibilitytest,gentamicin,erythromycin,amikacinandotherdrugscanbeusedClinicaltreatment.Keywords：Cows;endometritis;epidemiologicalinvestigation;pathogens;isolation;identificationIII 外文缩略词表英文缩写英文全称中文名称BVDVBovineViralDiarrheaVirus牛病毒性腹泻病毒IBRVInfectiousbovinerhinotracheitisvirus牛传染性鼻气管炎病毒BPIV3Bovineparainfluenzavirus3牛副流感病毒3型BoHV-1Bovineherpesvirus1牛疱疹病毒1型FCSfatcowsyndrome奶牛肥胖综合症NationalCommitteeforClinicalLaboratory美国国家临床实验室标准NCCLSstandards化委员会AMPampicillin氨苄西林AKAmikacin阿米卡星LEXcephalexin头孢氨苄DOXdoxycycline多西环素ENRenrofloxacin恩诺沙星FFNFlorfenicol氟苯尼考ERYerythromycin红霉素KANkanamycin卡那霉素STRstreptomycin链霉素PENpenicillin青霉素GENgentamicin庆大霉素TETtetracycline四环素NEOneomycin新霉素Ssaensitive敏感Iintermediate中敏Rresistant耐药IV 目录摘要.............................................................................................................................ISummary........................................................................................................................II外文缩略词表..............................................................................................................IV第一部分文献综述..................................................................................................1第一章奶牛子宫内膜炎研究进展............................................................................11奶牛子宫内膜炎的病因..................................................................................11.1细菌...........................................................................................................11.2病毒...........................................................................................................21.3真菌...........................................................................................................21.4支原体.......................................................................................................21.5其他病原体................................................................................................22奶牛子宫内膜炎的诱发因素..........................................................................22.1子宫内膜损伤............................................................................................22.2胎衣不下...................................................................................................32.3机体内分泌...............................................................................................32.4营养状况...................................................................................................32.5季节...........................................................................................................42.6其他...........................................................................................................43奶牛子宫内膜炎的临床症状...........................................................................43.1奶牛急性子宫内膜炎...............................................................................43.2奶牛慢性子宫内膜炎...............................................................................54奶牛子宫内膜炎的诊断....................................................................................64.1临床诊断...................................................................................................64.2实验室诊断...............................................................................................75奶牛子宫内膜炎的治疗..................................................................................85.1子宫内给药治疗.......................................................................................85.2全身抗菌结合对症治疗...........................................................................95.3激素治疗.................................................................................................10 5.4中药治疗.................................................................................................105.5激光治疗.................................................................................................106本研究的目的和意义....................................................................................11第二部分试验部分..................................................................................................12第二章陇西县奶牛子宫内膜炎流行病学调查......................................................121材料和方法....................................................................................................121.1材料.........................................................................................................121.2方法.........................................................................................................122结果.................................................................................................................142.1奶牛养殖条件调查情况.........................................................................142.2奶牛子宫内膜炎发病情况......................................................................142.3不同季节奶牛子宫内膜炎发病情况.....................................................152.4各乡镇奶牛子宫内膜炎发病情况..........................................................162.5不同饲养方式下奶牛子宫内膜炎发病情况..........................................192.6不同年龄奶牛子宫内膜炎发病情况......................................................203讨论.................................................................................................................213.1陇西县奶牛饲养管理基本情况.............................................................213.2陇西县奶牛子宫内膜炎发病情况..........................................................214小结.................................................................................................................23第三章奶牛子宫内膜炎主要致病菌分离鉴定和药敏试验..................................241材料和方法.....................................................................................................241.1材料..........................................................................................................241.2方法..........................................................................................................252结果................................................................................................................262.1致病菌分离培养结果.............................................................................262.2分离菌株生化试验鉴定结果..................................................................282.3致病菌药敏试验结果..............................................................................303讨论................................................................................................................313.1致病菌分离、鉴定..................................................................................32 3.2药敏试验结果分析..................................................................................324小结................................................................................................................33第四章结论..........................................................................................................33参考文献......................................................................................................................35致谢..........................................................................................................................40个人简介......................................................................................................................41导师简介......................................................................................................................42独创性声明..................................................................................43学位论文版权认定和使用授权书..............................................44 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第一部分文献综述第一部分文献综述第一章奶牛子宫内膜炎研究进展子宫内膜炎（endometritis）是由细菌、病毒、营养等因素引起子宫内膜结构发生炎性改变的临床疾病，中兽医中将该病称为“带下症”[1]。奶牛子宫内膜炎是引起奶牛不孕症的主要病因之一，生产管理粗放的养殖场内具有很高的发病率，造成的经济损失也是不可估量的。1奶牛子宫内膜炎的病因奶牛一般在分娩后子宫内侵入病原微生物并长期无法正常排出时就会发生子宫内膜炎，得不到及时有效的治疗炎症范围则会不断扩散，逐渐转变为慢性炎症后极大的增加治疗难度，导致病牛长期不孕[2]。引发奶牛子宫内膜炎的主要病因为病原微生物，主要有以下几种。1.1细菌在整个妊娠期间所有健康动物的子宫内几乎都是无菌的，在分娩后阴门、阴道肌肉发生松弛，子宫颈扩张后病原微生物会侵入子宫内发生感染，而且妊娠后子宫内环境极易适合微生物生长，因此临床上有超过90%以上患子宫内膜炎的奶牛均可从子宫内分泌物、宫颈刮片等样品中分离出长期感染的细菌[3]。母牛在生产后的首次发情时可从子宫内排出大部分甚至全部的细菌，但是首次发情延迟导致细菌不能排出时就会造成细菌感染，从而引发子宫内膜炎的发生，尤其发生难产、流产、死胎、胎衣不下等情况的奶牛极易出现子宫迟缓、复旧延迟而引发子宫内膜炎[4]。有学者对临床上发生子宫内膜炎的病牛子宫分泌物进行病原学和病理学检查，发现可以从大多数采集的病样分离出葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌等条件致病菌[5]。采集产后1d的母牛阴道内流出的恶露进行检测，从分泌物中主要检出大肠埃希氏菌和化脓链球菌，如果奶牛子宫内膜炎的病程不断延长，可以从阴道排出的脓性分泌物中检出化脓菌，据此，大多数学者普遍认为大肠埃希氏菌、化脓链球菌是造成奶牛发生子宫内膜炎的主要病原菌，而链球菌则为正常阴道菌群成员，在一定条件下会感染致病[6]。国外研究提出除了上述致病菌外还从患病奶牛子宫内分离到假单胞菌、坏死杆菌、变形杆菌、嗜血杆菌等，但是在不同地区、不同季节引发奶牛子宫内膜炎的细菌种属以及各种细菌所占的比例存在1 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第一部分文献综述很大的差异[7,8]。1.2病毒根据文献资料显示，能够引发奶牛子宫内膜炎，造成流产、不孕临床症状的病毒主要有黄病毒科瘟病毒属的牛病毒性腹泻病毒（BovineViralDiarrheaVirus，BVDV）、牛传染性鼻气管炎病毒（Infectiousbovinerhinotracheitisvirus，IBRV）、牛副流感病毒3型（Bovineparainfluenzavirus3，BPIV3）以及牛疱疹病毒1型（Bovineherpesvirus1，BoHV-1）[9]。1.3真菌我国学者研究黑龙江东部一些发生子宫内膜炎的奶牛发现，除了常见的致病细菌外还分离出念珠菌等真菌性病原。此外，有报道称酵母菌和霉菌也是引发奶牛子宫内膜炎的病原菌，这些感染主要是由于真菌感染阴道后上行至子宫造成的[10]。1.4支原体目前有研究者已从奶牛生殖道中分离出一些支原体，不断有资料证实支原体能够引起奶牛子宫内膜炎、阴道炎、输卵管炎等疾病[11]。1.5其他病原体有文献资料显示毛滴虫等寄生虫可引发奶牛子宫内膜炎，除此之外阴道滴虫等寄生虫也可引发疾病，这些寄生虫通过内源性或外源性感染造成子宫内膜发生炎症[12]。2奶牛子宫内膜炎的诱发因素2.1子宫内膜损伤临床上发生子宫内膜炎的奶牛以产后和流产后多见，主要是由于母畜在分娩和生产后生殖道各个器官形态结构发生巨大改变，正常的生理功能受到一定的影响，如胎儿在分娩过程中对产道造成机械性损伤，尤其人工助产时造成的机械性损伤更为明显。在母牛分娩后，其子宫会发生正常生理性复原，该过程中子宫内膜对外界病原微生物的抵抗力明显降低，在妊娠期间作为母体胎盘的子宫内膜在分娩后会发生变性、分解、脱落，致使浅表子宫内膜形成较为广泛的损伤[13]。除2 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第一部分文献综述此之外，人为引产、粗暴助产、频繁进行人工授精等都能对子宫黏膜造成严重的损伤，对子宫的防御屏障产生破坏作用，引起炎症发生。有资料显示，由胎衣不下造成的奶牛子宫内膜炎占17%，助产引起的占16%，分娩感染占12%[14]。2.2胎衣不下临床上奶牛产后由胎衣不下继发子宫内膜炎的病例占42.7%~71.5%。奶牛产生胎衣不下主要是由于在生产后机体内能量下降，子宫发生微弱阵缩引起的。奶牛的胎盘结构属于上皮绒毛膜和韧带绒毛膜混合型，胎儿的胎盘和母体胎盘之间的联系十分紧密，因此在生产过程中常见奶牛产后胎衣不下的病例[15]。如果母牛在妊娠期间感染病原微生物就会出现子宫内膜炎和胎盘炎，并表现一定的临床症状，严重者发生流产或死胎，在这种病理状况下子宫内膜发生大量结缔组织增生，此时胎儿胎盘和母体胎盘之间的病理性粘连更为紧密，这种牛在生产后就会发生胎衣不下[16]。滞留的胎衣在很短时间内发生腐败分解，也为外源性病原微生物的侵入和生长创造良好的环境，从而引起急性子宫内膜炎。2.3机体内分泌有研究资料显示，奶牛子宫的感染程度以及临床症状表现的严重情况与奶牛机体内激素代谢水平有直接的关系，其中雌激素能够有效地阻止子宫内感染。主要原因是雌激素能够提高子宫的紧张度，促进黏液分泌，其次可增强中性粒细胞的功能；孕酮水平维持时间过长会促使感染发生，可以将孕酮作为促进子宫内膜炎发生的影响因素，奶牛产后发生子宫内膜炎后会对卵泡的正常发育和排卵造成抑制[17]。在对产后1~3周内发生子宫内膜炎或子宫复旧缓慢的奶牛体内内分泌激素水平进行研究发现，该类病牛体内的前列腺素2α（Prostaglandins，PGF-2α）及其代谢产物长时间内维持在一个较高的水平，而孕酮与PGF-2α的水平存在相关性[18]。2.4营养状况奶牛妊娠后日粮营养价值不全，缺乏维生素、微量元素、矿物质，或者各种微量元素的比例失调后均会降低奶牛机体的降低力，容易引发疾病。已经有文献证实，钴、镁、锰等微量元素的缺乏容易提高奶牛胎衣不下和子宫内膜炎的发生率。但是，如果奶牛产前营养过剩会造成产前奶牛肥胖综合症（fatcowsyndrome，3 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第一部分文献综述FCS），也会对奶牛的繁殖效率造成一定的影响，发生肥胖综合症的奶牛出现难产、乳房炎、胎衣不下、酮病和子宫炎的几率明显提高；而产前奶牛膘情太差也会增加上述疾病的发生[19]。国外有文献资料报道，奶牛摄入日粮中蛋白质的含量偏少，在产后40d时发生子宫感染性疾病的几率明显要高于日粮正常的奶牛[20]；对产后奶牛的体况进行评分，体型偏瘦的奶牛在产后20d内发生子宫内膜炎的几率偏高[21]。2.5季节奶牛子宫内膜炎的发生与奶牛分娩的月份有直接的关系，一般在5—10月份发病率较高，在国内该病发病率平均为51.9%；而其余月份发病率则较低，为35.4%。也有文献报道春季发病率最高，达64.4%，秋季最低为19.2%[22]。由诸多文献可以看出，奶牛子宫内膜炎的发生与季节存在明显的关系，但是哪个季节发病率较高，不同文献存在很大的差异，由此可见，该病的发病率与地区、奶牛场养殖情况有关。2.6其他除上述影响因素之外，奶牛养殖场环境、饲养管理方式、抗生素使用不规范、奶牛其他疾病等都与子宫内膜炎的发生有很大的相关性。尤其在农村散养的模式下，饲养管理粗放，饲料成分单一，奶牛的体况差，抗病能力降低后发病率升高；此外牛舍、产房的环境脏乱差，细菌污染严重，产后奶牛阴门松弛，卧地时黏膜翻出体外接触地面或者摇摆尾巴时污物触及阴门等均可造成上行性感染，而引发子宫内膜炎[23]。3奶牛子宫内膜炎的临床症状根据奶牛子宫内膜炎在临床的表现和病程发展情况，可将其分为急性和慢性两种类型。3.1奶牛急性子宫内膜炎临床上根据病变类型可分为卡他性、脓性卡他性、纤维素性和坏死性子宫内膜炎四种类型。3.1.1急性卡他性或脓性卡他性子宫内膜炎常见于分娩或流产后10d内的奶牛，病初为卡他性炎症，治疗不及时转为4 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第一部分文献综述脓性卡他性，病牛体温升高至40.0~41.4℃，食欲不振或废绝，产奶量降低，出现拱背怒责，阴门中排出灰褐色黏液性或脓性带有腐臭味的分泌物，随着病程延长，分泌物逐渐变为灰白色；阴道检查发现病牛的阴道、子宫颈口黏膜明显充血、肿胀，子宫颈稍微开张，有炎性分泌物附着或流出，阴道底部蓄积有大量黏稠性分泌物；直肠检查发现子宫角比正常奶牛的大，触诊有明显的疼痛感，收缩反应微弱[24]。3.1.2急性纤维蛋白性子宫内膜炎病牛经常出现怒责、情绪不安，从阴门中排出黄棕色伴有灰白色组织碎片的分泌物。这种病牛的全身症状较为明显，出现高温、食欲下降、反刍消失、产奶量大量降低的症状；阴道检查发现阴道、子宫颈外口黏膜充血肿胀，不时有炎性分泌物排出体外；直肠检查子见宫壁变厚，触诊痛感十分明显[25]。3.1.3坏死性子宫内膜炎病牛临床表现十分明显，阴唇发紫，从阴门中流出黑褐色分泌物，有恶臭，内含腐败分解的组织碎片，病牛体温升高，精神委顿，食欲废绝，泌乳量急剧减少或彻底停止；阴道检查见阴道、子宫颈口的黏膜十分干燥并呈暗红色，直肠检查可见子宫角增大，子宫壁增厚、质地变硬，触诊痛感十分明显[26]。3.2奶牛慢性子宫内膜炎3.2.1隐性子宫内膜炎奶牛发病后无明显的临床症状，发情周期正常，但是多次配种后仍不见母牛受孕，阴道检查子宫形态正常，临床上有少数的病牛在发情期间阴道排出的黏液量增多，其中会伴有少许混浊的絮状物。3.2.2慢性卡他性子宫内膜炎该种类型的病牛临床表现为性周期、发情期和排卵正常，但是屡配不孕，或者受孕后的奶牛频发流产，病牛的阴道内有少量混浊的黏液发生聚集，发情时流出，黏液中往往混有絮状物；阴道检查宫颈口张开比较明显，子宫颈、阴道等部位出现明显的肿胀、充血；在直肠检查时发现子宫角增粗，子宫壁异常肥厚且弹性降低，子宫收缩十分微弱。在疾病进展过程中子宫颈口紧闭更容易造成炎性分泌物大量蓄积，从而引发子宫积水，直肠检查见子宫角出现明显的波动感[27]。3.2.3慢性脓性子宫内膜炎5 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第一部分文献综述该类病牛的发情周期和性周期不规律，严重者甚至不发情，阴道内排出大量灰白色、黄褐色脓性分泌物，有明显的恶臭味，尤其在病牛卧地后排出的量会异常增多；在直肠检查时发现子宫角异常肥大，子宫壁薄厚分布不均匀，同时子宫的收缩反应变微弱，宫颈口和阴道明显充血肿胀并贮留大量脓性分泌物。3.2.4慢性卡他性脓性子宫内膜炎该类病牛的性周期紊乱，发情紊乱或持续发情，排出灰白色、黄褐色稀薄的脓液，外观阴户和尾根部有黏液和脓性分泌物的干痂，病牛精神不振，食欲减退，前胃迟缓，部分病牛体温升高。阴道检查发现子宫颈和阴道黏膜充血肿胀，附着有黏稠脓性分泌物；直肠检查见子宫角增大，子宫壁厚薄、软硬不均；子宫颈紧闭后大量脓性分泌物会蓄积在子宫内，引起子宫积脓，触诊时波动感较为轻微，收缩反应微弱，并在卵巢上检查到持久黄体。4奶牛子宫内膜炎的诊断4.1临床诊断根据病牛阴道内流出大量黏粘性分泌物，结合发情周期变化和黏液的性质做出初步诊断，如流出大量稀薄如蛋清样黏液可视为卡他性炎，如果黏液量少、浓稠如浓痰状可视为脓性炎；除了病牛表现的临床症状，可结合阴道检查和直肠检查来确定子宫、阴道有无炎症变化、是否肿胀、质地以及疼痛反应。健康奶牛在休情期，检查其子宫角，呈明显的香肠样，发情期间会变粗、变软、充实且富有弹性，如果奶牛发生子宫内膜炎，检查时发现子宫角的体积异常增大，充实度明显降低且有松弛感，疼痛反应也比较明显；在发情期生殖器官均处在充血水肿的状态，子宫角柔软松弛有波动感[28]。在临床诊断的过程中还可以通过带长臂手套无菌操作掏取阴道分泌物，在自然光照射下观察阴道黏液的变化情况并定性，如果能借助内窥镜检查能够直接的了解到子宫颈和阴道内分泌物的特点，诊断的准确率更高，但是没有直肠检查广泛[29]。但是在实际操作过程中直肠检查和阴道检查的准确度与兽医人员的操作熟练程度和掌握不同时间子宫正常状态经验有很大的相关性，极易出现误诊，同时不能说明子宫的正常卷曲和病牛的繁殖性能。6 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第一部分文献综述4.2实验室诊断4.2.1分泌黏液白细胞检查根据病牛的临床表现做出初诊后进行实验室诊断。采集奶牛发情期阴道分泌物涂片后用95%酒精固定，姬姆萨染色后显微镜下进行白细胞计数，观察100个视野，计算白细胞的数量，判断奶牛是否患病以及严重程度。结果判定：白细胞数＜10个判为阴性（－），11~30个判为（+），31~80判为（++），81~150判为（+++），＞150判为（++++）[30]。4.2.2精液生物学诊断将两滴解冻的精液分开滴加在38℃的载玻片上，其中1滴中滴加等量母牛子宫、阴道分泌黏液，再盖干净的盖玻片后显微镜下观察，如果滴加了黏液后精液中精子在逐渐失去运动性或者彻底发生凝集则判断为子宫内膜炎阳性（+）。4.2.3子宫内膜活检刮取子宫内膜镜检，标本上出现淋巴样细胞凝集，上皮细胞正常，上皮下聚集大量中性白细胞，血管扩张，子宫腺体萎缩的病例判为阳性。4.2.4恶露检查尿兰母收集2mL产后奶牛的恶露置入试管后加入0.5mL硝酸，将试管放入沸水中煮沸1~2min，待冷却后加入1.5mL33%氢氧化钠，混匀后进行判定：液体呈黄绿色则判为阳性（+），呈琥珀色则判为卡他性炎症（++），呈橙黄色判为脓性卡他性炎症（+++），如果试管内的液体颜色不变则判为阴性（—）[31]。也可适应精密pH试纸检查子宫内分泌物，pH在7.5~8.5之间则判为阳性（+），＜7则判为阴性（—），临床上这种检查方法多用于脓性卡他性炎症的诊断。4.2.5含硫氨基酸诊断将4mL0.5%醋酸铅溶液加入试管后，再滴加14滴20%氢氧化钠溶液和1.0~1.5mL的子宫内分泌物，轻轻摇晃试管至溶液混匀，用酒精灯加热3min（注意不要使试管内液体沸腾），如果试管内液体变为深褐色或黑色时即可确定该奶牛子宫内分泌物中含有含硫氨基酸，确诊为子宫内膜炎阳性，这种检测方法操作简单，快速，结果准确率较高[32]。4.2.6硝酸银法7 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第一部分文献综述发生子宫内膜炎的奶牛子宫壁中肥大细胞的数量会明显增多，该细胞主要作用是产生组织胺，因此可以通过对奶牛尿液中的胺进行检测，从而确诊本病。具体操作为采集2mL尿液+1mL5%硝酸银水溶液置于试管内，在酒精灯上加热煮沸2min后观察结果，如果上述混合液中出现沉淀且颜色逐渐变黑判为阳性，如果沉淀颜色呈褐色甚至更浅则判为阴性，该种检测方法可用于批量样品检验。5奶牛子宫内膜炎的治疗临床治疗奶牛子宫内膜炎时首先要考虑抗菌消炎、保护子宫黏膜和增强机体防御功能，其次尽早排出宫腔内残存的病理产物，促进子宫、阴道受损黏膜的修复，如果病牛出现全身症状的要给予解热镇痛、缓解酸中毒等对症治疗方案。5.1子宫内给药治疗5.1.1消毒防腐药物冲洗子宫使用大量的生理盐水、消毒防腐药物灌入子宫，在较短的时间内再导出的方法对子宫进行冲洗，该种方法治疗的主要目的是使子宫内的病理产物、细菌、细菌产生的毒素进行物理性清除。但是过量使用消毒药物会对子宫壁造成不可逆的化学性损伤刺激作用，对子宫上皮的抵抗力和防御机能都产生负面影响，子宫紧张度也会降低引发子宫迟缓，因此，临床选择该种治疗方案时要根据患病奶牛的具体病情制定相应的治疗方案[5]。常用的子宫冲洗液有0.05%双氯苯双胍己烷或0.05%苯扎溴铵，2%等量苏打氯化钠溶液，3%~10%高渗盐水等。在冲洗子宫时必经的部位是子宫颈，一般选择在发情期间进行冲洗，会避免在休情期强行插管造成子宫口人为损伤。5.1.2抗微生物药物灌注子宫向子宫内灌注抗菌药物、激素、收敛剂等治疗子宫内膜炎，但是经过长达几十年的治疗后，该方法治疗存在争议，有资料显示，子宫灌注抗生素治疗子宫内膜炎对病牛的繁殖力无提高作用，反而在病牛的乳汁中检出抗生素残留，这种乳汁不能食用，只能废弃，造成极大的经济损失。还有学者提出，某些抗生素会对吞噬细胞的功能造成干扰，会对子宫内膜造成刺激作用[33]。目前子宫内灌注抗生素仍是广泛使用于临床的一种方法，主要是抗生素会对子宫内存在的细菌造成抑制和杀灭作用。常用的灌注药物有40万IU青霉素+1g链霉素溶于50~100mL生理盐水中进行灌注，1次/d，连续使用3~4d；也可使用乳酸环丙沙星，使用生8 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第一部分文献综述理盐水稀释至5g/L，每次灌注50mL，间隔24h投药1次，连用3次后对慢性子宫内膜炎的治愈率均超过70%以上[34]。在临床上不考虑奶牛乳汁中抗生素残留的情况下使用该种治疗方法均能取得较好的治疗效果，但是在使用过程中要交叉使用抗生素以防细菌产生耐药性，在条件允许的情况下采集母牛阴道分泌物进行细菌分离、鉴定，根据药敏试验结果选择致病菌最敏感的药物进行临床治疗，这样会缩短疗程，提高治愈率，降低治疗成本[35]。5.1.3生物制剂灌注子宫随着临床兽医学的不断发展，生物制剂逐渐替代抗微生物药物用于临床治疗中，生物制剂具有抗菌谱广，可抑杀多种病原菌，与此同时还能提高子宫的自然防御技能，对各种症型的病牛均有理想的疗效。有资料显示，使用10~40万IU/次剂量的溶菌酶治疗奶牛子宫内膜炎，间隔5~7d用药1次，连续治疗3次为1个疗程，治疗后奶牛的治愈率和受胎率均明显高于使用金霉素治疗的病牛群，而且治愈后奶牛产后至初配的时间也比较短[36]。此外利用表面活性剂、免疫调节剂、微生物细胞酶等研制出的高免血清、大肠埃希氏菌脂多糖等均可用于临床治疗。5.1.4药丸或栓剂填塞子宫将药物做成丸剂或栓剂从子宫颈塞入子宫的治疗方法被称为子宫填塞法，这个方法用药体积小，对子宫产生的物理损伤比较小。使用甘油明胶作为基质制成的洗必泰栓剂2~3枚放在10~15mL蒸馏水中加热融化后塞入阴道深部和子宫体内，1次/d，治疗1~3d后即可痊愈，治疗效果较为显著，但是在临床治疗过程中要注意避免该药物与肥皂、碱性药物同时使用，也不能与碘酊、高锰酸钾等药物同时使用[37]。5.2全身抗菌结合对症治疗静脉或肌内注射抗微生物药物，结合解热镇痛、强心利尿和补液等对症治疗的措施，这种治疗方案适用于感染严重、全身症状比较明显或继发其他感染的奶牛子宫内膜炎病例。感染严重的病牛全身症状比较明显，此时病原微生物已经冲破子宫进入血液循环，因此要使用抗生素进行全身治疗，但是牛的体重较大，全身使用抗生素的剂量也大，这样会在产出的乳奶中造成抗微生物药物残留，这种乳必须废弃，因此造成的经济损失也是不可估量的。因此，在实际生产中对于发9 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第一部分文献综述生子宫内膜炎的奶牛，只有在最严重时才使用该种治疗方案[38]。在条件允许的情况下，临床治疗前最好先采集子宫分泌物进行相关的细菌分离、鉴定和药敏试验，选择病原微生物敏感的抗生素进行治疗，这样就能用最少剂量的药物达到最佳的治疗效果，降低抗微生物药物残留[39]。在全身治疗的同时可使用催产素、麦角新碱、氨甲酰胆碱等药物活化子宫，如果病牛临床仍表现出体温升高、停止反刍时还需进行解热、补液、缓解酸中毒和促进瘤胃蠕动等对症疗法。5.3激素治疗使用激素类药物治疗奶牛子宫内膜炎，激素会在一定程度上促进子宫的收缩作用，从而增强子宫抵御细菌感染的能力，正常情况下，奶牛在发情期间子宫抗感染的能力相对较强。如雌激素能够提高子宫的紧张度，促进子宫分泌、排出黏液，同时增加中性粒细胞的数量和功能，有效的促进子宫排出异物，治疗慢性子宫内膜炎效果较好。目前临床常用的激素类药物有雌二醇，氯前列烯醇等前列腺素及其类似物，临床使用上述药物后会促使母牛进入发情期，从而提高子宫的血液供应。有研究证实，在子宫内膜炎患病奶牛产后31d和50d注射前列腺素会将下次配种时间减少24d，使用抗生素治疗的奶牛只减少10d[40]。5.4中药治疗临床上使用抗生素和激素治疗子宫内膜炎虽然能够取得一定的治疗效果，但是在治疗过程中药物会在牛奶中产生残留，而且不规范使用抗微生物药物会使病原菌产生耐药性，影响临床治疗疾病的效果[41]。近年来中草药治疗奶牛子宫内膜炎的研究不断增多和深入，中药均为纯天然产物，临床使用后不会造成残留、合理使用对奶牛机体也无明显的刺激性，针对奶牛子宫内膜炎使用的药物具有清热解毒、抗菌消炎、祛腐排脓作用。目前临床使用的研究较为成熟的方剂有促孕灌注液、清宫液、清宫消炎混悬剂、速效宫必治等方剂，治疗奶牛子宫内膜炎的治愈率均达到90.0%以上，同时能够提高治疗奶牛血清中的免疫球蛋白和吞噬细胞的数量[42]。5.5激光治疗20世纪80年代初，我国兽医研究者使用激光穴位照射法治疗奶牛子宫疾病10 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第一部分文献综述引起的临床不孕症，获得了一定的治疗效果。之后俄罗斯专家将激光疗法用于奶牛子宫内膜炎的临床治疗中，选择10~2000Hz的频率、0.1~5W、870~970nm波长的激光直肠照射6~8次后获得较好的治疗效果，奶牛的治愈率高达62.2%，激光治疗的同时配合药物治疗治愈率会更高[43]。6本研究的目的和意义奶牛子宫内膜炎是引起奶牛不孕症的常见产科疾病，具有发病率高、病程长、治疗难的特点，奶牛发病后不仅影响繁殖还会降低产奶量和奶的品质，严重威胁奶牛产业的健康发展，同时造成巨大的经济损失。本研究对陇西县内奶牛养殖场和散养户养殖情况进行全面调查研究，了解当地奶牛子宫内膜炎流行病学特征，并分离和鉴定引起该地区奶牛子宫内膜炎的主要致病菌，筛选出分离的优异菌株进行药物敏感试验，了解致病菌的耐药情况，为临床治疗本病提供科学依据。11 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分第二部分试验部分第二章陇西县奶牛子宫内膜炎流行病学调查近年来陇西县奶牛产业得到了较好的发展，奶牛的养殖数量也不断增加，截至2017年6月全县奶牛存栏量达到3000头以上，但是在养殖过程中存在饲养管理水平低下、养殖水平不高的粗放饲养模式，导致奶牛疾病频繁发生，尤其是奶牛子宫内膜炎，是临床上常见的产科疾病，发病率呈逐年上升的趋势，奶牛发病后病程较长，治疗存在较大的难度，患病奶牛屡配不孕，同时对奶牛产奶量和奶的品质产生严重影响，对奶牛产业发展造成巨大的经济损失。本研究对陇西县内的奶牛进行子宫内膜炎的流行病学调查，旨在摸清该病的在辖区内的发病规律，为制定综合性防治计划提供理论依据。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物将散养户和养殖场生产后1d~90d的奶牛作为试验动物。1.1.2采样地点在陇西县存在奶牛养殖的巩昌镇、文峰镇、首阳镇、菜子镇、云田镇、通安驿镇、渭阳乡、双泉乡、柯寨镇、宏伟乡、和平乡和碧岩镇等12个乡（镇）进行调查。1.1.3药品和试剂吉姆萨染色剂、冻精。1.1.4仪器和设备长臂手套、显微镜、改良牛鲍计数版、试管、吸管、微量吸管、吸头等。1.1.5资料来源奶牛养殖情况调查的相关资料来自陇西县畜牧兽医技术服务中心。1.2方法1.2.1奶牛养殖情况调查①调查奶牛养殖的情况主要调查奶牛养殖圈舍的地理位置、环境卫生状况、牛体外表清洁程度、养12 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分殖粪便和污水处理情况以及消毒制度合理程度。同时记录奶牛的品种、体况和生产状况。②调查奶牛养殖的饲养管理水平观察奶牛养殖的模式（集约化饲养、粗放饲养），养殖管理制度的完善程度；调查奶牛饲料种类以及营养配比是否合理科学，饮水是否清洁卫生。③调查奶牛养殖过程中兽医技术力量观察奶牛养殖场中是否配有专职的兽医和配种技术人员，兽医室、人工授精室的相关硬件设施、设备是否齐全，有无良好的消毒设备和配种设备，并查阅养殖场内的配种记录、奶牛生产记录、繁殖记录和对子宫的处理记录。④调查奶牛子宫内膜炎的发生规律调查辖区内奶牛子宫内膜炎的发生率与季节、乡镇、饲养管理方式、年龄之间的关系。1.2.2抽样方案从2016年1月1日—2016年12月31日期间，在每月最后1天对存在奶牛养殖的12个乡（镇）进行一次奶牛抽样，每个乡镇每次随机选取2~8岁的分娩奶牛10头进行临床诊断和实验室诊断，共抽检1440头产后奶牛，对各乡镇奶牛子宫内膜炎的发病情况进行调查。1.2.3奶牛子宫内膜炎临床诊断根据奶牛临床症状和直肠检查做出初步诊断，确诊需要取样进行实验室检查。①临床症状询问养殖户奶牛生产后各项生命体征变化情况以及临床表现异常的症状，观察奶牛阴道分泌物的性状，如果实验奶牛从奶牛阴道内流出大量粘性分泌物，结合发情周期和粘液性质做出初步诊断，如果流出的粘液量大、稀薄呈蛋清状，奶牛在正常发情期间不发情、屡配不孕则初步判断为卡他性子宫内膜炎；如果流出的粘液量少且浓稠如浓痰状，不发情或持续发情，屡配不孕判为脓性子宫内膜炎。②直肠检查将受检奶牛保定在六柱栏内，检查者戴好无菌塑料长臂手套，站在牛的正后方，为奶牛的肛门周围涂布润滑剂抚摸肛门，使奶牛安静下来，检查者将大拇指13 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分放在掌心，其余四指并拢聚成圆锥状，稍旋转前伸通过肛门插入直肠，手臂进入肛门后如有粪便可用手指扩张肛门，将空气经由手指缝进入直肠内促使宿粪排出，手臂继续向内延伸先摸到子宫颈，再将中指向前滑动寻找角间沟，再将手向前、向后、再向后试将两个子宫角都掌握在受内进行触摸。如果奶牛发生子宫内膜炎，在休情期奶牛的子宫角体积会异常增大，充实度降低，有松弛感，触之疼痛；发情期子宫角柔软松弛，有波动感，疼痛反应比较明显，但是这种诊断方法需要兽医人员具备丰富的临床经验和专业的产科知识。1.2.4实验室诊断①黏液白细胞检查采集发情奶牛的子宫颈口黏液，涂片后用95%酒精固定，姬姆萨染色后在10×显微镜下进行白细胞计数，根据白细胞的数量判断奶牛是否发生子宫内膜炎以及其严重程度，观察100个视野后根据白细胞的数量判断奶牛是否患病以及严重程度。结果判定：检查白细胞数＜10个判为阴性（－），11~30个判为（+），31~80判为（++），81~150判为（+++），＞150判为（++++）。该种检查方法使用于隐性和临床型炎症的早期诊断。②精液生物学诊断：将两滴解冻的精液分开滴加在38℃的载玻片上，其中1滴中滴加等量母牛子宫、阴道分泌黏液，再盖干净的盖玻片后显微镜下观察。结果判定：如果滴加了黏液后精液中精子在逐渐失去运动性或者彻底发生凝集，判断为子宫内膜炎阳性（+）。1.2.5统计学方法使用软件SPSS19.0对获得的数据进行统计学分析处理，计数资料和计量资料分别以百分率（%）表示，组间比较使用x2检验，P＜0.05为表示差异具有统计学意义。2结果2.1奶牛子宫内膜炎发病情况在2016年1月—2016年12月间对陇西县12个乡（镇）的奶牛进行抽检，每个乡（镇）每月抽检10头，此次调查共抽检1440头，经临床诊断结合实验室检查确诊发生奶牛子宫内膜炎的有183头，发病率为12.71%，各乡（镇）发14 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分病情况详见表2-1。表2-1各乡（镇）奶牛子宫内膜炎发生情况（头）Tab.2-1Theoccurrenceofendometritisinvarioustownship(town)cows项月份合目乡镇123456789101112计巩昌镇32312322122124文峰镇21221312222323首阳镇11102121102214菜子镇22111222212220云田镇22020110121214通安镇12211022012115发病头数渭阳乡11011212111214双泉乡11212111211115柯寨镇11111011121213宏伟乡10100231111011和平乡1101111100119碧岩镇12100022110111合计1716141112161917131416181832.3不同季节奶牛子宫内膜炎发病情况调查结果显示从2016年1月-2016年12月期间不同月份奶牛子宫内膜炎发病率存在差异，其中5月份最低为10.00%（12/120），7月最高为15.83%（19/120），不同月份发病率比较差异不显著（x2=1.568，P＞0.05），详见表2-2。表2-2不同季节奶牛子宫内膜炎发生情况Tab.2-2Theoccurrenceofendometritisinvarioustownship(town)cows月份1月2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月发病数171614111216191713141618（头）15 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分发病率（%）14.1713.3311.679.1710.0013.3315.8314.1710.8311.6713.3315.00将调查期间每个月奶牛子宫内膜炎发病率制成折线图，发现从1月~4月逐渐降低，到4月份全年最低，从5~7月又逐渐升高，7月达到最高状态，之后又逐渐降低从折线图观察，陇西县奶牛子宫内膜炎发病率呈现一种“W型”的分布（图2-1）。图2-12016年奶牛子宫内膜炎平均发病率月份分布图Fig.2-1TheMonthlyDistributionofEndometritisinDairyCow2.4各乡镇奶牛子宫内膜炎发病情况调查结果显示，各乡镇不同月份奶牛子宫内膜炎检出率在0.00%（0/10）~30.00%（3/10）之间，详见表2-3。表2-3不同季节各乡镇奶牛子宫内膜炎发生情况（%）Tab.2-3Theoccurrenceofendometritisinvarioustownship(town)cows1月2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月巩昌镇30.0020.0030.0010.020.0030.0020.0020.0010.0020.0020.0010.00文峰镇20.0010.0020.0020.0010.0030.0010.0020.0020.0020.0020.0030.00首阳镇10.0010.0010.000.0020.0010.0020.0010.0010.000.0020.0020.00菜子镇20.0020.0010.0010.0010.0020.0020.0020.0020.0010.0020.0020.00云田镇20.0020.000.0020.000.0010.0010.000.0010.0020.0010.0020.0016 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分通安镇10.0020.0020.0010.0010.000.0020.0020.000.0010.0020.0010.00渭阳乡10.0010.000.0010.0010.0020.0010.0020.0010.0010.0010.0020.00双泉乡10.0010.0020.0010.0020.0010.0010.0010.0020.0010.0010.0010.00柯寨镇10.0010.0010.0010.0010.000.0010.0010.0010.0020.0010.0020.00宏伟乡10.000.0010.000.000.0020.0030.0010.0010.0010.0010.0.00和平乡10.0010.000.0010.0010.0010.0010.0010.000.000.0010.0010.00碧岩镇10.0020.0010.000.000.000.0020.0020.0010.0010.000.0010.00将每个乡镇不同月份奶牛子宫内膜炎发病率制作折线图观察，养殖量较少的宏伟乡、和平乡、碧岩镇有几个月的调查中奶牛子宫内膜炎的发病率为0.00%，发病率最高的基本处在1月、3月、12月，为30.00%（图2-2）。图2-2不同乡镇奶牛子宫内膜炎发病率月份分布图Fig.2-2Monthlydistributionofendometritisincidenceindairycowsofdifferenttownships调查结果显示，陇西县不同乡镇奶牛子宫内膜炎的发病率存在差异（x2=4.135，P＜0.05），其中养殖量较大的巩昌镇和文峰镇发病率最高分别为20.00%和19.17%，养殖量较少的宏伟乡、和平乡和碧岩镇发病率较低，分别为9.17%、7.50%和9.17%，详见表2-4。17 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分表2-4不同乡镇奶牛子宫内膜炎发病情况Tab.2-4Theincidenceofendometritisindifferenttownship(town)dairycows乡镇试验奶牛数(头）发病(头）发病率（%）巩昌镇1202420.00%文峰镇1202319.17%首阳镇1201411.67%菜子镇1202016.67%云田镇1201411.67%通安镇1201512.50%渭阳乡1201411.67%双泉乡1201512.50%柯寨镇1201310.83%宏伟乡120119.17%和平乡12097.50%碧岩镇120119.17%合计144018312.71%各乡镇2016年度奶牛子宫内膜炎发病情况（图2-3）。图2-3不同乡镇奶牛子宫内膜炎发病率分布图Fig.2-3TheIncidenceofEndometritisinDifferentTownDairyCows18 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分2.5不同饲养方式下奶牛子宫内膜炎发病情况调查结果显示，存栏超过60头以上的养殖场奶牛子宫内膜炎发生率为8.91%，明显低于散养户13.52%（x2=3.468，P＜0.05）（表2-5）。表2-5不同饲养方式奶牛子宫内膜炎发生情况Tab.2-5OccurrenceofEndometritisinDairyCowswithDifferentFeeding养殖场集约化管理散养户粗放管理乡镇发病头数（头）发病率（%）发病头数（头）发病率（%）巩昌镇86.671613.33文峰镇108.331310.83首阳镇00.001411.67菜子镇54.171512.50云田镇00.001411.67通安镇00.001512.50渭阳乡00.001411.67双泉乡00.001512.50柯寨镇00.001310.83宏伟乡00.00119.17和平乡00.0097.50碧岩镇00.00119.17合计233.061839.65不同乡镇集约化管理养殖场饲养与农村散养户奶牛子宫内膜炎发病率对比情况（图2-4）。19 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分图2-4不同饲养管理模式与奶牛子宫内膜炎发病率的关系Fig.2-4TheRelationshipbetweenDifferentFeedingandManagementPatternsandIncidenceofDairyCowEndometritis2.6不同年龄奶牛子宫内膜炎发病情况调查结果显示，4岁奶牛子宫内膜炎发病率最低为6.68%（25/374），8岁奶牛子宫内膜炎发病率最高为21.43%（12/56），各年龄阶段奶牛子宫内膜炎发病率比较差异具有统计学意义（x2=5.671，P＜0.05），详见表2-6。表2-6奶牛子宫内膜炎发病率与奶牛年龄的关系Tab.2-6Therelationshipbetweentheincidenceofendometritisandtheageofdairycows年龄（岁）2345678合计奶牛数（头）21528637426515391561440发病数（头）32382536231712183发病率（%）14.8813.296.6813.5815.0318.6821.4312.71根据不同年龄奶牛子宫内膜炎发生率的点状图显示，4岁奶牛发病率最低，为6.68%，之后随着年龄增大或减小奶牛子宫内膜炎的发生率均逐渐增加，其中8岁奶牛的发病率最高为21.43%，走势图呈“V”型（图2-5）。20 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分图2-5不同年龄与奶牛子宫内膜炎发病率的关系Fig.2-5TheRelationshipbetweenageandmorbidityofendometritisindairycows3讨论3.1陇西县奶牛饲养管理基本情况此次调查结果显示，陇西县奶牛养殖存栏超过100头的养殖场有两个，为天力元乳业有限责任公司和陇西罗记乳业食品有限公司，其余两个小型养殖场存栏超过60头，其余均为散养户，这些养殖户养殖环境差、饲养管理方式粗放落后，饲料品质参差不齐、变动较大，养殖过程中无专业的兽医技术支撑，奶牛品种退化相当严重，但是这种环境下养殖的奶牛运动量大、光照强，接近于自然生长的状态。养殖场采用集约化管理的饲养方式，养殖条件比较好，饲料配方科学合理，具有强大的兽医技术和人工授精技术支撑，引进优良品种较多，但是这种情况下饲养的奶牛密度较大，缺乏运动。根据调查结果总结，要想健康稳定的发展陇西县奶牛养殖产业，不能只增加养殖的数量，必须要从改善养殖环境，增强疫病防控措施，提高奶牛产量，降低抗生素残留，调动养殖户的积极性，提高养殖质量，促进全县奶牛养殖业稳健发展。3.2陇西县奶牛子宫内膜炎发病情况我国学者瞿自明等人在20世纪80年代初期对全国16个大、中城市的41个奶牛场共计万头适龄母牛进行流行病学调查研究，结果显示，奶牛子宫内膜炎的发病率高达69.34%[44]；而国外多数资料显示，奶牛子宫内膜炎的发病率在20%~40%之间；杜光波对淮安地区调查发现辖区内奶牛子宫内膜炎的发病率为21 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分34.6%，靳光对山西省各大奶牛养殖场进行调查发现子宫内膜炎发病率为15.6%，张磊对山东省不同地市的十个大型奶牛场进行调查研究，发病率约在35~55%之间。本研究调查显示，陇西县奶牛子宫内膜炎发病率为12.71%，相对于奶牛养殖业发达的地区来说该发病率较低，主要可能是目前陇西县奶牛养殖业处于发展的起步阶段，奶牛养殖数量比周边定西市临洮县、安定区的低，本地兽医部门加强奶牛养殖的监管，基层兽医对于出现疑似子宫内膜炎的病牛能及时给予相应的治疗，阻碍了疾病的进一步发展和恶化。3.2.1奶牛子宫内膜炎发病率与季节的关系王建良等报道，江苏地区奶牛子宫内膜炎高发时期主要集中在6~9月间，与其他月份相比发病率存在显著的差异[45]；谷新利提出奶牛的子宫内膜炎在春季发病率最高，秋季最低，冬春两季的发病率约为夏秋季节的3倍之多；吴明楼等报道奶牛子宫内膜炎发病率的高低与奶牛分娩的时间存在明显的相关性，5~10月份发病率较高[12]。本次调查结果显示，从12月到第二年3月间、5~7月间奶牛子宫内膜炎具有较高的发病率，4月份为全年发病率最低的时间，从发病率的走势图观察，陇西县奶牛子宫内膜炎的发病率按照月份呈“W”型，这一调查结果与上述诸多文献资料显示的数据有所不同，可能与奶牛养殖地区、养殖环境、饲养管理模式等诸多综合因素有关。3.2.2奶牛子宫内膜炎发病率与乡镇的关系本次调查结果显示，陇西县存在奶牛养殖的不同乡镇，奶牛子宫内膜炎发生率有一定的差异（x2=4.135，P＜0.05），其中，巩昌镇发病率为20.00%，文峰镇19.17%，为全县最高，养殖量较少的宏伟乡、和平乡和碧岩镇相对较低，主要为9.17%、7.50%和9.17%，发生这种小范围的乡镇差异可能是由于陇西县的奶牛散养户主要集中在巩昌镇和文峰镇，散养户对于安全、健康养殖的意识不高，养殖环境差，甚至部分养殖户为奶牛饲喂土造的井用水引起的。3.2.3奶牛子宫内膜炎发病率与饲养管理模式的关系本次调查结果显示，存栏超过60头养殖场的奶牛子宫内膜炎的平均发生率为8.91%，明显低于散养户13.52%，由此证实良好的养殖环境、科学的饲养管理模式和饲料配方以及专业的兽医技术、消毒设备和良好的生产习惯会明显的降低奶牛子宫内膜炎的发生率。22 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分3.2.4奶牛子宫内膜炎发病率与年龄的关系有资料显示，初产奶牛相较于2~4胎次奶牛来说发生子宫内膜炎的几率更高，可能于初产奶牛死胎、难产和助产率有关，随着年龄的增长发病率会进一步升高。本次调查中陇西县4~8岁的奶牛随着年龄的增加子宫内膜炎的发病率也逐渐增加，其中8岁奶牛发病率最高，该调查结果与文献报道一致[46]。2~4岁的奶牛随着年龄的增加发病率却逐渐降低，可能与该年龄阶段的奶牛生长发育良好，机体抵抗力强，相对于初产奶牛来说难产率、死胎率的发生低有很大关系。4小结（1）陇西县散养户养殖的奶牛数量超过全县养殖量的4/5，大多数均选择粗放的管理模式，存在环境差、饲料品质不佳、兽医技术支撑不足、奶牛品种退化等缺点；规模化养殖场养殖条件好，品种优良，适宜长期发展；（2）2016年1月~2016年12月间陇西县奶牛子宫内膜炎的平均发病率为12.71%；（3）奶牛子宫内膜炎发病率存在季节差异，7月间发病率较高为15.83%，5月份最低为10.00%，各乡（镇）每个月发病率在0.00%~30.00%之间；（4）巩昌镇和文峰镇发病率最高为20.00%和19.17%，宏伟乡、和平乡和碧岩镇相对较低，为9.17%、7.50%和9.17%，不同乡镇奶牛子宫内膜炎发病率存在显著差异（x2=4.135，P＜0.05），（5）养殖场奶牛子宫内膜炎的发病率较为8.91%，明显低于散养户13.52%，差异具有统计学意义（x2=3.468，P＜0.05）；（6）4岁奶牛子宫内膜炎发病率最低为6.68%，8岁奶牛子宫内膜炎发病率最高为21.43%，各年龄阶段奶牛子宫内膜炎发病率比较差异具有统计学意义（x2=5.671，P＜0.05）。23 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分第三章奶牛子宫内膜炎主要致病菌分离鉴定和药敏试验奶牛发生子宫内膜炎的主要原因与感染病原微生物有关，而大量研究证实，细菌是引发疾病的主要病原[47]。在实际生产过程中克制引发奶牛子宫内膜炎的病原菌种类繁多，国内外文献报道存在很大差异，可能与奶牛品种、养殖环境、卫生状况、饲养模式、奶牛健康状况和抗微生物药物使用等有关系[48]。本次研究在不同季节从养殖场和散养户中选择不同年龄的25头确诊为奶牛子宫内膜炎病牛作为研究对象，分析引发奶牛患病的主要致病菌种类、分布和耐药情况，旨在为临床选择合理的治疗方案、有效的防控奶牛子宫内膜炎的发生和蔓延提供科学依据。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物选择某养殖场15头奶牛和巩昌镇、文峰镇、首阳镇、菜子镇、云田镇散养户养殖各2头经临床诊断和实验室诊断确诊为奶牛子宫内膜炎的病牛作为研究对象。病牛临床表现为弓背怒责，从阴道流出棕黄色污浊伴有腥臭味的粘性分泌物，常含有絮状物或胎衣碎片，一般情况下上述分泌物在奶牛的阴门或尾根部形成干痂。1.1.2仪器台式电子天平、微量移液器、高压蒸汽灭菌锅、无菌操作台、电热恒温培养箱、二氧化碳培养箱、电热恒温水浴锅、恒温摇床、生物显微镜、接种针、酒精灯、培养皿、试管、载玻片等。1.1.3试剂培养基：普通营养肉汤培养基、绵羊血琼脂培养基、伊红美兰琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、SS琼脂。生化鉴定：葡萄球菌属细菌生化鉴定管（16种×10支）、肠杆菌科细菌生化编码鉴定管（15种×10支）均购自杭州微生物试剂有限公司。药敏纸片：选择使用范围广泛的抗生素种类纸片进行相应的药物敏感试验，主要选择氨苄西林（ampicillin，AMP）、头孢氨苄（cephalexin，LEX）、多西24 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分环素（doxycycline，DOX）、阿米卡星（Amikacin，AK）、恩诺沙星（enrofloxacin，ENR）、红霉素（erythromycin，ERY）、氟苯尼考（Florfenicol，FFN）、链霉素（streptomycin，STR）、青霉素（penicillin，PEN）、卡那霉素（kanamycin，KAN）、庆大霉素（gentamicin，GEN）、四环素（tetracycline，TET）、新霉素（neomycin，NEO）等临床上常用的13种抗微生物药物进行药敏试验，上述药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司，生产批号20160815。1.2方法1.2.1采集样品患病牛排出粪便后消毒外阴，使用阴道开张器后用无菌棉签蘸取病牛子宫颈口黏液置入含有10mL增菌液的离心管，编号后送至实验室进行培养，与此同时将无菌采集的样品直接涂片后使用革兰氏染色法进行染色，显微镜下观察细菌的形态和数目，初步判定主要致病菌的种类。1.2.2增菌将采集的样品一分为二，一部分使用营养肉汤增菌后置于37℃恒温培养箱内18~24h，另一部分加至厌氧菌肉汤中，置于37℃二氧化碳培养箱中培养3~7d。1.2.3细菌分离培养无菌条件下将肉汤内培养的浑浊菌液接种至普通琼脂平板、鲜血平皿培养基后37℃培养18~24h，将厌氧增菌液中生长细菌的浑浊菌液接种至BA培养基内，厌氧培养3~7d，观察不同培养基上细菌生长状态，并进行革兰氏染色后油镜下观察细菌形态。1.2.4生化鉴定方法：将分离、纯化得到的细菌分别划线接种在5%兔脱纤血琼脂、营养琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂，37℃培养后观察菌落形态和细菌特性，将染色后判定为革兰氏阳性球菌的菌株分别进行接触酶试验和血浆凝固酶试验；革兰氏阴性杆菌作氧化酶试验；根据上述鉴定结果将分离、纯化的菌株用不同组合的细菌微量生化鉴定管进行进一步的鉴定。结果判定：根据《临床细菌学》[49]和《伯杰细菌鉴定手册》[50]中细菌分群的鉴定方法，初步判定为革兰氏阳性菌的菌株进行接触酶试验、氧化酶试验；葡25 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分萄球菌属和微球菌属鉴别进行O/F试验，其中前者为发酵型，镜下小球菌呈葡萄状排列，后者为氧化型或无反应，镜下为较大的四联球菌；葡萄球菌属和链球菌属鉴别主要依靠O/F试验和触酶试验，前者触酶试验结果为阳性，而后者为阴性；肠杆菌科及相关细菌鉴定需要进行靛基质试验、甲基红（MR）试验、硝酸盐还原及产气试验、明胶试验、运动性试验、苯丙氨酸利用试验、鸟氨酸赖氨酸利用试验、氧化-发酵试验、葡萄糖酸盐试验。除了上述特殊的生化鉴定管外还有葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、甘露糖、尿素、硫化氢试验、硝酸盐还原、枸橼酸、硫化氢等常规生化微量鉴定管。1.2.5药敏试验采用纸片琼脂扩散法进行分离菌株的药物敏感试验。将分离得到的致病菌株按照培养特性使用不同的液体培养基进行真菌，培养18~20h后使用分光光度计在600nm处1cm比色杯比色，使用生理盐水稀释浓度，将吸光度调至0.08~0.1，将0.1mL菌液倾倒于MH显色琼脂平板，如果是链球菌则倾倒于鲜血琼脂平板，使用灭菌的三角玻璃棒将增菌液均匀涂布在平板上，待琼脂表面的水分完全被吸收后用无菌镊子将待测的药敏纸片稳妥的贴在琼脂表面上，每个平板上最多贴5个纸片，纸片间距不得小于24mm，纸片中心和平板边缘的距离不得少于15mm，贴完纸片后将平板反转180°后置于37℃恒温培养箱中进行培养，正常情况下MH显色琼脂在4~8h后可观察到明显的抑菌圈，鲜血平板则需要24h以上。培养结束后倒置平板，用游标卡尺测量每个纸片产生的抑菌环直径大小，每个药敏纸片产生的抑菌环应重复测量3次取平均值。药敏试验结果判定:根据NCCLS制定的标准进行，分为敏感（saensitive，S）、中敏（intermediate，I）和耐药（resistant，R），病原菌对抗生素药物的敏感性根据抑菌圈直径的大小进行判定，青霉素类药物抑菌圈直径＜15mm判为R，15~20mm为I，≥21mm为S；其他药物抑菌圈直径＜10mm为R，10~15mm为I，≥16mm为S。2结果2.1致病菌分离培养结果采集的25头患子宫内膜炎的奶牛子宫分泌物进行实验室检测，共分离出63个菌株，根据不同菌株生长特性和染色镜检结果初步判定为革兰氏阴性杆菌3226 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分株，革兰氏阳性菌28株，染色不均3株（表3-1）。表3-1分离菌株培养特性Tab.3-1Isolatestrainculturecharacteristics普通琼脂平板菌血琼脂平板麦康凯琼脂平板菌涂片染色镜种类细菌形态落形态菌落形态落形态检生长良好，菌生长良好，菌落直生长良好，菌落落直径径2~3mm呈粉红色中等大小杆疑似大肠杆直径2~3mm，表2~3mm，灰色不透明，菌落下琼菌，单在或菌（20株）面光滑湿润呈灰或微黄色，部脂呈粉红色，部分成双排列色或微黄色分呈β溶血菌株菌落呈白色革兰氏阴生长良好，呈灰生长良好，呈生长良好，长出土中等大小杆性菌（32疑似变形杆色波浪形蔓延生波浪形蔓延黄色或浅褐色不透菌，呈杆状、株）菌（7株）长的菌苔，边缘生长的大菌明、边缘不齐的菌球杆状、丝不齐苔落状扁平光滑，边缘扁平光滑，边直径2mm左右，呈中等大小杆疑似绿脓杆平齐，呈黄绿色缘不齐，中心土黄色，边缘整齐，菌，单个或菌（5株）带有特殊气味的较暗有溶血半透明状成双排列大菌落环的大菌落疑似金黄色金黄色直径菌落形态似呈葡萄串状葡萄球菌（121.5~2mm不透明普通培养，有—排列的球菌株）的菌落溶血圈呈灰白色直呈灰白色直径革兰氏阳疑似表皮葡径1.5~2mm呈葡萄串状1.5~2mm不透明—性菌（28萄球菌（7株）不透明的菌排列的球菌的菌落株）落呈浅灰色半生长不良，呈针疑似链球菌透明、露滴状呈长链状排尖大小的露滴状—（9株）小菌落，呈α列的球菌湿润菌落溶血或β溶血27 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分生长缓慢，呈生长缓慢，呈乳疑似酵母样乳白色大菌呈圆形、椭白色大菌落，有—真菌（2株）落，有一定的圆形大菌体一定的黏性染色不均黏性匀生长迅速，圆菌体中央（3株）生长缓慢，圆形形凸起表面疑似化脓放G+周边G凸起表面光滑呈光滑呈灰白—线菌（1株）—杆状或棒灰白色的小菌落色有窄溶血状成丛排列环的菌落注：“—”表示未检测。2.2分离菌株生化试验鉴定结果（1）革兰氏阳性菌分离纯化得到的63个菌株经生化鉴定后发现革兰氏阳性菌分别为金黄色葡萄球菌12株、表皮葡萄球菌7株、化脓链球菌9株。生化鉴定结果详见表3-2。表3-2分离出革兰氏阳性菌株生化鉴定结果Tab.3-2TheresultsofbiochemicalidentificationofGram-positivestrainswereisolated项目金黄色葡萄球菌（12株）表皮葡萄球菌（7株）化脓链球菌（9株）溶血性βαβ凝固酶+——氧化酶———乳糖+±—麦芽糖+——甘露糖+——木糖———覃糖+——松二糖+±—蔗糖—？+M.R试验++—V.P试验+——28 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分明胶液化——+运动力———靛基质试验———硫化氢试验———硝酸盐还原++—过氧化氢—±+注：“+”表示阳性，“±”表示有时阳性有时阴性，“—”表示阴性，“？”表示可疑。（2）革兰氏阴性菌本次试验分离的革兰氏阴性菌主要为大肠杆菌12株、变形杆菌9株、克雷伯氏菌5株、绿脓杆菌6株，以肠杆菌科细菌多见。生化鉴定结果详见表3-3。表3-3分离出革兰氏阴性菌株生化鉴定结果Tab.3-3TheresultsofbiochemicalidentificationofGram-negativestrainswereisolated项目大肠杆菌（12株）变形杆菌（9株）克雷伯氏菌（5株）绿脓杆菌（6株）葡萄糖酸盐——+—苯丙氨酸—+——半固体++—？葡萄糖++/——硫化氢试验—+/——M.R试验++——V.P试验——？—枸橼酸盐——++乳糖（+）（+）+甘露醇+—/++山梨醇+—？蔗糖？++—明胶液化—+/——分解尿素—？？运动力+/—+—靛基质试验+？——29 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分硝酸盐还原+++过氧化氢—++注：“+”表示阳性，“（+）”表示产酸产气，“+/—”表示大多数阳性/少数阴性，“—/+”表示大多数阴性/少数阳性，“—”表示阴性，“？”表示可疑。（3）着色不均菌：有3株，主要有白色念珠菌2株、化脓放线菌1株，生化鉴定结果详见表3-4。表3-4分离出真菌菌株生化鉴定结果Tab.3-4Theresultsofbiochemicalidentificationoffungalstrainswereisolated指标白色念珠菌（2株）化脓放线菌（1株）乳糖—+甘露醇+葡萄糖（+）+蔗糖++麦芽糖（+）+木糖+分解尿素—注：“+”表示阳性，“（+）”表示产酸产气，“—”表示阴性。（4）细菌分离主要致病菌：由分离菌生化鉴定结果可以得出引起陇西县奶牛发生子宫内膜炎的细菌有金黄色葡萄球菌19.05%（12/63）、表皮葡萄球菌11.11%（7/63）、化脓链球菌14.29%（9/63）、大肠杆菌19.05%（12/63）、变形杆菌14.28%（9/63）、克雷伯氏菌7.94%（5/63）、绿脓杆菌9.52%（6/63）。其中主要致病菌有肠道杆菌、葡萄球菌和链球菌。2.3致病菌药敏试验结果主要药敏试验结果显示，分离到的主要致病菌对与临床广泛用于抗革兰氏阳性菌的氨苄青霉素、青霉素以及广谱抗菌的链霉素等药物存在不同程度的耐药性，对于兽药临床中不常用的广谱抗生氟苯尼考来说各种致病菌都具有较高的敏感性，对于广泛用于临床治疗疾病的阿米卡星、多西环素等药物具有较高的敏感30 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分性，其中革兰氏阳性球菌类对红霉素高度敏感，而庆大霉素、阿米卡星等药物对肠杆菌（大肠杆菌、克雷伯氏菌等）以及绿脓杆菌抑菌效果较好（表3-5）。表3-5主要致病菌药敏试验结果（抑菌圈/敏感性）Tab3-5Theresultsofmajorpathogenicdrugsusceptibilitytest药物大肠杆菌变形杆菌克雷伯氏金黄色葡表皮葡萄化脓链球绿脓杆菌萄球菌球菌菌AMP11.5/R11.2/R10.2/R11.8/R12.4/R10.5/R9.3/RAK25.6/S24.9/S25.1/S19.8/S20.1/S22.5/S17.1/SLEX19.8/S21.2/S19.7/S28.6/S10.8/I11.5/I18.2/SDOX12.3/I12.8/I13.0/I36.2/S35.2/S32.4/S14.3/IENR18.7/S20.3/S19.8/S30.2/S31.5/S28..7/S19.5/SFFN42.1/S38.6/S40.5/S8.7/R38.6/S37.2/S33.6/SERY8.2/R10.2/R8.6/R44.1/S31.8/S33.6/S14.0/IKAN19.5/S21.4/S22.6/S30.2/S29.6/S28.5/S20.2/SSTR8.5/R10.5/R9.7/R14.2/I13.4/I14.0/I12.9/IPEN6.4/R8.1/R7.9/R9.0/R11.0/R9.5/R6.4/RGEN14.8/I13.9/I14.6/I20.3/S19.8/S19.3/S27.1/STET8.4/R9.2/R8.5/R19.2/S20.3/S24.1/S18.6/SNEO23.6/S24.7/S23.4/S33.5/S33.2/S35.2/S19.1/S注：氨苄西林（AMP）、头孢氨苄（LEX）、多西环素（DOX）、阿米卡星（AK）、恩诺沙星（ENR）、红霉素（ERY）、氟苯尼考（FFN）、链霉素（STR）、青霉素（PEN）、卡那霉素（KAN）、庆大霉素（GEN）、四环素（TET）、新霉素（NEO）。“S”为敏感、“I”为中敏、“R”为耐药。3讨论正常情况下，健康的奶牛的子宫内形成一个相对无菌的环境，同时机体具有较强自净能力，在受到强烈机械刺激或者机体抵抗力降低后会滋生大量的病原微生物，从而引起子宫内膜发生病理变化[51,52]。有研究报道，在母牛生产后2周内子宫被细菌污染的情况十分常见，微生物会从多种途径侵入子宫内，大多数奶牛会在产后首次发情（12~18d）时将子宫内全部或大部分细菌排出，对于首次发31 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分情延迟或不能排出细菌的就导致子宫内膜炎发生，由此在难产、胎衣不下、流产、死胎滞留子宫内发生子宫迟缓、复旧延迟的奶牛来说发病率非常高[53]。3.1致病菌分离、鉴定近年来我国相关资料显示，引起奶牛子宫内膜炎的主要致病菌有葡萄球菌（Staphylococcus）、链球菌（Streptococcus）、化脓杆菌以及大肠杆菌（Escherichiacoli）4种，除此之外还有蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus.Frankland）、胎儿弯曲菌（Campylobacter）以及白色念珠菌（candidaAlbicans）等真菌[54]。本研究从陇西县养殖场和散养户家中挑选具有典型症状和实验室诊断确诊为子宫内膜炎的奶牛25头作为研究对象，采集病牛子宫颈口分泌物进行实验室细菌分离、鉴定。结果显示，共分离到63个菌株，金黄色葡萄球菌19.05%（12/63）、表皮葡萄球菌11.11%（7/63）、化脓链球菌14.29%（9/63）、大肠杆菌19.05%（12/63）、变形杆菌14.28%（9/63）、克雷伯氏菌7.94%（5/63）、绿脓杆菌9.52%（6/63）。，由该结果可以得知，引起陇西县奶牛子宫内膜炎的主要致病菌为肠杆菌科细菌、葡萄球菌、链球菌等，上述细菌大多数在正常环境中存在，可以证实环境因素对奶牛子宫内膜炎的发生率具有很大的影响，但是上述细菌是否为致病菌需要进一步动物试验来证实。此次细菌分离鉴定结果与大多数文献报道基本一致[30]。3.2药敏试验结果分析本次试验针对分离出的细菌种类，结合临床治疗选择抗生素的特性和菌谱选择氨基糖苷类、β-内酰胺类、大环内酯类和喹诺酮类中的15种抗微生物药物用于药物敏感试验，其中青霉素主要抑制细菌细胞壁肽聚糖的合成，抗菌谱窄，主要用于革兰氏阳性菌感染的治疗，氨苄青霉素对溶血性链球菌和不产青霉素酶的葡萄球菌具有较强的抗菌作用[55]；链霉素属于氨基糖苷碱性化合物，其与细菌核糖体S30亚单位进行特异性结合，抑制细菌合成蛋白质，尤其对结核分枝杆菌的抑菌性能较强，对大多数革兰氏阴性菌抑菌效果明显，对葡萄球菌和其他革兰氏阳性球菌的抑菌作用较差，卡那霉素对肠杆菌科细菌抗菌性较强；红霉素作为大环内脂类抗生素的代表药物，主要杀菌机制为药物与细菌核糖核蛋白体的50S亚基发生结合，对核糖蛋白体的移位产生一定的阻碍作用，其抗菌谱与青霉素十分类似，临床上主要用于革兰氏阳性菌的杀灭，对部分革兰氏阴性菌有一定的抑制作用[10,56]。32 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分本研究结果显示用的氨苄青霉素、链霉素、青霉素等药物抑菌效果普遍较差，分离到的主要致病菌都存在不同程度的耐药性，分析发生这种现象的主要原因可能是由于临床上过度使用上述抗生素后造成细菌产生耐药性，其中革兰氏阳性球菌类对红霉素高度敏感，尤其是对青霉素产生耐药性的菌株对红霉素具有较强的敏感性。对于广泛用于临床治疗疾病的阿米卡星、多西环素等药物具有较高的敏感性，如庆大霉素、阿米卡星等氨基糖苷类药物对肠杆菌科细菌和绿脓杆菌均具有较好的抑菌效果，对于兽药临床不常用的广谱抗生氟苯尼考来说各种致病菌都具有较高的敏感性，但是由于该药物难溶于水，利用率较低，不能充分发挥其药效，而我国大量研究的助溶剂微粉化、超微、研磨分散体等多种方法进行助溶后药物溶解的效果仍不理想[57,58]，因此，对于氟苯尼考来说药物溶解速度慢、溶出度小，不推荐临床使用治疗奶牛子宫内膜炎[59]。使用抗微生物药物治疗奶牛子宫内膜炎致使药物在牛奶中兽药残留，这样的乳制品流入市场后会对人体健康造成危害，其次容易引发细菌产生耐药性，降低药物的治疗效果。因此，今后发展生态养殖的过程中要不断研发无药物残留、刺激性低的纯天然中药治疗方案，方剂中部分中药成分除了抗菌消炎的功效外还可以清热解毒、活血化瘀、去腐排脓、增强机体抵抗力等诸多功效。鉴于中兽药的疗效比较慢，治疗急性奶牛子宫内膜炎时效果不如西药疗效快，因此产后预防本病可适当使用中兽药[60]。4小结（2）采集25头患子宫内膜炎奶牛的宫颈口粘液进行细菌分离，共分离到63个菌株，金黄色葡萄球菌19.05%（12/63）、表皮葡萄球菌11.11%（7/63）、化脓链球菌14.29%（9/63）、大肠杆菌19.05%（12/63）、变形杆菌14.28%（9/63）、克雷伯氏菌7.94%（5/63）、绿脓杆菌9.52%（6/63）。（2）药敏试验结果证实引起陇西县奶牛子宫内膜炎的主要致病菌对氨苄青霉素、链霉素、青霉素等药物具有耐药性，根据药敏试验建议使用阿米卡星、多西环素等敏感性较高的药物进行临床治疗。33 甘肃农业大学2017届兽医硕士学位论文第二部分试验部分第四章结论1.2016年1月—2016年12月间奶牛子宫内膜炎的平均发病率为12.71%，奶牛子宫内膜炎发病率存在季节差异，7月间发病率较高为15.83%，5月份最低为10.00%，各乡（镇）每个月发病率在0.00%~30.00%之间；巩昌镇和文峰镇发病率最高为20.00%和19.17%，宏伟乡、和平乡和碧岩镇相对较低，为9.17%、7.50%和9.17%，不同乡镇奶牛子宫内膜炎发病率存在显著差异（x2=4.135，P＜0.05）；养殖场奶牛子宫内膜炎的发病率较为8.91%，明显低于散养户13.52%，差异具有统计学意义（x2=3.468，P＜0.05）；4岁奶牛子宫内膜炎发病率最低为6.68%，8岁奶牛子宫内膜炎发病率最高为21.43%，各年龄阶段奶牛子宫内膜炎发病率比较差异具有统计学意义（x2=5.671，P＜0.05）。2.采集25头患子宫内膜炎奶牛的宫颈口粘液进行细菌分离，共分离到63个菌株，金黄色葡萄球菌19.05%（12/63）、表皮葡萄球菌11.11%（7/63）、化脓链球菌14.29%（9/63）、大肠杆菌19.05%（12/63）、变形杆菌14.28%（9/63）、克雷伯氏菌7.94%（5/63）、绿脓杆菌9.52%（6/63）；药敏试验结果显示革兰氏阳性球菌类对红霉素高度敏感，革兰氏阴性菌如大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌以及绿脓杆菌等病原菌对庆大霉素、阿米卡星等药物高度敏感。34 参考文献[1]邓近平,吴登坤.奶牛子宫内膜炎[J].江西畜牧兽医杂志,1996,12(1):44-47.[2]贾杏林,齐长明.奶牛子宫内膜炎研究进展[J].中国兽医杂志,2005,41(2):34-36.[3]杜光波,徐莉,高梦宁.奶牛子宫内膜炎主要病原菌的调查[J].畜牧与兽医,2007,39(4):24-26.[4]谷新利,刘四国.奶牛子宫内膜炎发病原因调查[J].甘肃畜牧兽医,1992,(3):3-5.[5]简子健,赵红琼,马素珍,等.奶牛子宫内膜炎治疗学研究进展[J].动物医学进展,2007,28(4):72-76.[6]侯振中,许微微.奶牛子宫内膜炎致病菌的分离与鉴定[J].东北农业大学学报,2008,39(12):76-81.[7]加依那·马胡如夫.奶牛子宫内膜炎诊断及防治[J].当代畜牧,2017,1(8):13-14.[8]AghamiriS,HaghkhahM,AhmadiM,etal.DevelopmentofaMultiplexPCRfortheIdentificationofMajorPathogenicBacteriaofPost-PartumEndometritisinDairyCows[J].ReproductioninDomesticAnimals,2013,49(2):233–238.[9]吴登涛.奶牛子宫内膜炎的实验室诊断[J].现代畜牧科技,2017(3):10-10.[10]BogadoPO,HostensM,DiniP,etal.Comparisonbetweencytologyandhistopathologytoevaluatesubclinicalendometritisindairycows[J].Theriogenology,2016,86(6):1550-1557.[11]蔡明周.奶牛子宫内膜炎的临床诊治分析[J].畜牧兽医科技信息,2016,13(1):44-45.[12]梁书文.奶牛子宫内膜炎的病因与综合防制[J].中国畜牧兽医,2011,38(3):207-210.[13]EnbergsH,SensenB.Effectivenessofahomeopathictreatmentofchronicendometritisindairycows[J].DerPraktischeTierarzt,2007,88(7):534-543.[14]李世宏,杨国林,杨锐乐,等.奶牛子宫内膜炎研究进展[J].中国奶牛,2007,11(1):34-38.[15]RinaudoA,BernardiSF,MariniPR.EffectofmilkproductioninthedevelopmentofendometritisindairycowsinSantaFe(Argentina)[J].RevistaVeterinaria,2014,8(12):134-138.35 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致谢本文是在导师薛慧文教授、王旭东高级兽医师的悉心指导下完成的，在论文的完成过程中，各养殖场老板和工人给予了很大的帮助。从论文的选题、试验的设计到最后的修改、定稿薛慧文教授均给予了大量详尽细致的指导，论文的完成，浸透着导师们大量的心血。几年来，两位导师对我的学习、工作给予了极大的关心和支持，他们严谨的治学态度、认真的工作作风、真诚的待人原则让我难忘，催我奋进。在此对两位导师表示深深的谢意！感谢陇西县畜牧兽医技术服务中心提供了优良的实验条件，感谢养殖场同事们的大力支持和帮助，从调查收集资料、试验，他们进行了大量繁杂、细致的工作，使试验工作得以顺利进行。在此向他们深表谢意。在3年的研究生学习过程中，陇西县畜牧兽医技术服务中心的各位领导和同事们对我的学习给予了极大的支持和关怀，使得我能顺利完成专业课程的学习和论文的制作，在此向他们表示深深的谢意。谨向所有关心过我，支持过我，帮助过我，鼓励过我的领导、老师、同事、同学和朋友表示由衷的谢意！在此，真诚感谢甘肃农业大学研究生处、动物医学院给了本人进一步学习、深造的机会，你们将各方面最新的知识传授于我，使我能及时了解到兽医科技最新研究动态和信息，提高和丰富了自身的理论知识水平。所学到的新知识、新技术将对我以后的工作和学习产生重要影响。最后，感谢我的家人对我的理解和支持！感谢父亲对我的教诲、鼓励及帮助。40 个人简介姓名:孟彦军性别:男出生:1988年08月出生于甘肃陇西主要经历:2008年09月—2012年06月在甘肃农业大学动物医学院动物医学专业学习，获动物医学本科学历，农学学士学位。2012年09月—至今在陇西县畜牧兽医技术服务中心。2013年10月在陇西县畜牧兽医技术服务中心工作任助理兽医师。2013年09月—2016年10月在甘肃农业大学动物医学院攻读兽医专业硕士学位。2013年12月取得执业兽医师资格证书。主要论文发表情况:硕士学位在读期间主要论文及著作发表出版情况在《中国畜牧兽医文摘》杂志上发表专业论文1篇。41 导师简介薛慧文：女，1964年5月生，山西万荣人。毕业于甘肃农业大学兽医系兽医专业，1985年获学士学位，1988年获硕士学位。现为甘肃农业大学动物医学院教授、硕士研究生导师。兼任中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会常务理事、甘肃省重大动物疫病防控专家委员会委员、甘肃省动物防疫专家委员会专家、甘肃省肉类协会理事、甘肃省牛羊产业协会专家委员会委员。自工作以来，一直从事兽医公共卫生学和动物性食品卫生学的教学与科研工作。主要承担本科生《动物性食品卫生学》、《动物卫生法学》等课程的教学任务，其中主讲课程《动物性食品卫生学》获得省级精品课程称号；为硕士和博士研究生讲授《现代食品安全科学》、《现代食品卫生与食品安全》、《兽医公共卫生学》和《兽医公共卫生与食品安全》、《兽医法规》等课程。主持完成和参与完成科研项目10余项。近年来，作为主要参加人参与完成的“肉用绵羊营养和繁育技术的研究与应用”获2007年度甘肃省科技进步二等奖，“奶牛乳房炎功能基因组学及蛋白质组学研究及其综合防治体系的建立”获2011年度甘肃省科技进步二等奖。在国内外重要学术期刊上发表科技论文30余篇。副主编普通高等教育“十一五”、“十二五”国家级规划教材《动物性食品卫生学》﹙第3版，第4版、第5版﹚和《动物性食品卫生学实验指导》（第1版、第1版）、《兽医公共卫生学》（第2版）、《动物卫生法学》7部，参编《食品安全与卫生学》和《兽医公共卫生学》等全国高等农业院校重点规划教材；主编《肉品卫生监督与检验手册》、《无公害养殖药物使用指南》、《羊防疫员培训教材》等7部专著，参编《现代中国养羊》、《动物性食品安全生产与检验技术》、《中国养养学》、《全国畜禽屠宰检疫检验培训教材》、《甘肃省选拔万名大学生下基层考试专用教材.畜牧兽医专业知识》和2009—2015年《全国执业兽医资格考试应试指南》等15部专著。42 43