对高压冷冻技术的应用探究

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1、对高压冷冻技术的应用探究　　1高压冷冻对高压冷冻技术的应用探究　　1高压冷冻对高压冷冻技术的应用探究　　1高压冷冻对高压冷冻技术的应用探究　　1高压冷冻对高压冷冻技术的应用探究　　1高压冷冻对高压冷冻技术的应用探究　　1高压冷冻　　高压冷冻是在2.1×108Pa压力下对生物样品进行冷冻固定，在此压力下，允许样品在一定的冷冻速度范围内得以充分地冷冻，而且冷冻样品的厚度可达600Λm[19]。冷冻过程实际上是使细胞内的水由液体转变为固体的过程。在此过程中，水的体积增大，而2.1×108Pa的高压明显地抑制这一膨胀过程，使

2、得通过改变水的物理特性从而抑制冰晶的形成。这一变化减少了由于水结冰而产生的热量，实际上也就减少了单位时间内所需冷却的热量，因此也就降低了获得满意冷冻效果所需的冷冻速度[21]。样品有效冷冻厚度的增加，使得冷冻技术为生物结构的研究创造了更多的机会。　　2高压冷冻仪　　细胞暴露在高压下自然会受到损伤[23]，而且压力越大，暴露时间越长，所受的损伤越严重[19]。因此要防止压力对样品的损伤，必须设计出合理的仪器，使得细胞在冷冻之前能经受瞬间的高压。Moor及其同事经过20余年的努力已发展出适用于生物组织和细胞学研究用的高压

3、冷冻仪BalzerHPM010（BalzersCorporation，Hudson，NH）[19，20，25]。　　高压冷冻仪利用液氮做为冷冻剂和升压剂，以便当100ml液氮在0.5s内通过直径为013mm的小孔进入样品室时能够保持2.1×108Pa的压力，而且温度和压力几乎在30ms内同时达到173K和2.1×108Pa.这种同步过程主要是通过在液氮进入样品室之前直接注入少量热异丙醇做为升压介质来实现。当压力产生时，大约0.2ml的异丙醇首先进入样品室，接着液氮才能进行样品的冷却。此系统能够在冷冻之前产生和保持充分

4、的压力并且同时保证仅仅在极短时间（30ms）对样品产生压力[19]。　　高压冷冻仪尽管操作简单，可靠和迅速，但由于价格昂贵，目前仅有30余台分布欧美及日本的少数实验室。　　3高压冷冻植物样品的制备　　理想的样品制备是将生活在自然状态的植物样品进行直接固定，如单细胞藻类或薄层培养的植物组织细胞。但是大多数植物样品必须经过分割使之成为高压冷冻所要求大小的组织块。因此样品的制备必须精心操作，尽量保持组织细胞的完整性。否则便会由于操作不当，使组织细胞在分割过程中遭到破坏或改变其超微结构细节。　　植物细胞由于具有相当厚的细胞壁

5、和大液泡，因而给冷冻固定带来诸多不便。厚的细胞壁阻碍冷冻剂的迅速渗入，同时含有大量水分的液泡常常因得不到彻底冷冻而形成冰晶[5，22]。因此，植物材料应根据不同组织的细胞结构特点，样品厚度≤200Λm为宜。　　植物样品的常规制备方法是利用解剖刀或刀片切取适当厚度的组织薄片，并分割成适合于冷冻的大小。通常从分割到冷冻至少需要5～6min，加之手工操作不可避免地对样品产生机械损伤，从而引起组织或细胞结构在固定前发生明显的变化，以致使所得的结果与自然状态相差甚远。Müller实验室推荐使用一种特制的手动切片刀，其固定部分由

6、厚度调节器和夹物部位组成，活动部分由刀片和夹刀部分组成，整个切片过程类似于简单的滑走切片机。首先用手动切片刀制取200Λm厚度的组织片，再用直径2mm的打孔器制取样品圆片，将圆片放入盛有12hexadecene溶剂的Eppendorf试管中，在较缓和的真空条件下抽气，然后将样品转移至内径为2mm，深度为200Λm的圆形铝盘中，并用12hexadecene填充盘内的剩余空间，再用另一平底的圆形铝盘盖严。　　最后将铝盘连同样品一起放入样品夹中，插入高压冷冻机进行冷冻固定。整个样品制备过程简单迅速，时间可缩短至2～3min

7、.4高压冷冻技术在植物细胞超微结构研究中的应用　　高压冷冻技术在植物细胞超微结构中的应用，按其研究内容大致分为两类：一类利用植物为材料进行高压冷冻技术本身的研究和发展，另一类则以高压冷冻技术为手段来探讨结构植物学研究中的一些问题。　　应用高压冷冻技术对不同植物细胞进行研究并和常规化学固定方法比较，可以充分说明高压冷冻技术的优越性。Kaneko和Walther利用高压冷冻技术和常规化学固定方法对萌发的豌豆幼叶进行了超微结构的比较研究，结果显示：经高压冷冻固定的样品，细胞膜光滑无皱褶，细胞器非常饱满，细胞质和细胞器基质均

8、匀浓厚，高尔基体潴泡清晰，同时微丝束频繁可见。同样，在发菜（Nostocflagelliforme）营养细胞的超微结构研究中也证实，经高压冷冻固定和冷冻置换制备的发菜营养细胞，胶质鞘与细胞结合紧密，细胞壁分层清晰，细胞质膜平滑，内膜结构饱满，而应用常规化学方法，胶质鞘严重收缩，细胞内膜结构呈弯曲的线条状（）[27]。Galway等[28]认为高