基于气滞血瘀型子宫肌瘤病证结合动物模型研究三棱-莪术的相须配伍规律

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成都中医药大学（基础医学院）二0一八届硕士研究生学位论文基于气滞血瘀型子宫肌瘤病证结合动物模型研究三棱-莪术的相须配伍规律StudyontheSynergicCompatibilityLawofSanleng-EzhuBasedonQiStagnationandBloodStasisSyndromeofUterineLeiomyomainRats研究生姓名：赵金双指导教师：余成浩（教授）学科专业：方剂学二○一八年五月1 成都中医药大学2018届硕士学位论文学位论文基于气滞血瘀型子宫肌瘤病证结合动物模型研究三棱-莪术的相须配伍规律StudyontheSynergicCompatibilityLawofSanleng-EzhuBasedonQiStagnationandBloodStasisSyndromeofUterineLeiomyomainRats赵金双指导教师姓名:余成浩申请学位级别：硕士专业名称：方剂学论文提交时间：2018年5月论文答辩时间：2018年5月二○一八2 成都中医药大学2018届硕士学位论文中文摘要目的：在中医基础理论的指导下，采用雌孕激素负荷法结合多因素刺激法建立气滞血瘀型子宫肌瘤病证结合动物模型。通过观察子宫形态和病理，分析大鼠子宫组织、卵巢组织和血清中的雌激素、孕激素、雌激素受体、孕激素受体、成纤维细胞活化蛋白的表达，基于“方病证、药病证、有效组分与病证、有效成分与病证”创新药物发现模式，从整体、器官、组织、分子多层次探究三棱-莪术组分配伍水煎液、三棱-莪术组分及组分配伍对气滞血瘀型子宫肌瘤的防治作用与作用机制及三棱莪术相须配伍规律，为子宫肌瘤的科学研究、方剂配伍规律研究提供新方法、新思路，为临床应用提供一定科学依据。方法：1、大鼠分组、造模和给药。将大鼠随机分为空白组、模型组、阳药组、三棱-莪术组分配伍（1:1）高剂量组、三棱-莪术组分配伍（1:1）中剂量组、三棱-莪术组分配伍（1:1）低剂量组、三棱-莪术组分配伍（1:2）组、三棱-莪术组分配伍（2:1）组、三棱总黄酮组、莪术挥发油组、三棱-莪术水煎液组。除空白组外，其他各组每日灌胃给予己烯雌酚药液1.35mg/kg,另每周一、三、五下肢外侧肌肉注射黄体酮注射液1.0mg/只，连续5周；从第四周开始皮下注射盐酸-1肾上腺素注射液0.9mg/kg·d，四小时后给予慢性不可预见性刺激（①60db噪音刺激连续3h，②昼夜颠倒，③5-10℃冰水浴游泳4min，④悬尾10min，⑤50℃烘箱烘10min，每日随机给予1种刺激，并保证整个周期中每种刺激不少于2次），连续2周。空白组每日给予生理盐水2ml，另每周一、三、五下肢外侧肌肉注射生理盐水0.05ml/只，连续5周。从造模第一周开始，在造模后2小时即给予药物治疗，各组分别灌胃给予生理盐水、生理盐水、9%的宫瘤消胶囊药液、66.7%、33.3%、16.7%的三棱莪术（1:1）配伍组药液、100%的三棱莪术（1:2）配伍组药液、100%的三棱莪术（2:1）配伍组药液、66.7%的三棱总黄酮药液、66.7%的莪术挥发油药液、三棱-莪术水煎液，连续5周。1 成都中医药大学2018届硕士学位论文2、大鼠各指标的观察和检测。（1）大鼠一般行为学观察。试验过程中观察各组大鼠的一般行为学状态。（2）子宫形态和病理组织学。各组大鼠最后一次给药后，禁食12h，称重后，解剖，取出子宫组织，剔除脂肪，清除血迹，拍照记录子宫形态。然后取子宫分角上有较明显病变（水肿、结节、囊肿、空泡变性等）组织，制作病理切片。（3）子宫、卵巢系数和子宫横竖径的检测。大鼠解剖后，取出子宫和卵巢，剔除脂肪，清除血迹，称取各脏器湿重，计算子宫、卵巢脏器系数（脏器系数=脏器湿重/大鼠体重×100）。子宫横径，游标卡尺选取子宫体最宽处进行测量。子宫竖径，游标卡尺选取子宫分角上，较长的一侧子宫的长度。（4）大鼠血清中各指标的检测。大鼠股动脉取血，15ml离心管储存，室温血液自然凝固10-20min，3000r/min，离心20min，仔细收集血清。4℃冰箱保存，尽快用酶联免疫试剂盒测定血清中的E2、ER、P、PR的含量。（5）卵巢、子宫组织中各指标的检测。剪取适量组织，称重后放入匀浆管中，1:9比例加入PBS，匀浆机2000r/min，1min进行匀浆。然后取出匀浆管离心3000r/min，20min，仔细收集上清，采用酶联免疫试剂盒检测子宫、卵巢中的E2、ER、P、PR的含量。剪取子宫组织，称重，剪碎后置于匀浆机中，加入RIPA细胞裂解液30min，后12000rpm/min离心10min，收集上清液，用蛋白质印迹法(WesternBlot)测定大鼠子宫组织中成纤维细胞活化蛋白（FAP）的含量。结果：1、基于“方病证”、“有效组分与病证”研究三棱莪术及其组分配伍对大鼠外观、子宫形态与病理组织学的影响。与空白组比较，模型组和各用药组大鼠造模后，外观呈现毛色暗淡无光、皮毛凌乱、脱落、毛根不固等改变。与空白组相比，模型组大鼠双侧子宫形态发生改变，宫体出现囊肿、结节、水肿，双侧子宫出现大小不一、形状不对称等病理改变，其他各组大鼠子宫出现不同程度的水肿、结节、囊肿、质地不均等病理改变。与空白组比较，其他各组大鼠病理切片分析结果显示有肌纤维排列紊乱、增厚，肌细胞增生、炎细胞浸润等病理表现。其中三棱莪术水煎液组和S-E（1:1）高剂量组大鼠的外观和子宫病理改变较其他用药组轻。2、基于“方病证”、“有效组分与病证”研究三棱莪术及其组分配伍对子2 成都中医药大学2018届硕士学位论文宫、卵巢系数和子宫横竖径的影响与空白组比较，模型组大鼠子宫、卵巢系数和子宫横竖径均升高。与模型组比较，各用药组大鼠子宫、卵巢系数和子宫横竖径均有不同程度的降低，其中三棱莪术水煎液和S-E（1:1）高剂量组大鼠子宫、卵巢系数和子宫横竖径降低较明显。3、基于“方病证”、“有效组分与病证”研究三棱莪术及其组分配伍对大鼠血清中E2、ER、P、PR含量的影响与空白组比较，模型组大鼠血清中E2、ER、P、PR的含量明显升高。与模型组比较，各用药组大鼠血清中的E2、ER、P、PR含量均有所降低，其中三棱莪术水煎液组大鼠血清中E2、ER、P、PR的含量降低明显。三棱-莪术组分配伍（1:1）高剂量组大鼠血清中E2、P、PR含量降低明显，ER含量也有所降低。4、基于“方病证”、“有效组分与病证”研究三棱莪术及其组分配伍对大鼠卵巢组织中E2、ER、P、PR含量的影响与空白组比较，模型组大鼠卵巢组织中E2、ER、P、PR的含量明显升高。与模型组比较，其他各组阿叔卵巢组织中的E2、ER、P、PR均有所降低，其中三棱莪术水煎液组能明显抑制卵巢组织ER和P的表达，三棱-莪术组分配伍（1:1）高剂量组大鼠卵巢组织中ER、P、PR含量降低明显，E2含量也有所降低。较其他用药组效果好。5、基于“方病证”、“有效组分与病证”研究三棱莪术及其组分配伍对大鼠子宫组织中E2、ER、P、PR、FAP含量的影响与空白组比较，模型组大鼠子宫组织中E2、ER、P、PR、FAP的表达明显升高。与模型组比较，各用药组子宫组织中E2、ER、P、PR、FAP的表达均有所降低，其中三棱莪术水煎液组能明显抑制子宫中ER、P、PR、FAP的表达，三棱-莪术组分配伍（1:1）高剂量组子宫组织中E2、ER、P、PR、FAP含量降低明显，较其他用药组效果好。结论：3 成都中医药大学2018届硕士学位论文以上结果表明，三棱莪术水煎液能改善气滞血瘀型子宫肌瘤大鼠外观、子宫形态，减轻子宫病理改变，明显降低大鼠血清、卵巢和子宫组织中E2、ER、P、PR、FAP的含量。三棱总黄酮、莪术挥发油和三棱莪术组分配伍不同比例对大鼠子宫形态、病理改变、血清E2、ER、P、PR、卵巢E2、ER、P、PR、子宫E2、ER、P、PR、FAP均有不同程度的抑制作用，但三棱-莪术组分配伍（1:1）高剂量组对子宫肌瘤有更好的抑制作用，该其药理作用机制可能是，同时抑制雌孕激素、雌孕激素受体以及成纤维细胞活化蛋白的表达。此外，实验结果表明大鼠子宫组织中的雌激素与成纤维细胞活化蛋白的表达呈现一定程度的正相关关系，我们推测成纤维细胞活化蛋白的高表达可能是由过荷的雌激素刺激造成的。关键词：子宫肌瘤动物模型三棱-莪术雌孕激素成纤维细胞活化蛋白（FAP）4 成都中医药大学2018届硕士学位论文AbstractObjective:UndertheguidanceofthebasictheoryofTCM,themodelofuterineleiomyomaintegratedwithQistagnationandbloodstasiswasestablishedbyusingtheestrogenandprogesteroneloadmethodcombinedwithmultifactorstimulation.Byobservingthemorphologyandpathologyoftheuterus,andanalyzingestrogen,progesterone,estrogenreceptor,progesteronereceptor,fibroblastactivationproteinexpressionintheuterus,ovariantissueandserum,wecanexploretheeffectandSynergicCompatibilityLawofRhizomaSparganicandRhizomaCurcumaecomponentcompatibilityonUterineLeiomyomainrats,basingoninnovativedrugdiscoverypatterns‘prescription-disease-syndrome,ChineseHerbs-disease-syndrome,effectcomponents-disease-syndrome,effectiveingredients-diease-syndrome’.Andtheresultwillprovidenewmethodsandnewideasforthescientificresearchandprescriptioncompatibilityoftheuterinefibroids,aswellasthescientificbasisforclinicalapplication.Method:1.Group,modelingandmedication.Atotalof88healthySpragueDawleyratswererandomlydividedinto11groups:normalcontrolgroup,modelgroup,Gongliuxiaogroup,S-Ecomponentcompatibility(1:1)highdosegroup,S-Ecomponentcompatibility(1:1)middledosegroup,S-Ecomponentcompatibility(1:1)lowdosegroup,S-Ecomponentcompatibility(1:2)group,S-Ecomponentcompatibility(2:1)group,Sgroup,Egroup,S-Edecoctiongroup.Exceptfornormalcontrolgroup,thedailygavageofeachgroupwas1.35mg/kg,andthelateralmuscleinjectionofprogesteroneinjectionwas1.0mg,lastingfor5weeks.Subcutaneousinjectionof-1adrenalinehydrochloride0.9mg/kg·dwadstartedfromthefourthweek,lastingfor2weeks.Andgivingchronicunpredictabilitystimulusfourhourslater:(1)60dbnoisestimulationfor3h,(2)dayandnightupsidedown,3.5～10℃icewaterbathswimming4min,(4)tailsuspension10min,5to50℃oventobakefor10min,giving1kindofstimulationeachday,andtoensurethateachstimulusisnotlessthan5 成都中医药大学2018届硕士学位论文2timesduringentirecycle),for2weeks.Thenormalcontrolgroupwasgivenadailyamountofdistilledwater2ml.andeveryMonday,Wednesday,Friday,wasinjectedbynormalsaline0.05ml,for5weeks.Medicinesweregivenin2hoursaftermolding.Respectivelyarenormalsaline,9%ofgongliuxiaocapsulesolution,66.7%,33.3%,16.7%ofS-E(1:1)componentcompatibilitygroupsolution,100%oftheS-E(1:2)componentcompatibilitygroupsolution,100%ofS-E(2:1)componentcompatibilitygroups,66.7%ofSgroup,66.7%ofEgroup,andS-Edecoctiongroup,for5weeks.2.Observationanddetectionofalltheindexesinrats.(1)Generalbehavioralobservationofrats.Weobservedthebehaviors,appearances,dietandsleepqualitythreetimesaday(7am,12noonand6pm),andtooknotes.(2)Uterinemorphologyandhistopathology.Theratswerefastingfor12hafterthelastadministration,andthenwetookoutthetissuesoftheuterus,removedthefat,clearedtheblood,andtookphotostorecordtheshapeoftheuterus.Weselecteduterustissueswhichhadobviouslesions(edema,nodules,cysts,vacuolardegeneration,etc.)intheuterusdividingangle.(3)Measurementofuterus,ovarycoefficientanduterinetransversediameter.Wetookoutthetissuesoftheuterus,removedthefat,clearedtheblood,andweighthewetweigh.Andthenwecalculateuterusandovarycoefficient.(4)Detectionofvariousindexesinratserum.Wecollectedbloodfromratfemoralartery,andcollectedserumafter3000r/min,centrifugationfor20min.ThecontentsofE2,ER,PandPRinserumweredeterminedbyenzyme-linkedimmunoassaykitassoonaspossible.(5)Detectionofindicatorsinovaryanduterinetissues.Wecuttherightamountoftissue,weighitandputitinthehomogenatetube;thehomogenizerwasto2000r/min,1min.serumshouldbecollectedcarefully.ThecontentsofE2,ER,PandPRintheuterusandovariesweredetectedbyenzymo-elisakit.TheFAPcontentinuterinetissuesofratswasdeterminedbytheWesternBlot.Results:1.TheeffectofS-Edecoctionanditseffectiveingredientsontheappearance,morphologyandhistopathologyofratsbasingon‘prescription-disease-sydromeandeffectiveingredients-disease-sydrom’Comparedwiththenormalcontrolgroup,theappearanceoftheratsintheother6 成都中医药大学2018届硕士学位论文groupspresentedchangessuchasdarkhaircolor,messyfur,peelingandunstablehairroots.Comparedwithnormalcontrolgroup,modelgroupratswithbilateraluterusshapechange,fromacyst,nodule,edema,bilateraluterinepathologicalchangessuchassize,shape,asymmetric,othergroupsintheratuterusappeareddifferentdegreeofedema,nodules,cysts,unequaltexturepathologicalchanges.Comparedwiththenormalcontrolgroup,theresultsofpathologicalsectionsofratsinothergroupsshowedpathologicalmanifestationssuchasdisorderedmusclefiberarrangement,thickening,myocytehyperplasiaandinflammatorycellinfiltration.TheappearanceanduterinepathologicalchangesofratsintheS-EdecoctionandS-E(1:1)highdosegroupwerelessthanthoseinothergroups.2.TheeffectofS-Edecoctionanditseffectiveingredientsonuterus,ovarycoefficientanduterinetransversediameterbasingon‘prescription-disease-sydromeandeffectiveingredients-disease-sydrom’Comparedwiththenormalcontrolgroup,theuterus,ovarycoefficientandverticaldiameterofuteruswereallincreasedinthemodelgroup.Comparedwithmodelgroup,thetreatmentgroupcoefficientofuterus,ovaryanduterusofratsbearingdiameterreducedtosomeextent,theS-EdecoctionandtheS-E(1:1)highdosegroupcouldreducecoefficientofofratsuterus,ovariesanduterusbearingdiameterobviously.3.TheeffectofS-EdecoctionanditseffectiveingredientsonthecontentofE2,ER,PandPRinratserumbasingon‘prescription-disease-sydromeandeffectiveingredients-disease-sydrom’Comparedwiththenormalcontrolgroup,thecontentofE2,ER,PandPRinserumofthemodelgroupincreasedsignificantly.Comparedwithmodelgroup,thecontentofE2,ER,P,PRcontentdecreasesintheotherrats’serum.TheS-EdecoctiongroupratsserumE2,ER,P,PRcontentreducedobviously.ThecontentofE2,PandPRinserumofratsintheS-E(1:1)highdosegroupwassignificantlydecreasedandthecontentofERwasalsodecreased.4.TheeffectofS-EdecoctionanditseffectiveingredientsonthecontentofE2,ER,PandPRinratovarybasingon‘prescription-disease-sydromeandeffectiveingredients-disease-sydrom’7 成都中医药大学2018届硕士学位论文Comparedwiththenormalcontrolgroup,thecontentofE2,ER,PandPRintheovariantissueofthemodelgroupincreasedsignificantly.Comparedwithmodelgroup,ofthecontentofE2,ER,P,PRinothergroupsarereduced,theS-EdecoctiongroupcanobviouslyinhibitovariantissueexpressionofERandP,S-E(1:1)highdosegroupofERinratovariantissue,P,PRcontentreduceobviously,E2levelsarereduced.Theresultswerebetterthanthoseofothergroups5.TheeffectofS-EdecoctionanditseffectiveingredientsonthecontentofE2,ER,P,PRandFAPinratuterusbasingon‘prescription-disease-sydromeandeffectiveingredients-disease-sydrom’Comparedwiththenormalcontrolgroup,theexpressionofE2,ER,P,PRandFAPintheuterinetissueofratsinthemodelgroupwassignificantlyincreased.Comparedwithmodelgroup,theexpressionofERandP,PR,FAPwerereducedinothergroups,theS-EdecoctiongroupcanobviouslyinhibittheexpressionofER,P,PR,FAP,S-E(1:1)highdosegroupofuterustissueE2,ER,P,PR,FAPweredecreasedobviously,andotherdrugeffectisgood.Conclusion:TheaboveresultsindicatedthatS-Edecoctioncouldimproveappearance,uterinemorphologyandpathologicchange,andinhibitedtheexpressionofE2,ER,P,PRandFAPinserum,uterusandovary.TheeffectofothergroupscouldactasS-Edecoction;however,S-Ecomponentcompatibility(1:1)highdosegrouphadabetterinhibitoryeffectonuterinefibroids.ItsmechanismmaybetheinhibitioneffectofS-EcomponentcompatibilityonE2,ER,P,PRandFAPsimultaneously.Inaddition,resultsalsoindicatedthegrowthofestrogenintheuterinetissuesofratswaspositivelycorrelatedwiththegrowthoffibroblastactivatedprotein,andthehighexpressionoffibroblastactivatedproteinmaybecausedbythestimulationofoestrogen.Keywords：UterineLeiomyoma,AnimalModel,SanLeng-Ezhu,estrogen-progestin,fibroblastactivationprotein(FAP)8 成都中医药大学2018届硕士学位论文缩略词注释表缩略词英文名称中文译名dbdecibel分贝E2Estradiol雌二醇EREstrogenReceptor雌激素受体PProgesterone孕酮PRProgesteroneReceptor孕激素受体ELISAEnzymeLinkedImmunosorbentAssay酶联免疫吸附法WBWesternBlot蛋白质印迹法FAPfibroblastactivationprotein成纤维细胞活化蛋白GAPDHglyceraldehyde-3-phosphate甘油醛-3-磷酸脱氢酶dehydrogenaseDPPDipeptidylPeptidase二肽基肽酶ECMextracellularmatrix细胞外基质GPRG-protein-coupledreceptorG蛋白偶联受体ULUterineLeiomyoma子宫肌瘤9 成都中医药大学2018届硕士学位论文简写词表简写词全称S-E1:1高组三棱-莪术组分配伍1:1高剂量组S-E1:1中组三棱-莪术组分配伍1:1高剂量组S-E1:1低组三棱-莪术组分配伍1:1高剂量组S-E1:2组三棱-莪术组分配伍1:2剂量组S-E2:1组三棱-莪术组分配伍2:1剂量组S-E水煎液组三棱-莪术水煎液组S组三棱总黄酮药液E组莪术挥发油药液10 成都中医药大学2018届硕士学位论文目录中文摘要........................................................................................................................1Abstract..........................................................................................................................5缩略词注释表................................................................................................................9简写词表......................................................................................................................10引言..............................................................................................................................141实验目的.........................................................................................................................172实验材料与方法.............................................................................................................172.1实验材料.................................................................................................................172.1.1实验动物.............................................................................................................172.1.2实验药物.............................................................................................................172.1.3实验试剂..............................................................................................................182.1.4实验仪器..............................................................................................................182.2实验方法.................................................................................................................192.2.1药物制备..............................................................................................................192.2.2动物分组及给药..................................................................................................202.2.3动物模型制备......................................................................................................202.2.4动物取材.............................................................................................................212.2.5脏器系数..............................................................................................................212.2.6子宫横径和竖径..................................................................................................212.2.7子宫病理组织观察..............................................................................................212.3统计学处理.............................................................................................................213实验结果..........................................................................................................................223.1三棱-莪术药物及组分配伍对大鼠形态的影响...................................................223.2三棱-莪术药物及组分配伍对大鼠子宫外观的影响............................................223.3三棱-莪术药物及组分配伍对大鼠子宫病理组织学的影响...............................233.4三棱-莪术药物及组分配伍对大鼠脏器系数及子宫横竖径的影响...................253.4.1基于“方病证”研究三棱莪术配伍水煎液对子宫和卵巢系数影响............253.4.2基于“有效组分与病证”研究三棱莪术组分配伍对子宫和卵巢系数影响..263.4.3基于“方病证”研究三棱莪术配伍水煎液对子宫横竖径的影响................2711 成都中医药大学2018届硕士学位论文3.4.4基于“有效组分与病证”研究三棱莪术组分配伍对子宫横竖径的影响......283.4.5小结......................................................................................................................303.5三棱-莪术药物及组分配伍对大鼠血清中E2、ER、P和PR的影响..................313.5.1基于“方病证”研究三棱莪术配伍水煎液对大鼠血清中E2和ER的浓度的影响.....................................................................................................................................313.5.2基于“有效组分与病证”研究三棱莪术组分配伍对大鼠血清中E2和ER的浓度的影响.........................................................................................................................323.5.3基于“方病证”研究三棱莪术配伍水煎液对大鼠血清中P和PR的浓度的影响.....................................................................................................................................333.5.4基于“有效组分与病证”研究三棱莪术组分配伍对大鼠血清中P和PR的浓度的影响.........................................................................................................................353.6三棱-莪术药物及组分配伍对大鼠卵巢组织中E2、ER、P和PR的影响..........363.6.1基于“方病证”研究三棱莪术配伍水煎液对大鼠卵巢中E2和ER浓度的影响.........................................................................................................................................363.6.2基于“有效组分与病证”研究三棱莪术组分配伍对大鼠卵巢中E2和ER浓度的影响.............................................................................................................................373.6.3基于“方病证”研究三棱莪术配伍水煎液对大鼠卵巢中P和PR浓度的影响.........................................................................................................................................393.6.4基于“有效组分与病证”研究三棱莪术组分配伍对大鼠卵巢中P和PR浓度的影响.............................................................................................................................403.7三棱-莪术药物及组分配伍对大鼠子宫组织中E2、ER、P、PR和FAP的影响423.7.1基于“方病证”研究三棱莪术配伍水煎液对大鼠子宫中E2和ER浓度的影响.........................................................................................................................................423.7.2基于“有效组分与病证”研究三棱莪术组分配伍对大鼠子宫中E2和ER浓度的影响.............................................................................................................................433.7.3基于“方病证”研究三棱莪术配伍水煎液对大鼠子宫中P和PR浓度的影响.........................................................................................................................................443.7.4基于“有效组分与病证”研究三棱莪术组分配伍对大鼠子宫中P和PR浓度的影响.............................................................................................................................463.7.5基于“方病证”研究三棱莪术配伍水煎液对大鼠子宫中FAP浓度的影响473.7.6基于“有效组分与病证”研究三棱莪术组分配伍对大鼠子宫中FAP表达的影响.....................................................................................................................................483.8小结：......................................................................................................................4912 成都中医药大学2018届硕士学位论文4讨论..................................................................................................................................514.1、关于三棱-莪术水煎液的药效问题.....................................................................514.2、关于三棱-莪术组分配伍的用药比例问题.........................................................514.3、成纤维细胞的活化与子宫肌瘤...........................................................................524.4、成纤维细胞活化蛋白与雌激素...........................................................................545结论..................................................................................................................................56创新性与特色..............................................................................................................57不足与展望..................................................................................................................58致谢..........................................................................................................................59附录1子宫肌瘤的病因学研究进展......................................................................60附录2子宫肌瘤的治疗学研究进展......................................................................61附录3成纤维细胞活化蛋白（FAP）的研究进展................................................63参考文献......................................................................................................................66在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果..................................................7013 成都中医药大学2018届硕士学位论文引言子宫肌瘤（UterineLeiomyoma，UL）是育龄期妇女生殖系统最常见的良性肿瘤，在绝经前女性中有较高的发病率。其中约20%-40%的患者有明显的临床症[1]状并寻求妇产科治疗。由于患病初期症状不明显，所以临床报道发病率远低于真实发病率。子宫肌瘤的主要临床症状包括不正常的子宫出血、盆腔压迫性疼痛、[2]不孕、习惯性流产等，较大的子宫肌瘤是行子宫切除术的主要原因。约3%-5%[3]的怀孕妇女患有子宫肌瘤，其中粘膜下和肌壁间肌瘤大大增加了自发性流产、胎位不正、胎盘前置、早产、剖腹产和产后出血的风险，对生育结果有较大的不[4,5]良影响。子宫肌瘤由增生肥大的平滑肌细胞、成纤维细胞和细胞外基质构成，[6]子宫肌瘤的发生、发展与雌孕激素和雌孕激素受体的高表达密切相关。雌孕激素及其受体可促进肌瘤细胞的增生和血管的生长。研究证实FAP在一些基质成纤[7][8]维细胞活化的疾病中有表达，如创面愈合、瘢痕组织、骨关节炎、动脉粥样[9][10]硬化、肝硬化等疾病，成纤维细胞活化蛋白的高表达与成纤维细胞的增殖密切相关,往往意味着活化的成纤维细胞也会增多；成纤维细胞活化蛋白还可溶解细胞外基质中的蛋白、胶原纤维等，为肿瘤的增长提供空间；活化的成纤维细胞又可分泌生长因子等促进细胞外基质的堆积，是瘤体增大。总之成纤维细胞活化蛋白广泛参与了细胞、细胞外基质的堆积和肿瘤内组织的重构。而关于成纤维细胞活化蛋白与子宫肌瘤的关系的研究鲜有报道。子宫肌瘤由增生肥大的平滑肌细胞、成纤维细胞和细胞外基质构成，基于成纤维细胞活化蛋白在肿瘤组织中的作用，我们有理由推测成纤维细胞活化蛋白和子宫肌瘤的发生发展有重要联系。通过对子宫肌瘤患者的中医诊断，可将子宫肌瘤归入中医“癥瘕”、“积聚”的范畴。癥为腹内有形坚硬结块，按之应手，推之不动。多因寒热失宜，情志失调，饮食不节至在脏腑之气虚弱、气血滞涩，聚结在内而为癥。见于《金匮要略·妇人妊娠病脉证并治》：“妇人宿有癥病，经断未及三月，而得漏下不止，胎动在脐上者，为癥痼害……”。宋朝《妇人良方大全》中提出“血癥”。古人多将癥分为两类：食癥和血癥。食癥多为饮食不节所致，血癥所谓气聚血凝，气血滞涩所致。治以行气破血消癥，使气血流通。瘕为脐下，腹部肿块，推之可移，痛无定处。因寒热失宜，饮食不消，与脏器相搏，积在腹内，随气移动，去来无常。见于《素14 成都中医药大学2018届硕士学位论文问·骨空论篇》：“男子内结七疝，女子带下瘕聚”，《灵枢·水胀篇》描述石瘕为：“石瘕生于胞中，日以益大，状如怀子，月事不以时下，皆生于女子”。《诸病源候论》曰：“八瘕者，皆胞胎生产，月水往来，血脉精气不调所生也”。《类证治裁》曰：“八瘕，皆生于左胞宫，右子户，多由经行交合，小腹满急，经血瘀阻，因成瘕聚，如怀孕，甚则溺涩，痛苦如淋，令人无子”。治以行气活血散瘀。积为腹腔有形结块，固定不移，痛有定处。多因寒热失宜，饮食不节，情志不调，抑制气血滞涩，郁结积久而成。见于《难经·第五十五难》：“气之所积名曰积……积者阴气也，其始发有常处，其痛不离其部，上下有所始终，左右有所穷处”。聚，无形质，无定处。由饮食失节，情志失常所致。见于《难经·五十五难》：“聚者，阳气也”，“六腑所成”。癥积皆为有形之邪，按之应手，痛有定处，推之不移。瘕聚多无具体形质，推之可移，痛有定处。癥积之病多在血分，易引起器质性损伤，病程较长，难以消除，不易痊愈。瘕聚之邪多在气分，易引起功能性变化，病程一般较短，易消除，易痊愈。通过对近几年来中医诊治子宫肌瘤的文献的分析，子宫肌瘤的中医证型多达40种，其中约17.09%的案例病证类型为气滞血瘀型，占比最高。所用频次比较多的232味中药中，莪术的应用频次为193次，三棱的用药频次为173次，分别位居第一、二位。针对子宫肌瘤的用药[11]归经以肝经为主，脾经次之，其余为归心经、肾经等。莪术，辛、苦，温，归肝、脾经。功能破血行气，消积止痛。应用于癥瘕积聚、经闭及心腹瘀痛，亦可用于食积脘腹胀痛。《药品化义》：“蓬术味辛性烈，专攻气中之血，主破积消坚，去积聚癖块，经闭血瘀，扑损疼痛。与三棱功用颇[12]同”。莪术的有效组分为莪术油，莪术油具有抗肿瘤作用，其主要活性成分和指标性成分包括莪术醇、莪术二酮、β-榄香烯、吉玛酮，这些成分具有抗肿瘤的作用。有关莪术油抗肿瘤作用的谱效关系表明，莪术油活性成分的抗癌作用是这些有效成分共同作用的结果，作用大小依次为莪术醇＞莪术二酮＞β-榄香烯﹥吉玛酮。莪术还可通过移植血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶的表达，改善蛋白[13]合成，达到保肝降酶的作用，同时可预防肝纤维化。莪术同样具有抗炎、镇痛的作用，研究表明莪术醇提物和水提物均可减轻小鼠因醋酸引起的疼痛，减少因疼痛而产生的扭体作用，这种作用呈浓度依赖性。对二甲苯导致的耳廓肿胀、冰醋酸导致的毛细血管棉球肉芽肿也有较好的抑制作用，且随着剂量的增高作用不15 成都中医药大学2018届硕士学位论文[14]断增强。由此可见，莪术醇提物对各种炎症都具有良好的抗炎作用。另有研究表明，莪术醇提物对化学物刺激引起的疼痛的抑制作用，可能与中药莪术的活血[15]化瘀作用有关。三棱，辛、苦，平。归肝、脾经，功能破血行气，消积止痛。用于癥瘕痞块，痛经，瘀血经闭，胸痹心痛，食积胀痛。研究表明三棱能抑制血小板聚集和抗血[16][17]栓，对动脉粥样硬化有治疗作用；同时三棱总黄酮还可通过抑制血管内皮生[18][19]长因子（VEGF），从而抑制血管生成；孟冰等研究表明三棱对局灶性脑缺血、再灌注损伤、缺氧的小鼠有保护作用，可使缺氧区损伤程度改善，降低脑组织的[20]水肿程度；三棱总黄酮具有抗炎、镇痛作用，能抑制炎症细胞肿瘤坏死因子、白介素-6、白介素-1β等炎症因子的表达。三棱还具有抗肿瘤的作用，能够抑制人肺腺癌A549细胞、人肝癌HepG2细胞、乳腺癌ZR-75-1细胞的增殖，增加活[21]性氧的产生和天冬氨酸蛋白水解酶-3的分解，进而促进肿瘤细胞的凋亡。三[22]棱的有效成分为三棱总黄酮，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等作用。三棱偏于破血，莪术偏于破气。《医学衷中参西录》：“三棱气味俱淡，微有辛意；莪术味微苦，亦微有辛意，性皆微温，为化瘀血之要药。若细核二药之区别，化血之力三棱优于莪术，理气之力莪术优于三棱”。三棱所治病证与莪术基本相同，临床常[23][24][25]相须为用。二药配伍常用于痛经、卵巢囊肿、子宫肌瘤等妇产科疾病。《医学衷中参西录》上册所载：理冲汤，其中三棱、莪术各9克，功能益气行血，调经祛瘀，全方主治妇女经闭不行，脏腑癥瘕积聚。《经验良方》中的三棱丸，初见三棱、莪术相须配伍，功能行气止痛、活血散瘀、消积化癥，多用于“癥瘕”、“积聚”等病证。本实验采用雌孕激素负荷法结合多因素刺激法构建气滞血瘀子宫肌瘤模型，在“方病证、药病证、有效组分与病证、有效成分与病证”理论指导下，根据中医发病机理和中药治疗经验对大鼠子宫肌瘤进行干预治疗，研究三棱、莪术对大鼠子宫肌瘤的治疗效果及配伍规律。16 成都中医药大学2018届硕士学位论文1实验目的在中医基础理论的指导下，采用雌孕激素负荷法结合多因素刺激法建立气滞血瘀型子宫肌瘤病证结合动物模型。通过观察子宫形态和病理，分析大鼠子宫组织、卵巢组织和血清中的雌激素、孕激素、雌激素受体、孕激素受体、成纤维细胞活化蛋白的表达，基于“方病证、药病证、有效组分与病证、有效成分与病证”创新药物发现模式，从整体、器官、组织、分子多层次探究三棱-莪术组分配伍水煎液、三棱-莪术组分及组分配伍对气滞血瘀型子宫肌瘤的防治作用与作用机制及三棱莪术相须配伍规律，为子宫肌瘤的科学研究、方剂配伍规律研究提供新方法、新思路，为临床应用提供一定科学依据。2实验材料与方法2.1实验材料2.1.1实验动物SPF级成年雌性未孕SD大鼠，体重180-220g，88只，由简阳达硕动物科技有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK（川）2013-24。检疫后备用，正常光照条件，适宜湿度、温度，自由摄食、水，适应性饲养3天。2.1.2实验药物三棱饮片，规格：0.5kg/袋，生产批号：170901，四川恒康源药业有限公司；莪术饮片，规格：0.5kg/袋，生产批号：170301，四川原上草中药饮片有限公司；宫瘤消胶囊，规格：0.5g/粒，生产批号：170224，山东步长神州制药有限公司；己烯雌酚，货号：1017202，山东西亚化学工业有限公司；黄体酮注射液，规格：20mg/ml，批号：150610，浙江仙琚制药股份有限公司；盐酸肾上腺素注射液，规格：1mg/ml，批号：160401，远大医药（中国）有限公司；生理盐水，规格：500ml/瓶，生产批号：B17111102，山东科伦药业有限公司。17 成都中医药大学2018届硕士学位论文2.1.3实验试剂RIPA组织细胞快速裂解液，货号：R0020，北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒，货号：PICPI23223，赛默飞世尔科技有限公司；Tris-HCl,pH=8.8电泳缓冲液，货号：T1010，北京索莱宝科技有限公司；Tris-HCl,pH=6.8电泳缓冲液，货号：T1020，北京索莱宝科技有限公司；10%SDS，货号：S1010，北京索莱宝科技有限公司；10%过硫酸铵，货号：A1030，北京索莱宝科技有限公司；TEMED，货号：T8090，北京索莱宝科技有限公司；4×蛋白上样缓冲液，货号：P1015，北京索莱宝科技有限公司；蛋白预染Marker，货号：SM1811，Fermentas公司；NC膜，货号HATF00010，密理博中国有限公司；脱脂奶粉，B7306，内蒙古伊利实业集团股份有限公司；发光液，货号：WBKLS0100，密理博中国有限公司；PBS磷酸盐缓冲液，货号：P1010，北京索莱宝科技有限公司；吐温-80，货号：P1754，北京白鲨易科技有限公司；吐温-20，货号：T8220，北京白鲨易科技有限公司；FAP抗体，货号：ab28244，abcam；GAPDH，货号：Ab22555，abcam；羊抗兔HRP标记二抗，货号：A0208，碧云天。Rat雌二醇（E2），ELSA，货号：XL-Er0478，规格：96孔/盒，abcam生产；Rat孕激素（P），ELSA，货号：XL-Er0477，规格：96孔/盒；Rat雌激素受体（ER），ELSA，货号：XL-Er1021，规格：96孔/盒；Rat孕激素受体（PR），ELSA，货号：XL-Er0474，规格：96孔/盒。2.1.4实验仪器酶标仪，型号：VARIOSKANLUX，赛默飞世尔仪器有限公司；电泳仪，型号：miniprotean3cell，BIO－RAD公司；电转仪，型号：TE77XP，HOEFER公司；水浴锅，型号：HH-8，金坛市医疗仪器厂；正置显微镜，型号：CX41，OLYMPUS公司产品；恒温烘箱，上海恒一科学仪器有限公司产品；石蜡切片机，型号：SQ2125，徕克公司产品；摊片机，型号：PPTHK-21B徕克公司产品；移液器，型号：LZ02087，Thermo公司产品；数码相机，型号：D5100，NIKON公司产品。18 成都中医药大学2018届硕士学位论文2.2实验方法2.2.1药物制备2.2.1.1三棱总黄酮制备将三棱饮片打成粗粉并过40目筛，取适量三棱药粉置于圆底烧瓶中，加入70%乙醇（液料比1:16），浸泡30min后，电热套加热，微沸回流提取2次，每次1.5小时。合并滤液，旋转蒸发仪减压回收溶剂，将收集到的浓缩液用石油醚对进行脱脂，脱脂后的样品进行聚酰胺柱层析。先用蒸馏水洗脱，然后用乙醇洗脱，将洗脱液回收乙醇，配制成1g生药/mL的溶液，4℃冰箱保存。2.2.1.2莪术挥发油制备取适量药材，加入适量的自来水，按水蒸气蒸馏法进行提取。将挥发油配制成1g生药/mL的溶液，加吐温80配成乳化剂，4℃冰箱保存。2.2.1.3三棱总黄酮-莪术挥发油组分配伍药液制备三棱-莪术不同配伍比例，按照三棱总黄酮和莪术挥发油按生药量进行折算配置。临用前加吐温80配成乳化剂（用量﹤1%）。2.2.1.4三棱-莪术水煎液的制备取三棱-莪术（1:1）适量，打成粉末过40目筛，加水浸泡1小时，煎煮2次，每次1小时，合并滤液并浓缩为1g生药/ml溶液。2.2.1.5宫瘤消胶囊药液制备取出宫瘤消胶囊的内容物，用蒸馏水溶解混匀，配置成0.09g/ml药液，置于4℃冰箱保存，用前摇匀。19 成都中医药大学2018届硕士学位论文2.2.2动物分组及给药空白组：空白对照组模型组：气滞血瘀型子宫肌瘤组阳药组：宫瘤消胶囊阳性药物对照组S-E1:1高组：三棱总黄酮-莪术挥发油组分配伍1:1高剂量组S-E1:1中组：三棱总黄酮-莪术挥发油组分配伍1:1中剂量组S-E1:1低组：三棱总黄酮-莪术挥发油组分配伍1:1低剂量组S-E1:2组：三棱总黄酮-莪术挥发油组分配伍1:2组S-E2:1组：三棱总黄酮-莪术挥发油组分配伍2:1组S组：三棱总黄酮组E组：莪术挥发油组S-E水煎液组：三棱-莪术水煎液组每日于己烯雌酚造模后2h给予中药灌胃，阳药组灌宫瘤消胶囊药液10ml/kg，66.7%、33.3%、16.7%的三棱莪术（1:1）配伍组药液、100%的三棱莪术（1:2）配伍组药液、100%的三棱莪术（2:1）配伍组药液、66.7%的三棱总黄酮药液、66.7%的莪术挥发油药液、三棱-莪术水煎液，连续5周。空白组与模型组灌生理盐水10ml/kg。2.2.3动物模型制备将大鼠适应性喂养3天，随机分11组，每组8只。除空白组外，其他各组每日灌胃给予己烯雌酚药液1.35mg/kg,另每周一、三、五下肢外侧肌肉注射黄体酮注射液1.0mg/只，连续5周；从第4周开始皮下注射盐酸肾上腺素注射液-10.9mg/kg·d，4小时后给予慢性不可预见性刺激（①60db噪音刺激连续3h，②昼夜颠倒，③5-10℃冰水浴游泳4min，④悬尾10min，⑤50℃烘箱烘10min，20 成都中医药大学2018届硕士学位论文每日随机给予1种刺激，并保证整个周期中每种刺激不少于2次），连续2周。空白组每日给予生理盐水2ml，另每周一、三、五下肢外侧肌肉注射生理盐水0.05ml/只，连续5周。2.2.4动物取材各组大鼠最后一次用药后，禁食不禁水12h，称重后，取大鼠血清、子宫、卵巢，脏器称重，子宫测量分角下最大的竖径、横径，卵巢一半固定于固定液中，另一半置液氮中保存。子宫称重后，每个样本分为3份，铝箔纸包好，贴好标签纸，分装后置于液氮中保存。2.2.5脏器系数大鼠解剖后，取出所需脏器，剔除各脏器表面脂肪，清除血迹，称取各脏器湿重，计算子宫和卵巢脏器系数（脏器系数=脏器湿重/大鼠体重*100）。2.2.6子宫横径和竖径游标卡尺测量子宫分角上的部分。竖径为子宫两分支中较长一支的长度，横径为子宫两分支中最宽处的长度。2.2.7子宫病理组织观察取子宫分角上病理改变较典型部位的组织，制作病理切片。2.3统计学处理用SPSS21.0统计学软件对实验数据进行分析处理，结果以均数（X）±标准差（S）表示。若方差齐，采用单因素方差分析法及LSD检验；若方差不齐，则采用多样本比较的非参数检验。差异水平以P＜0.05具有统计学意义，P＜0.01差异显著。21 成都中医药大学2018届硕士学位论文3实验结果3.1三棱-莪术药物及组分配伍对大鼠形态的影响造模前，各组大鼠性情温和，行为正常，毛色柔顺有光泽，饮食饮水量正常。造模后，除空白组大鼠外，其余组大鼠饮食饮水尚可，性情略烦躁，毛色暗淡无光泽、皮毛凌乱、脱落、毛根不固（图1）。图1为造模后大鼠外观图。注：A为空白组大鼠，B、C、D为其他组外观改变较典型的大鼠3.2三棱-莪术药物及组分配伍对大鼠子宫外观的影响空白组（图2-A），可见两侧子宫左右对称，呈Y形，横竖径正常，质地均匀，未见结节、囊肿，颜色鲜亮呈粉红色；造模后，模型组（图2-B），可见两侧子宫不对称，横竖径均有增大，宫体可见囊肿，颜色暗淡；阳药组（图2-C），可见两侧子宫囊肿、结节，横竖径增大，颜色淡红；S-E1：1高剂量组（图2-D），宫体可见水肿、结节，横竖径增大，颜色淡红；S-E1：1中剂量组（图2-E），可见双侧子宫不对称，宫体可见水肿，横竖径增大，颜色淡红；S-E1：1中剂量组（图2-F），可见双侧子宫不对称，宫体水肿，横竖径增大，颜色暗淡；；S-E1：2组(图2-G)，可见宫体质地不均，宫颈处有囊肿，竖径增大，颜色淡红；S-E2：1组（图2-H），可见双侧子宫不对称，宫体水肿，横竖径增大，颜色淡白透亮；S组（图2-I），可见双侧子宫不对称，宫体质地不均，有囊肿、结节，竖径增大，颜色暗淡；E组(图2-J)，可见宫体囊肿，竖径增大，颜色暗淡；S-E22 成都中医药大学2018届硕士学位论文水煎液组（图2-K），可见宫体水肿，横竖径增大，颜色淡白透亮。图2为各组大鼠子宫大体观。注：A：空白组；B：模型组；C：阳药组；D：S-E1：1高剂量组；E：S-E1：1中剂量组；F：S-E1：1低剂量组；G：S-E1：2组；H：S-E2：1组；I：S组；J：E组；K：S-E水煎液组3.3三棱-莪术药物及组分配伍对大鼠子宫病理组织学的影响空白组（图3-A），子宫平滑肌细胞排列正常，数量正常，体积正常，未见明显病变；模型组(图3-B)，子宫平滑肌纤维排列紊乱，黏膜上皮细胞少量增生，肌间可见炎性细胞浸润；阳药组（图3-C），可见肌纤维排列紊乱，肌纤维稍有增厚，肌细胞稍有增加，偶见少量炎性细胞浸润；S-E1：1高剂量组（图3-D），23 成都中医药大学2018届硕士学位论文可见肌细胞排列紊乱、增厚，肌间炎性细胞浸润；S-E1：1中剂量组（图3-E），可见肌纤维紊乱、增厚，肌细胞稍有增加，炎性细胞浸润；S-E1：1低剂量组（图3-F），可见少量粘膜上皮细胞空泡变性，肌纤维稍有增厚；S-E1：2组（图3-G），可见粘膜上皮细胞空泡变性，肌层少量炎性细胞浸润，肌纤维排列紊乱；S-E2：1组（图3-H），可将肌纤维排列紊乱，稍有增厚，肌间炎性细胞浸润，偶见少量粘膜上皮细胞空泡变性；S组（图3-I），可见肌纤维稍有增厚，少量粘膜细胞水肿，肌间稍有炎性细胞浸润；E组（图3-J），可见肌纤维排列紊乱，肌间炎性细胞浸润，黏膜上皮细胞空泡变性；S-E水煎液组（图3-K），可见肌纤维排列紊乱，偶见少量细胞水肿、充血，偶见少量炎性细胞浸润。图3为各组大鼠子宫病理切片（×200）。注：A：空白组；B：模型组；C：阳药组；D：S-E1：1高剂量组；E：S-E1：1中剂量组；F：S-E1：1低剂量组；G：S-E1：2组；H：S-E2：1组；I：S组；J：E组；K：S-E水煎液组24 成都中医药大学2018届硕士学位论文3.4三棱-莪术药物及组分配伍对大鼠脏器系数及子宫横竖径的影响3.4.1基于“方病证”研究三棱莪术配伍水煎液对子宫和卵巢系数影响与空白组比较，模型组子宫系数明显增大，差距具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，S组、E组和三棱莪术水煎液组大鼠子宫系数有所降低，其中三棱莪术水煎液组降低较多，但差别无统计学意义（P＞0.05）（见表1-1和图1-1）。与空白组比较，模型组卵巢系数明显增大，差距具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，S组、E组大鼠卵巢系数有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），三棱莪术水煎液组大鼠卵巢系数明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）（见表1-1和图1-1）。表1-1三棱莪术水煎液对各组大鼠子宫系数和卵巢系数的影响（X±S，n=8）组别剂量（g/kg）子宫系数卵巢系数空白组—0.27±0.100.03±0.01****模型组—0.57±0.080.06±0.01#阳药组0.900.47±0.100.04±0.01S组3.330.53±0.140.05±0.02E组3.330.57±0.040.05±0.01#水煎液组3.33+3.330.50±0.060.04±0.01###注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，P<0.05，P<0.01。25 成都中医药大学2018届硕士学位论文图1-1三棱莪术水煎液对各组大鼠子宫系数和卵巢系数的影响3.4.2基于“有效组分与病证”研究三棱莪术组分配伍对子宫和卵巢系数影响与空白组比较，模型组子宫系数明显增大，差距具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，S-E1:1高、S-E1:1中、S-E1:1低、S-E1:2、S-E2:1组大鼠子宫系数有所降低，其中S-E1:1高剂量组降低较多。但差别无统计学意义（P＞0.05）（见表1-2和图1-2）。与空白组相比，模型组卵巢系数明显增大，差距具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳药组、S-E1:1高、S-E1:1中、S-E1:1低、S-E1:2、S-E2:1大鼠卵巢系数明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。其他各用药组大鼠卵巢系数虽然有所减小，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表1-2和图1-2）。表1-2三棱-莪术组分配伍对各组大鼠子宫系数和卵巢系数的影响（X±S，n=8）组别剂量（g/kg）子宫系数卵巢系数空白组—0.27±0.100.03±0.01****模型组—0.57±0.080.06±0.01#阳药组0.900.47±0.100.04±0.0126 成都中医药大学2018届硕士学位论文#S-E1:1高3.33+3.330.49±0.090.04±0.01#S-E1:1中1.67+1.670.54±0.090.05±0.01#S-E1:1低0.83+0.830.56±0.060.05±0.02#S-E1:23.33+6.670.56±0.100.04±0.01#S-E2:16.67+3.330.54±0.140.04±0.01###注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，P<0.05，P<0.01。图1-2三棱-莪术组分配伍对各组大鼠子宫系数和卵巢系数的影响3.4.3基于“方病证”研究三棱莪术配伍水煎液对子宫横竖径的影响与空白组相比，模型组大鼠子宫横径明显增大，差距具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，S组、E组大鼠横径有所减小，但差异无统计学意义（P＞0.05），S-E水煎液组大鼠卵巢系数明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）（见表1-3和图1-3）。与空白组相比，模型组大鼠子宫竖径明显增大，差距具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，S组、E组大鼠竖径有所降低，但差距无统计学意义（P＞0.05），水煎液组大鼠卵巢系数明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）27 成都中医药大学2018届硕士学位论文（见表1-3和图1-3）。表1-3三棱莪术水煎液对各组大鼠子宫横竖径的影响（X±S，n=8）组别剂量（g/kg）子宫横径（mm）子宫竖径（mm）空白组—3.09±0.7225.75±2.36****模型组—5.39±0.7941.12±4.33##阳药组0.904.52±0.3332.70±3.02S组3.335.58±0.5140.69±6.06E组3.335.45±0.9340.07±6.40##水煎液组3.33+3.334.56±0.3635.75±3.38###注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，P<0.05，P<0.01。图1-3三棱莪术水煎液对各组大鼠子宫横竖径的影响3.4.4基于“有效组分与病证”研究三棱莪术组分配伍对子宫横竖径的影响与空白组相比，模型组大鼠子宫横径明显增大，差距具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳药组、S-E1:1高剂量组、S-E水煎液组大鼠卵巢系数明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。S-E1:1中剂量组、S-E1:128 成都中医药大学2018届硕士学位论文低剂量组、S-E1:2组、S-E2:1组大鼠横径有所减小，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表1-4和图1-4）。与空白组相比，模型组大鼠子宫竖径明显增大，差距具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳药组、S-E1:1高、S-E1:1中、S-E1:1低、S-E1:2组大鼠卵巢系数明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），S-E2:1组、S组、E组大鼠竖径有所降低，但差距无统计学意义（P＞0.05）（见表1-4和图1-4）。表1-4三棱-莪术组分配伍对各组大鼠子宫横竖径的影响（X±S，n=8）组别剂量（g/kg）子宫横径（mm）子宫竖径（mm）空白组—3.09±0.7225.75±2.36****模型组—5.39±0.7941.12±4.33##阳药组0.904.52±0.3332.7±3.02##S-E1:1高3.33+3.334.49±0.5936.13±3.74#S-E1:1中1.67+1.675.25±0.8335.94±2.52#S-E1:1低0.83+0.835.63±0.6935.50±2.13#S-E1:23.33+6.675.88±0.3935.95±5.17S-E2:16.67+3.335.88±0.5937.31±4.27###注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，P<0.05，P<0.01。29 成都中医药大学2018届硕士学位论文图1-4三棱-莪术组分配伍对各组大鼠子宫横竖径的影响3.4.5小结由上述结果可以看出，造模后，模型组大鼠子宫和卵巢质量增大，子宫和卵巢系数较空白组明显上升，经各组实验药物干预治疗后，大鼠子宫和卵巢质量、脏器系数均有不同程度的下降，其中阳药组，S-E1:1高剂量组，阳药组、S-E1:1高、S-E1:1中、S-E1:1低、S-E1:2、水煎液组效果较好；造模后，模型组大鼠子宫横径和竖径较空白组明显升高，经各组实验药物干预治疗后，大鼠子宫横径和竖径均有不同程度缩小，其中阳药组、S-E1:1高剂量组、S-E水煎液组效果较好。30 成都中医药大学2018届硕士学位论文3.5三棱-莪术药物及组分配伍对大鼠血清中E2、ER、P和PR的影响3.5.1基于“方病证”研究三棱莪术配伍水煎液对大鼠血清中E2和ER的浓度的影响与空白组比较，模型组大鼠血清中的E2浓度明显升高，差异具有显著的统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，E组大鼠血清中的E2浓度降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），三棱莪术水煎液组大鼠血清中的E2浓度明显降低，差异具有显著的统计学意义（P＜0.01）（见表2-1和图2-1）。与空白组比较，模型组大鼠血清中ER浓度明显升高，差异有显著的统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，E组大鼠血清中的ER浓度明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05)，三棱莪术水煎液组大鼠血清中ER浓度明显降低，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）（见表2-1和图2-1）。表2-1三棱-莪术水煎液对大鼠血清中E2和ER浓度的影响（X±S，n=8）组别剂量（g/kg）E2(ng/L)ER(ng/ml)空白组—57.02±5.012.67±0.23****模型组—90.42±17.295.58±2.03####阳药组0.9067.66±8.023.65±0.50S组3.3392.28±18.365.71±2.58#E组3.3387.50±15.994.28±1.04####水煎液组3.33+3.3378.82±14.033.96±0.73###注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，P<0.05，P<0.01。31 成都中医药大学2018届硕士学位论文图2-1三棱-莪术水煎液对大鼠血清中E2和ER浓度的影响3.5.2基于“有效组分与病证”研究三棱莪术组分配伍对大鼠血清中E2和ER的浓度的影响与空白组比较，模型组大鼠血清中的E2浓度明显升高，差异具有显著的统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳药组、S-E1:1高、S-E1:1中剂量组大鼠血清中的E2浓度明显降低，差异具有显著的统计学意义（P＜0.01），S-E1:1低、S-E2:1组大鼠血清中的E2浓度明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），S-E1:2、E组大鼠血清中的E2浓度降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表2-2和图2-2）。与空白组比较，模型组大鼠血清中ER浓度明显升高，差异有显著的统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳药组、S-E1:1低、水煎液组大鼠血清中ER浓度明显降低，差异具有显著统计学意义（P＜0.01），S-E1:1高、S-E1:1中、S-E1:2、E组大鼠血清中的ER浓度明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05)（见表2-2和图2-2）。32 成都中医药大学2018届硕士学位论文表2-2三棱-莪术组分配伍对大鼠血清中E2和ER浓度的影响（X±S，n=8）组别剂量（g/kg）E2（ng/L）ER(ng/ml)空白组—57.02±5.012.67±0.23****模型组—90.42±17.295.58±2.03####阳药组0.9067.66±8.023.65±0.50##S-E1:1高3.33+3.3379.47±12.965.39±2.60##S-E1:1中3.33+3.3379.47±12.965.39±2.60###S-E1:1低1.67+1.6776.30±11.264.49±0.64#S-E1:2组3.33+6.6787.10±14.424.99±1.33#S-E2:1组6.67+3.3382.96±17.155.78±3.21###注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，P<0.05，P<0.01。图2-2三棱-莪术组分配伍对大鼠血清中E2和ER浓度的影响3.5.3基于“方病证”研究三棱莪术配伍水煎液对大鼠血清中P和PR的浓度的影响与空白组比较，模型组大鼠血清中的P浓度明显升高，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，三棱莪术水煎液组大鼠血清中的P浓度明显降33 成都中医药大学2018届硕士学位论文低，差异具有显著统计学意义（P＜0.01），S组、E组大鼠血清中P的浓度有降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表2-3和图2-3）。与空白组比较，模型组大鼠血清中的PR浓度明显升高，差异具有明显的统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，水煎液组大鼠血清中PR浓度明显降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01），E组大鼠血清中PR浓度明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05)，S组大鼠血清中PR浓度有降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表2-3和图2-3）。表2-3三棱-莪术水煎液对大鼠血清中P和PR浓度的影响（X±S，n=8）组别剂量（g/kg）P(ng/ml)PR(ng/ml)空白组—18.53±1.903.23±0.24****模型组—45.85±10.919.68±2.14####阳药组0.9026.10±4.384.67±0.50S组3.3340.29±4.747.35±0.53#E组3.3339.30±8.177.76±1.11####水煎液组3.33+3.3324.60±1.706.46±0.58###注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，P<0.05，P<0.01。图2-3三棱-莪术水煎液对大鼠血清中P和PR浓度的影响34 成都中医药大学2018届硕士学位论文3.5.4基于“有效组分与病证”研究三棱莪术组分配伍对大鼠血清中P和PR的浓度的影响与空白组比较，模型组大鼠血清中的P浓度明显升高，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳药组、S-E1:1高剂量组组大鼠血清中的P浓度明显降低，差异具有显著统计学意义（P＜0.01），S-E2:1组大鼠血清中P浓度明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05)，S-E1:1中、S-E1:1低、S-E1:2组大鼠血清中P的浓度有降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表2-4和图2-4）。与空白组比较，模型组大鼠血清中的PR浓度明显升高，差异具有明显的统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳药组、S-E1:1高剂量组大鼠血清中PR浓度明显降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01），S-E1:1中、S-E1:2、S-E2:1组大鼠血清中PR浓度明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05)，S-E1:1低剂量组大鼠血清中PR浓度有降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表2-4和图2-4）。表2-4三棱-莪术组分配伍对大鼠血清中P和PR浓度的影响（X±S，n=8）组别剂量（g/kg）P（ng/ml）PR(ng/ml)空白组—18.53±1.903.23±0.24****模型组—45.85±10.919.68±2.14####阳药组0.9026.10±4.384.67±0.50####S-E1:1高3.33+3.3328.34±5.195.16±0.40#S-E1:1中1.67+1.6737.62±5.057.60±0.85S-E1:1低0.83+0.8337.30±8.947.46±0.26#S-E1:23.33+6.6739.68±8.827.24±0.26##S-E2:16.67+3.3334.55±6.297.54±1.08###注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，P<0.05，P<0.01。35 成都中医药大学2018届硕士学位论文图2-4三棱-莪术组分配伍对大鼠血清中P和PR浓度的影响3.6三棱-莪术药物及组分配伍对大鼠卵巢组织中E2、ER、P和PR的影响3.6.1基于“方病证”研究三棱莪术配伍水煎液对大鼠卵巢中E2和ER浓度的影响与空白组比较，模型组大鼠卵巢中E2浓度明显升高，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；S组、E组、水煎液组大鼠卵巢中E2浓度有所升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表3-1和图3-1）。与空白组比较，模型组大鼠卵巢中ER浓度明显升高，差异有显著的统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，水煎液组大鼠卵巢中ER浓度明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），S组、E组大鼠卵巢中的ER浓度明显降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表3-1和图3-1）。36 成都中医药大学2018届硕士学位论文表3-1三棱-莪术水煎液对大鼠卵巢中E2和ER浓度的影响（X±S，n=8）组别剂量（g/kg）E2（ng/L）ER(ng/ml)空白组—72.03±17.6714.03±0.82****模型组—172.09±9.0420.60±0.51##阳药组0.90148.99±18.9116.29±0.78S组3.33173.34±40.6519.17±0.86E组3.33172.39±34.5819.11±0.83#水煎液组3.33+3.33178.08±32.1218.83±0.50###注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，P<0.05，P<0.01。图3-1三棱-莪术水煎液对大鼠卵巢中E2和ER浓度的影响3.6.2基于“有效组分与病证”研究三棱莪术组分配伍对大鼠卵巢中E2和ER浓度的影响与空白组比较，模型组大鼠卵巢中E2浓度明显升高，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳药组大鼠卵巢中的E2浓度明显降低，差异具有显著的统计学意义（P＜0.05），S-E1:1高组、S-E1:1中、S-E1:1低、S-E1:2、S-E2:1组大鼠卵巢中E2浓度有所升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表3-2和图3-2）。37 成都中医药大学2018届硕士学位论文与空白组比较，模型组大鼠卵巢中ER浓度明显升高，差异有显著的统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳药组、S-E1:1高、S-E1:1中剂量组大鼠卵巢中ER浓度明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），S-E1:1低、S-E1:2、S-E2:1组大鼠卵巢中的ER浓度明显降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表3-2和图3-2）。表3-2三棱-莪术组分配伍对大鼠卵巢中E2和ER浓度的影响（X±S，n=8）组别剂量（g/kg）E2（ng/L）ER(ng/ml)空白组—72.03±17.6714.03±0.82****模型组—172.09±9.0420.60±0.51##阳药组0.90148.99±18.9116.29±0.78#S-E1:1高3.33+3.33177.01±37.2016.89±0.57#S-E1:1中1.67+1.67182.59±37.4418.26±1.06S-E1:1低0.83+0.83182.62±43.4418.61±1.57S-E1:23.33+6.67174.35±57.9418.98±0.74S-E2:16.67+3.33177.50±53.3918.97±1.15###注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，P<0.05，P<0.01。图3-2三棱-莪术组分配伍对大鼠卵巢中E2和ER浓度的影响38 成都中医药大学2018届硕士学位论文3.6.3基于“方病证”研究三棱莪术配伍水煎液对大鼠卵巢中P和PR浓度的影响与空白组比较，模型组大鼠卵巢中P的浓度明显升高，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，三棱莪术水煎液组大鼠卵巢中的P浓度明显降低，差异具有显著的统计学意义（P＜0.01），E组大鼠卵巢P的浓度有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表3-3和图3-3）。与空白组比较，模型组大鼠卵巢中PR浓度明显升高，差异有显著的统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，S组、E组、三棱莪术水煎液组大鼠卵巢中的PR浓度有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），其中三棱莪术水煎液组降低较多（见表3-3和图3-3）。表3-3三棱-莪术水煎液对大鼠卵巢中P和PR浓度的影响（X±S，n=8）组别剂量（g/kg）P（ng/ml）PR(ng/ml)空白组—20.57±2.563.17±0.28****模型组—34.41±3.448.31±1.48####阳药组0.9021.46±3.005.29±0.75##S组3.3325.01±2.598.54±0.67E组3.3329.21±4.678.58±0.82##水煎液组3.33+3.3323.31±3.197.47±0.75###注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，P<0.05，P<0.01。39 成都中医药大学2018届硕士学位论文图3-3三棱-莪术水煎液对大鼠卵巢中P和PR浓度的影响3.6.4基于“有效组分与病证”研究三棱莪术组分配伍对大鼠卵巢中P和PR浓度的影响与空白组比较，模型组大鼠卵巢中P的浓度明显升高，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳药组、S-E1:1高剂量组、S-E1:2组大鼠卵巢中的P浓度明显降低，差异具有显著的统计学意义（P＜0.01），S-E2:1组大鼠卵巢中P浓度明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）,S-E1:1中、S-E1:1低剂量组大鼠卵巢P的浓度有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表3-4和图3-4）。与空白组比较，模型组大鼠卵巢中PR浓度明显升高，差异有显著的统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳药组、S-E1:1高剂量组大鼠卵巢中PR浓度明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），S-E1:1中、S-E1:1低、S-E1:2、S-E2:1组大鼠卵巢中的PR浓度有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表3-4和3-4）。40 成都中医药大学2018届硕士学位论文表3-4三棱-莪术组分配伍对大鼠卵巢中P和PR浓度的影响（X±S，n=8）组别剂量（g/kg）P（ng/ml）PR(ng/ml)空白组—20.57±2.563.17±0.28****模型组—34.41±3.448.31±1.48####阳药组0.9021.46±3.005.29±0.75####S-E1:1高3.33+3.3320.32±4.215.66±1.09S-E1:1中1.67+1.6730.06±5.907.78±1.17S-E1:1低0.83+0.8332.15±2.968.03±0.58##S-E1:23.33+6.6725.34±0.958.29±0.87#S-E2:16.67+3.3324.66±3.548.13±1.00###注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，P<0.05，P<0.01。图3-4三棱-莪术组分配伍对大鼠卵巢中P和PR浓度的影响41 成都中医药大学2018届硕士学位论文3.7三棱-莪术药物及组分配伍对大鼠子宫组织中E2、ER、P、PR和FAP的影响3.7.1基于“方病证”研究三棱莪术配伍水煎液对大鼠子宫中E2和ER浓度的影响与空白组比较，模型组大鼠子宫中E2的浓度明显升高，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，水煎液组大鼠子宫中E2的浓度有降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），S组、E组大鼠子宫E2的浓度略高，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表4-1和图4-1）。与空白组比较，模型组大鼠子宫中ER浓度明显升高，差异有显著的统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，水煎液组大鼠子宫中ER浓度明显降低，差异具有显著统计学意义（P＜0.01），S组、E组大鼠子宫中的ER浓度有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表4-1和图4-1）。表4-1三棱-莪术水煎液对大鼠子宫中E2和ER浓度的影响（X±S，n=8）组别剂量（g/kg）E2（ng/L）ER(ng/ml)空白组—125.81±11.362.46±0.17****模型组—200.81±34.305.64±1.13####阳药组0.90176.56±29.023.08±0.32S组3.33220.25±25.994.65±0.72E组3.33212.06±32.914.90±1.03##水煎液组3.33+3.33200.24±31.273.83±0.50###注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，P<0.05，P<0.01。42 成都中医药大学2018届硕士学位论文图4-1三棱-莪术水煎液对大鼠子宫中E2和ER浓度的影响3.7.2基于“有效组分与病证”研究三棱莪术组分配伍对大鼠子宫中E2和ER浓度的影响与空白组比较，模型组大鼠子宫中E2的浓度明显升高，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳药组、S-E1:1高组、S-E1:2组大鼠子宫中的E2浓度明显降低，差异具有显著的统计学意义（P＜0.01），S-E1:1中、S-E1:1低、S-E2:1组大鼠子宫E2的浓度略高，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表4-2和图4-2）。与空白组比较，模型组大鼠子宫中ER浓度明显升高，差异有显著的统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳药组、S-E1:1高、S-E1:1中剂量组大鼠子宫中ER浓度明显降低，差异具有显著统计学意义（P＜0.01），S-E1:1低组大鼠子宫中的ER浓度明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）,S-E1:2、S-E2:1组大鼠子宫中的ER浓度有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表4-2和图4-2）。43 成都中医药大学2018届硕士学位论文表4-2三棱-莪术组分配伍对大鼠子宫中E2和ER浓度的影响（X±S，n=8）组别剂量（g/kg）E2（ng/L）ER(ng/ml)空白组—125.81±11.362.46±0.17****模型组—200.81±34.305.64±1.13####阳药组0.90176.56±29.023.08±0.32####S-E1:1高3.33+3.33165.92±29.563.08±0.53##S-E1:1中1.67+1.67211.84±48.913.81±0.69#S-E1:1低0.83+0.83201.22±22.924.27±0.15##S-E1:23.33+6.67179.02±17.594.68±0.87S-E2:16.67+3.33201.40±32.094.90±1.10###注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，P<0.05，P<0.01。图4-2三棱-莪术组分配伍对大鼠子宫中E2和ER浓度的影响3.7.3基于“方病证”研究三棱莪术配伍水煎液对大鼠子宫中P和PR浓度的影响与空白组比较，模型组大鼠子宫中P的浓度明显升高，差异具有显著统计学44 成都中医药大学2018届硕士学位论文意义（P＜0.01）；与模型组比较，三棱莪术水煎液组大鼠子宫中的P浓度明显降低，差异具有显著的统计学意义（P＜0.01），S组、E组大鼠子宫中的P的浓度有所下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表4-3和图4-3）。与空白组比较，模型组大鼠子宫中PR浓度明显升高，差异有显著的统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，三棱莪术水煎液组大鼠子宫中PR浓度明显降低，差异具有显著统计学意义（P＜0.01），S组、E组大鼠子宫中的PR浓度有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表4-3和图4-3）。表4-3三棱-莪术水煎液对大鼠子宫中P和PR浓度的影响（X±S，n=8）组别剂量（g/kg）P(ng/ml)PR(ng/ml)空白组—7.38±0.883.18±0.37****模型组—18.58±2.006.14±0.95####阳药组0.9012.81±2.464.05±0.61S组3.3317.15±4.375.94±0.98E组3.3317.27±3.045.57±0.59####水煎液组3.33+3.3315.00±2.544.53±0.86###注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，P<0.05，P<0.01。图4-3三棱-莪术水煎液对大鼠子宫中P和PR浓度的影响45 成都中医药大学2018届硕士学位论文3.7.4基于“有效组分与病证”研究三棱莪术组分配伍对大鼠子宫中P和PR浓度的影响与空白组比较，模型组大鼠子宫中P的浓度明显升高，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳药组、S-E1:1高组、S-E1:1低、S-E1:2、S-E2:1、三棱莪术水煎液组大鼠子宫中的P浓度明显降低，差异具有显著的统计学意义（P＜0.01），S-E1:1中剂量组大鼠子宫中P的浓度略低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表4-4和图4-4）。与空白组比较，模型组大鼠子宫中PR浓度明显升高，差异有显著的统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳药组、S-E1:1高、S-E1:1中、S-E2:1组大鼠子宫中PR浓度明显降低，差异具有显著统计学意义（P＜0.01），S-E1:1低、S-E1:2组大鼠子宫中的PR浓度有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表4-4和图4-4）。表4-4三棱-莪术组分配伍对大鼠子宫中P和PR浓度的影响（X±S，n=8）组别剂量（g/kg）P（ng/ml）PR(ng/ml)空白组—7.38±0.883.18±0.37****模型组—18.58±2.006.14±0.95####阳药组0.9012.81±2.464.05±0.61####S-E1:1高3.33+3.3314.16±2.854.50±1.11##S-E1:1中1.67+1.6716.74±5.614.54±1.12##S-E1:1低0.83+0.8314.85±4.045.47±1.12##S-E1:23.33+6.6715.02±3.985.36±0.68####S-E2:16.67+3.3315.27±2.824.47±0.54###注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，P<0.05，P<0.01。46 成都中医药大学2018届硕士学位论文图4-4三棱-莪术组分配伍对大鼠子宫中P和PR浓度的影响3.7.5基于“方病证”研究三棱莪术配伍水煎液对大鼠子宫中FAP浓度的影响与空白组比较，模型组大鼠子宫组织中FAP的表达明显升高，差异具有显著的统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，E组、S-E水煎液组大鼠子宫组织中FAP表达明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），S组大鼠子宫组织中FAP的表达有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（表4-5和图4-5）。各组大鼠子宫组织所含FAP检测条带图（见图3）表4-5三棱-莪术水煎液对大鼠子宫中FAP表达的影响（X±S，n=8）组别剂量（g/kg）FAP空白组—0.51±0.10**模型组—0.85±0.11##阳药组0.900.63±0.06S组3.330.74±0.11#E组3.330.73±0.07#水煎液组3.33+3.330.71±0.10###注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，P<0.05，P<0.01。47 成都中医药大学2018届硕士学位论文图4-5三棱-莪术水煎液对大鼠子宫中FAP表达的影响3.7.6基于“有效组分与病证”研究三棱莪术组分配伍对大鼠子宫中FAP表达的影响与空白组比较，模型组大鼠子宫组织中FAP浓度明显升高，差异具有显著的统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳药组大鼠子宫组织中FAP浓度明显降低，差异具有显著统计学意义（P＜0.01），S-E1:1高剂量组、S-E1:1中剂量组组大鼠子宫组织中FAP表达明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），S-E1:1低、S-E1:2、S-E2:1组大鼠子宫组织中FAP浓度有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（表4-6和图4-6）。各组大鼠子宫组织所含FAP检测条带图（见图3）表4-6三棱-莪术组分配伍对大鼠子宫中FAP表达的影响（X±S，n=8）组别剂量（g/kg）FAP空白组—0.51±0.10**模型组—0.85±0.11##阳药组0.900.63±0.0648 成都中医药大学2018届硕士学位论文#S-E1:1高3.33+3.330.67±0.10#S-E1:1中1.67+1.670.67±0.30S-E1:1低0.83+0.830.74±0.17S-E1:23.33+6.670.70±0.15S-E2:16.67+3.330.76±0.16###注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，P<0.05，P<0.01。图4-6三棱-莪术组分配伍对大鼠子宫中FAP表达的影响图3为各组大鼠子宫组织FAP条带图。注：A为空白组、B为模型组、C为阳药组、D为S-E1:1高、E为S-E1:1中、F为S-E1:1低、G为S-E1:2组、H为S-E2:1、I为S组、J为E组、K为水煎液组。3.8小结：从上述实验结果可知，与空白组相比，模型组大鼠血清、卵巢组织、子宫组织中的E2、ER、P、PR、FAP含量明显升高；与模型组相比，应用阳性药液干预49 成都中医药大学2018届硕士学位论文治疗后，大鼠血清、卵巢组织、子宫组织中的E2、ER、P、PR、FAP含量明显降低；应用S-E1:1高剂量药液干预治疗后，大鼠血清、子宫组织中的E2、ER、P、PR含量明显降低，卵巢组织中的ER、P、PR明显降低；应用S-E1:1中剂量药液干预治疗后，大鼠血清中E2、ER、PR含量明显降低，卵巢组织中ER含量明显降低，子宫组织中ER、PR含量明显降低；应用S-E1:1低剂量药液干预治疗后，大鼠血清中E2、ER的含量明显降低，子宫组织中ER、P的含量明显降低；应用S-E1:2药液干预治疗后，大鼠血清ER、PR含量明显降低，卵巢组织中P含量明显降低，子宫组织中E2、P含量明显降低；应用S-E2:1药液干预治疗后，大鼠血清中ER、P、PR含量明显降低，卵巢组织中P含量明显降低，子宫组织中P、PR含量明显降低；应用S药液干预治疗后，大鼠卵巢组织中P含量明显降低；应用E药液干预治疗后，大鼠卵巢组织中P含量明显降低；应用S-E水煎液干预治疗后，大鼠血清中E2、ER、PR含量明显降低，卵巢组织中ER、P含量明显降低，子宫组织中ER、P、PR含量明显降低。从整体情况分析，阳药组、S-E1:1高组、水煎液组可以降低子宫肌瘤大鼠血清、卵巢组织、子宫组织中的雌孕激素及雌孕激素受体的表达，也可降低子宫组织中FAP的表达，从而抑制子宫肌瘤的发生发展。50 成都中医药大学2018届硕士学位论文4讨论4.1、关于三棱-莪术水煎液的药效问题[26]刘习珍等以不同年龄段的非孕期妇女为研究对象，应用三棱、莪术各10克，配伍炮山甲、桃仁、茯苓、赤芍等对子宫肌瘤进行治疗，结果表明：经过30天到90天的治疗后，B超检查肌瘤消失或大幅度减小，临床症状基本消失。[27]李文静等研究表明，三棱（3.0g/kg）、莪术(3.0g/kg)对药合煎液对大鼠子宫肌瘤有一定的防治作用，可下调有助于细胞外基质（ECM）累积的转化生长因子（TGF-β3）和基质金属蛋白酶（MMP-11）。本实验研究同样佐证，三棱、莪术水煎液对大鼠子宫肌瘤也有较好的疗效。4.2、关于三棱-莪术组分配伍的用药比例问题莪术，辛、苦，温，归肝、脾经。功能破血行气，消积止痛。应用于癥瘕积聚、经闭及心腹瘀痛，亦可用于食积脘腹胀痛。《药品化义》：“蓬术味辛性烈，专攻气中之血，主破积消坚，去积聚癖块，经闭血瘀，扑损疼痛，与三棱功用颇同。”莪术的有效组分为莪术油，莪术挥发油具有抗肿瘤作用，莪术挥发油活性成分的抗癌作用是这些有效成分共同作用的结果，作用大小依次为莪术醇＞莪术二酮＞β-榄香烯﹥吉玛酮。同时还具有预防肝纤维化、抗炎、镇痛等作用。三棱，辛、苦，平。归肝、脾经，功能破血行气，消积止痛。然三棱偏于破血，莪术偏于破气。《医学衷中参西录》：“三棱气味俱淡，微有辛意；莪术味微苦，亦微有辛意，性皆微温，为化瘀血之要药。若细核二药之区别，化血之力三棱优于莪术，理气之力莪术优于三棱”。三棱所治病证与莪术基本相同，临床常相须为用。三棱有效成分为三棱总黄酮，具有抗血小板聚集，抗血栓的作用，同时具有抗肿瘤、抗炎、镇痛的效果。中医古籍中记载的三棱、莪术多按1:1比例应用。《普济方》三八三卷所载：三棱莪术汤，主治小儿疳积，其中三棱、莪术等分。《医学衷中参西录》上册所载：理冲汤，其中三棱、莪术各9克，功能益气行血，调经祛瘀，全方主治妇女经闭不行，脏腑症瘕积聚。《内外验方秘传》所载：食积痞胀散，其中三棱、莪术各1两5钱。全方主治食积痞胀。《医学入门》所载：51 成都中医药大学2018届硕士学位论文香平丸，其中三棱、莪术各3两，全方主治水肿、气肿、血肿。《妇科玉尺》卷一所载：苍术香附丸，其中三棱、莪术各2两，全方主治经壅，潮热骨痛，内有气结。《竹林女科》卷一所载：莪术汤，三棱、莪术各7分，全方主治血滞不行，内有瘀血，经来一半，遍身潮热，头痛口渴，小便作痛。本实验研究表明三棱、莪术组分配伍最佳比例为1:1，其中药效最佳为三棱-莪术组分配伍1:1高剂量组。现代研究同样表明，三棱、莪术1:1配伍疗效显[26]著。刘习珍等以不同年龄段的非孕期妇女为研究对象，应用三棱、莪术各10克，配伍炮山甲、桃仁、茯苓、赤芍等对子宫肌瘤进行治疗，结果表明：经过30天到90天的治疗后，B超检查肌瘤消失或大幅度减小，临床症状基本消失。[27]李文静等研究表明，三棱（3.0g/kg）、莪术(3.0g/kg)对药合煎液对大鼠子宫肌瘤有一定的防治作用，可下调有助于细胞外基质（ECM）累积的转化生长因子[25]（TGF-β3）和基质金属蛋白酶（MMP-11）。余成浩等研究表明，三棱（3.33g生药/kg）、莪术（3.33g生药/kg）组分配伍对实验性大鼠子宫肌瘤有明显的防治作用，可降低雌孕激素及肌瘤相关基因蛋白的含量。本实验结果也可佐证三棱、莪术1:1组分配伍，相较于三棱、莪术1:2和三棱、莪术2：1组，三棱单药组、莪术单药组，可从整体上更好的降低雌孕激素及其受体表达，也可降低肌瘤相关成纤维细胞活化蛋白（FAP）的表达。[28]此外，三棱、莪术配伍应用效果优于单煎。三棱有效成分为三棱总黄酮，[29]研究表明三棱总黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抑制雌激素表达的作用。莪术的有[30]效成分为莪术挥发油，研究表明莪术挥发油具有抗肿瘤、抗病毒、消炎等作用。大鼠灌胃给予莪术后，在血清中可检出7中挥发油成分，其中含量较高的4种挥[31]发油成分依次为β-榄香烯、莪术二酮、吉马酮、莪术醇。研究表明，三棱、[32,莪术配伍使用后可明显提高药液中挥发油的含量，增强抗氧化、抗肿瘤的作用33][34][35]，并且可检测到新增挥发油成分，同时合煎后姜黄素的煎出率也明显提高。本实验结果也可佐证，三棱、莪术配伍使用效果优于单煎。4.3、成纤维细胞的活化与子宫肌瘤成纤维细胞活化蛋白（FibroblastActivationProtein，FAP）是肿瘤相52 成都中医药大学2018届硕士学位论文关成纤维细胞的特异性标志物之一，也是成纤维细胞活化的标志性蛋白，一般而言，成纤维细胞活化蛋白的表达越多，活化的成纤维细胞数量也就越大。FAP是二肽基肽酶家族一员，该家族还包括DDP4(DipeptidylPeptidase4)、DPP8和[36]DPP9。该家族的酶具有相似的结构和二肽基肽酶活性，即能针对性的裂解阻止[37]蛋白水解的脯氨酸链，因此可加速组织或细胞蛋白的水解进程。除此之外，FAP还具有独特的肽链内切酶活性，该活性可促使FAP裂解蛋白质氨基端2个以上的[38]氨基酸，可大量水解ECM中的蛋白质。相较于其他可裂解氨基端2个氨基酸的[39,40]酶来说，FAP具有更强的促蛋白水解活性，可特异性的裂解明胶、变性的Ⅰ[41,42][43]型胶原和α2-抗纤维蛋白，另据研究表明，FAP同样可裂解Ⅲ型胶原。胶原纤维是细胞外基质（ExtracellularMatrix,ECM）的重要组成部分，为组织和细胞提供结构支撑。研究表明ECM重构是肿瘤和纤维化疾病发生、发展的普遍过程，而ECM的重构过程离不开胶原的异常堆积和降解。FAP特异性的裂解变性的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的能力是FAP在ECM重构过程中非正常表达的重要原因。FAP在正常人组织中一般无表达，仅存在于宫颈和子宫内膜中，在胚胎发[44,45]育过程中短暂表达；在正常大鼠子宫、胰腺、皮肤、睾丸中有较高表达；在[46]正常狒狒子宫、睾丸、膀胱、结肠、皮肤、舌头中有较高表达。研究证实FAP[7]在一些基质成纤维细胞活化的疾病中有表达，如创面愈合、瘢痕组织、骨关节[8][9][10]炎、动脉粥样硬化、肝硬化等疾病。同时FAP选择性的表达于90%以上的[47]上皮恶性肿瘤的基质成纤维细胞表面，并在肿瘤发展的过程中扮演溶解胶原的[48]角色，促进肿瘤细胞的浸润和转移。总之，在肿瘤以及纤维化疾病的发生、发[49]展过程中，活化的成纤维细胞和ECM的异常累积是其主要的病理过程。子宫肌瘤由增生肥大的平滑肌细胞、成纤维细胞和细胞外基质组成，其最显[50]著的病理学特点是主要由Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白组成的坚硬的ECM的过度堆积。而ECM则有胶原蛋白、纤维连接蛋白和蛋白多糖构成。FAP一方面活化成纤维细胞，活化的成纤维细胞可分泌大量生长因子、趋化因子和ECM，促进血管内皮细胞和外周细胞的招募,分泌和重塑肿瘤基质,促进血管生成和肿瘤发展。另一方面可溶解起支撑作用的胶原纤维，为肿瘤和肌瘤的生长提供空间。由本实验结果可知，阳药组，S-E1:1高剂量组、水煎液组可有效降低雌孕激53 成都中医药大学2018届硕士学位论文素及其受体的表达，FAP含量也有所降低。再结合上述分析，我们可以做出如下推测：三棱-莪术组分配伍对大鼠子宫肌瘤的抑制作用，可能是通过雌孕激素和FAP的协同作用完成的。研究表明抑制雌孕激素的分泌，可有效控制平滑肌细胞[51,52]的增殖，减少ECM的堆积。减少FAP的表达，可抑制其水解Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋[53]白和ECM蛋白的水解，从而减少生长因子的释放，抑制成纤维细胞的活化，减[54]小肌瘤增长空间。4.4、成纤维细胞活化蛋白与雌激素子宫肌瘤多见于育龄期妇女，妊娠期子宫肌瘤可能增大，绝经后逐渐萎缩甚至消失。应用促性腺激素释放激素激动剂治疗后，肌瘤体积缩小，停药后肌瘤会重新增大，提示子宫肌瘤是性激素依赖性肿瘤。研究发现，肌瘤细胞中雌激素受体的表达水平高于正常平滑肌细胞。由此可以分析，雌激素大量结合于子宫瘤[55]局部的雌激素受体，使肌瘤局部呈现高雌激素状态，这可能是子宫肌瘤细胞不[56]断增生的基础。Luo等通过对人源子宫肌瘤的研究发现，雌激素与FAP关系密切。雌激素通过成纤维细胞的活化促进子宫肌瘤细胞增殖，而FAP是成纤维细胞活化的标志蛋白，在雌激素介导的成纤维细胞活化中起着重要的作用，即在肌瘤细胞的增殖中起关键作用。本实验研究结果表明，大鼠经雌孕激素负荷造模以后,与空白组相比，随着模型组雌激素表达的增多，模型组FAP表达也增多；与模型组相比，各用药组可使大鼠子宫组织中的雌激素和FAP有不同程度的降低，而雌激素和FAP的降低程度大致呈正相关（见表4-7和图4-7）。我们推测，在大鼠子宫肌瘤组织中，雌激素刺激肌瘤生长的作用可能是通过刺激FAP的高表达，从而使大量的成纤维细胞活化，释放大量生长因子等，促进肌瘤细胞的增殖。表4-7各组大鼠子宫组织中E2和FAP的表达（X±S，n=8）组别N（例）子宫E2（ng/L）FAP空白组8125.81±11.360.51±0.10模型组8200.81±34.300.85±0.11阳药组8176.56±29.020.63±0.06S-E1:1高8165.92±29.560.67±0.1054 成都中医药大学2018届硕士学位论文S-E1:1中8211.84±48.910.67±0.30S-E1:1低8201.22±22.920.74±0.17S-E1:28179.02±17.590.70±0.15S-E2:18201.40±32.090.76±0.16水煎液组8200.24±31.270.71±0.10图4-7各组大鼠子宫组织中E2和FAP的表达（X±S，n=8）55 成都中医药大学2018届硕士学位论文5结论1、三棱莪术水煎液对子宫肌瘤有较好抑制作用，比三棱莪术单用效果好。2、三棱-莪术组分配伍以1:1高剂量应用，药效最优。3、三棱-莪术组分配伍对大鼠子宫肌瘤有抑制作用。可抑制大鼠子宫肌瘤的生长，并抑制雌孕激素、雌孕激素受体、成纤维细胞活化蛋白的表达。该抑制作用可能是通过同时抑制雌孕激素、雌孕激素受体以及成纤维细胞活化蛋白的表达实现的。4、子宫组织中FAP的表达与雌激素表达大致呈正相关，我们推测FAP的高表达可能与过多的雌激素的刺激有关；雌激素促进肌瘤细胞增殖的作用机制可能是通过刺激FAP的表达，活化成纤维细胞实现的。56 成都中医药大学2018届硕士学位论文创新性与特色1、本课题中医药基础理论和在“方病证、药病证、有效组分与病证、有效成分与病证”创新药物发现模式理论指导下，首次采用气滞血瘀型子宫肌瘤大鼠病证结合动物模型（专利申请号：201710398215.7），通过观察大鼠子宫形态和病理，分析大鼠子宫组织、卵巢组织和血清中的雌激素、孕激素、雌激素受体、孕激素受体、成纤维细胞活化蛋白的表达，从整体、器官、组织、分子多层次探究三棱莪术配伍水煎液、三棱-莪术组分及其组分配伍对气滞血瘀型子宫肌瘤大鼠的防治作用与作用机制及三棱莪术相须配伍规律，为子宫肌瘤的科学研究、方剂配伍规律研究提供新方法、新思路，为临床应用提供一定科学依据2、采用现代分子生物学技术将成纤维细胞活化蛋白（FAP）与子宫肌瘤的发生、发展紧密联系起来。通过蛋白质印迹法（WB）对空白组、模型组、各用药组大鼠子宫组织中的FAP表达进行检测，发现除空白组外，FAP在其余各组中具有较高表达，而且各组雌激素的表达与FAP表达大致呈正相关，我们推测，FAP的高表达可能与过量的雌激素的刺激有关，雌激素是刺激可能FAP表达的重要原因；因过荷的雌孕激素是子宫肌瘤细胞增殖的主要原因，FAP与基质成纤维细胞的活化增殖关系密切，各用药组雌孕激素和FAP均有不同程度的下降，我们推测三棱-莪术组分配伍对大鼠子宫肌瘤的抑制作用可能是通过同时抑制雌孕激素和FAP的表达实现的。57 成都中医药大学2018届硕士学位论文不足与展望1、本实验通过WesternBlot法对各组大鼠子宫组织中FAP进行定量分析，来研究FAP的表达与子宫肌瘤发生、发展的关系；及其与其他可能诱导肌瘤产生的因素之间是否存在协同关系；以及三棱-莪术对FAP的抑制作用。但却忽视了对FAP的定位研究，如果应用免疫组化法对FAP进行定位，可大致确定FAP的表达位置，为日后进一步研究三棱-莪术的微观作用部位提供依据和支持。2、虽然对三棱莪术配伍水煎液进行了研究，但本次只设置了1个剂量组，但缺乏分煎与合煎、量效关系的深入研究，今后继续采用气滞血瘀型子宫肌瘤大鼠病证结合动物模型在此方面进行深入研究，以期为临床提供科学依据。3、本论文只对“方病证”、“有效组分与病证”进行了研究，今后应该进一步加强“药病证”、“有效成分与病证”的研究。58 成都中医药大学2018届硕士学位论文致谢时光荏苒，三年的硕士研究生学习生活转眼间即将结束，回首这3年，我的成长和收获离不开很多人的指导和帮助。在论文完成之际，在此向这三年间给予我指导和帮助的人们致以最真挚的感谢。首先，我要向我的导师余成浩教授致以最衷心的感谢。我在日常学习、临床实践、实验研究中的每一次进步都离不开余老师的悉心指导，在学习中赢得的每一项荣誉都离不开余老师的支持和栽培。余老师是一位治学严谨、低调朴实、学识渊博、充满正能量的导师，是我学习的好榜样。在此，向我的导师余成浩教授表达我最崇高的敬意和感谢。衷心感谢彭成教授、曹小玉研究馆员、基础医学院方剂系、实验中心的各位老师，课题的顺利完成离不开他们的指导和帮助。衷心感谢彭腾老师及师弟匡宇在药材提取实验中的知道与帮助。衷心感谢同门师妹李瑶、师弟赵辉、付煜等人在实验过程中给予我的大力支持。衷心感谢药学院刘友平教授的学生鄢玉芬、基础医学院张天娥教授的学生王艳秋分子生物学实验中给予我的热情帮助。衷心感谢我的父母在生活学习中给予我的无微不至的关怀和大力支持，他们是我学习和生活的无限动力。再一次向这3年中，无私关怀和帮助我的老师、同学和家人致以最真诚的感谢。最后，向论文评阅和答辩委员会的所有专家、老师们表示由衷的感谢！59 成都中医药大学2018届硕士学位论文附录1子宫肌瘤的病因学研究进展子宫肌瘤（UterineLeiomyoma，UL）是女性生殖系统最常见的良性肿瘤，在绝经前女性中有较高的发病率。其中约20%-40%的患者有明显的临床症状并寻[1]求妇产科治疗。由于患病初期症状不明显，所以临床报道大病率远低于真实发病率。子宫肌瘤的主要临床症状包括不正常的子宫出血、盆腔压迫性疼痛、不孕、[2]习惯性流产等，较大的子宫肌瘤是行子宫切除术的主要原因。综合近几年来的国内外文献，子宫肌瘤的病因大致有以下几个方面：1、种族因素。种族因素是子宫肌瘤发病的重要原因。针对子宫肌瘤患者的人口统计学结果显示，子宫肌瘤在黑人妇女中的患病人数是白人妇女的3倍之多，[57]具有较高的流行性，疾病程度也较重。在子宫肌瘤患者中，黑人女性的住院率较白人女性高3.5%，行肌瘤切除术的人数较白人女性高6.8%，行子宫切除术的人[58]数较白人女性高2.4%。2、初潮年龄。根据2001-2011年对子宫肌瘤患者的追踪调查表明，女性初[59]潮的年龄越早，患子宫肌瘤的机率越大。初潮年龄小于等于11岁，具有很高的患病风险，初潮年龄大于13岁，则患病风险大大降低。初潮年龄过早，使女性长期处于雌孕激素的刺激中，可能是其发病机率增高的原因。3、怀孕次数。怀孕次数增加可相对降低患子宫肌瘤的可能性。有研究者筛[60]选了171名孕期子宫肌瘤患者，并观察这些子宫肌瘤在孕期和产后的变化情况。结果显示，36%的患者在产后3-6个月并未探测到子宫肌瘤，64%的患者子宫肌瘤为消失，但肌瘤体积均有不同程度的减小。这可能与产后子宫重构和分娩时肌瘤局部缺血有关。4、雌孕激素及其受体子宫肌瘤多见于育龄期妇女，妊娠期子宫肌瘤可能增大，绝经后逐渐萎缩甚至消失。应用促性腺激素释放激素激动剂治疗后，肌瘤体积缩小，停药后肌瘤会重新增大，提示子宫肌瘤是性激素依赖性肿瘤。研究发现，肌瘤细胞中雌激素受体的表达水平高于正常平滑肌细胞。由此可以分析，雌激素大量结合于子宫瘤[56]局部的雌激素受体，使肌瘤局部呈现高雌激素状态，这可能是子宫肌瘤细胞不60 成都中医药大学2018届硕士学位论文[61]断增生的基础。研究也证实，对比相邻的子宫肌层组织，在子宫肌瘤组织的边缘发现了更高水平的孕激素受体-M和线粒体膜孔蛋白，并由此得出结论:孕激素介导的机制可能通过改变线粒体的活动来影响子宫肌瘤的生长。5、环境因素和生活习惯。子宫及其附近脏器的环境可能增高患子宫肌瘤的风险。在对大鼠的研究中发现，己烯雌酚、内分泌干扰素、双酚A、邻苯二甲酸[62]等可促进子宫肌瘤的产生和发展。不良的饮食习惯和生活习惯同样可诱发子宫肌瘤，如吸烟、长期服用避孕药、长期大量饮酒和咖啡、维生素D缺乏等都与子[63]宫肌瘤的发病密切相关。6、遗传学。研究表明，40%-50%的子宫肌瘤存在染色体异常的情况。包括染色体12q15或者6p21的重新排列和染色体7p的清除。大量的染色体12q15断点出现在高迁移率启动因子HMGA2的上游段，导致HMGA2的过表达，从而刺激肌瘤的形成和增大。异常的染色体是刺激肿瘤和肌瘤体积增大的重要因素，在子宫浆膜下和肌壁间肌瘤中就发现了大量的异常染色体HMGA2；MED12是与肿瘤发生发展密切相关的特异性基因，有85%的子宫肌瘤病因学研究报告显示，在针对子宫肌瘤的基因检测中，MED12也是最频繁发生突变的基因，在肌瘤的发生发展中起重要作[64]用；GRP10是人源子宫肌瘤样本中发现的上调最多的受体，它可以激活哺乳类[65]动物的雷帕霉素靶蛋白以促进平滑肌细胞的大量增殖；非编码小基因（22-25bp，miRNAs）被普遍认为是主导人类疾病产生的原因。少部分miRNAs可激活单个或多个目标基因，并使该目标基因表达大幅度上调，从而激活多种信号通路，促使细[66]胞或组织发生病理变化。研究证实miRNAs可通过多种蛋白通路参与到细胞增殖、炎症反应、血管再生、组织重构这些与肌瘤发生发展密切相关的病理过程中，推动肌瘤发展进程。附录2子宫肌瘤的治疗学研究进展临床上子宫肌瘤的治疗方法主要有非手术治疗和手术治疗。手术治疗方式包括以下4种。1、子宫切除术。子宫切除术在治疗子宫肌瘤时可完全避免子宫肌瘤剥除术后复发的问题，该方法切断了子宫动脉上行支对卵巢的血液供应，使卵巢的血液61 成都中医药大学2018届硕士学位论文供应相对减少，可引起卵巢功能早衰及早衰相关的并发症切断了子宫各组韧带,破坏了盆底的完整性，脱垂发生的可能性增加，盆腔黏连后还可能引起周围脏器的损伤，子宫切除对妇女的心理及生理均有不良的影响。2、子宫肌瘤剥除术。子宫肌瘤剥除术保留了子宫，可以满足患者的生育要[67]求，创伤相对较小，但有术后复发的可能。吴晚英等对247例子宫肌瘤剥除术后患者随访5一10年发现：总复发率为46.2%，患者年龄、子宫肌瘤个数、子宫肌瘤部位、随访时间与子宫肌瘤剥除术后复发相关。宫腔镜下子宫肌瘤剔除术具有一定的局限性，主要针对浅表的肌壁间肌瘤和黏膜下肌瘤适用，同时此术式在临床的应用还受到肌瘤数量、是否带蒂、大小、蒂的宽度等因素限制，对多发性子宫肌瘤通常无法进行根除，尤其是突向宫腔外生长、宫腔外肌瘤。腹腔镜下子宫肌瘤剔除术是目前临床对子宫肌瘤治疗的主流手术方式，在手术创伤、术后患者的恢复、盆腔术野、术后疼痛、周围组织脏器损伤等方面均优于开腹手术治疗。同时其盆腔粘连的发生率低于开腹手术，有效避免患者再次手术风险性，如剖宫产。其还具有手术切口小、伤口美观、术后愈合快、住院时间短等优点，同时也具备了对子宫的保留和生育能力的保留作用，但是腹腔镜下手术，不能跟开腹手术相比的是，不能用手对患者的子宫进行触摸检查，不能够发现体积较小的肌瘤，因此对体积过小的肌瘤容易发生遗漏。3、子宫肌瘤切除术。仅适合于一些宫颈肌瘤或黏膜下肌瘤，可经阴道行宫腔镜电切术。其优点为不用行开腹手术，创面小。并可保留子宫，不影响卵巢和生育功能；子宫无创口，可减少怀孕后行剖腹产的机率。手术的预后较好。4、子宫动脉阻断术。通过由可吸收材料制成的动脉管管夹对子宫动脉进行夹闭，可阻断子宫动脉血流，使子宫肌瘤失去血供，促使子宫肌瘤萎缩。可以明显减少腹股沟血肿、误栓塞其他血管等并发症的发生，治疗过程疼痛减轻，对子宫肌瘤具有较好的治疗效果，术后并发症发生少。适应证于有较严重症状而不愿意行手术治疗的子宫肌瘤患者。非手术治疗方式包括以下2种。1、高强度聚焦超声治疗。高强度聚焦超声治疗是一种非侵入性新型治疗技术，将高强度的超声波聚焦在子宫肌瘤处，局部温度迅速升至60℃-90℃,使肌62 成都中医药大学2018届硕士学位论文瘤组织发生凝固性坏死，坏死组织可逐渐被吸收或瘫痕修复。该方法治疗子宫肌瘤时具有无痕、无出血、并发症少等优点。因为其对肿瘤病灶组织具有高效的破坏力，且能够防止超声波对病灶周围组织产生伤害，并且从体外治疗子宫肌瘤，是真正意义上的微创治疗方式。2、药物治疗。子宫肌瘤是一种性激素依赖性的良性肿瘤。与雌孕激素和多肽类生长因子关系密切。研究发现，子宫肌瘤组织中的雌激素、孕激素受体明显[56,61]高于子宫肌层，雌激素、孕激素共同促进子宫平滑肌细胞增殖、生长。因此，可通过使用一些雌孕激素受体拮抗剂来抑制子宫肌瘤的生长，减轻子宫肌瘤患者的临床症状。常用药物有一下3种。2.1促性腺激素释放激素类药物(GnRHa)。GnRH是由下丘脑促垂体区肽能神经元脉冲式分泌的十肽激素。GnRHa是GnRH的衍生物，大剂量连续给药后，可抑制雌孕激素的分泌，是雌激素水平下降至绝经时水平，以抑制肌瘤的生长并使肌瘤体积缩小。用药3～6个月，肌瘤体积可缩小50%-77%，有效率达87%，[68]但完全消失者仅见于小肌瘤，用药12-16周效果最佳。该药物主要不良反应有潮热、出汗、阴道干燥、骨质疏松等，因此不能长期给药。2.2米非司酮。米非司酮为受体水平抗孕激素药物。该类药物能够拮抗孕激素受体，有效阻断孕激素对肌瘤细胞的促生长作用和扩大肌瘤血管的作用，是肌瘤组织得不到充足的孕激素刺激和血液供应，从而抑制肌瘤的生长，减小肌瘤体积。但有闭经、恶心、潮热等副作用。临床较常用。2.3醋酸乌利司他。是一种选择性孕激素受体调节剂。结构与米非司酮相似。在治疗由子宫肌瘤引起的出血方面疗效较好，长时间服用可使肌瘤体积明显[69]缩小。2.4芳香化酶抑制剂。来曲唑是第三代芳香化酶抑制剂，是一种人工合成苄三唑类衍生物，能够有效消除雌激素对肌瘤生长的刺激作用。来曲唑对全身各系统及靶器官没有毒性作用，具有较好的耐受性，药理作用强等优点，与其他[70]芳香化酶抑制剂相比较，具有更强的抗肌瘤作用。63 成都中医药大学2018届硕士学位论文附录3成纤维细胞活化蛋白（FAP）的研究进展成纤维细胞活化蛋白（FibroblastActivationProtein，FAP）是肿瘤相关成纤维细胞的特异性标志物之一，也是成纤维细胞活化的标志性蛋白。FAP是二肽基肽酶家族一员，该家族还包括DDP4(DipeptidylPeptidase4)、DPP8和[36]DPP9。该家族的酶具有相似的结构和二肽基肽酶活性，即能针对性的裂解阻止[37]蛋白水解的脯氨酸链，因此可加速组织或细胞蛋白的水解进程。FAP在正常人组织中一般无表达，仅存在于宫颈和子宫内膜中，在胚胎发育过程中短暂表达。FAP具有独特的肽链内切酶活性，该活性可促使FAP裂解蛋白质氨基端2个以上[38]的氨基酸，可大量水解ECM中的蛋白质。相较于其他可裂解氨基端2个氨基酸[39,40]的酶来说，FAP具有更强的促蛋白水解活性，可特异性的裂解明胶、变性的[41,42][43]Ⅰ型胶原和α2-抗纤维蛋白，另据研究表明，FAP同样可裂解Ⅲ型胶原。胶原纤维是细胞外基质（ExtracellularMatrix,ECM）的重要组成部分，为组织和细胞提供结构支撑。研究表明ECM重构是肿瘤和纤维化疾病发生、发展的普遍过程，而ECM的重构过程离不开胶原的异常堆积和降解。FAP特异性的裂解变性的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的能力是FAP在ECM重构过程中非正常表达的重要原因。综上所述，FAP一方面活化成纤维细胞，活化的成纤维细胞可分泌大量生长因子、趋化因子和ECM，促进血管内皮细胞和外周细胞的招募,分泌和重塑肿瘤基质,促进血管生成和肿瘤发展。另一方面可溶解起支撑作用的胶原纤维，为肿瘤和肌瘤的生长提供空间。近年来的实验研究和报道，多集中于成纤维细胞活化蛋白与肿瘤的关系。如[71]邵叶波等人研究的成纤维细胞对小鼠胰腺癌的影响，证实FAP核算疫苗可预防小鼠体内胰腺癌瘤体的形成与增长。临床试验显示FAP抗体在患者体内表现出高[72]度的抗肿瘤效应。段优等研究了成纤维细胞活化蛋白在口腔鳞状细胞癌组织中的表达。提示FAP的表达与口腔鳞癌的临床分期及淋巴结的转移有关，成纤维细胞的活化可能是口腔鳞癌的促发因素之一，可作为预测口腔鳞癌侵袭转移的生物[73]学标志。孙辉等研究FAP在胆囊癌组织中的表达与意义，实验结果表明，FAP的阳性表达与胆囊癌肝浸润、淋巴结转移、肿瘤浸润的深度密切相关，有望成为[74]胆囊癌临床治疗和预后判断的独立指标。余志红等观察消痰散结方对胃癌组织64 成都中医药大学2018届硕士学位论文中FAP表达的影响，发现消痰散结方可明显抑制胃癌原位移植瘤额的生长，抑制[74,75]胃癌转移，下调FAP蛋白及mRNA的表达。张红霞等基于FAP在乳腺癌组织中的分布特点，表达特征和变化规律，探讨FAP在乳腺癌发生发展中的作用，实验结果表明，FAP特异性的表达与乳腺癌瘤周基质成纤维细胞中，在乳腺癌的发生、[7]发展、浸润转移方面起到了重要作用。FAP还参与创面愈合、瘢痕组织、骨关[8][9][10][47]节炎、动脉粥样硬化、肝硬化、上皮恶性肿瘤等疾病的发生发展过程。[76]刘蕊等研究FAP在非小细胞肺癌组织中的表达和临床意义，证实FAPmRNA表达是影响肺腺癌患者雨后的独立因素，与肺腺癌的临床分期呈负相关，与肺腺癌患者的预后密切相关。通过对近十年来约100篇中外有关FAP的实验性文献的查询中，我们发现，学者们的研究方向主要有2个。一、FAP在各种肿瘤的发生、发展、浸润、转移中所扮演的角色，以及该角色发挥作用的机制，以期为临床治疗提供新靶点。二、判断肿瘤预后。三、通过体内外实验，研究FAP的特性，为各种疾病研究提供依据。65 成都中医药大学2018届硕士学位论文参考文献[1]MarshEE,EkpoGE,CardozoER,etal.Racialdifferencesinfibroidprevalenceandultrasoundfindingsinasymptomaticyoungwomen(18–30yearsold):apilotstudy[J].FertilityandSterility.2013,99(7):1951-1957.[2]CardozoER,ClarkAD,BanksNK,etal.TheestimatedannualcostofuterineleiomyomataintheUnitedStates[J].AmericanJournalofObstetricsandGynecology.2012,206(3):211.[3]StoutMJ,OdiboAO,GraseckAS,etal.LeiomyomasatRoutineSecond-TrimesterUltrasoundExaminationandAdverseObstetricOutcomes[J].2010,116(5):1056-1063.[4]ParazziniF,TozziL,BianchiS.Pregnancyoutcomeanduterinefibroids[J].BestPractice&ResearchClinicalObstetrics&Gynaecology.2016,34:74-84.[5]MetwallyM,FarquharCM,LiTC.Isanothermeta-analysisontheeffectsofintramuralfibroidsonreproductiveoutcomesneeded?[J].ReproductiveBioMedicineOnline.2011,23(1):2-14.[6]王振骏，周洪贵.子宫肌瘤的病因学研究进展[J].医学综述.2016,22(16):3158-3160.[7]RettigWJ,Garin-ChesaP,BeresfordHR,etal.Cell-surfaceglycoproteinsofhumansarcomas:Differentialexpressioninnormalandmalignanttissuesandculturedcells[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmeiica.1988,9(85):3110-3114.[8]MilnerJM,KevorkianL,YoungDA,etal.Fibroblastactivationproteinalphaisexpressedbychondrocytesfollowingapro-inflammatorystimulusandiselevatedinosteoarthritis[J].ArthritisResTher.2006,8(1):R23.[9]BrokoppCE,SchoenauerR,RichardsP,etal.FibroblastactivationproteinisinducedbyinflammationanddegradestypeIcollageninthin-capfibroatheromata[J].EuropeanHeartJournal.2011,32(21):2713-2722.[10]WangXM,YuDMT,MccaughanGW,etal.Fibroblastactivationproteinincreasesapoptosis,celladhesion,andmigrationbytheLX-2humanstellatecellline[J].Hepatology.2005,42(4):935-945.[11]司富春，李山霞.近30年临床子宫肌瘤中医证型和用药规律分析[J].世界中西医结合杂志.2009(01):45-47.[12]曾建红，莫炫永，戴平，等.广西莪术挥发油抗肿瘤作用的谱效关系研究[J].中国实验方剂学杂志.2012(13):91-94.[13]彭岳，吴光，韦燕飞，等.桂郁金提取物对人肝星状细胞增殖、细胞周期及凋亡影响的研究[J].时珍国医国药.2012(05):1076-1078.[14]林国彪，苏姜羽，杨秀芬.桂郁金提取物的抗炎镇痛作用[J].中国实验方剂学杂志.2011(16):171-173.[15]周芳，林国彪，杨秀芬，等.桂郁金水提物的镇痛、抗炎和止血作用研究:中国药理学会第十次全国学术会议[Z].中国天津:20091.[16]李伦，刘琳，李传钰，等.3种活血化瘀药对实验性血瘀证模型大鼠作用的比较研究[J].中医药学报.2011(06):37-39.[17]汪典，刘亚娟，刘丹，等.不同剂量活血、破血药对动脉粥样硬化小鼠主动脉Bcl-2及Bax基因表达的影响[J].中国中医急症.2015(10):1693-1695.[18]肖渊，李娜，李海芳，等.观察12种活血祛瘀类中药对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生成的影响[J].药物分析杂志.2009(07):1079-1082.[19]孟冰，闵冬雨，谷淑玲.5种中药对脑缺血缺氧损伤的保护作用[J].徐州医学院学报.2009(09):615-617.66 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成都中医药大学2018届硕士学位论文在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果成果鉴定、颁奖部门及奖励类序本人署名成果（论文、专著、获奖项目）名称别、等级或发表刊物与出版单号次序位、时间1论文：现代生物学技术在子宫肌瘤细《生物化工》；江西省科学院，第一作者胞研究中的应用进展2017年06月2论文：中医方剂的命名方式《临床医药文献电子杂志》；中第一作者国医药科技出版社，2017年7月3会议论文：FagopyrumMill-AReviewAdvancesinEngineering第一作者ofPhytochemistryandPharmacologicalResearchEffects4论文：TheestablishmentofratmodelBrazilianJournalofMedicaland其他作者foruterineleiomyomasbasedontheoryBiologicalResearch；2018年（已ofWesternandTraditionalChinese同意出版）Medicine5论文：生三棱-生莪术组分配伍对卵巢江西中医药大学学报；江西中医其他作者囊肿大鼠雌激素受体的作用研究药大学；2017年4月70