鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用

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分类号：Ｓ８５５授予学位单位代码：１０４３４研究生学号：２０１４１１０４７８山東農業大學硕士学位论文鸡Ｔ－１ＩＡ和Ｇ３ＢＰ１在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用Ｅｆｆｅｃｔｓ－ｏｆＣｈｉｃｋｅｎＴＩＡ１ａｎｄＧ３ＢＰ１ｏｎＳｔｒｅｓｓＧｒａｎｕｌｅＦｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄＡｎｔｉｖｉｒａｌＲｅａｃｔｉｏｎ研究生：张频学科专业：临床兽医学研究方向：动物疾病防治学院：动物科技学院指导教师：马卫明副教授２０１７年６月４日 关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，。本声明的法律责任由本人承担均在文中明确说明。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者鮮：象衫导师签名：日期：／郎， 论文提交日期：2017.04.28论文答辩日期：2017.06.03学位授予日期：2017.06学科门类：农学答辩委员会主席：李建基 国家自然科学基金重点项目(31530074)资助山东省“双一流”奖补奖金（FundsofShandong“DoubleTops”Program)资助 符号说明缩略词英文全拼中文ARSsodiumarsenite亚砷酸钠AUF-1AU-richRNAbindingfactors富含AU的RNA结合因子Bpbasepair碱基对CEFchickenembryofibroblast鸡胚成纤维细胞CHXcycloheximide放线菌酮dsRNAdouble-strandedRNA双链RNAeIFeukaryoticinitiationfactor真核细胞翻译起始因子FBSfetalbovineserum胎牛血清Hhour小时HRIHemoglobinregulatedkinase血红素调节激酶IFAIndirectimmunofluorescence间接免疫荧光Kbkilobase千碱基（对）Minminute分钟mLMilliliter毫升MOImultiplicityofinfection感染数mRNPmessengerribonucleoprotein信使核糖核蛋白NDVNewcastlediseasevirus新城疫病毒PPprotein磷蛋白PABPpoly(A)-bindingproteinpoly-A结合蛋白PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PKRProtein-Kinase-regulated-dsRNAase蛋白激酶调节的dsRNA酶RpsRibosomalsubunitprotein核糖体亚基蛋白SGstressgranule应激颗粒TIA-1T-cellinternalantigen-1T细胞内部抗原-1µLmicroliter微升 目录中文摘要....................................................................................................................IAbstract....................................................................................................................III前言...........................................................................................................................11.1应激颗粒研究进展.......................................................................................................11.1.1应激颗粒概述............................................................................................................11.1.2应激颗粒发生过程....................................................................................................21.1.3应激颗粒的信号转导调控........................................................................................31.1.4应激颗粒与病毒感染研究进展................................................................................51.1.4.2病毒通过感染抑制SG的形成..............................................................................61.1.4.3SG的抗病毒反应...................................................................................................71.2RNA结合蛋白TIA-1和G3BP1研究进展....................................................................71.2.1TIA-1研究进展..........................................................................................................71.2.2G3BP1研究进展........................................................................................................81.3本研究的目的和意义..................................................................................................92材料与方法..........................................................................................................102.1材料.............................................................................................................................102.1.1病毒.........................................................................................................................102.1.2细胞系.....................................................................................................................102.1.3鸡胚成纤维细胞（CEF）.......................................................................................102.1.4抗体..........................................................................................................................102.1.5主要试剂..................................................................................................................102.1.6相关试剂的配制......................................................................................................112.1.7主要仪器.................................................................................................................122.2方法.............................................................................................................................132.2.1GFP标签鸡TIA-1，PRD，RRM，和G3BP1，A，B，C，D及Flag标签鸡TIA-1，PRD，RRM质粒构建.......................................................................................................132.2.2外源表达鸡TIA-1观察SG的免疫荧光检测.........................................................152.2.3外源表达鸡TIA-1的免疫荧光检测.......................................................................15 2.2.4CHX的药物处理......................................................................................................162.2.5內源性TIA-1的免疫荧光检测...............................................................................162.2.6NDV诱导G3BP1的免疫荧光检测.........................................................................172.2.7外源表达G3BP1的免疫荧光检测.........................................................................182.2.9Westen-blot方法.....................................................................................................192.2.9G3BP1和TIA-1的同源性对比方法........................................................................203结果......................................................................................................................213.1GFP-TIA-1，PRD，RRM和Flag-TIA-1，PRD，RRM以及GFP-G3BP1，A，B，C，D重组质粒的构建...............................................................................................................213.2G3BP1和TIA-1的同源性对比...................................................................................213.3Hela细胞和DF-1细胞外源表达TIA-1诱导SG的产生..........................................233.4HeLa细胞外源表达鸡TIA-1与内源性SG标志物共定位.......................................243.5ctGFP-cPRD诱导有别于SG的大颗粒，且在CHX处理下不解聚..........................253.6GFP标签影响PRD的定位.........................................................................................273.7内源性TIA-1在应激处理下聚集至鸡细胞质SG中................................................283.8鸡的组织中SG的形成..............................................................................................293.9NDV诱导G3BP1在细胞中聚集形成SG..................................................................303.10外源表达G3BP1促进SGs的形成..........................................................................313.11G3BP1的RNA结合结构域介导SGs的招募..........................................................313.12G3BP1促进NDV的复制..........................................................................................324讨论......................................................................................................................344.1外源表达TIA-1能够诱导SG的产生........................................................................344.2外源表达TIA-1能够诱导SG的产生并与内源性的SG的标记物共定位..............344.3ctGFP-cPRD诱导有别于SG的大颗粒，且在CHX处理下不降解，GFP标签影响PRD的定位...............................................................................................................................344.4NDV诱导G3BP1在细胞中聚集形成SG..................................................................354.5G3BP1的RNA结合结构域介导SGs的招募............................................................364.6G3BP1促进NDV的复制............................................................................................365结论.......................................................................................................................37参考文献.................................................................................................................38 致谢..........................................................................................................................47攻读学位期间发表论文情况....................................................................................49 山东农业大学硕士学位论文中文摘要中文摘要中文摘要当细胞暴露于各种环境应激条件下，如亚砷酸盐，缺氧和热休克时，细胞终止蛋白翻译，在细胞质中形成储存mRNA的颗粒，称为应激颗粒（stressgranule，SG）。SG是在应激条件下从解聚的多核糖体储存位点释放的mRNA，对选择性翻译是所必需的。当应激条件消失时，应激刺激的细胞内损伤得到修复，例如DNA损伤和错误折叠蛋白的积累。RNA结合蛋白T细胞内部抗原-1（TIA-1）和GTP酶激活蛋白SH3功能区结合蛋白1（G3BP1）是参与SG形成的重要组件。作为对环境应激的一种保守应答反应，SG存在于各种物种中。然而，在鸡细胞中SG形成以及TIA-1/G3BP1在鸡SG装配中的作用还没有被阐明。本研究重点将对鸡TIA-1/G3BP1的功能及其在病毒复制中的作用进行研究。TIA-1在调节人类细胞中前mRNA剪接，mRNA翻译和SG形成中发挥作用。在本研究中，我们克隆鸡TIA-1（cTIA-1），结果表明外源转染cTIA-1促进人和鸡细胞中经典SGs的形成。具有氨基末端GFP标签（ntGFP-cPRD）或Flag标签（Flag-cPRD）的cTIA-1朊蛋白相关结构域cPRD的过表达诱导典型的SG的产生，说明cPRD参与了SG的聚集。然而，羧基末端GFP标签（ctGFP-cPRD）cPRD诱导明显较大的细胞质颗粒，并且不与内源性G3BP1共定位，CHX处理后仍保持稳定不降解，这些结果表明这些颗粒不是典型的SGs，ctGFP标签影响cPRD定位。在外界环境应激下，内源性cTIA-1被募集到的鸡细胞的SG中，在热休克处理下，鸡心脏中出现明显SG颗粒。以上结果表明：cTIA-1在鸡细胞中的经典SG形成中起作用，cPRD在SG聚集过程中发挥重要作用。G3BP1是SGs的重要组件，能够启动组装SGs形成多聚体。为掌握G3BP1在如何作用于鸡细胞中SG形成，以及鸡G3BP1（cG3BP1）在新城疫病毒（NDV）感染诱导SG形成过程中的作用，用NDV感染HeLa细胞，免疫荧光检测内源性G3BP1的定位，结果表明G3BP1呈现典型的点状荧光，但不与病毒P蛋白共定位。将鸡G3BP1分别转染至HeLa，DF-1和CEF后，以不同应激处理之后均能在细胞中观察到SG。外源转染cG3BP1和各分段结构域后以不同应激处理之后观察与内源性SG标志物共定位现象，结果发现G3BP1的A结构域（NTF2样结构域）不能被招募到SGs中，并且抑制原有SGs的形成，D区为RNA结合结构域，单独表达D区能够诱导SG形成，说明cG3BP1的RNA结合结构域对聚集至关重要。最后转染G3BP1之后感染NDV，以Western-blotI 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用和TCID50检测病毒复制情况。结果显示：G3BP1过表达能够增强病毒细胞中病毒蛋白的表达以及上清中的病毒滴度，说明SG在NDV复制过程中发挥促进作用。鸡TIA-1和G3BP1在鸡细胞SG形成过程中至关重要，鸡细胞中G3BP1介导的SG能够促进NDV复制，这为进一步研究NDV和禽源细胞互作奠定了基础。关键词关键词：关键词：：：TIA-1；PRD；G3BP1；鸡；应激颗粒；新城疫病毒；复制II 山东农业大学硕士学位论文AbstractWhenexposedtovariousenvironmentalstressconditions,suchasarsenite,hypoxia,andheatshock,cellsinhibittheirproteintranslationandformgranulescontainingmRNAinthecytoplasm,termedasstressgranules(SGs).SGisastoragesiteformanymRNAsreleasedfromdepolymerizedpolyribosomesunderstressconditionsandisrequiredforselectivetranslationofthestress-inducinggene.Whenstressisrelieved,thecelldamageisrecovered,suchasDNAdamageandmisfoldedproteinaccumulation.RNA-bindingproteinT-cellinternalantigen-1(TIA-1)andRas-GTPase-activatingproteinSH3domain-bindingprotein1(G3BP1)playimportantrolesinSGformation.Asanevolutionallyconservedresponsetoenvironmentalstress,SGhasbeenreportedtoexistinvariousspecies.However,SGformationinchickencellsandtheroleofTIA-1/G3BP1inchickenSGassemblyandvirusinfectionhasnotbeenelucidated.ThisstudymainlyfocusedonthefunctionofTIA-1/G3BP1andtheirroleinvirusinfection.TIA-1playsaroleinregulatingalternativepre-mRNAsplicing,mRNAtranslation,andstressgranuleformationinhumancells.Inthepresentstudies,weclonedchickenTIA-1(cTIA-1)andshowedthatcTIA-1facilitatesintheassemblyofcanonicalSGsinbothhumanandchickencells.Overexpressionofchickenprion-relateddomain(cPRD)thatboreanamino-terminalGFPtag(ntGFP-cPRD)orFlagtag(Flag-cPRD)inducedtheproductionoftypicalSGs.However,carboxyl-terminalGFPtag(ctGFP-cPRD)inducedsignificantlylargecytoplasmicgranulesthatweredevoidofendogenousG3BP1andremainedstablewhenexposedtoCHX,indicatingthatthesewerenottypicalSGs,andntGFPtaginfluencescPRDlocalization.Finally,endogenouscTIA-1wasdeterminedtoberecruitedtoSGsinchickencellsandtissuesunderenvironmentalstress.Takentogether,ourstudiesprovideevidencethatcTIA-1playsaroleincanonicalSGformationinchickencellsandtissues.OurfindingsalsoindicatedthatcPRDisnecessaryforSGaggregation.G3BP1isanSGscomponentthatinitiatesassemblyofSGstoformmultimers.ToinvestigatethemechanismofchickenstressgranuleformationandtheroleofG3BP1inSGformationandvirusinfection,immunofluorescenceassaywasutilizedtoevaluateG3BP1accumulationinNewcastleDiseasevirus(NDV)infectedHeLacells.TheresultsshowedthatIII 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用NDVinducedG3BP1granulesinHeLacells.However,PproteinofNDVdidnotco-localizewithendogenousG3BP1.TransfectionofexogenouschickenG3BP1intoeitherHeLa,DF-1orCEFcellsinducedSGsinthepresenceorabsenceofenvironmentalstress.GFP-taggedchickenG3BP1anditsfourdomainwastransfectedintoHeLacells,respectively,beforeexposedtovariousstressors.ItwasfoundthattheAdomain(NTF2-likedomain)ofG3BP1couldnotberecruitedintoSGs,andtheformationoftheoriginalSGswasinhibited,andtheDregion(RNA-bindingdomain)wastheRNAbindingdomainandwasrecruitedintotheSGs.Finally,G3BP1wastransfectedintocellsbeforeNDVinfection.Western-blotandTCID50testwereutilizedtoevaluatevirusreplication.TheresultsshowedthatG3BP1overexpressionenhancedNDVreplication,indicatingthepro-viralroleofSGinNDVinfection.TheseresultsdemonstratedthatchickenTIA-1andG3BP1playedanimportantroleinSGformation.ChickenSGpromotesNDVreplication.ThestudieslaythefoundationfortheinteractionsbetweenNDVandchickencells.Keywords：TIA-1;PRD;G3BP1;Chicken;SG;NDV;ReplicationIV 山东农业大学硕士学位论文1前言1.1应激颗粒研究进展1.1.1应激颗粒概述真核细胞受环境刺激如氧化应激、病毒感染或热休克时，能够迅速终止翻译，多聚核糖体解离，在胞质中形成的致密颗粒状聚合体即应激颗粒（stressgranules,SGs）(AndersonandKedersha,2006)。SG是大小约0.1-0.2µm的非膜细胞质点状聚集，由翻译起始中停滞信使核糖核蛋白（mRNP）聚集而形成，主要由未翻译的mRNP组成。当翻译起始被药物或应激反应抑制时，形成SG。类似地，应激颗粒状RNP颗粒存在于神经元和胚胎中，其中存在显著的非翻译mRNP库(ApostolovandSawa,1976)。SG中含有翻译起始因子和在翻译起始步骤中停滞的特异性mRNA。SG包含各种蛋白质组及几种RNA结合蛋白，其中包括：GTP酶激活蛋白SH3功能区结合蛋白1（G3BP1）、T细胞限制性胞内抗原1（TIA-1）、TIA-1相关蛋白（TIAR）、eIF3、eIF4E、eIF4G、poly-A结合蛋白（PABP）和核糖体小亚基蛋白（rPS6,rPS3）等(Kedersha,Choetal.,2000;Kennedy,Frenchetal.,2001;Kimball,Horetskyetal.,2003)。经过对应激颗粒内“核心”稳定亚结构的蛋白质组学分析，大约50％的SG组分是RNA结合蛋白的亚组(Jain,Wheeleretal.,2016)。不结合RNA的SG组分可通过蛋白-蛋白相互作用被招募到SG中。这种非RNA结合蛋白包括翻译后修饰酶，代谢酶和蛋白质或RNA重塑复合物，其可以影响SG装配和解离。SG还包含信号通路的关键组分，说明其可能参与细胞内信号的传导(Buchan,2014;JainandWheeleretal.,2016)。有报道显示：酵母在极端热应激状态下形成聚集体，并且一些聚集蛋白质中含有SG的组分(Cherkasov,Grousletal.,2015;Wallace,Kear-Scottetal.,2015)。哺乳动物SG核心蛋白质组学分析确定了SG成分之间的蛋白质-蛋白质相互作用网络(Jain,Wheeleretal.,2016)，能够有助于以冗余的方式使SG形成。例如，在哺乳动物细胞中，Atx2/Pbp1或TIA1/Pub1蛋白促进SG组装，但并不是SG形成必须的蛋白(Gilks,Kedershaetal.,2004;Buchan,Muhlradetal.,2008)。SG可以通过不同的作用，在不同的应激条件下发生。例如，在氧化应激条件下，哺乳细胞旁系同源蛋白G3BP1和G3BP2对SG的形成发挥重要的作用(Tourriere,Cheblietal.,2003)。类似的，在酵母细胞葡萄糖饥饿期间Gtr1，Rps1b和Hgh1促进SG的形成，但在热休克条件下，抑制SG的形成。因此，颗粒装配是高度冗余的，装配的机制境况是特定的。这表明细胞特定条件下，颗1 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用粒组装不同，并且SG对不同的刺激有不同的功能。1.1.2应激颗粒发生过程当暴露于诸如病毒感染，氧化应激，热休克和紫外线照射等环境应激时，哺乳动物细胞通过暂时抑制细胞翻译相关蛋白进入相对稳定的状态。诱导SG抑制细胞质mRNA翻译，未翻译的mRNA和蛋白质翻译因子与RNA结合蛋白结合(Kedersha,Guptaetal.,1999;Kedersha,Chenetal.,2002)。经典SG形成的经典通路起始于真核翻译起始因子2α（eIF2α）磷酸化，以及上游四种蛋白激酶的激活，四种激酶包括双链RNA依赖性激酶（PKR，也称为EIF2AK2），血红素调节激酶（HRI，也称为EIF2AK1），总蛋白调节激酶（GCN2，也称为EIF2AK4）和PKR样内质网激酶（PERK，也称为EIF2AK3）(AndersonandKedersha,2002)。在一些情况下，SG形成可能独立于eIF2a磷酸化发生，如在牛皮癣醇诱导的应激过程(Mazroui,Sukariehetal.,2006;Arimoto,Fukudaetal.,2008;Qin,Carrolletal.,2011,Grousl,Ivanovetal.,2013)。大多数细胞mRNA的传统帽子依赖性翻译始于eIF4F复合物对7-甲基化-GTP帽子结构的识别(SchneiderandMohr,2003)。eIF4F由3个起始因子：eIF4E，eIF4G和eIF4A组成。eIF4G的中心区与40S核糖体亚基结合，N末端通过与poly（A）-结合蛋白（PABP）Met结合而募集mRNA(Gingras,Raughtetal.,1999)。eIF2-GTP-tRNA三元复合物与40S复合物结合并识别起始密码子(KedershaandAnderson,2002)。当细胞暴露于应激源时，MeteIF2α的磷酸化导致eIF2-GTP-tRNA的数量降低(KedershaandAnderson,2002)。RNA结合蛋白TIA-1和TIAR蛋白质从细胞核穿梭到细胞质，以螯合SGs处的未翻译mRNA(Kedersha,Guptaetal.,1999)。在Ser-51处eIF2α的磷酸化由多种激酶介导，包括血红素调节的抑制剂激酶，一般性对照不可抑制激酶，PKR和PERK(Kedersha,Tisdaleetal.,2008)。非经典机制诱导的SG与eIF2α无关，是通过抑制eIF4F复合物的3个亚基（eIF4A，eIF4G和eIF4E）的活性诱导SG。这个过程最终导致降低翻译起始速率和SG的形成。(Mazroui,Sukariehetal.,2006;Emara,Fujimuraetal.,2012)SG的组分包括失速的48S起始翻译复合物和一组RNA结合蛋白，如TIA-1，TIAR和G3BP1(AndersonandKedersha,2002;OhnandAnderson,2010)。另外，其他细胞蛋白可以被包装到SG中，包括Tudor葡萄球菌核酸酶（Tudor-SN，也称为SND1），作用于RNA的腺苷脱氨酶1（ADAR1）(Kim,Cookeetal.,2012)，还包括p90核糖体S6激酶2（RSK2，也称为RPS6KA3），Ras同源基因家族成员A和Rho相关的卷曲螺旋形成激酶1（RhoA和ROCK1）(TsaiandWei,2010)，2-氧戊二酸和Fe（II）-依赖性加氧酶结构2 山东农业大学硕士学位论文域1（OGFOD1）(Wehner,Schutzetal.,2010)，黑色素瘤分化相关基因5（MDA5，也称为IFIH1）和视黄酸诱导型基因I（RIG-I，也称为DDX58）(Onomoto,Jogietal.,2012)。当恢复适于翻译的条件时，SG的组分动态释放，使得翻译快速重新开始。因此，SG被认为用作翻译沉默mRNA的临时储存库，从而促进细胞存活(AndersonandKedersha2002;Arimoto,Fukudaetal.,2008;TsaiandWei,2010)。1.1.3应激颗粒的信号转导调控环境的变化要求细胞不断适应以保持其活力，环境应激（氧化应激，热休克，紫外线辐射，渗透压休克和病毒感染）是形成所有真核细胞进化的保守性刺激。转录水平的调节是原核细胞调节蛋白质合成最重要的机制。然而，除了转录水平调控之外，真核细胞能够在转录后水平调节基因表达，这样的调节对于细胞来说至关重要。应激颗粒形成是一种重要的转录后调控，其能够不断的修饰合成蛋白质组成成分，导致蛋白质翻译受到选择性抑制。在此期间，细胞存活需要的转录物获得最高的翻译优先权。两个相关的多功能RNA结合蛋白：TIA-1和TIAR，在应激反应中是两个重要的翻译调节因子。在大脑，睾丸和脾脏中，TIA-1蛋白是特别丰富的核胞质穿梭蛋白。缺乏TIA-1或TIAR的小鼠表现出高胚胎致死率，而缺乏TIAR的小鼠是不育的，因为缺乏TIA-1或TIAR的小鼠的原始生殖细胞死亡(Bullock,Clarksonetal.,1996)。TIA-1和TIAR能够以高亲和力结合至TNF-α富含AU元件（ARES），并使RNA从多核糖体转移到非翻译信使核糖核蛋白（mRNP）中，从而使作为巨噬细胞中肿瘤坏死因子（TNF）-α表达翻译沉默，而不改变TNF-αmRNA的稳定性。除了所选择的细胞质转录物的翻译沉默之外，TIA-1和TIAR都能够调节细胞核中特异性剪接位点的选择(Forch,Puigetal.,2000;LeGuiner,Gesneletal.,2003)。因此，这些蛋白质在细胞核和细胞质中都具有多重功能。在应激细胞中TIA-1蛋白在细胞中的分布表现出显著的改变，从细胞核转移到细胞质中，它们在亚细胞位点积累，形成SG(Kedersha,Guptaetal.,1999)。类似的颗粒在热休克的番茄细胞中也有报道(Nover,Scharfetal.,1983)，在哺乳动物细胞中也有报道相似的结构。植物细胞SGs中除了热休克蛋白（HSPs）外还含有RNA。值得注意的是，植物热休克SGs中的RNA含量是选择性的，它们含有编码管家基因的mRNA，但排除了新合成的热休克mRNA(Nover,Scharfetal.,1983)。SG中的RNA在翻译上无活性，但可以在体外翻译，并且也可以在细胞解除应激条件后恢复正常的翻译。因此，SGs是mRNA在应激期间储存位点，以用于解除应激条件后恢复正常后的翻译。通过对任一TIA-1蛋白或聚腺苷酸化的[poly（A）+]mRNA结合蛋白（PABP）的3 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用免疫染色，哺乳动物中的SG能够在细胞中检测到。SGs还可以通过热休克以外的各种应激诱导，例如氧化应激，紫外线辐射和渗透压等(Kedersha,Guptaetal.,1999)。有趣的是，低分子量的HSPs能够在热休克应激诱导的SGs中发现，但并不能在其他刺激诱导的SGs中发现。对于外界刺激诱导的SG中共同起始反应是真核起始因子（eIF）2α亚met基的磷酸化，eIF2-GTP-tRNAi三元复合物将起始甲硫氨酸组装到小核糖体亚基上起始翻译。eIF2α的磷酸化防止其从eIF2B解离，eIF2B是通过促进GDP/GTP交换而生成三元复合物的酶，从而通过降低三元复合物的水平停止翻译起始。eIF2α的磷酸化缺失突变体的表达，通过抑制三元复合物形成而影响蛋白质合成，而非磷酸化突变体阻止翻译停止，即使当细胞受到应激时。通过此突变体，表明eIF2α磷酸化诱导SG形成(Kedersha,Guptaetal.,1999)。作用于eIF2α磷酸化下游的TIA-1蛋白是SG装配所必需的。TIA蛋白和PABP在应激细胞中的SG中定量积累，而沉降实验表明，对应于80S单体的区域中，这些蛋白仅有少部分在蔗糖梯度中共沉淀。TIA-1从应激细胞移行的优势为可溶性mRNPs，尽管通过显微镜观察到TIA-1定位到看起来很大的SG中。通过mRAP揭示SGs的动态质，我们质疑它们在蔗糖梯度上的稳定性，并使用免疫荧光评估SG组成，而不是使用更明显的生物化学纯化法。通过荧光显微镜观察显示了小核糖体亚基是SGs的组件。在所测试的eIF中，eIF3，eIF4E和eIF4G被募集到SG中，然而，eIF5和eIF2不存在于SG中(Kedersha,Chenetmetal.,2002)。由于eIF5通常用于将eIF2-GTP-tRNAi连接到eIF3，因此一种可能的模型Met是eIF2-GTP-tRNAi和TIA蛋白质竞争前蛋白复合物上的相同位点(Kedersha,Chenetal.,2002)。细胞中活性三元复合物和细胞质中的TIA的相对量的多少将决定转录物是否Met被有效启动或引起SG的形成。在没有应激的情况下，eIF2-GTP-tRNAi三元复合物，Met可用于在加帽转录物的5'端形成经典的48S前复合物并开始密码子扫描，通过tRNA的反密码子识别起始密码子后，eIF5促进GTP水解，早期的内部因子被60S核糖体亚Met基取代。在应激细胞中，eIF2α磷酸化消耗储存的elF2-GTP-tRNAi，细胞质中的TIA-1的量增加，TIA-1包含非经典的eIF2/eIF5缺失前起始复合物中，TIA-1通过N端结合RNA，C端自聚合结构域聚集，促使这些复合物的聚集形成SGs。存在于SG中的翻译组分显示为红色；SG中存在的非翻译蛋白显示为黄色，SG中缺少的翻译蛋白显示为绿色（见图1）SG中的其他蛋白质组分包括RNA结合蛋白HuR，稳定RNA的ARE结合蛋白质和三四氯丙素（TTP）。除此之外，其他ARE结合蛋白，例如hnRNPA1（heteronuclear4 山东农业大学硕士学位论文RNP-A1）和hnRNPD（heteronuclearRNP-D）/AUF-1（富含AU的RNA结合因子）不被招募到SG(Kedersha,Chenetal.,2002)。图1应激条件下和正常条件下翻译起始过程(Kedersha,Chenetal.,2002)Fig1Translationalinitiationintheabsenceorpresenceofstress(Kedersha,Chenetal.,2002)1.1.4应激颗粒与病毒感染研究进展作为专性细胞内寄生生物，病毒依赖宿主细胞翻译机制。为了顺利复制，病毒采用一系列方法来劫持宿主翻译系统。例如，流感病毒非结构蛋白NS1与eIF4GI和PABP-1以及病毒mRNA相互作用，募集43S复合物特异性供病毒mRNA翻译(Burgui,Aragonetal.,2003)。许多其他RNA病毒含有内部核糖体进入位点（IRES）位于基因组（g）RNA的5’-非翻译区中，其驱动病毒信息翻译的帽子独立启动。这些RNA病毒中有些诱导eIF2α的磷酸化和关闭细胞总蛋白合成。在这种情况下，某些病毒例如丙型肝炎病毒（HCV）在活化的PKR和eIF2a的磷酸化的存在下通过IRES结构进行翻译(Robert,Kappetal.,2006)。eIF2a的磷酸化也导致SG形成。一些病毒通过影响SG形成逃避翻译抑制(McInerney,Kedershaetal.,2005)。近年来，越来越多的病毒的复制与SG形成相关。(Onomoto,Yoneyamaetal.,2014)。5 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用不同病毒物种病毒诱导的SG的模式不同。一些病毒抑制SG形成。例如，野生型甲型流感病毒不诱导SGs，但NS1突变型病毒以PKR依赖性方式触发SG形成(Khaperskyy,Hatchetteetal.,2012;Onomoto,Jogietal.,2012)。一些病毒诱导瞬时SG形成。例如，在小RNA病毒感染的早期阶段，可观察到病毒诱导SG，但随后消失，可能是因为病毒3C蛋白酶对应激颗粒成分G3BP的切割(White,Cardenasetal.,2007;Qin,Hastingsetal.,2009;Ng,Jogietal.,2013)。某些病毒诱导稳定的SG形成。例如，用HCV在感染后48h观察到SG并且在72h时增加到峰值(Garaigorta,Heimetal.,2012)。1.1.4.1NDV对SG的影响NDV是副粘病毒科的成员，具有单股负链RNA基因组。溶瘤性NDV可以在肿瘤细胞中选择性复制并且是重要的溶瘤病毒(Fiola,Peetersetal.,2006)。NDV基因组包含6个基因编码融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN），基质蛋白（M）、核衣壳蛋白（NP），磷蛋白（P）和大聚合酶（L）组成，负责病毒转录和复制。NP封装RNA基因组，其用作病毒转录和复制的模板(Zengel,Pickaretal.,2015)。P蛋白是模板病毒RNA合成必不可少的成分(Curran,1996)。NDV入侵宿主细胞后，NP包裹的病毒基因组RNA以及其他病毒组分被释放到细胞质中(Smith,Popaetal.,2009)。NP包裹病毒gRNA作为模板以产生（+）互补（c）RNA和mRNA。病毒mRNA在蛋白质合成过程中被L蛋白包裹和聚腺苷酸化(Horikami,Smallwoodetal.,1996,Kolakofsky,Peletetal.,1998)。翻译过程依赖于宿主细胞细胞质内的细胞翻译机制，引起细胞的强应激反应。1.1.4.2病毒通过感染抑制SG的形成许多野生型病毒感染观察不到SG形成，并且感染后能够抑制eIF2α磷酸化反应。轮状病毒（RV）能够激活eIF2α的磷酸化，但不能促使SG形成，感染细胞对亚砷酸盐诱导形成的SGs没有影响(Montero,Rojasetal.,2008)。eIF2α磷酸化对于有效的RV复制不是必需的，但可以抑制宿主细胞蛋白质合成(Raaben,GrootKoerkampetal.,2007;Montero,Rojasetal.,2008)。鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）感染后抑制SG的形成。TMEV前导序列蛋白（L）与SG抑制相关，因为具有突变型L蛋白的病毒能够诱导SG形成。在外源性应激反应下，L蛋白的异位表达单独抑制SGs(BorgheseandMichiels,2011)。急性Junin病毒感染阻断亚砷酸盐处理的eIF2α的磷酸化反应，病毒的核蛋白（N）或糖蛋白前体（GPC）以一种未知机制对其进行调节(Linero,Thomasetal.,2011)。甲型流感病毒感染不能诱导SGs的形成，在NS1突变的病毒感染情况下，SGs以PKR依赖性方式形成，说明流感病毒NS1蛋白抑制PKR活化。SG的形成与病毒6 山东农业大学硕士学位论文复制的抑制相关(Khaperskyy,Hatchetteetal.,2012)。人类T细胞白血病病毒1型（HTLV-1）通过病毒Tax蛋白的表达抑制SG形成(Legros,Boxusetal.,2011)。SGs的抑制是由于Tax与HDAC6的相互作用，HDAC6是对SG形成和维持的至关重要的蛋白质(Kwon,Zhangetal.,2007)。DNA病毒及单纯疱疹病毒1（HSV1）突变株能够诱导SG或SG样结构。野生型HSV1的感染导致TIA-1和TIAR的细胞质聚集定位，但是形成SG不明显。然而，感染HSV1∆UL41，缺乏病毒宿主关闭蛋白（Vhs）的突变株，导致细胞形成SG，但这一过程与eIF2α磷酸化无关(Esclatine,Taddeoetal.,2004,Dauber,Pelletieretal.,2011)。这些初始数据表明：HSV通过调控宿主翻译eIF2α磷酸化抑制SG形成。这些结果也证实eIF2α磷酸化不是引发SG形成的唯一途径。1.1.4.3SG的抗病毒反应SGs具有潜在地抗病毒功能，因为它们能够结合对于病毒复制至关重要的细胞组分。例如，SGs通过结合与负链RNA互补的3'茎环来螯合黄病毒RNA复制所需的TIA-1和TIAR(EmaraandBrinton,2007)。G3BP也被HCV复制复合物利用(Ariumi,Kurokietal.,2011)。翻译起始因子是任何病毒有效复制所必需的，因此40S亚基和eIF4G，eIF4A，eIF4B和eIF3的螯合可以对病毒复制具有负面效果。虽然有证据表明将病毒RNAs招募至SGs中可以抑制病毒复制(Henao-Mejia,Liuetal.,2009)，在大多数病毒系统中没有证据证实病毒RNA被招募至正常条件下的SGs中。SG可能也包括结合mRNP复合物并穿梭进入SG和PB的抗病毒蛋白，例如APOBEC3G和APOBEC3F蛋白(Gallois-Montbrun,Krameretal.,2007;Gallois-Montbrun,Holmesetal.,2008)。APOBEC3G通过结合HIVRNA进入到SG和PB中(Kozak,Marinetal.,2006)。其他病毒基因组结合SG标记蛋白螯合到SG中，例如TIA-1/TIAR与黄病毒RNA的结合，以及最近的报道的HCV和DVRNA与G3BP结合(Ward,Bidetetal.,2011;Yi,Panetal.,2011)。最后，尽管SGs可以被认为是主要抗病毒细胞应激反应，它们可以作为细胞凋亡的抑制剂。例如SG可通过RACK1和其他细胞凋亡促进因子螯合作用负调节JNK/SAPK通路阻断细胞凋亡(Arimoto,Fukudaetal.,2008;BuchanandParker,2009)。1.2RNA结合蛋白TIA-1和G3BP1研究进展1.2.1TIA-1研究进展TIA-1和TIAR是紧密相关的RNA结合蛋白，其通过结合富含尿苷的RNA位点来7 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用调节基因表达。内源和重组野生型TIA-1分布在细胞核和细胞质中(Kedersha,Guptaetal.,1999)。TIA-1/R的作用根据其亚细胞定位而变化。在细胞核中，TIA-1/R的功能主要是调节前体mRNA剪接(Forch,Puigetal.,2000,Zhu,Hasmanetal.,2003)。在细胞质中，TIA-1/R通过结合mRNA的3'非翻译区（3'UTR）中富含AU的元件来调节mRNA翻译(Piecyk,Waxetal.,2000;Kandasamy,Josephetal.,2005)。此外，当细胞暴露于环境应激物如氧化应激，热休克或病毒感染时，TIA-1/R从细胞核穿梭到细胞质，以螯合未翻译的mRNA形成细胞质点状聚集。随后，通过将mRNA转录物募集到SG中，细胞进入相对稳定的状态，抑制蛋白质翻译。TIA-1/R是RNA结合蛋白，具有3个氨基末端RNA识别基序（RRM）和一个羰基末端朊病毒相关域（PRD），这两者都是SG装配所必需的。RRM的作用是募集RNA，PRD的作用是聚集RNA、RNA结合蛋白和其他SG组分以形成SG(Gilks,Kedershaetal.,2004)。全长TIA-1表达诱导SG的装配。PRD的过表达招募内源性TIA-1诱导形成细胞质聚集体(Kedersha,Guptaetal.,1999)。敲除TIA-1PRD将抑制蛋白质的聚集和SG组装(Gilks,Kedershaetal.,2004)。PRD聚集由分子伴侣热休克蛋白70（HSP70）调节，并且HSP70的过表达防止PRD的细胞质聚集(Gilks,Kedershaetal.,2004)。暴露于热休克的番茄细胞的细胞质中观察到SGs(Nover,Scharfetal.,1983)。在经受各种环境刺激下，哺乳动物细胞中检测到类似的SG结构。此外，TIA-1/R已被确定为哺乳动物SGs的关键组成部分(Kedersha,Guptaetal.,1999)。这些报告表明SG是对环境刺激的进化保守反应。已有报告显示鸡细胞中也能观察到SG。例如，热休克蛋白24（HSP24）被招募到细胞质的不溶性颗粒中，这种不溶性颗粒可能是SGs(Kedersha,Guptaetal.,1999)。体内实验表明，SGs存在于庆大霉素处理的鸡的耳蜗细胞中(Mangiardi,McLaughlin-Williamsonetal.,2004)。然而，鸡细胞中SG形成未有系统研究。特别是，虽然TIA-1/R已被证明是鸡DT-40细胞存活所必需的，但TIA-1在鸡SG装配中的作用尚未阐明(LeGuiner,Gesneletal.,2003)。1.2.2G3BP1研究进展G3BP1在SGs的形成中起到重要的作用，敲除细胞中的G3BP1，SGs的聚集显著减少(Bullock,Clarksonetal.,1996;Kent,Clarksonetal.,1996;Gallouzi,Parkeretal.1998;Tourriere,Gallouzietal.,2001)。G3BP1蛋白由以下几个结构域组成：NTF2样（nucleartransportfactor2-like）结构域、酸性区域、PXXP基序和两个RNA结合基序，分别是RNA识别基序（RRM）和精氨酸-甘氨酸富集区(RGG)]。NTF2样结构域和RNA结合8 山东农业大学硕士学位论文基序是SGs的形成所必需的(Tourriere,Cheblietal.2003)。另有报道显示G3BP1具有一定的RNA核糖核酸内切酶的活性，尽管还不清楚这一活性是否与SGs功能相关(Gallouzi,Parkeretal.,1998)。在RNA病毒感染过程中，最经典的SG形成通路是细胞通过PKR识别病毒复制中间体双链RNA（dsRNA）诱导eIF2α磷酸化和SG形成。新城疫病毒（NDV）隶属于副黏病毒科副黏病毒属，对养禽业危害巨大。本实验室前期报道显示，NDV感染细胞能够显著激活PKR/eIF2α通路(Zhang,Sunetal.,2014)，由此推测NDV感染能够诱导SG的产生。本研究证实了NDV感染人源和禽源细胞均能诱导SG标志物G3BP1聚集，G3BP1的RNA结合结构域对聚集至关重要。G3BP1过表达能够增强病毒复制，说明SG在NDV复制过程中发挥促进作用。1.3本研究的目的和意义G3BP1和TIA-1是SG的标志物，对SG的形成具有重要的作用，对G3BP1和TIA-1的研究为进一步研究SG的形成机制以及SG的功能奠定基础。NDV对养禽业危害巨大，SG对NDV具有一定的作用，研究SG与NDV之间的相互关系，能够为更有效的防控NDV提供理论基础。9 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用2材料与方法2.1材料2.1.1病毒本实验中所用到的NDVHerts/33标准强毒株由中国农业科学院上海兽医研究所丁铲课题组保存，原购自中国兽医药品监察所。2.1.2细胞系人子宫颈癌（Hela）细胞和鸡成纤维(DF-1)细胞使用含有10%FBS的DMEM培养基培养细胞。Hela细胞和DF-1细胞由中国农业科学院上海兽医研究所丁铲课题组保存。2.1.3鸡胚成纤维细胞（CEF）首先取8~9日龄的SPF健康鸡胚（购置北京梅里亚通实验动物技术有限公司），经酒精擦拭消毒后进行严格无菌操作在超净台内，用无菌镊子将鸡胚取出置于无菌培养皿中，依次剪去头、翅、四肢并剥离内脏。用高压过的无菌PBS缓冲液清洗剩余的胚体2-3次，将鸡胚取出并置于无菌培养皿中，依次剪去头、翅和双腿并剥离内脏。用高压3的无菌PBS缓冲液清洗剩余的胚体2-3次，用剪刀剪碎至1-2mm大小，转入锥形瓶内，加入含0.25%胰蛋白酶的PBS消化液，在37℃水浴锅中消化约5-10min，待组织块呈蓬松茸毛状倒掉含胰酶的上清，加入含有1%抗生素的10%FBS细胞培养基（DMEM）终止消化，用吸管吹打悬浮组织块，静置3min后吸出上层液体，用灭菌4层纱布过滤，收集滤液。用细胞计数仪计数，以500-800万活细胞铺在细胞培养皿中。置37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，12h-24h内观察CEF细胞生长状态，并根据需要更换培养基。2.1.4抗体Anti-β-actinantibody，G3BP1antibody，PABPantibody和eIF3antibody为美国Sigma公司产品；GFPantibody和TIA-1antibody分别购自Abcom公司；新城疫病毒抗磷蛋白（P）鼠源单克隆抗体由中国农业科学院上海兽医研究所丁铲课题组制备；AlexaFluor488标记的驴抗山羊、山羊抗兔、山羊抗小鼠的荧光二抗及AlexaFluor594标记的驴抗山羊、山羊抗兔、山羊抗小鼠的荧光二抗均为Invitrogen（lifetechnologies）公司的产品；DAPI染液均购自碧云天生物技术研究所。2.1.5主要试剂DMEM培养基、Opti-MEM培养基、胎牛血清FBS为美国GIBCO公司产品；Lipo-fectamin2000转染试剂、TPMix、DNApolymerase、UniverseBuff购自biotool公司；10 山东农业大学硕士学位论文PCRMix购自东盛生物公司；预染蛋白质Marker购自MBI公司；5×SDS-PAGEloadingBuffer、蛋白酶抑制剂(PMSF)、Western及IP细胞裂解液、一抗二抗去除液、显影液及定影液试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；引物由生工公司合成；Agarose购自南京生兴生物技术有限公司；Tris（pH8.8）、Tris（pH6.8）、30%丙烯酰胺混合溶液、异丙醇均购自生工生物公司；BSA购自美国Roche公司、tritonX-100透化液购自生工生物公司；TWEEN-20、ProClin-300、抗荧光猝灭封片剂购自美国SIGMA公司，甲醛溶液购自国药集团化学试剂有限公司；无内毒素大提试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自天根生化科技有限公司；250bp-llDNAladder、5×loadingbufferforAgarosGels均购自GENERAYBiotec公司；50×TAE缓冲液、5×SDS电泳缓冲液、10×转印缓冲液、TBST缓冲液、4%中性甲醛固定液、IP裂解液、10%过硫酸铵由本实验室配制；放线菌酮（CHX）购自美国CALBIOCHEM公司。2.1.6相关试剂的配制2.1.6.110×TBS和1×TBST先称取80gNaCl置于1L烧杯中，再取24.2gTris-base加入此烧杯中，然后在烧杯中加入800mL去离子水，充分揽拌使固体彻底溶解，使用浓盐酸将溶液pH值调至7.6，并定容至1L，室温保存备用。使用时取100mL10×TBS置于量筒中，再加入900mL去离子水配置成1L的1×TBS溶液，再加入500µL吐温即配置成为1×TBST。2.1.6.25×SDS电泳缓冲液分别称取75.5gTris、470g甘氨酸和25gSDS依次加入5L烧杯中，加入4L去离子水，充分搅拌至使粉末彻底溶解。最后加去离子水定容5L，室温保存备用。使用时5×SDS电泳缓冲液和去离子水按照1:4比例分别加入到量筒中，将其稀释成工作浓度使用。2.1.6.310×转印缓冲液分别称取58.18g甘氨酸、116.18gTris和7.5gSDS依次置于3L烧杯中，加入1.5L去离子水，充分搅拌并使固体彻底溶解，然后定容2L，并保存在常温下。使用时10×转印缓冲液、无水乙醇溶液和去离子水以1:2:7比例分别加入到量筒中，充分混匀后使用。2.1.6.450×TAE缓冲液分别称取242.2gTris和37.2gNa2EDTA)·2H2O置于烧杯中，加入800ml去离子水，充分搅拌溶解，然后再加入57.1ml冰醋酸，充分搅匀，加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存。使用时按1:50比例加入50×TAE缓冲液和去离子水，充分混匀后使用。11 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用2.1.6.5LB培养基分别称取10g胰蛋白胨(tryptone)、5g酵母提取物(yeastextract)、10gNaCl置烧杯中，加去800mL离子水后，充分搅匀，加去离子水将溶液定容至1L，用5mol/LNaOH（约0.2ml）调pH至7.2，121℃灭菌25min后，室温保存备用。固体培养基另加15-20g琼脂粉，121℃灭菌25min后备用。2.1.6.64%中性甲醛固定液量取40%甲醛溶液倒入烧杯中，再分别秤取6.5g无水磷酸氢二钠、4.0g磷酸二氢钠分别加入烧杯中，再加蒸馏水定容至1L，放4℃保存备用。2.1.6.70.5%TritonX-l00吸取500µLTritonX-l00加入100mLPBS中，充分混匀保存至4℃备用。2.1.6.83%BSA封闭液称取3gBSA放入烧杯中，用量筒量取100mLPBS倒入烧杯中，然后充分搅匀并使其全部溶解，放4℃保存备用。2.1.6.910%的过硫酸铵（Aps）称取0.1g过硫酸铵放入2mLEP管中，加入1mL去离子水，将固体粉末彻底溶解，储存于4℃备用。10%过硫酸铵最好现配现用，配好的溶液在4℃保存最多可使用2周左右。2.1.6.1010%SDS-PAGE的配制2.1.6.10.110%SDS-PAGE分离胶用1mL移液器分别量取1.9mL去离子水，1.7mL30%Acrylamide和1.3mL1.3mol/LTris(pH8.8)加入到2mL小烧杯中，再用10µL移液器分别加入0.05mL10%过硫酸铵、0.05mL10%SDS和0.002mLTEMED，充分混匀后，加入到SDS-PAGE的玻璃板中，再向玻璃板中加入2mL异丙醇。待胶凝固备用。2.1.6.1110%SDS-PAGE浓缩胶用1mL移液器分别量取1.4mL去离子水，0.33mL30%Acrylamide和0.25mL1mol/LTris(pH6.8)加入到2mL小烧杯中，再用10µL移液器分别加入0.02mL10%过硫酸铵、0.02mL10%SDS和0.002mLTEMED，充分混匀后，加入到分离胶已凝固的SDS-PAGE的玻璃板中，插入与SDS-PAGE玻璃板相配套的10孔梳子，带胶凝固后备用。2.1.7主要仪器12 山东农业大学硕士学位论文PCR仪（国BIO-RAD公司）；高速台式离心机（德国Eppendorf公司)；高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；洁净工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；雪花制冰机（北京长流科学仪器有限公司生产）纯水装置（彤迪科学仪器上海有限公司）；凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）；隔水式恒温培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；全自动化学发光图像分析系统（美国Tanon公司）；小容量恒温培养振荡器（苏州裕宸仪器有限公司专业生产）；激光共聚焦显微镜（日本Nikon公司)；生物安全柜（新加坡艺思高科技有限公司）；稳压稳流电泳仪（上海天能科技有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（北京海峰致远科技有限公司）；电热恒温水槽（上海一恒科学仪器有限公司）；微量震荡仪（北京京辉凯业科技有限公司）；金属浴加热器（上海珂淮仪器有限公司专业生产）；正置显微镜、正置荧光显微镜（日本Nikon公司）。2.2方法2.2.1GFP标签鸡TIA-1，PRD，RRM，和G3BP1，A，B，C，D及Flag标签鸡TIA-1，PRD，RRM质粒构建表3-1GFP标签鸡TIA-1和G3BP1的引物序列表Table3-1ListofprimersforGFPtaggedchickenTIA-1andG3BP1’’名称引物序列（5-3方向）酶切位点GFP-TIA-1FCACAGAATTCATGGAGGATGAAATGECORⅠGFP-TIA-1RTATATAGTCGACTGCTGTGTCTCAAAGCCTSalⅠGFP-RRMFCACAGAATTCATGGAGGATGAAATGECORⅠGFP-RRMRTATATAGTCGACTGTAACTGCTCTGTCAGGSalⅠGFP-PRDFCACAGAATTCATGCGCCAGACCTTTTCECORⅠGFP-PRDRTATATAGTCGACTGCTGTGTCTCAAAGCCTSalⅠGFP-G3BP1FCACAGAATTCATGGTGATGGAGAAGECORⅠGFP-G3BP1RTATATAGTCGACTGCTGGCGTTGCCCGATSalⅠGFP-G3BP1AFCACAGAATTCATGGTGATGGAGAAGECORⅠGFP-G3BP1ARTATATAGTCGACTGAGAGTCACCAAAAACSalⅠGFP-G3BP1BFCACAGAATTCATGGGTGACTCTGACACTECORⅠGFP-G3BP1BRTATATAGTCGACTGCTCCAATACTGGCTCSalⅠGFP-G3BP1CFCACAGAATTCATGGAATCGGCTCCAGAAECORⅠGFP-G3BP1CRTATATAGTCGACTGGTGACTGTCCGGGTASalⅠGFP-G3BP1DFCACAGAATTCATGAGGTACCCGGACAGTECORⅠGFP-G3BP1DRTATATAGTCGACTGCTGGCGTTGCCCGATSalⅠFlag-TIA1FGCGGAATTCACCATGGAGGATGAAATGCCCAAGECORⅠFlag-TIA1RCACAGGATCCCTGTGTCTCAAAGCCTGCCACBamHIFlag-RRMFGCGGAATTCACCATGGAGGATGAAATGECORⅠFlag-RRMRCACAGGATCCTAACTGCTCTGTCAGGBamHIFlag-PRDFGCGGAATTCACCATGCGCCAGACCTTTTCECORⅠFlag-PRDRCACAGGATCCCTGTGTCTCAAAGCCTBamHI13 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用构建好的引物送上海生工公司合成，合成好的引物按要求进行溶解稀释后备用。按照如下体系(50µL)进行PCR，分别加样：High-FidelityDNAPolymerase1µL5×Q5ReactionBuffer10µL10mMdNTPs1µLcDNA模板2µLPremierF(10uM)2µLPremierR(10uM)2µL超纯水32µL加完样品后进行瞬离，放入PCR仪中，在PCR上设置反应程序：95℃3min95℃30sec55℃30sec30Cycles72℃1min72℃5minPCR产物琼脂凝胶电泳回收后用图表3-1中相对应的双切酶对PCR产物进行酶切，酶切体系如下:PCR回收产物30µLECORⅠ2µLSalⅠ2µL10×buffer5µL超纯水11µL酶切3小时后，酶切产物经琼脂凝胶电泳回收，将回收产物连接到经同样酶切的GFP-N1的载体上，连接体系如下：TIA-1／RRM／PRD／G3BP1／A／B／C／D目的片段7µLGFP-N1载体1µL10×T4ligasebuffer1µLT4ligase1µL4℃连接过夜、转化、涂板，然后挑取单菌落后在含有氨苄抗性的液体LB中培养，小提质粒，琼脂凝胶电泳进行鉴定，鉴定为阳性的质粒送往上海生工生物工程技术服务14 山东农业大学硕士学位论文有限公司进行测序验证。2.2.2外源表达鸡TIA-1观察SG的免疫荧光检测51）先将无菌飞片放入六孔板中，将Hela细胞和DF-1细胞分别7×10个细胞接种到六孔板中，每孔加入10%FBS的DMEM的培养基，在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，培养至70%时进行转染。2）转染：用200µLOPTI-MEM培养基稀释2µg质粒在1.5mLEP管中，在另一个EP管中用200µLOPTI-MEM培养基稀释4µLLipofectamin2000，在室温孵育5min后，将两个EP管中的培养基混合。在室温孵育20min。在这期间，用无血清的DMEM培养基洗涤六孔板的细胞3次，然后在每孔加入1mL的OPTI-MEM培养基，20min后加入上述的培养基混合物，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24h。3）NDVHerts/33感染组：转染24h后用无血清DMEM培养基洗涤细胞3次，用无血清DMEM培养基稀释NDVHerts/33，病毒感染量为1MOI。将稀释的病毒加入六孔板中，每孔1mL。放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，1h后，将NDVHerts/33感染组的细胞用PBS缓冲液洗三遍，然后加入1%DMEM培养基维持液，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，18h后进行收样固定。4）ARS处理组：直接在ARS组的细胞培养基中以1:100的比例加入ARS。放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，作用30min后用PBS缓冲液洗涤3次然后进行收样并用4%中性甲醛固定。5）将抗猝灭荧光封片剂滴加到载玻片上，再将含有细胞的飞片反扣在载玻片，风干后，用激光共聚焦显微镜进行观察。2.2.3外源表达鸡TIA-1的免疫荧光检测51)先将无菌飞片放入六孔板中，将7×10个Hela细胞接种到六孔板中，每孔加入10%FBS的DMEM的培养基，在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，培养至70%时进行转染。2）将GFP-N1，GFP-TIA转染Hela细胞，具体转染方法同2.2.2。3)ARS处理组：具体方法同2.2.24）间接免疫荧光：用PBS缓冲液将细胞洗涤3次，然后用4%中性甲醛对细胞进行固定10-20min，再用TBST缓冲液将细胞洗涤3次，加入0.3%Xtriton-100溶液到六孔板中，将细胞透化10min，之后再用TBST缓冲液将细胞洗涤3次，然后在六孔板中加入3%BSA，放在37℃水浴锅中封闭30min。15 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用5）将滤纸湿润，然后将湿润的滤纸附在湿盒的背面，再在滤纸上贴上一层保鲜膜，保鲜膜要平整无皱褶，在保鲜膜上分别滴加100µL以1:250稀释的G3BP1抗体，1:200稀释的PABP抗体和1:200稀释的eIF3抗体。将带有细胞的飞片反扣到保鲜膜上的抗体上，保证细胞与抗体充分接触。放在37℃的水浴锅中孵育1h。6）将飞片放入六孔板中，细胞面向上，用TBST缓冲液在微量振荡器上洗涤3次，每次振荡洗涤5min。将滤纸上的保鲜膜换成新的，然后在保鲜膜上滴加100µL1:500稀释的AlexaFluor594标记的山羊抗鼠的二抗。将细胞飞片反扣到滴加的抗体上，并保证细胞与抗体充分接触。放在37℃的水浴锅中孵育30min，7）将飞片正面向上的放入六孔板中，用TBST缓冲液在微量振荡器上洗涤3次，每次振荡5min。将TBST缓冲液吸出，在每孔中加入1mL1:500稀释的DAPI染细胞核，室温孵育5min。之后将DAPI稀释液吸出，加入TBST缓冲液在微量振荡器上洗涤3次，每次振荡5min。8）在载玻片上滴加抗猝灭荧光封片剂，再将含有细胞的飞片反扣在载玻片的封片剂上，在避光处风干后，用激光共聚焦显微镜进行观察。2.2.4CHX的药物处理61)先将无菌飞片放入六孔板中，在将7×10个Hela细胞接种至六孔板中，每孔加入10%FBS的DMEM的培养基，在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，培养至70%时进行转染。2）GFP-TIA-1，GFP-PRD，GFP-RRM分别转染Hela细胞，具体转染方法同3.2。3）CHX细胞处理：在收样前2h时在实验组的细胞中加入1µL浓度为20mg/mLCHX，在对照组的细胞中加入等量的DMSO，放在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，当药物作用1.5h后，在细胞中加入ARS，作用30min后，将培养基吸出，用PBS缓冲液洗涤3次，在用4%中性甲醛将细胞固定。4)间接免疫荧光：具体操作方法同2.2.3。2.2.5內源性TIA-1的免疫荧光检测51)先将无菌飞片放置在六孔板中，将7×10个DF-1细胞接种到六孔板中，每孔加入适量10%FBS的DMEM的培养基，在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，培养至70%时进行细胞处理。2）ARS处理：直接在细胞培养基中以1:100比例加入ARS。放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，作用30min后用PBS缓冲液洗涤3次然后进行收样并用4%中性甲16 山东农业大学硕士学位论文醛固定。3）NDVHerts/33感染组：用无血清的DMEM培养基洗涤细胞3次，用无血清DMEM培养基稀释NDVHerts/33，病毒感染量为1MOI。将稀释的病毒加入六孔板中，每孔1mL。放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，1h后，将NDVHerts/33感染组的细胞用PBS缓冲液洗三遍，然后加入1%DMEM培养基维持液，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，18h后用PBS缓冲液洗涤3次收样并用4%的中性甲醛溶液固定。4）间接免疫荧光：将孵育的一抗换成1:200TIA-1抗体，结合的二抗为AlexaFluor488标记的驴抗山羊抗体，具体操作方法同2.2.3。2.2.6NDV诱导G3BP1的免疫荧光检测51）在六孔板中加入无菌飞片，在飞片上接种7×10个Hela细胞，每孔加入适量10%FBSDMEM的培养基，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养至70%，然后对细胞进行处理。2）用无血清的DMEM培养基洗涤细胞3次，用无血清DMEM培养基稀释NDVHerts/33，病毒感染量为1MOI。将稀释的病毒加入六孔板中，每孔1mL。放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，1h后，将NDVHerts/33感染组的细胞用PBS缓冲液洗三遍，然后加入1%DMEM培养基维持液，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，。分别在0h、6h、12h、18h、24h时收样，用PBS缓冲液洗涤3次后用4%中性甲醛溶液室温固定10min-20min。3）将固定的细胞用TBST缓冲液洗涤3次，然后加入在每孔中加入1mL0.3%TritonX-100溶液室温透化10min，用TBST缓冲液洗涤3次，在加入3%BSA在37℃水浴锅中封闭30min，用TBST缓冲液洗涤3次。4)将湿润的滤纸贴在湿盒的背面，然后在湿润的滤纸上平整的附上一层保鲜膜，用TBST缓冲液按1:1000稀释NP抗体，滴加100µL在保鲜膜上，将六孔板中的飞片夹出反扣在滴加的NP抗体上，保证细胞与抗体充分接触。在37℃水浴锅中孵育1h。5）将细胞飞片正面向上的放置回六孔板中，用TBST缓冲液在微量振荡器上洗涤3次，每次振荡5min。在湿盒的背面换一层新的保鲜膜，然后在保鲜膜上滴加100µL用TBST按1:500比例稀释好的AlexaFluor594标记的山羊抗鼠的二抗，夹出细胞飞片反扣在滴加的AlexaFluor594标记的山羊抗鼠的二抗上，保证细胞与抗体充分接触。在37℃的水浴锅中孵育30min。6）将细胞飞片正面向上的放置回六孔板中，用TBST缓冲液在微量振荡器上洗涤17 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用3次，每次振荡5min。吸出TBST缓冲液，加入3%BSA在37℃的水浴锅中封闭30min，之后再用TBST缓冲液洗涤3次。7）在湿盒的背面换一层新的保鲜膜，然后在保鲜膜上滴加100µL用TBST缓冲液按1:250比例稀释的G3BP1抗体，夹出细胞飞片反扣在滴加的G3BP1抗体上，保证细胞与抗体充分接触。在37℃水浴锅中孵育1h。8）将细胞飞片正面向上的放置回六孔板中，用TBST缓冲液在微量振荡器上洗涤3次，每次振荡5min。在湿盒的背面换一层新的保鲜膜，然后在保鲜膜上滴加100µL用TBST按1:500比例稀释好的AlexaFluor488标记的山羊抗兔二抗，夹出细胞飞片反扣在滴加的AlexaFluor488标记的山羊抗兔二抗上，保证细胞与抗体充分接触。在37℃水浴锅中孵育30min。9）将细胞飞片正面向上的放置回六孔板中，用TBST缓冲液在微量振荡器上洗涤3次，每次振荡5min。在湿盒的背面换一层新的保鲜膜，然后在保鲜膜上滴加100µL用TBST按1:500比例稀释好的DAPI，夹出细胞飞片反扣在滴加的DAPI上，保证细胞与DAPI充分接触。室温孵育5min。10）将细胞飞片放置回六孔板中，细胞在上，用TBST缓冲液在微量振荡器上洗涤3次，每次振荡5min。在载玻片上滴加一滴抗猝灭荧光封片剂，从六孔板中夹出细胞飞片反扣在封片剂上，放在避光处风干，用激光共聚焦观察。2.2.7外源表达G3BP1的免疫荧光检测51）在六孔板中加入无菌飞片，在飞片上分别接种7×10个Hela细胞，DF-1细胞和CEF细胞，每孔加入适量10%FBS的DMEM的培养基，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养至70%，然后对细胞进行处理。2）将GFP-N1和GFP-G3BP1分别转染Hela细胞，DF-1细胞及CEF细胞，具体转染方法同2.2.2。3）热休克组处理：转染24h后，将热休克组放入42℃恒温箱中，处理40min后用4%中性甲醛固定。4）ARS处理和NDVHerts/33感染方法同2.2.2。5）将抗猝灭荧光封片剂滴加到载玻片上，将细胞飞片反扣在封片剂上，放避光干燥处风干，用激光共聚焦观察。2.2.8外源表达G3BP1的RAN结合结构域的免疫荧光检测51)在六孔板中加入无菌飞片，在飞片上接种7×10个Hela细胞，每孔加入适量18 山东农业大学硕士学位论文10%FBSDMEM的培养基，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养至70%，然后对细胞进行处理。2）将GFP-G3BP1，GFP-G3BP1A，GFP-G3BP1B，GFP-G3BP1C，GFP-G3BP1D分别转染Hela细胞。具体转染方法同2.2.2。3）ARS处理和NDVHerts/33感染，方法同2.2.2。4）间接免疫荧光：具体方法同2.2.3。2.2.9Westen-blot方法51）在六孔板中接种7×10个Hela细胞，每孔加入适量10%FBSDMEM的培养基，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养至70%，然后对细胞进行处理。2）细胞转染：将GFP-G3BP1转染至细胞，具体方法同2.2.2。3）NDVHerts/33感染:具体感染方法同3.2。病毒感染后，分别在0h，12h，24h时进行收样，收样时加入100µLwestern及IP细胞裂解液（碧云天）裂解细胞。4℃离心机12000r/min离心5min，取上清，加入2×蛋白上样缓冲液，在金属浴中100℃煮沸10min，然后室温12000r/min离心5min。4）SDS-PAGE凝胶电泳：在每孔中加入40µg上样蛋白，将电压调为80v恒压。待蛋白样品从浓缩胶跑到分离胶时，将电压调至为120v恒压，继续电泳直至溴酚蓝迁移至分离胶底部。5）蛋白转印：SDS–PAGE电泳结束后，将凝胶从玻璃板中取出，与所需的三层滤纸、海绵和根据凝胶大小剪好的硝酸纤维素（NC）膜一起浸泡于4℃预冷的转印缓冲液中，按照“黑胶白膜”即“膜正胶负”的顺序安装电泳装置，即负极-海绵-三层滤纸-凝胶-NC膜-三层滤纸-海绵-正极。组装成“三明治”结构的装置，然后加入转印缓冲液后在冰浴条件下进行转印，将电流调至250mA恒流的条件下进行转印90min。6）封闭：转印完成后，配制5%脱脂乳，将转印好的硝酸纤维素（NC）膜用5%脱脂乳室温封闭2h。7）孵育一抗：将封闭好的硝酸纤维素（NC）膜用TBST缓冲液洗三遍，然后加入1:1000含1%叠氮钠的TBST稀释的GFP多克隆抗体（用于检测GFP-G3BP1蛋白）、1:1000稀释的NDVHerts/33P蛋白鼠源单克隆抗体（用于检测NDVHerts/33P蛋白）和1:3000稀释的β-actin鼠源单克隆抗体（用于检测β-actin内参），4℃孵育过夜，然后将一抗进行回收，用TBST缓冲液在微量振荡器上洗涤3次，每次洗涤10min。8）孵育二抗：加入1:8000TBST稀释的羊抗鼠或羊抗兔IgG-HRP二抗，在微量振19 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用荡器上室温孵育1h，用TBST缓冲液在微量振荡器上洗涤3次，每次10min。9）将ECL显色试剂盒的A液和B液1:1混合后孵育NC膜，作用1min后将NC膜放置于全自动化学发光图像分析系统的暗盒内曝光，用TBST缓冲液将NC膜洗净后再进行上述封闭和抗体作用等步骤。2.2.10G3BP1和TIA-1的同源性对比方法1）在文献中查找不同物种的G3BP1和TIA-1序列。2）用Lasergene软件进行序列对比。20 山东农业大学硕士学位论文3结果3.1GFP-TIA-1，PRD，RRM和Flag-TIA-1，PRD，RRM以及GFP-G3BP1，A，B，C，D重组质粒的构建为了研究SG的标志性蛋白TIA-1及G3BP1，我们构建了TIA-1的结构片段区域RRM和PRD以及G3BP1的结构片段A，B，C和D。我们将TIA-1，RRM和PRD及G3BP1，A，B，C和D结构域的编码区分别克隆入带绿色荧光标签GFP和带标签蛋白Flag的真核表达质粒。克隆后提取质粒进行PCR鉴定（图2），将鉴定正确的质粒送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序验证，测序正确的质粒用于下一步实验。图2GFP-TIA-1，PRD，RRM和Flag-TIA-1，PRD，RRM以及GFP-G3BP1，A，B，C，D重组质粒PCR鉴定M为DNA的marker；1-3分别为GFP-TIA-1，PRD，RRM的PCR的鉴定；4-6分别为Flag-TIA-1，PRD，RRM的PCR的鉴定；7-11分别为GFP-G3BP1，A，B，C，D的PCR的鉴定；Fig.2IdentificationofGFP-TIA-1,PRD,RRMandFlag-TIA-1,PRD,RRMandGFP-G3BP1,A,B,C,DrecombinantplasmidPCRMisthemarkerofDNA;1-3istheidentificationofPCRofGFP-TIA-1,PRD,RRM;4-6arePCR-specificforFlag-TIA-1,PRD,RRM;7-11wereidentifiedforPCRofGFP-G3BP1,A,B,C,3.2G3BP1和TIA-1的同源性对比为了更好的研究G3BP1和TIA-1，我们查找了人，鸡，鸭和斑胸草雀的G3BP1的序列，以及鸡、鸭、人和斑胸草雀的TIA-1的序列，使用MegAlign软件进行了序列对比，从图3B中可以发现人和鸡同源性为82.9%，人和鸭的同源性为83.5%，人和斑胸草雀的同源性为84.4%，鸡和鸭的同源性为98.3%，鸭的G3BP1不同亚型的同源性达到了99.2%(图3A)。结果表明：G3BP1序列不同物种之间具有高度同源性。TIA-1序列通过软件序列对比发现，鸡和鸭的同源性为94.6%，鸡和人的的同源性为92.2%，鸡和鼠的同源性为90.6%，斑胸草雀和人的同源性为96.4%（图3D）。21 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用图3G3BP1和TIA-1序列的同源性比对A和B为G3BP1序列的同源性对比；C和D为TIA-1序列的同源性对比；Fig.3HomologycomparisonofG3BP1andTIA-1sequencesAandBareG3BP1sequencehomologycomparison;CandDfortheTIA-1sequencehomologycomparison;22 山东农业大学硕士学位论文这些结果表明：各物种间的TIA-1序列具有高度同源性。TIA-1可分为RRM结构域和PRD结构域，从图3C可以发现，RRM结构域具有高度保守性，但是PRD结构域的同源性较低。3.3Hela细胞和DF-1细胞外源表达TIA-1诱导SG的产生实验构建了C-末端GFP标记的鸡TIA-1真核表达质粒（ctGFP-cTIA-1），并将其转染到HeLa和DF-1细胞中。结果显示ctGFP-cTIA-1在ARS和热休克的刺激下HeLa细胞细胞质中有明显的点状聚集。在NDV感染的HeLa细胞中也检测到TIA-1点（图4A，第2列和第3列）。通过比较，GFP-N1载体的转染导致全细胞中绿色荧光的弥漫分布（图4A，第1列）。在DF-1细胞的细胞质中观察到类似的TIA-1点（图4A，右图）。对TIA-1荧光点进行定量分析：在20倍视野中在不同的领域随机捕获大约10张照片通过人工计数。由图4B显示，通过ARS处理，在ctGFP-cTIA-1转染的HeLa细胞中观察到100%的TIA-1点。在热休克处理和病毒感染的HeLa细胞中，转染ctGFP-cTIA-1的细胞中分别大约75%和25%的含有明显的细胞质颗粒（图4B，左图）。在相同的应激条件下，在ctGFP-cTIA-1转染的DF-1细胞中观察到类似的趋势（图4B，右图）。过表达ctGFP-cTIA-1的细胞中诱导少数TIA-1颗粒的产生（对于HeLa为大约20%，对于DF-1细胞为大约10%），由此表明过表达cTIA-1能够诱导细胞质颗粒的形成。23 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用图4HeLa和DF-1细胞外源表达cTIA-1诱导产生SGA)过表达GFP-TIA-1，在ARS，heat，NDV的应激下的Hela细胞和DF-1细胞对SG的检测；B)Hela细胞和DF-1细胞在ARS，heat，NDV的应激下产生SG的细胞数Fig.4EctopicexpressionofcTIA-1inducedstressgranuleinHeLaandDF-1cellsundervariousstress.A)WhenGFP-TIA-1overexpressed,SGsinHelacellsandDF-1cellsweredetectedunderstressofARS,heat,NDV;B)ThenumberofHelacellsandDF-1cellscellsthatproduceSGunderthestressofARS,heat,NDV3.4HeLa细胞外源表达鸡TIA-1与内源性SG标志物共定位间接免疫结果表明，在ARS的氧化刺激下过表达ctGFP-cTIA-1诱导的颗粒状聚集与SG的标志物G3BP1、PABP和eIF3共定位（图5），值得注意的是，没有应激条件处理的对照组过表达ctGFP-cTIA-1也能够诱导颗粒状聚集，并且能够与SG的标志物G3BP1、PABP和eIF3共定位。这些研究结果表明：无论有没有应激条件的存在，过表达ctGFP-cTIA-1都能够诱导细胞中的SG的形成。24 山东农业大学硕士学位论文图5HeLa细胞外源表达cTIA-1与内源性SG标志物共定位Fig.5Co-locationofchickenTIA-1expressedandSGsinHeLacells3.5ctGFP-cPRD诱导有别于SG的大颗粒，且在CHX处理下不解聚在本研究中，构建C端GFP标记的cTIA-1全长基因（ctGFP-cTIA-1），RRM（ctGFP-cRRM）或PRD（ctGFP-cPRD）质粒并转染HeLa细胞以鉴定各结构域的定位模式。结果显示：在ctGFP-cRRM转染的细胞中没有SG点。在ARS处理的细胞中，25 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用ctGFP-cRRM的过表达诱导了表现出弱绿色荧光的非典型SG点的形成，并与内源性G3BP1共定位（图6A，第3和6行）。相比之下，在没有外界条件处理的情况下，ctGFP-cPRD的过表达诱导细胞中不同于典型SG的点状聚集形成。在ctGFP-cPRD转染的细胞中观察到两种类型的细胞质灶。约55%的ctGFP-cPRD转染的细胞具有规则大小的聚集点，而在剩余的约45%的转染细胞中检测到显着较大的聚集点。常规大小的点状聚集能够与内源性SG标志物共定位，但是较大的点状聚集不与內源性SG标志物共定位（图6A，第2行和4行）。典型SGs在CHX的存在下分解，图6B显示通过内源G3BP1的定位所指示的，在ARS处理的细胞中，CHX诱导SGs的分解。转染ctGFP-cTIA-1的细胞中的点状聚集，在CHX处理下分解（图6B，第4行）。类似地，在ARS处理组中，ctGFP-cRRM转染的细胞中的非典型SG也在CHX处理下解聚（图6B，第6行）。但是，由ctGFP-cPRD诱导的大的点状聚集在CHX处理下不分解，而常规大小的ctGFP-cPRD点状聚集被分解（图6B，第2和5行）。这些结果表明ctGFP-cPRD诱导不同于典型SGs的大颗粒的聚集。图6ctGFP-cPRD诱导有别于SG的大颗粒，且在CHX处理下不降解A)无CHX处理的TIA-1CHX结构域的免疫荧光检测；B）在CHX处理下TIA-1结构域的免疫荧光检测；a）有别于SG的大颗粒；b）标准SGFig.6LargegranulesinducedbyctGFP-cPRDwhichwasnotdiffernetfromSGsafterCHXtreatmentA)ImmunofluorescenceassayofTIA-1domainwithoutCHXtreatment;B)ImmunofluorescenceassayofTIA-1domainwithCHXtreatment;a)largeparticlesdifferentfromSG;b)standardSG26 山东农业大学硕士学位论文3.6GFP标签影响PRD的定位因为GFP标签的大小（238个氨基酸）远远大于HA或Flag标签（<10个氨基酸）的大小，所以这种差异可能在很大程度上影响cPRD的定位。为了排除由于受GFP标签的影响而出现的假象定位，我们构建了Flag标签的cTIA-1，cRRM和cPRD（图7A）。进行Western印迹分析以检测它们的表达（图7B）。图4C和D显示在用Flag标记的cTIA-1/cRRM细胞和具有ctGFP-标记的cTIA-1/cRRM的细胞中观察到类似的定位模式。有趣的是，在没有ARS的Flag标签的cPRD转染的HeLa细胞中没有观察到SG（图7E，第3行）。另一方面，ntGFP标记的细胞的转染诱导正常大小的SG的形成（图7E，第2行）。当细胞暴露于ARS氧化应激时，在Flag-cPRD和ntGFP-cPRD转染的细胞中都观察到典型SG（图7E，第5和6行）。为了检查由cPRD转染诱导的SG是否是典型SG，用CHX处理转染的细胞。结果表明，只有由ctGFP-cPRD诱导的大颗粒在CHX的处理下不分解。相比之下，Flag-cPRD和ntGFP-cPRD诱导的SG在CHX的处理下被降解，表明这些点是典型的SG。这些实验研究结果表明，尽管GFP标签不影响cTIA-1和cRRM的定位，但C端GFP标签对cPRD定位有很大的影响。27 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用图7GFP标签对cPRD在Hela细胞中定位的影响A）ctGFP-cPRD、ntGFP-cPRD、Flag-cPRD的结构图；B）ctGFP-cPRD、ntGFP-cPRD、Flag-cPRD在Hela细胞中的表达；C）Flag-cTIA-1与G3BP1的免疫荧光检测；D）Flag-cRRM与G3BP1的免疫荧光检测；E）无CHX处理的Hela细胞中SG的荧光免疫检测；F）CHX处理的Hela细胞中SG的荧光免疫检测Fig.7InfluencesofGFPtagtothelocalizationofcPRDinHelacellsA)StructurediagramofctGFP-cPRD,ntGFP-cPRD,Flag-cPRD;B）ExpressionofctGFP-cPRD,ntGFP-cPRD,Flag-cPRDinHelacells;C)ImmunofluorescenceassayofFlag-cTIA-1andG3BP1;D)ImmunofluorescenceassayofFlag-cRRMandG3BP1;E)ImmunofluorescenceassayofSGwithoutCHXtreatment;F）ImmunofluorescenceassayofSGwithCHXtreatment3.7内源性TIA-1在应激处理下聚集至鸡细胞质SG中为了进一步阐明TIA-1在鸡细胞中SG形成中的作用，在ARS、NDV感染等应激28 山东农业大学硕士学位论文源处理的情况下，使用抗TIA-1抗体对内源性TIA-1染色。间接免疫荧光结果显示，在没有应激源处理的DF-1细胞中没有观察到SG（图8A，第1行）。另一方面，在ARS氧化刺激下和病毒感染的DF-1细胞中检测到典型SG（图8A，第2-4行）。实验结果表明：TIA-1在SG的形成中起到重要的作用，并且在SG的形成过程中TIA-1被招募到SG中。图8应激处理下内源性cTIA-1聚集至鸡细胞质SG中Fig.8EndogenouscTIA-1wasaccumulatedinSGsinchickencellsunderstress3.8鸡的组织中SG的形成通过qRT-PCR分析健康鸡组织中cTIA-1mRNA的表达水平。在所检查的所有组织中，cTIA-1表达在肠，肾和心脏中观察到最高水平（图9）。接下来，我们评估了在热休克应激下体内SG的形成。图8显示，在阴性对照组的鸡组织中，心肌细胞排列良好，不含SG点。但是，在热休克处理的鸡中，心肌细胞被广泛破坏，并且核周间隙扩大。如预期的那样，在心肌细胞中检测到不同的SG点（图9，第2行）。这些结果表明在外界环境刺激下内源性cTIA-1在体外和体内都能使SG聚集。29 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用图9鸡心肌组织中SG的形成Fig.9FormationofSGinchickenhearttissue3.9NDV诱导G3BP1在细胞中聚集形成SG为了探究病毒复制与病毒诱导SG产生的相互关系，收集病毒感染后不同时间点的细胞样品，在新城疫病毒Herts/33株感染后6h时，病毒的P蛋白己经在细胞内聚集，但此时SG并未形成。感染后12h的细胞内形成了少量G3BP1的点状聚集，证明此时己开始形成SG，感染后的12h-24h，细胞内G3BP1的聚集愈来愈多，但G3BP1并不与P共定位，且SG仅在病毒感染的细胞中检测到（图10A）。Western-Blot结果显示，NDV感染后G3BP1蛋白量并没有明显变化（图10B）。灰度值扫描结果显示NDV随着时间的变化复制增多，但G3BP1蛋白量并没有显著改变（图10C，D）。图10NDV感染诱导G3BP1聚集形成SGsA）NDV感染G3BP1和P蛋白免疫荧光检测；B）NDV感染后G3BP1和P蛋白westernblot检测；C）G3BP1westernblot灰度扫描结果；D）P蛋白westernblot灰度扫描结果Fig.10NDVinfectioninducedG3BP1accumulatingasSGsA）TheimmunofluorescenceassayofG3BP1andPproteinafterNDVinfection.B）WesternblotassayofG3BP1andPproteinafterNDVinfection.C）TheintensitybandratioofG3BP1toβ-actin.D）TheintensitybandratioofPtoβ-actin.30 山东农业大学硕士学位论文3.10外源表达G3BP1促进SGs的形成以上结果证实NDV诱导内源性的G3BP1聚集，为了研究外源表达G3BP1对SGs有何影响，将鸡源G3BP1扩增并插入GFP-N1载体中，构建成功的GFP-G3BP1外源转染至Hela细胞，结果显示，外源表达G3BP1后，在ARS（氧化应激）、热休克和NDV感染条件下均能促进SGs的形成。在DF-1和CEF细胞中外源表达G3BP1，在ARS、热休克、NDV感染条件下，同样促进SGs的形成。值得注意的是：在没有刺激的条件下，在HeLa、DF-1和CEF细胞中外源表达G3BP1也有SGs的形成（图11）。这些结果显示G3BP1在SGs的形成中起到重要的作用。图11外源表达GFP-G3BP1在应激处理下的定位情况Fig.11ThelocalizationofexogenousGFP-G3BP1inthepresenceofvariousstress3.11G3BP1的RNA结合结构域介导SGs的招募G3BP1蛋白全长可分为4个结构域，从NH2-到COOH端分别被称作A、B、C和D结构域（图12A）。为了研究病毒感染后G3BP1如何招募至SG中，将带有GFP标签的鸡G3BP1A、B、C、D四个结构域的质粒分别转染HeLa细胞，观察其与内源性SG标志TIA-1的共定位。Western-blot结果显示G3BP1分段质粒表达成功（图12B）。共定位结果显示：对照组除了G3BP1全长转染能够诱导SG之外，分别表达任一结构域均不能诱导SG形成。在ARS处理或NDV感染的细胞中，G3BP1促进SGs的形成，D区为RNA结合结构域，被招募到SGs中，A区即NTF2样结构域不能被招募到SGs中，并且抑制原有SGs的形成。B和C区的转染不能诱导SG形成，但是不影响内源性31 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用SGs的形成（图12）。图12G3BP1分段结构域对SG形成的影响A）鸡G3BP1各结构域模式图；B）G3BP1各结构域westernblot验证；C-E）G3BP1各结构域在不同刺激（C.对照组；D.ARS处理；E.NDV感染）下对SG的影响Fig.12TheimpactofG3BP1eachdomaininSGformationA）SchematicrepresentationofeachdomainofchickenG3BP1；B）WesternblotanalysisofeachdomainofchickenG3BP1；C-E）TheimpactofG3BP1eachdomaininSGformationinthepresenceofvariousstress(C.control;D.ARStreatment;E.NDVinfection)3.12G3BP1促进NDV的复制NDV感染后能够使G53BP1招募到SGs中，接下来对G3BP1在NDV复制过程中32 山东农业大学硕士学位论文的作用进行研究。在HeLa细胞中过表达G3BP1，Western-Blot结果显示：过表达G3BP1促进NDV的复制（图13A）。从灰度值可以明显看出，与对照组相比，过表达G3BP1组NDV病毒蛋白表达量显著增加（图13B），同时，细胞上清中病毒滴度滴定结果显示，与对照组细胞相比，过表达G3BP1组细胞上清中病毒滴度显著升高（图13C）。这些结果说明SG中的G3BP1能够促进NDV的复制。图13外源表达G3BP1对NDV复制的影响A）过表达G3BP1后P蛋白westernblot检测；B）P蛋白westernblot灰度扫描结果；C）上清中病毒滴度检测Fig.13TheimpactofexogenousG3BP1inNDVinfectionA）WesternblotassayofPproteinafterG3BP1overexpression.B）TheintensitybandratioofPtoβ-actin.C）TitrationofNDVinthesupernatants33 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用4讨论4.1外源表达TIA-1能够诱导SG的产生作为对环境应激的进化保守反应，SG已经在各种物种中检测到（BuchanJRetal.,2008;GilksNetal.,2004;NoverLetal.,1983）包括在哺乳动物，植物和酵母中。在人类细胞中，TIA-1/R负责招募细胞质中SGs处的未翻译mRNA。因此，TIA-1/R在应激环境下对SG形成起着重要的作用（KedershaNLetal.,1999）。在鸡细胞中，TIA-1/R已被证明是维持细胞活性所必需的（LeGuinerCetal.,2003）。然而，TIA-1/R在鸡细胞和组织中对SG形成过程中的作用仍然不清楚。本实验研究的结果表明，在各种应激条件下，GFP标记的cTIA-1（GFP-cTIA-1）外源表达导致在HeLa和DF-1细胞的细胞质中形成荧光点。值得注意的是，cTIA-1的单独表达诱导细胞群中细胞质TIA-1点的形成。之前的报道已经显示，在缺乏应激的情况下，人TIA-1（hTIA-1）的过表达会导致70％的转染细胞中形成SGs（GilksNetal.,2004）。虽然cTIA-1和hTIA-1的转染诱导不同量的SG，cTIA-1的外源性表达导致能够螯合内源性TIA-1和其它SG标记物形成SG。4.2外源表达TIA-1能够诱导SG的产生并与内源性的SG的标记物共定位虽然细胞质的颗粒的一些组分依赖于不同的应激源而变化，但SG的核心组分保持不变（AndersonPetal.,2006;PiotrowskaJetal.,2010）。典型的SG包含小核糖体亚基，eIF和RNA结合蛋白。此外，经典的SG在CHX的处理下溶解，这是稳定多核糖体上的mRNA的药物（KedershaNetal.,2000）。因此，进行2个实验以证明通过转染ctGFP-cTIA-1诱导的细胞质中的颗粒是否是实际的SG。如预期的，在转染cTIA-1诱导的SG中能够检测到多种SG标记物，例如G3BP1，PABP和eIF3。此外，ctGFP-TIA-1在CHX的处理下溶解，表明ctGFP-cTIA-1的过表达诱导经典SG的装配，而不是仅形成cTIA-1聚集体。4.3ctGFP-cPRD诱导有别于SG的大颗粒，且在CHX处理下不降解，GFP标签影响PRD的定位在大多数体细胞中，TIA-1/R在细胞核和细胞质中积累（KedershaNLetal.,1999）。事实上，这两种RNA结合蛋白穿梭在这两个亚细胞区域之间。在这个过程中，RRM2和RRM3分别在核积累和核出口中起作用（ZhangTetal.,2005）。在RRM水平上观察34 山东农业大学硕士学位论文到鸡，鸭，人和小鼠TIA-1的最高程度的同一性（>94％）。因此，鸡RRM的功能可能类似于人类RRM的功能。如所预期的，缺少RRM的GFP-或Flag-标记的cPRD主要定位在细胞质中，特别是在应激条件下。相应地，转染GFP-或Flag-标记的RRM导致弥漫性的分布在细胞质和核中。此外，与人类TIA-1RRM类似，cRRM不影响氧化应激条件下现有的SG。SG装配是通过人类细胞中TIA-1的PRD介导（GilksNetal.,2004）。在本研究中，我们首先合成C端GFP标记鸡TIA-1PRD（GFP-TIA-1PRD）并转染到HeLa细胞中。甚至在没有应激的情况下，在ctGFP-cPRD转染的细胞中同时检测到明显大和规则大小的细胞质点。小点被鉴定为典型的SG，因为这些颗粒能够与内源性G3BP1共定位并在CHX的处理下溶解。另一方面，明显大的点不能与内源性G3BP1共定位，并且在CHX处理下仍保持稳定，表明这些颗粒不是SG。以前的报道中没有观察到这种大颗粒在HA标记的人类TIA-1的PRD结构域（hPRD）转染的细胞中（GilksNetal.,2004）。因此，构建Flag标记的和N末端GFP标记的cPRD并转染细胞。结果显示在ntGFP-cPRD和Flag-cPRD转染的细胞中没有大点，表明C端GFP标签确实影响cPRD定位。GFP标记蛋白是迄今为止应用最广泛的的经典荧光标记蛋白（GerdesHHetal.,1996;CubittABetal.,1995）。在本研究中，GFP标记不影响TIA-1或RRM的定位，如在GFP-和Flag-标记的TIA-1/RRM之间定位模式相同。但GFP-PRD与Flag-PRD定位模式则有明显区别，GFP标签（238aa）大于cPRD（95aa），但小于cTIA-1（373aa）和cRRM（275aa），这可以在某种程度上解释观察到的差异。更有可能的是，PRD结构域的性质是造成大点的形成的原因。具有PRD的蛋白质具有形成聚集体的能力。例如，在酵母中，也具有PRD的SUP35可以采用2种不同的构象。SUP35设定在（psi-）菌株中的可溶性结构，而它在（psi+）菌株中设定聚集倾向性构象（SerioTRetal.,2001）。因此，在本研究中，C末端GFP标签可以通过cPRD聚集以形成大荧光点。该过程独立于RNA转位和蛋白质翻译，因为点在CHX的存在下不溶解。总之，本研究的结果表明鸡TIA-1在鸡细胞中对SG形成起到重要的作用。cPRD在SG聚合中起作用。为了证明PRD的功能，应该避免使用C末端GFP标签，因为它影响PRD定位。4.4NDV诱导G3BP1在细胞中聚集形成SG病毒在感染哺乳动物细胞后，由于细胞的内平衡紊乱，压力积累而产生SG。以控35 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用制细胞自身的翻译水平，从而抑制病毒在细胞内的快速复制。NDV属于单股负链RNA病毒，在其基因组复制过程中会以负链RNA为模板，合成正向反义基因组RNA，然后正向反义基因组RNA作为模板合成负链RNA基因组，在此过程中形成dsRNA中间体能够激PKR-eIF2α通路，而这正是病毒诱导SG形成的最主要通路（ZhangSetal.,2014）。本实验证实了NDV可持续性诱导HeLa细胞产生SG。NDV感染Hela细胞实验中发现只有NDV感染的细胞中能够检测到SG的存在。除此之外还有一些细胞中能够检测到病毒P蛋白的表达，但是没有SG，说明病毒P蛋白不是NDV感染诱导SG的必要成分。NDV的P蛋白不与SGs共定位，其与SG有何关系还有待进一步研究。4.5G3BP1的RNA结合结构域介导SGs的招募G3BP1分为A、B、C、D四个结构域，从实验结果可以看出，D区即RNA结合结构域，能够被招募到SGs中，说明RNA结合结构域对于G3BP1介导的SG形成至关重要。有趣的是，人G3BP1的NTF2样结构域是SGs的形成所必需（TourriereHetal.,2003），但鸡的A区即NTF2样结构域在鸡SG形成过程中发挥负调控作用，这可能为了防止细胞产生过量SG的一种保护性机制，具体原因还有待进一步研究。4.6G3BP1促进NDV的复制病毒感染细胞后其自身的翻译、表达完全依赖于宿主细胞的翻译系统。宿主细胞的先天性免疫系统则可通过各种拮抗机制来抑制病毒的复制，其中SG是非常重要的一种抗病毒机制。对于多数病毒而言，SG的产生能够有效抑制病毒的复制。然而本研究证实：对于NDV而言，SG不仅没有能够有效抑制病毒的复制，过表达SG的标志性蛋白G3BP1，促进了SG形成后，NDV的复制水平反而升高。也就是说，SG从某种程度上很可能辅助了病毒的复制。与此类似，同属副黏病毒科的呼吸道合胞体病毒（RSV）感染细胞之后也能稳定诱导SG产生，G3BP1敲低之后RSV复制水平下降（LindquistMEetal.,2010）。除此之外，SG标志物TIA-1，TIAR或G3BP1的敲减抑制丙肝病毒的复制，病毒粒子的组装和释放（GaraigortaUetal.,2012）。这些报道和本研究的共同点是NDV、RSV和HCV均能够诱导稳定存在的SG，即SG的出现伴随着整个病毒感染过程，这种状态下SG能够促进病毒复制。除了这几种病毒之外，是否其他病毒也有类似的SG促进病毒增殖的现象，是否和病毒稳定诱导SG正相关还有待证实。本研究证实了鸡G3BP1在SG形成和病毒复制过程中发挥重要作用，这为鸡应激反应的形成和其在病毒复制中的作用机制研究奠定了基础。36 山东农业大学硕士学位论文5结论1、鸡内源性TIA-1在应激状态下聚集形成SG。2、cTIA-1介导鸡细胞中的SG的形成，PRD结构域在其中发挥重要作用。3、NDV感染细胞诱导G3BP1在细胞中聚集形成SG。G3BP1促进NDV的复制，这为鸡应激反应的形成和其在病毒复制中的作用机制研究奠定了基础。37 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用参参参考文献Abrahamyan,L.G.,L.Chatel-Chaix,L.Ajamian,M.P.Milev,A.Monette,J.F.Clement,R.Song,M.Lehmann,L.DesGroseillers,M.Laughrea,G.BoccaccioandA.J.Mouland."NovelStaufen1ribonucleoproteinspreventformationofstressgranulesbutfavourencapsidationofHIV-1genomicRNA."JCellSci,2010,123(Pt3):369-383.Anderson,P.andN.Kedersha."Visiblystressed:theroleofeIF2,TIA-1,andstressgranulesinproteintranslation."CellStressChaperones,2002,7(2):213-221.Anderson,P.andN.Kedersha."RNAgranules."JCellBiol,2006,172(6):803-808.Apostolov,K.andM.I.Sawa."EnhancementofhaemolysisbyNewcastlediseasevirus(NDV)afterpre-treatmentwithheterophileantibodyandcomplement."JGenVirol,1976,33(3):459-469.Arimoto,K.,H.Fukuda,S.Imajoh-Ohmi,H.SaitoandM.Takekawa."Formationofstressgranulesinhibitsapoptosisbysuppressingstress-responsiveMAPKpathways."NatCellBiol,2008,10(11):1324-1332.Ariumi,Y.,M.Kuroki,Y.Kushima,K.Osugi,M.Hijikata,M.Maki,M.IkedaandN.Kato."HepatitisCvirushijacksP-bodyandstressgranulecomponentsaroundlipiddroplets."JVirol,2011,85(14):6882-6892.Borghese,F.andT.Michiels."Theleaderproteinofcardiovirusesinhibitsstressgranuleassembly."JVirol,2011,85(18):9614-9622.Buchan,J.R."mRNPgranules.Assembly,function,andconnectionswithdisease."RNABiol,2014,11(8):1019-1030.Buchan,J.R.,D.MuhlradandR.Parker."PbodiespromotestressgranuleassemblyinSaccharomycescerevisiae."JCellBiol,2008183(3):441-455.Buchan,J.R.andR.Parker."Eukaryoticstressgranules:theinsandoutsoftranslation."MolCell,2009,36(6):932-941.Bullock,T.L.,W.D.Clarkson,H.M.KentandM.Stewart."The1.6angstromsresolutioncrystalstructureofnucleartransportfactor2(NTF2)."JMolBiol,1996,260(3):422-431.Burgui,I.,T.Aragon,J.OrtinandA.Nieto."PABP1andeIF4GIassociatewithinfluenza38 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山东农业大学硕士学位论文致谢三年前，我怀着无尽的遐想，来到山东农业大学，来到动物科技学院临床兽医系，三年来，我无时无刻不在感受着老师们的关爱和师兄师姐及同学们的无私帮助。三年光阴，如同白驹过隙，转眼间研究生生活即将结束，但是，一想起曾在这里的点点滴滴，我都会像今天这样感动，这种感动，将会伴随我的一生。在硕士毕业论文完成之际，我要向所有支持、关心、帮助过我的人们表示最诚挚的谢意!在三年的学习过程中，感谢校内导师马卫明副教授，校外导师丁铲研究员及孙英杰副研究员以渊博的学识，严谨的科研思路和丰富的经验在学业和生活上都给予了我极大的帮助。本实验是在中国农科院上海兽医研究所水禽创新团队实验室完成的，本论文的工作是在孙英杰老师的悉心指导下完成的，孙老师以他敏锐的洞察力、渊博的知识、严谨的实验思路、精益求精的工作作风和对科学的献身精神使我受益匪浅，为我以后的工作和学习都有极大的帮助。感谢上海兽医研究所水禽创新团队的丁铲研究员，孙英杰副研究员，袁艳梅科研助理，张蓉科研助理，刘清艳科研助理，王雷科研助理，刘婷科研助理王新博士，程靖华博士，曲昱荣博士，顾峰博士，张石磊博士，王蕊博士，李燕荣博士，任善会博士，你们开创性的研究拓展了我的学术视野，无数次的争论和探讨使我的研究工作有了长足的进展。感谢董璐娜师姐，杨洋师兄，盛香香师姐；感谢同届郑航，张建康，曲永星，汪伟，王睿，段坦然，王华夏，张耀丹同学；感谢毛旭明师弟，谢军师弟，王欢师弟，从你们身上我学到很多知识，感谢项目组成员在项目开发中的互助合作，正是集体的努力才使得实验进展顺利。感谢所有老师，师兄师姐及同学。没有你们的无私的帮助，我不可能顺利的完成所有的实验，在此，向你们表示衷心的感谢！感谢山东农业大学的于小婷师姐，张梦晓师姐，国爱雯师姐，刘雪梅师姐，郭佳佳师姐，郭双双师姐；同届张鹏同学，刘婷同学，王胜华同学，宋祥斌同学，刘飞同学，姜晓彤同学，李文慧同学；周长明师弟，赵晓丹师妹，刘营师弟，杨海明师弟。特别感谢周长明师弟，帮助我做好校内的一些事宜，为我在校外学习和实验奠定了良好的基础。感谢与我互勉互励，互相帮助的室友徐蒙蒙，韩亚茹，姜丹丹，赵丹，刘婷，在你们的默默支持和关怀下，使我不断克服困难，积极进取，完成了我的学业。感谢山东农业大47 鸡TIA-1和G3BP1在应激颗粒形成和抗病毒反应过程中的作用学临床兽医系实验室所有同学营造出乐观向上，积极进取，互勉互励的学习氛围，我很荣幸在这样的环境里度过了研究生三年的美好时光。衷心的感谢我的父母和其他亲朋好友对我的关心、支持和理解，没有你们对我的关心、鼓励和支持，我无法完成现在的硕士学业。毕业了，在以后的生活和工作中，我会更加努力，积极向上，不断进取，取得更多的成果回馈社会。在此，我对上述的老师，同学，朋友再次表示真诚的感谢！张频2017年6月于山东泰安48 山东农业大学硕士学位论文攻读学位期间发表论文情况1、张频，孙英杰，郑航，毛旭明，仇旭升，谭磊，孟春春，宋翠萍，廖瑛，丁铲，马卫明；鸡G3BP1在新城疫病毒感染诱导应激颗粒形成过程中的作用；畜牧兽医学报；2017.48(3):515-5212、YingjieSun,LunaDong,ShengqingYu,XiaoxuWang,HangZheng,PinZhang,ChunchunMeng,YuanZhan,LeiTan,CuipingSong,XushengQiu,GuijunWang,YingLiao,andChanDing.Newcastlediseasevirusinducesstableformationofbonafidestressgranulestofacilitateviralreplicationthroughmanipulatinghostproteintranslation.TheFASEBJournalarticlefj.201600980R.PublishedonlineDecember23,2016.49