伊布利特对家兔左心室肌细胞快钠通道跨壁异质性的影响

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1、摘要】　　目的探讨伊布利特（ibutilide）对家兔心室肌细胞快钠通道电流(INa)跨壁异质性的影响。方法30只兔随机分为3组：正常对照组、10-7mol/L和10-6mol/L伊布利特组。用膜片钳技术研究各组左室3层心肌细胞INa的改变。结果正常对照组左室3层细胞的INa存在跨壁异质性,中层心肌(M)细胞的峰值INa是心内膜层(Endo)和心外膜层(Epi)的2倍多;M细胞的INa失活最快；两个伊布利特组3层细胞的INa密度下降,以M细胞变化最显著；INa稳态失活曲线均左移,以M细胞变化最显著;失活后恢复曲线均恢复减慢。结

2、论左室心肌细胞的INa存在跨壁异质性；伊布利特可减弱INa的跨壁异质性。【关键词】伊布利特心室肌细胞异质性膜片钳快钠通道　　伊布利特(ibutilide)是一种国内新近推出的速效、安全的3类抗心律失常药物。它即是β肾上腺素能受体拮抗剂的同系物，又是一种甲基磺胺类化合物,主要用于快速转复心房颤动/心房扑动。其作用机制与其他的3类抗心律失常药物不同，更与其他类抗心律失常药作用机制不同〔1〕。近期动物试验已证实，伊布利特对抑制室性心律失常也有作用〔2〕。本研究采用酶解法分离左室单个心外膜、心内膜和中层心室肌细胞，应用膜片钳全细胞记

3、录方法，研究3层心室肌细胞快钠通道电流(INa)的活性，并对应用伊布利特干预后INa特性的变化进行系统观察，为临床应用伊布利特治疗室性心律失常提供理论基础。　　1材料与方法　　1.1实验动物新西兰纯种大耳白兔30只,由华北制药厂实验动物中心提供,雌雄不拘,体重1.5～2.0kg,随机分为3组：正常对照组（con）、10-7mol/L伊布利特组(10-7)、10-6mol/L伊布利特组(10-6)。　　1.2液体配制①无钙台氏液(mmol/L):NaCl140，NaHCO311.9，KCl5.4，MgCl20.53，NaHPO4

4、0.33，HEPES5，葡萄糖10,用NaOH调节pH至7.3。②含酶液：无钙台氏液中加入0.4g/L胶原酶I和0.7g/L牛血清白蛋白。②KB液(mmol/L):KOH70，KCl40，KH2PO420，L谷氨酸50，牛磺酸20，EGTA0.5，HEPES10，葡萄糖10,用KOH调节pH至7.3。③INa电极内液(mmol/L):CsCl130，MgCl22，NaCl10，HEPES10,用CsOH调节pH至7.3。④INa电极外液(mmol/L):氯化胆碱100，NaCl50，MgCl22，HEPES10,葡萄糖10,

5、用NaOH调节pH至7.3。胶原酶、HEPES、BSA等由Sigma公司生产,余为国产分析纯。　　1.3单细胞分离猛击兔头颅枕部致昏迷，迅速开胸取心脏，置于冰冷的无钙台氏液中，剪去心包，心脏经修饰后连接在Langendorff心脏灌流装置上，经主动脉根部逆行用无钙台氏液灌流(灌注压70mmHg，恒温36℃)10min。用含酶液灌流16～20min，至心脏膨大、松弛后从灌流装置上取下。用眼科剪分别剪取左室游离壁心内膜下＜1.5mm和左室游离壁心外膜下＜1.5mm的组织，剩余中间部分以外科手术刀片刮除残余心内膜和外膜细胞后为中层细

6、胞。将之分别剪碎，置于KB液中搅拌，整个搅拌过程保持恒温36℃并充O2。取细胞悬液置于KB液中保存，1h后细胞膜状态恢复，即可备用。　　1.4细胞封接与全细胞记录模式的建立按文献〔3〕的方法建立全细胞膜片钳记录模式。实验在室温(20～25℃)下进行,细胞破膜后稳定2min开始记录电流。　　1.5细胞膜电容的记录通道信号经HEKAEPC9膜片钳放大器放大,电流信号由pulse+pulsefit8.53软件控制,细胞封接时由软件自动测量细胞膜电容值。　　1.6INa电流记录　　1.6.1电流电压曲线从维持电位(HP)-140m

7、V,阶跃+10mV,从-80mV逐步去极化到+60mV,刺激频率1Hz,钳制时间50ms。为消除细胞间误差,电流值以电流幅值与膜电容相比即电流密度(pA/pF)表示,以不同钳制电压下的INa峰电流密度绘成电流电压(IV)曲线。　　1.6.2稳态失活曲线采用双脉冲刺激法,HP=-120mV,条件脉冲-160～-40mV,钳制时间1000ms,阶跃+10mV,每次条件脉冲后紧跟一固定的去极化到-20mV的测试脉冲,持续时间50ms,刺激频率1Hz。将记录的INa与最大激活时的INa之比,与相应的条件脉冲膜电位作图得钠通道失活曲

8、线,并通过Pulse+Pulsefit软件用Boltzmann方程自动计算出INa半数失活电压(V0.5)。　　1.6.3失活后再恢复曲线采用双脉冲刺激法。第1个脉冲(即条件脉冲)HP=-80mV,去极化到-20mV,持续时间50ms；在第1个脉冲回到HP后不同时间间隔给予第