健康与发病山核桃树体pH值、养分与微生物多样性差异

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分类号Ｓ７６３密级公开ＵＤＣ６３２硕士学位论文健康与发病山核桃树体Ｈ值、养分与微生物多样性差异ｐ作者姓名：林马水—指导教师：林海萍教授、学科专业名称：森林保护学研究方向：森林微生物所在学院：林业与生物技术学院论文提交日期：２０１８年６月浙江农林大学２０１８年６月７日 ZhejiangAgriculture&ForestryUniversityMasterDegreeThesisDifferencesofpHValues,Nutrients,andMicrobialDiversitiesbetweenHealthyandDiseasedCaryacathayensisCandidate:LinMa-shuiSupervisor:LinHai-ping,ProfessorSpecialty:ForestMicrobiologyDateofSubmission:June7,2018ZhejiangA&FUniversityLin’an,Zhejiangprovince,P.R.ChinaJune,2018 独创性声明本人声明，所呈交的学位论文，受浙江省科技厅公益技术研究农业项目（2015C32078）、杭州市社会发展科研主动设计项目（20172015A01）项目资助，是在指导教师指导下，通过我的努力取得的成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已经作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果，也不包含在浙江农林大学或其他教育机构获得学位或证书而使用过的材料。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如被查有严重侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位论文作者亲笔签名：日期：2018.6.11论文使用授权的说明本人完全了解浙江农林大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书。□不保密,本学位论文属于不保密。（请在方框内打“√”）学位论文作者亲笔签名：日期：2018.6.11指导教师亲笔签名：日期：2018.6.11 摘要摘要为探究山核桃树体微生物多样性及功能对山核桃干腐病的影响，本文采用高通量测序，比较了健康山核桃树、发病山核桃树发病与未发病部位树皮、木质部的pH值、养分和细菌、真菌多样性差异，并分析了相关性。主要研究结果如下：1、健康山核桃树皮与木质部pH值分别为7.03与7.63，显著高于发病山核桃树，发病、未发病部位树皮与木质部pH值分别为5.95、5.43与5.95、5.69（P<0.05）。2、健康山核桃树皮单宁、可溶性糖含量分别为0.317%、3.348%，木质部这两种养分含量分别为0.079%、0.626%，均显著高于发病山核桃树（P<0.05）。健康山核桃树皮、木质部还原糖含量分别为0.865%、0.420%，均显著低于发病山核桃树（P<0.05）。3、健康山核桃树皮细菌与真菌OTU数目显著高于发病山核桃树、木质部细菌OTU数目显著低于发病山核桃树，木质部真菌OTU数目显著高于发病山核桃树。健康山核桃树、发病山核桃树发病、未发病部位主要细菌菌属，树皮分别有7、8、8个，木质部分别有8、4、8个，主要真菌菌属树皮分别有7、12、5个，木质部分别有8、3、6个，且健康与发病山核桃树皮和木质部主要菌属在种类和多度上均存在显著差异（P<0.05）。健康山核桃树皮优势细菌属为蛭弧菌属、酸胞菌属、鞘氨醇单胞菌属，多度分别为0.13%、0.01%、15.32%，优势真菌属为附球菌属，多度为0.111%，木质部优势细菌属为Massilia、鞘氨醇单胞菌属，多度分别为1.2%、4.41%，优势真菌属为喙枝孢属，多度为4.47%，均显著高于发病山核桃树（P<0.05）。发病山核桃树发病与未发病部位树皮中，优势细菌属均为粘细菌属与甲基杆菌属，发病部位该2个菌属的多度分别为7.56%、6.46%，优势真菌属均为德福霉属与Spizellomyces，发病部位该2个菌属的多度分别为10.44%、0.014%，显著高于未发病部位，且发病山核桃树两种部位树皮该4个菌属的多度均显著高于健康山核桃树（P<0.05）。发病山核桃树发病与未发病部位木质部中，甲基杆菌属、Luedemannella、粘细菌属均为优势细菌属，多度分别为2.36%、0.35%、2.35%与1.76%、1.81%、0.55%，茎点霉属、念珠菌属均为优势真菌属，多度分别为1.31%、1.85%与0.51%、0.84%，且发病山核桃树两种部位木质部该5个菌属的多度均显著高于健康山核桃树（P<0.05）。4、健康山核桃树皮与木质部的Ace、Chao、Shannon和Simpson细菌多样性指数差异显著，分别为599、603、6.59、0.98与440、454、6.35、0.95，真菌这4种多样性指数差异显著，分别为321、318、4.42、0.92与311、263、5.93、0.96（P<0.05）。5、RDA分析表明，pH值、可溶性糖、还原糖均对山核桃树皮与木质部的细菌与真菌优势属有显著影响（P<0.05）。研究结果可为山核桃林可持续健康经营提供借鉴。I 摘要关键词：山核桃树体；山核桃干腐病；pH值；养分；微生物多样性II ABSTRACTABSTRACTInordertoinvestigatetheeffectofmicrobialdiversityandfunctionofCaryacathayensisoncankerdisease,thisarticleadoptedhigh-throughputsequencing,comparedthedifferencesofpHvalues,nutrients,bacteriaandfungidiversityinsickpartsandhealthypartsofbarkandxylemofhealthyanddiseasedhickorytrees,andtheircorrelationswereanalyzed.Themainfindingsareasfollows:1.ThepHvaluesofbarkandxylemofhealthyhickorytreeswere7.03and7.63,respectively,whichweresignificantlyhigherthanthoseofacidicdiseasedhickorytrees(P<0.05).2.Thecontentsoftanninandsolublesugarinhealthybarkwere0.317%and3.348%respectively,andtwokindsofnutrientcontentsinxylemwere0.079%and0.626%,respectively,whichweresignificantlyhigherthanthosediseasedhickorytrees(P<0.05).Thecontentsofreducingsugarinthebarkandxylemofhealthyhickorytreeswere0.865%and0.420%,respectively,whichweresignificantlylowerthanthosediseasedhickorytrees(P<0.05).3.TheamountofbacterialandfungalOTUinbarkofhealthyhickorytreeswassignificantlyhigherthanthatininfectedhickorytrees,theamountofbacterialOTUinxylemwassignificantlylowerthanthatindiseasedhickorytreesandtheamountoffungalOTUissignificantlyhigherthanthatindiseasedones.Themainbacterialgeneraofthehealthyhickorytrees,thediseasedpartofhickorytreesandthenon-diseasedpartofthehickorytrees,theamountofbarkarerespectively7,8,8,xylem,respectively8,4,8,thebarkofthemajorfungiare7,12,5,xylem,respectively8,3,6.Thereweresignificantdifferencesinspeciesandabundancebetweenhealthyanddiseasedhickorybarkandxylem(P<0.05).ThedominantbacterialgeneraofhealthyhickorybarkwereBdellovibrio,Acidocella,Sphingomonas,withabundanceof0.13%,0.01%and15.32%respectively,forthedominantfungusEpicoccum,0.111%,thedominantbacterialgeneraofxylemareMassilia,Sphingomonas,withabundancerespectively1.2%,4.41%,forthedominantfungusRhinocladiella,4.47%,allofthereindicatorsweresignificantlyhigherthandiseasedhickorytrees(P<0.05).Thehickorydiseasedandnon-diseasedbark,thedominantbacterialgenerawereByssovoraxandMethylobacterium,abundanceofthe2bacterialgenerawas7.56%and6.46%respectively.ThedominantfungigenerawereDevriesiaandSpizellomyces,abundanceof2bacterialgenerawas10.44%and0.014%respectively,significantlyhigherthanthatofnon-diseasedparts,andabundanceofhickorytreesintwoIII ABSTRACTpartsofthebarkof4bacterialgeneraweresignificantlyhigherthanthatofhealthyhickorytrees(P<0.05).Thehickorydiseasedandnon-diseasedxylem,thedominantbacterialgenerawereMethylobacterium,LuedemannellaandByssovorax,abundanceofthe4bacterialgenerawas2.36%,0.35%,2.35%and1.76%,1.81%,0.55%respectively,PhomaandCandidawasthedominantgenusoffungi,abundancewas1.31%,1.85%and0.51%,0.84%respectively,andthediseasedhickorytreesintwopartsofthexylemof5bacterialabundanceweresignificantlyhigherthanthatofhealthyhickorytrees(P<0.05).4.ThebacterialdiversityindexofAce,Chao,ShannonandSimpsoninbarkandxylemofhealthyhickorytreesare599,603,6.59,0.98,and440,454,6.35,0.95respectively.Thediversityindexofthesefourfungiwere321,318,4.42,0.92and311,263,5.93,0.96(P<0.05).5.RDAanalysisshowedthatpHvalues,solublesugarandreducingsugarhadsignificanteffectsonthedominantgeneraofbacteriaandfungiinbarkandxylemofhickorytrees(P<0.05)Theresultscanbeusedforreferenceforsustainableandhealthymanagementofhickoryforest.Keyword:Hickorytree;Caryacathayensiscankerdisease;pH;Nutrients;MicrobialdiversityIV 目录目录摘要........................................................................................................................................IABSTRACT............................................................................................................................III第一章文献综述..................................................................................................................11.1植物体微生物多样性.............................................................................................11.1.1植物内生菌..................................................................................................11.1.1.1植物内生菌定义...............................................................................11.1.1.2植物内生菌的作用...........................................................................11.1.1.3植物内生菌与病害的相关性...........................................................11.1.2植物体微生物多样性影响因素..................................................................21.1.3微生物多样性研究方法..............................................................................31.1.3.1平板培养法.......................................................................................31.1.3.2Biolog微平板分析法......................................................................31.1.3.3磷酸脂肪酸（PLAFA）法.................................................................41.1.3.4现代分子生物学方法.......................................................................41.2山核桃干腐病.........................................................................................................51.2.1山核桃干腐病发展现状..............................................................................51.2.2山核桃干腐病防治研究进展.......................................................................61.3植物体pH值、养分、微生物多样性与病害的相关性.......................................71.3.1植物体pH值与病害的相关性....................................................................71.3.2植物体养分与病害的相关性......................................................................71.3.2.1植物体含水量与病害的相关性.......................................................71.3.2.2植物体单宁与病害的相关性...........................................................71.3.2.3糖类与病害的相关性.......................................................................81.3.3植物体微生物多样性与病害的相关性......................................................81.4本论文研究目的与意义.........................................................................................9第二章材料与方法............................................................................................................102.1实验材料...............................................................................................................102.1.1样地选择....................................................................................................102.1.2样品采集....................................................................................................102.1.3实验仪器....................................................................................................102.1.4实验试剂....................................................................................................112.2实验方法...............................................................................................................112.2.1pH值与养分测定.......................................................................................112.2.2生物多样性测定........................................................................................122.2.2.1基因组DNA提取.............................................................................122.2.2.2基因组DNA测序.............................................................................122.2.2.3样品微生物多样性分析.................................................................122.2.3数据处理与分析........................................................................................12第三章结果与分析............................................................................................................133.1病健山核桃树样品pH值与养分含量差异.........................................................133.2病健山核桃树样品细菌多样性差异...................................................................14V 目录3.2.1α-多样性差异..........................................................................................143.2.1.1细菌OTU数目差异.........................................................................143.2.1.2细菌群落结构差异.........................................................................143.2.1.3细菌群落α-多样性指数差异.......................................................163.2.2β-多样性差异..........................................................................................173.2.2.1主要细菌群落差异.........................................................................173.2.2.2优势细菌属与pH值和养分的相关性...........................................183.3病健山核桃树样品真菌多样性差异...................................................................213.3.1α-多样性差异..........................................................................................213.3.1.1真菌OTU数目差异.........................................................................213.3.1.2真菌群落结构差异.........................................................................213.3.1.3真菌群落α-多样性指数差异.......................................................233.3.2β-多样性差异..........................................................................................243.3.2.1主要真菌群落差异.........................................................................243.3.2.2优势真菌属与pH值和养分的相关性...........................................25第四章结论与讨论............................................................................................................29第五章创新与展望............................................................................................................315.1创新点...................................................................................................................315.2研究展望...............................................................................................................31参考文献..............................................................................................................................32个人简介..............................................................................................................................38致谢......................................................................................................................................39VI 第一章文献综述第一章文献综述1.1植物体微生物多样性1.1.1植物内生菌1.1.1.1植物内生菌定义1886年，DeBarry首次提出内生菌“endophyte”[1]。20世纪30年代，感染内生真菌的牧草被牲畜消耗，畜牧业遭受严重损失，内生菌的研究这才开始[2]。1986年，Carrol把内生菌解释为在植物根部以上、活着的组织中生活，不会使植物产生症状的微生物[3]。1991年，Petrini给的定义是一种生活在活的植物组织中一段时间，且不会在植物体引起疾病的微生物[4]。1992年，Kleopper等报道植物内生菌是可以在细胞内或细胞中定殖的微生物，并且可以与寄主植物建立和谐共生的关系[5]。1997年，Hallmann补充植物内生细菌的概念，植物内生细菌从表面消毒的植物组织中，或者从植物汁液中分离出来，并且不会对植物的外观造成伤害，不改变植物任何表型特征和功能的细菌[6]。现在已经普遍被接受的内生菌（Endophyte）定义是：指那些在其生活史的一定阶段或者全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或者细菌。1.1.1.2植物内生菌的作用目前的生物固氮模式已被发现是根瘤菌和豆科植物共生系统，此最为经典。伴随着人们逐渐深入研究内生菌，一些学者还发现的生物固氮模式与非豆科类植物的关系。Dobereiner等将固氮螺菌(Azospirillum)分离自甘蔗植株，目前已经发现的固氮内生菌源自棕榈树、高粱、水稻、小麦、甘蔗等非豆科类植物。新型有固氮作用，嗜氮营养的醋杆菌从甘蔗中发掘，其生长状况与环境酸性、糖分含量正相关关系，并在固氮上处于较高活性[7]。张集慧等人在20年前，分离自兰科植物一种内生真菌，分析发酵产物并获得五种植物激素为：赤霉素、玉米核苷、玉米素、脱落酸、吲哚乙酸，该五种植物激素对植物生长均起着促进作用[8]。史应武等在2009年，分离既一株能提高叶绿素含量、含糖率、鲜重的甜菜内生菌[9]。内生菌能够代谢产生一些抗菌物质，几丁质酶、葡聚糖酶、藤黄绿脓菌素、脂肽、吡咯菌素等。这类物质广泛应用于开发天然农药、植物抗菌剂等方面的生物防治。Chen等在1995年，将棉花的内生细菌接在棉花植株上，这种做法有效减轻棉花枯萎病[10]。在2003年，龙良鲲等分离了番茄的内生细菌239株，对番茄青枯病菌起抗性作用有18株[11]。1.1.1.3植物内生菌与病害的相关性植物内生菌通常存活在高等植物体内，内生细菌存在于木本植物，草药，双子叶1 健康与发病山核桃树体pH值、养分与微生物多样性差异植物和单子叶植物中。目前，世界上有80个属中约有290种禾本科植物，已发现在各种经济作物或农作物内生细菌120多种。植物内生菌群的变化和植物病害关系密切。Ravindra等在体外实验研究发现，8种桉树内生菌对Trichophytonrubrum、Curvularialunata、Bipolarissp.、Microsporumgypseum、Fusariumudum、Fusariumoxysporum、Cladosporiumcladosporioides、Alternariaalternata致病菌起拮抗的作用[12]。Arnold等研究发现，可可内生菌对M.Perniciosa、P.palmivora、M.roreri致病菌起拮抗的作用，对该三种菌均达到拮抗作用分别为27%(4/15)、65%(28/43)、40%(21/52)[13]。张丽娜研究表明，山茶叶部的真菌群落越丰富越均匀，山茶花灰斑病情指数越低[14]。许多国内外学者发现，内生菌与植物病害密切相关[13,15-17]。1.1.2植物体微生物多样性影响因素环境因素（土壤性质，地理位置等），生理条件（树龄，营养状况等），寄主物种和农业管理都可能对植物生物多样性产生影响[18]。植物内生细菌在同一植物不同部位的分布可能受到特定生长环境中各种因素的影响[19]。时涛研究发现，中国橡胶树不同组织中内生细菌的种类与数量是不同的，这可能是由于橡胶树不同组织提供的水分与营养物质的差异，这种趋势基本上与水和营养物质的运输方向相同[20]。内生细菌的结构组成和多样性与宿主植物密切相关，研究表明在相同条件下的间作环境，甜玉米与棉花内生细菌种群结构是有差异的，如，微杆菌属(Microbacterium)、枸橼酸杆菌属(Citrobacter)等分离于甜玉米根部，而丛毛单胞菌(Comamonas)、纤维菌属(Cellulomonas)和产碱杆菌属(Alcaligenes)等分离于棉花根部[21]。Misko等[22]报道，分离自不同栽培条件下的油菜品种根部的内生细菌利用碳源能力也不同，其原因是不同基因型的植物根组织内部的营养成分差异，可能致使定殖内生细菌的组成结构与其多样性。Germida等[23]报道，现代小麦的内生细菌丰富性远高过传统小麦，这原因分析主要是在多种生物、土壤、气候环境条件下长期栽培选择导致不同基因型作物的内生细菌组成有差别。KuklinskySobral等[24]报道，大豆的内生细菌种类与季节、植物年龄等相关。Tian等[25]就不同地区水稻内生真菌的多样性研究表明，内生真菌群落差异受土壤化学成分差异的影响。叶与植株株龄增加，叶内生真菌的感染率也升高，这表明内生真菌不断迁移到组织中，或是内生真菌在一系列组织中传播和繁殖，可分离自不同的叶片[26]。许多调查发现，地理位置影响高羊茅和黑麦草内生真菌的分布，如，美国高羊茅与大洋州黑麦草内生真菌的感染率高，其在欧洲则感染率低[27]。普遍认为，温带森林的树木种类和分离获得的真菌比热带少[28]。分离自健康植物组织的内生真菌，将其接种到别的植物体中，或者随着寄主生理与环境状况改变，表现出可能有不同的存活方法。枝孢属（Cladosporium）、镰刀菌属（Fusarium）和链格孢属（Alternaria）都是一般的腐生真菌，在健康的瓜类中大量而普遍的存在[29,30]。2 第一章文献综述农业管理主要包括施肥，农药喷洒和耕作方式，是影响植物根内生细菌数量、多样性和组成的重要因素之一。细菌在植物中定殖与施肥有关，高氮肥区域的甘蔗根中细菌数量少于低氮肥的区域[31]。这表明了在植物生长区施用氮肥可改变植物的生理功能，进而影响植物根组织内部生长的细菌群落结构[32]。氮肥对水稻根系固氮菌的数量和活性有显著影响，施氮15天后，水稻根系固氮菌数量明显减少[33]。Seghers等[34]发现，不同的施肥处理和长期施肥都会影响小麦根内生细菌的群落结构，除草剂的使用对小麦根内生细菌群落结构没有显著影响，但有机肥的施用对植物根系的内生细菌群落组成和数量有显着影响，1%甲壳素肥料在棉花根际土壤中的施用增加了根际细菌群落结构的多样性和细菌数量[35]。可见，采用适当的农业管理方法可以改善植物根组织的细菌群落结构，实现农作物增产，生物防治的经营目标，实现农业经营的可持续发展。1.1.3微生物多样性研究方法1.1.3.1平板培养法平板培养法是一种微生物研究的实验方法。该种方法主要使用营养不同的固体培养基来分离和培养微生物，然后根据微生物菌落形态和菌落数量来计测微生物的数量和类型。平板培养法是分离和培养微生物的常规方法，分为稀释、接种、培养、计数等步骤，该种方法简单易用，已被广泛使用。该种方法常用于微生物的研究，研究表明，该种方法获得的微生物的多样性和病害的控制与有机物的分解存在一定的关系[36,37]。因此，微生物平板计数法在测定微生物群落中的应用越来越少。1.1.3.2Biolog微平板分析法1991年，Mill和Garland[38]开始使用Biolog微孔板研究土壤微生物群落。环境微生物群落研究运用Biolog方法。1.高灵敏度、强分辨力。测量多个SCSU可以获得微生物群落的代谢特征指纹(MetabolicFingerprint)，辨别微生物群落的细微变化。2.不需要分离和培养纯种微生物，以最大限度地保持微生物群落的原始代谢特征。3.易于测定，数据读取和记录可以通过计算机完成。一次性完成微生物对不同碳源代谢的测定，提升效率。对照孔、95不同的单一碳源孔组成BIOLOG微平板，接种纯菌液时，其中一些孔用于营养物质，孔中出现不同的颜色，这构成了微生物独有的“代谢指纹”(MetabolicFingerprint)，由相应的仪器记录，导入BIOLOG软件中，与标准菌株的数据库比对用以鉴定菌株[39]。在使用这种方法时也有一些问题。1.接种密度和培养时间非常重要，底物氧化取决于接种物的密度和组成[40]。初始接种密度要一致，因为这会直接影响微孔的颜色变化，另外，当细胞密度达到108个﹒mL-1时，用了碳源会使颜色发生变化，如果初始密度小，颜色变化时间将会延长。2.这种方法对于生长迅速且适合在实验条件下生长的群落具有很强的选择性[41]。3.被测试的底物不能精确地表示生态系统中存在的底物3 健康与发病山核桃树体pH值、养分与微生物多样性差异的类型。所以Biolog的反应特征只能粗略地表示土壤微生物种群底物利用的特征。1.1.3.3磷酸脂肪酸（PLAFA）法脂肪酸广泛存在于各种生物体内，是构成细胞膜的成分，在现代生物学当中，甲基脂肪酸已经成为了确定微生物种属的判断依据之一。因此，针对脂肪酸的这一生物学特性就逐步发展出了脂肪酸甲酯来区分微生物的分析方法，称之为FattyAcidMethylEster，FAME方法，又叫磷脂脂肪酸谱图分析法[42]。不同的生物内部的磷脂含量不同，成分不同，而且是一个相对恒定的量，与分类位置有较为密切的关系。同时，磷脂只能存在于活体的生物内部，当生物死亡后磷脂就会快速消失。该分析方法首先是提取，然后通过气相色谱（GasChromatograph，GC）分析，给出FAME图[43]。该图由美国MIDI公司开发，目前，是一种非常可靠和简单的方法。获得图谱后，通过软件的数据库进行分析和比对，快速获得分析生物的类型。通过大数据库和简单的图谱，可以快速和简洁地提供分析，这对于现代生物学研究具有重要意义。1.1.3.4现代分子生物学方法微生物组学(Microbiomes)是揭示微生物多样性与人和生态稳定性之间关系的新兴学科，其研究成果将应用于工业、农业、水产和医药等领域，为人类解决食品、环境、能源、健康等方面所面临的危机[44]。近5年以来，随着高通量测序、规模化微生物分离鉴定和微生物组学研究技术的发展[45]，微生物组学研究中的高通量测序技术可以一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，使得可对一个物种的转录组和基因组进行深人、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序。可以快捷方便的读取样品中复杂的微生物结构，且分析能力和分析精度较之前采用的PCR-DGGE分析技术、16SrDNA序列同源性分析技术等都有较大水平的提高，是分析复杂多菌种样品的首选方法[46]。高通量测序技术(Nextgenerationsequencing，NGS)、单分子实时测序技术(Singlemoleculereal-time，SMRT)结合传统平板培养技术，可帮助人们把握微生物组的全貌，获得更加真实的植物微生物群落的分类、功能等，从而深入揭示植物微生物组或群与植物病害的关系、与病原菌或微生物生防菌的相互作用，建立可信的生防体系互作模型，为生物防治提出新思路[47]。微生物组的研究思路或可被生防领域借鉴，用于在实验室条件下研究微生物生防菌、病原菌与植物间的互作机制，更准确地揭示生防菌的防病机理。一些报道称微生物生防菌施用后，植物微生物群结构出现了变化[48-51]。Massarta等人认为，如果施用微生物生防菌一段时间后，根围微生物群落可以恢复至对照水平，那么该微生物生防菌可定义为环境友好型生防菌剂[52]。微生物组学对植物病害微生物防治领域研究的思维模式带来了更为深远的影响，即从关注简单的二元、三元互作模式拓展至对植物微生物组全局的考量。当研究病原菌病理特性时，应加入对微生物组分析的步骤，不仅分析病原菌与微生物生防菌的相互作用，还要分析病原4 第一章文献综述菌与微生物组的相互影响。当界定一种微生物对植物有益或有害时，除了考察该菌株对植物本身的作用，更要考虑其如何影响了植物自身的微生物生态[53]。微生物组学研究思路或对生防研究具有借鉴意义，如Bai等人从模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)叶片和根中分离到400多种可培养细菌，并在拟南芥无菌苗中重建了根和叶的微生物组[54]。可见，微生物组学技术和思路为微生物防治提供了更深入的研究空间。1.2山核桃干腐病1.2.1山核桃干腐病发展现状山核桃干腐病（cankerdiseaseofCaryacathayensis）又名枯萎病，普遍认为这是由一种真菌，葡萄座腔菌（B.dothidea）引发的，植物表皮及木质部浅层次的病变。通常发生干腐病后，植物病变部位失去功能，生长受损，严重的会导致整株植物病死。干腐病是当代森林的常见病之一，通常会对森林尤其是经济作物造成严重影响。山核桃是一种高价值的果品，一旦出现干腐病的问题，轻则导致产量降低，果品质量下降，重则导致颗粒无收，甚至植株死亡。由于山核桃的经济价值主要是高级果品的价值是近年来随着我国社会经济生产发展到一定阶段后才逐步显现的，山核桃的干腐病等病变问题的研究开展较晚。从目前可以查阅到的相关文献来看，关于该病变的研究都是90年代以后，主要集中于新世纪，具体说是新世纪前十年之后才集中出现的。同时，随着现代科学技术、生物技术的发展水平的提高，对山核桃干腐病的认识、分析、治理、防范等子系统的研究才逐步展开。巨云为等[55]认为山核桃的相关常见病虫害当中，真菌引发的最多达到16种，其次是细菌引发的为3种，再次是丝虫有2种。干腐病是一种非常典型的真菌引发的病害，其孢子释放的高峰一般在5月间，期间扩撒速度最快。尤其是我国山核桃是作为专门的人工经济林存在，植株单一，一旦发病有利于病菌快速传播蔓延，会造成较为严重的经济损失。因此，从目前来看，山核桃干腐病就是一种由葡萄座腔菌引发的植物病变，对经济林有较大威胁。真菌菌株在冬季隐藏于山核桃（Caryacathayensis）植物内部越冬，春季植物开花前后开始快速繁衍，并渗透到树皮之外，形成类圆形的黄褐色霉斑，并随着时间的推移拉长、扩散，导致植物树皮坏死，渗透汁液，并继续蔓延，深度可达到木质层2～3厘米。根据生长条件的不同，有的植株上几个霉斑，有的多达几百个，严重摧毁山核桃自身的植物功能。章顺来[56]近年来爆发在我国山核桃较为集中的地区的干腐病，一旦发病就呈现大面积爆发态势，达到80%以上，甚至100%。张璐璐[57]通过研究发现山核桃干腐病的发生原因是非常复杂的，有许多变量在发生作用，但通过总结研究可以发现，主要发生原因与树龄、郁闭度，森林经营管理水平、果树结实情况，植株立地条件等有较为直接的关联，其中树龄因素不可忽视。山核桃干腐病的发生于树龄的关系是一种抛物线的发生状态，集中在15～30年树龄的阶段，也即山核桃开始产生经济效益的初期。而在之前和之后，干腐病的发生几率都在降低。这种5 健康与发病山核桃树体pH值、养分与微生物多样性差异情况的原因并不明确，分析推测可能是由于树龄较小的情况下植物生长迅速导致病菌难以形成稳定的群落，树龄较大可能是山核桃自身产生了一定的“抗体”。另外，山核桃的发病几率与种植地带也有关系，一般来说，阳坡比阴坡严重。1.2.2山核桃干腐病防治研究进展目前国内关于山核桃干腐病防治的研究进展，在防治手段方面主要分为两类：其一是直接防治，其二是间接防治。直接防治就是针对病变山核桃采用物理、化学、生物等对策给予挽救，也即“治”的部分；间接防治则主要针对山核桃干腐病的发病机理，采取御前措施，降低山核桃干腐病的发病几率、降低发病危害程度。张传清等[58]利用山核桃干腐病菌能够潜伏在树体中越冬这一特点，采用“涂干加喷雾”的方法对其进行防治，发现戊唑醇和腐霉利均能有效地控制山核桃干腐病溃疡病的形成，防治效果较好。彭丽[59]用福美胂、戊唑醇和腐霉利进行过相关防治试验，结果发现采用福美胂涂干，戊唑醇和腐霉利以1：5的比例混合并连喷3次，防治效果达到81.44%。张璐璐等[57]认为采用“病斑刮除后再涂药”的方式来防治干腐病比直接在树干涂抹或划线喷药的成效好。物理方法来刮除霉斑虽然作用显著，但很容易刮破树皮，刮除霉斑就相当于刮掉树皮，势必造成外部真菌更容易侵入树木内部的问题，而化学方法的喷洒农药的不足之处在于虽然可以杀死部分真菌，但是山核桃自身是一种高级果品，是一种越来越讲究绿色无公害的食品，而喷洒农药难免农药残留，这无论对山核桃出口还是国内的市场前景来说都存在一定的潜在威胁[60]。田甜等[61]针对山核桃干腐病展开了生物学方面的防治研究，其通过研究筛选了对干腐病有一定抑制作用的真菌，研究认为，棘袍木霉（Trichodemaasperellum）和草酸青霉（Penicilliumoxalicum）这2种细菌，对山核桃干腐病的葡萄座腔真菌有较为明显的抑制作用，但抑制的机理不同。前者是通过抗菌素和重寄生两种方式抑制病原菌生长，后者可能仅是通过分泌抗生物质抑制病原菌生长。前者在培养过程中与病原菌初期互不干涉，形成隔离带，后期通过孢子扩散生长覆盖并杀死病原菌。抑制机制包括抗生、重寄生、融菌、营养竞争等多重作用。初期可能是产生抗菌素抑制病原菌扩散，后来扩散到病原菌上的棘袍木霉菌孢子生长，可能是通过重寄生。草酸青霉初筛时能够在病原菌平板上形成明显的抑制菌圈，对峙生长中速度相当，有明显的隔离带，分泌抗生物质，含有至少2种活性成分。杨淑贞等[62]研究认为2种葡萄座腔菌导致山核桃干腐病。郑宏兵研究发现，病原菌为Dothiorellagregaria，属于聚胜小穴壳菌。这些研究差异可能是因为山核桃干腐病的取样对象不同导致的[63]。可见，关于山核桃干腐病的防治，主要是分为物理方法（刮除病斑），化学方法（喷洒农药），生物方法（病菌抑制）3种，在实践方面，一般前2种方法为组合使用，在生物方面。综合防治主要针对导致山核桃干腐病发生的综合环境入手，根据山核桃干腐病的发病几率高、危害大、后果严重就改变什么状况。6 第一章文献综述1.3植物体pH值、养分、微生物多样性与病害的相关性1.3.1植物体pH值与病害的相关性在致病过程中，病原菌可以改变宿主组织的pH值，pH与致病有关酶基因转录和表达有关，换句话说与致病力强弱有关。王玉嬿等对江苏、安徽2疫区的黑松、赤松、马尾松、湿地松4个树种松材线虫病Bursaphelenchusxylophilus的病、健木pH值差异性分析结果表明，该4种树感染了松材线虫后与健康木相比，pH值均呈下降之势，而且，受害越严重，病木pH值就越低[64]。鳄梨病原菌（Golletotrichumgloeosporioides）、番茄病原菌（C.coccodes）、苹果病原菌（C.Acutatum）侵染宿主，氨在宿主侵染部位积累，导致感染部位的pH升高，从而增强pelB基因表达和PL分泌，增强致病力[65]。赵越在基于质外体pH和铁素分析的‘库尔勒香梨’黄化症诊断的研究发现，‘库尔勒香梨’不同器官，木质部质外体汁液pH不同且差异显著，正常树木木质部的pH值比黄化树高0.3个单位[66]。在感染病原菌的桃树树皮上有草酸钙晶体产生，原因是病原菌分泌的草酸和植物组织细胞中的钙离子合成草酸钙，结果造成植物的细胞缺乏钙离子和组织坏死[67]。庞继先多年来在果树腐烂病治理上，发现腐烂病的部位呈酸性，pH值为4～5，腐烂病菌在酸性环境中存活，实践中表明，涂抹6倍的液体火碱液，防治苹果树腐烂病效果最好[68]。1.3.2植物体养分与病害的相关性1.3.2.1植物体含水量与病害的相关性郑宏兵[63]研究山核桃抗溃疡病机理及其相关因素中发现，感病程度随树皮的含水量升高而降低。当RT值高于82%时，感染程度极低或几乎没有感病，抗病性较强。当RT值低于67%时，感病程度最高，在两者之间的感病程度则属于中间类型。刘红宇等[69]在樟树黄化病与树皮含水量关系研究发现，树皮含水率高，黄化病发生程度低。赵伟等[70]在松树枝枯病与枝条含水量关系研究发现，在黑松的生长季节，3龄枝相对含水量与枝枯病发病率呈负相关。陈策等[71]在苹果树皮充水度与愈伤能力关系的研究发现，在相同的温度下，树皮含水量较高的树皮组织愈伤快，如果充水度超过80%，则可生成愈伤周皮较快；随着充水度的降低，愈伤能力急剧减弱，当其降至70%以下时，愈伤能力基本丧失。1.3.2.2植物体单宁与病害的相关性前人研究表明，植物中单宁可有效防御病害的威胁。李春江、吴玉柱等认为树皮中单宁的质量分数与其抗病性密切相关，酚类物质及其衍生物对致病微生物有毒害作用，通过其抑制作用，杀灭作用可抵抗微生物的繁殖和扩张，从而增加树木对溃疡病的抵抗力[72,73]。红栎木的叶片被舞毒蛾幼虫咬食过之后会掉落，Schultz等[74]发现在这些被咬过的叶片中，总酚、可溶性单宁、不可溶单宁的含量与未被咬食的叶片相比，7 健康与发病山核桃树体pH值、养分与微生物多样性差异都明显的要高出很多，他们做了进一步的研究，发现红栎木叶片里的单宁会结合舞毒蛾幼虫体内的一些蛋白质，进而影响幼虫的消化功能。该研究进一步表明了作为黄酮类化合物中的一种，可溶性单宁与不可溶性单宁具有一定的抗虫效果。贾之春[75]在克隆杨树单宁代谢途径中关键酶基因LAR3研究发现，将该基因导入毛白杨后，其表达显着增加，单宁合成增加，转基因杨树对黑斑病的抗性显着增强。杨树在感染叶锈病之后，和单宁表达相关的关键基因LAR、DFR、CHS的表达量上升，单宁的含量也随之增加，这也表明单宁和杨树的抗病反应直接相关[76]。董玉峰等在杨树无性系树皮生理生化特性与溃疡病抗性间的关联中发现，单宁质量分数与大田疾病指数呈负相关，说明它对杨树抗病性有一定的正相关[77]。抗病的铁粒头、九家、它栗与感病的石丰比较，抗病性强的品种单宁含量高，否则含量低[78]。有研究通过植物转基因工程，将番茄表皮中的花青素、单宁等黄酮类物质的含量提高后，发现番茄的保质期、抗氧化能力、抗菌能力都有很大程度的提高[79,80]。1.3.2.3糖类与病害的相关性可溶性糖是调节细胞渗透压与控制细胞内含水量的主要物质，是植物抗病性和抗逆性重要的指标之一[81]。梁军等[82]研究发现，可溶性糖的含量与杨树抗溃疡病之间存在正相关的关系。马玲[81]研究发现，杨树烂皮病接种后，小叶杨可溶性糖含量持续下降，黄芪多糖能使小叶杨可溶性糖含量维持在较高水平。李佐同等[83]测定水稻幼苗叶片中可溶性糖含量变化发现，水稻幼苗可溶性糖含量与稻瘟病早期对稻瘟病的抗性呈正相关，高含量的可溶性糖有利于水稻抗稻瘟病。周博如等[84]将小种1和小种4，分别将2个菌株接种到一片复叶期的2个感病品种(绥农8、东农42)和2个抗病品种(黑农37、黑农38)，接种后，感病品种可溶性总糖含量显著减少，抗病品种的可溶性总糖含量显著增加，在未接种的健株中，感病品种的可溶性总糖含量高于抗病品种。万贤崇等[85]研究发现，在病害侵染初期，与感病无性系(I-214杨、P15A杨、加龙杨)比较，抗病无性系(I-63杨、I-69杨、I-72杨)叶片还原糖含量偏低，呈下降趋势，感病无性系呈上升趋势。李梅婷[86]研究发现，香蕉枯萎病菌CWDEs对香蕉假茎组织具有降解破坏作用，PG降解香蕉假茎组织的能力与香蕉的抗性有关。对于抗病的香蕉品种，PG降解其假茎的能力较弱，降解后释放出还原糖的量较低；PG降解感病香蕉品种假茎的能力强，还原糖释放量高。1.3.3植物体微生物多样性与病害的相关性Fabi等[87]研究意大利本土杨溃疡病微生物组成发现，从白杨褐斑组织分离出Pseudomonasmendocinapalleroni1970和Erwiniaherbicola、而从溃疡组织分离到Erwiniacarotovorasubsp.carotovora，偶尔还可以分离到E.herbicola。接种试验证明只有E.carotovorasubsp.carotovora产生典型的溃疡症状。李永[88]通过比较欧美杨品种107杨和中林46杨的健康植株与染病植株干部树皮8 第一章文献综述内微生物菌群的组成和变化发现，溃疡病的发生改变了树皮的生理生化组成和结构，也改变了真菌和细菌落结构，健康植株树皮微生态系统中以对植物生长或微生态环境有利的菌群为主，如Pseudomonas属、Pantoea属、Rhizobium属、Microbacterium属、Bacillus属。而感染溃疡病的树皮发病部位微生态系统则以各类病原菌、肠道细菌和能发酵细菌为主，真菌优势种群为茄镰孢菌，细菌优势种群为（Lonsdaleaquercinasubsp.populi），另外还包括柳树水纹病病菌（Brenneriasalicis）、马铃薯茎腐病病菌Pectobacteriunwasabiae）、软腐果胶杆菌软腐亚种（Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum）等植物病原菌。1.4本论文研究目的与意义我国现有山核桃栽培面积约1.3×106hm2，年平均产值达17.5亿元，加工产值达34.2亿元。在浙江省临安市岛石镇等重点产区，山核桃收入占林农全年总收入的85%以上。为此，山核桃是天目山区、昌北区林农致富、小康社会建设的主要经济支柱。近年来，山核桃干腐病的蔓延和大面积爆发已对山核桃产业可持续发展构成严重威胁。各产区山核桃干腐病的发病率均达60%以上，其中以浙江省临安市最为严重，发病率高达86.5%，每年直接经济损失高达1.0244亿元。自上世纪90年代开展山核桃干腐病的研究和防治工作以来，基本掌握了病原菌的生物学特性，在药物筛选、防治方法上也取得了一定进展，但现有的技术手段，往往偏重于药物治疗，而忽视了生态化综合防控技术，忽视了以经营措施为主体的生态化综合防控技术，往往治标不治本，长期来看收效甚微，而且对环境造成了污染。每年5月，茶藨子葡萄座腔菌孢子大量释放，5月中下旬为孢子释放高峰期，借助风雨从树体伤口或自然孔口侵入传播，引起树体发病。可见，山核桃干腐病是通过孢子传播进行传染扩散的，而作者研究发现，发病与健康山核桃林中病原菌孢子量的差异并不显著（另文发表）。由此可以推断，与人的免疫力对维持健康的重要性类似，树体的生理状态与抵抗力对维持自身的健康与抗病有重要影响。已有研究表明，病原菌在对植物的致病过程中，可改变寄主组织的pH值，而环境pH值与病原菌致病力强弱密切相关，树体养分状况直接影响自身抗病能力的强弱，植物内生菌有利于植物对病原菌的防卫或促进植物生长，有些还对植物病害有生物防治潜能。鉴于此，本论文研究了健康与发病山核桃树皮、木质部pH值、养分与微生物多样性的差异，并分析了其相关性，为通过提高山核桃树体的抵抗力来防治山核桃干腐病提供了依据。9 健康与发病山核桃树体pH值、养分与微生物多样性差异第二章材料与方法2.1实验材料2.1.1样地选择选择浙江省临安区太阳镇武村（29~30°N，118~120°E）为实验样地，山核桃林样地平均年龄为30a，林分密度为380株/ha，主要分布在坡向西南方，坡度25°，海拔340m的山腰。属于亚热带季风气候区，季节分明，气候温和，雨量充沛，年均气温17.2℃，年均日照时数1837.9h，年均降水量1613.9mm，土壤类型为红壤。2.1.2样品采集根据山核桃干腐病分级标准（详见表2.1），选择健康无病斑的树为健康山核桃树，病斑数为11-15个的为发病山核桃树。表2.1山核桃干腐病分级标准Table2.1TheclassificationstandardofcankerdiseaseofCaryacathayensis病级代表数值分类标准Ⅰ0健康无病斑Ⅱ1≤5个病斑Ⅲ26-10个病斑Ⅳ311-15个病斑Ⅴ4≥16个病斑Ⅵ5死亡在山核桃干腐病发病期（2016年6月），随机选取健康和发病山核桃树各5棵，其中样品分别为健康山核桃树皮（JP）和木质部（JM）；发病山核桃树发病部位树皮（FFP）和木质部（FFM）；发病山核桃树未发病部位树皮（FJP）和木质部（FJM），每棵树主干距离地面130cm处，用酒精棉擦拭树皮，用刮皮刀采集10×10cm大小的树皮，用树木生长锥采集15cm木质部并弃去靠近树皮0.5cm长的木质部。本研究共采集健康和发病山核桃树皮样品15个、木质部样品15个。将样品分为两部分，一部分105℃烘干后用来测定含水量和pH值，另外一部分新鲜样品用来测定单宁、还原糖、可溶性糖和细菌多样性，保存在-80℃环境中。2.1.3实验仪器10 第二章材料与方法本实验所用实验仪器见表2.2。表2.2本实验所用实验仪器Table2.2Experimentalinstrumentsusedinthisstudy仪器设备名称购买公司仪器型号电子天平梅特勒-托利多仪器上海有限公司AL204离心机美国贝克曼库尔特有限公司J-301数显恒温水浴锅国华电器有限公司HH-4立式压力蒸汽灭菌器上海博迅实业有限公司医疗设备厂YXQ-LS-75S11紫外分光光度计日立公司UV-9100pH计上海三信仪表厂PHB-1凝胶成像系统美国BIO-RADGelDocXR+台式高速冷冻离心机德国Eppendorf5810R鼓风干燥箱上海一恒DHG-9140A制冰机美国GrantXB130-FZMilli-Q超纯水仪美国MilliporeDerect-8超声波细胞粉碎机宁波新艺超声设备有限公司JY92-ⅡDN水平电泳槽美国BIO-RAD超低温冰箱日本SANYO有限公司2.1.4实验试剂无水葡萄糖、氢氧化钠、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、结晶酚、亚硫酸钠、EDTA二钠盐、硫酸铁铵、浓硫酸、1,10-邻二氮菲、冰醋酸、单宁酸、乙醇、蒽酮均为国产分析纯；PowerSoilTMDNAIsolationKit试剂盒购自MIBIO公司；HighPhusion®High-FidelityPCRMasterMixwithGCBuffer、NEBNext®Ultra™DNALibraryPrepKitforIllumina购自NewEnglandBiolabs公司；产物纯化试剂盒购自ThermoScientific公司。2.2实验方法2.2.1pH值与养分测定采用12.5:1的水树皮比和水木质部比，便携式pH计测定pH值；采用重烘干称11 健康与发病山核桃树体pH值、养分与微生物多样性差异重法测定含水量；采用邻二氮菲法测定单宁；采用3,5-二硝基水杨酸法测定还原[89-91]糖；采用蒽酮法测定可溶性糖。2.2.2生物多样性测定2.2.2.1基因组DNA提取采用CTAB法提取树皮、木质部基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度与纯度。根据DNA的浓度，用无菌水将其稀释成1ng/μL，送浙江天科高新技术发展有限公司测序。2.2.2.2基因组DNA测序使用带Barcode的特异引物，高效高保真酶对16SrDNA的V3、V4区域进行扩[92]增，引物序列为341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)，[92]806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。使用带Barcode的特异引物，高效高保真酶对ITSrDNA的ITS1区域进行扩增，引物序列为[93][93]ITS-1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)，ITS-2(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)。PCR反应体系为30μL：DNA模板10μL，PhusionMasterMix(2×)15μL，上下引物各1.5μL，ddH2O2μL。反应条件为：98℃预变性1min；30个循环包括（98℃变性10s；50℃复性30s；72℃延伸30s）；最后72℃延伸5min。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，选取长度在400-450bp之间的清晰条带，用ThermoScientific公司的GeneJET胶回收试剂盒进行回收。下一步通过Illumina测序仪进行测序。2.2.2.3样品微生物多样性分析测序所得数据截去Barcode和引物序列后，利用FLASH等对每个样本进行拼接、过滤、去嵌合体处理，最后得到有效的数据[94,95]。通过Uparse等对所有样品的有效tags进行聚类分析，以97%序列一致性将序列聚类成OTUs，再利用Silva.nr_v123数据库在各个分类水平对代表序列进行物种注释分析[96]。以样品中最低数据量作为均一化处理的标准，使用R等软件(Version3.2.2;https://cran.r-project.org/)进行α-多样性分析和β-多样性分析[97]。2.2.3数据处理与分析使用SPSS19.0对所得数据进行单因素方差分析，进而分析显著性。12 第三章结果与分析第三章结果与分析3.1病健山核桃树样品pH值与养分含量差异表3.1、表3.2列出了病健山核桃树皮与木质部的pH值和养分含量，经单因素方差分析可知，健康与发病山核桃树相比，不管是树皮还是木质部，pH值、单宁、还原糖和可溶性糖含量均存在显著差异（P<0.05），而发病山核桃树发病部位与未发病部位相比，树皮、木质部的pH值和养分含量差异均不显著。健康山核桃树皮、木质部pH值分别为7.03和7.63，均为中性，显著高于呈酸性的发病山核桃树皮与木质部（P<0.05）。健康山核桃树皮的单宁与可溶性糖含量分别为0.317%和3.348%，木质部为0.079%和0.626%，均显著高于发病山核桃树（P<0.05）。健康山核桃树皮与木质部的还原糖含量分别为0.865%和0.42%，均显著低于发病山核桃树（P<0.05）。表3.1病健山核桃树皮pH值与养分含量差异Table3.1ThecomparisonofpHvalueandnutrientcontentofdiseased/healthyhickorytrees树体部位pH值含水量单宁还原糖可溶性糖（%）（%）（%）（%）健康健康7.03±0.03a43.3±0.01a0.317±0.066a0.865±0.009b3.348±0.077a发病5.95±0.06b41.21±0.04a0.207±0.001b1.073±0.006a2.892±0.001b发病未发病5.95±0.12b40.26±0.02a0.227±0.017b1.15±0.004a2.534±0.101b注：表中数据为平均值±标准差（n=5），同一列不同小写字母表示在0.05水平下差异显著（P<0.05），以下同。Note:Datainthetableweretheaveragevalue±standarddeviation(n=5),anddifferentlowercaselettersinthesamecolumnmeantsignificantdifferenceat0.05level(P<0.05),thesameasbelow..表3.2病健山核桃树木质部pH值与养分含量差异Table3.2ThecomparisonofpHvalueandnutrientcontentofdiseased/healthyhickorytrees树体部位pH值含水量单宁还原糖可溶性糖（%）（%）（%）（%）健康健康7.63±0.01a45.45±0.01a0.079±0.006a0.42±0.008b0.626±0.062a发病5.43±0.04b43.51±0.03a0.041±0.008b0.519±0.001a0.178±0.001b发病未发病5.69±0.06b39.01±0.05a0.037±0.004b0.513±0.004a0.119±0.013b13 健康与发病山核桃树体pH值、养分与微生物多样性差异3.2病健山核桃树样品细菌多样性差异3.2.1α-多样性差异3.2.1.1细菌OTU数目差异健康山核桃树、发病山核桃树发病和未发病部位树皮细菌OTU数目分别为565、377和413，可见健康山核桃树皮细菌OTU数目显著高于发病山核桃树，未发病部位树皮细菌OTU数目显著高于发病部位（P<0.05）。健康山核桃树、发病山核桃树发病和未发病部位木质部细菌OTU数目分别为281、401和393，可见发病山核桃树木质部细菌OTU数目显著高于健康山核桃树，发病部位木质部细菌OTU数目，显著高于未发病部位（P<0.05）。3.2.1.2细菌群落结构差异根据所有样品在属水平的物种注释及多度信息，选取相对多度0.39%的属，从物种和样品两方面进行聚类，绘制成热图见图3.1。由图可见，在属水平上，健康山核桃树皮有7个主要属，分别为Actinoplanes，Bryobacter，Terriglobus，Salinarimonas，Rhizobium，Blastocatella，Sphingomonas；发病山核桃树发病部位与未发病部位树皮各有8个主要属，分别为Hymenobacter，Microcella，Spirosoma，Acidiphilium，Byssovorax，Actinomycetospora，Methylobacterium，Mesorhizobium与Geodermatophilus，Edaphobacter，Byssovorax，Actinomycetospora，Devosia，Sphingomonas，Gemmata，Jatrophihabitans。健康山核桃树木质部有8个主要属，分别为Lachnoclostridium5，Ruminiclostridium5，Dactylosporangium，Escherichia−Shigella，Delftia，Pseudonocardia，Devosia，Rhizobium；发病山核桃树发病部位有4个主要属，分别为Pleomorphomonas，Brenneria，Lachnoclostridium，Serratia；未发病部位有8个主要属，分别为Luedemannella，Proteiniphilum，Lachnoclostridium，Paracocccus，Delftia，Brenneria，Serratia，Burkholderia。14 第三章结果与分析图3.1病健山核桃树皮与木质部细菌物种相对多度聚类图Fig.3.1Speciesrelativeabundanceclusteringofbacteriaofhickorytreebarkandxylem注：热图对应的值为每一行物种相对多度经过标准化处理后得到的Z值。Note:ThecorrespondingvaluesinheatmapwereZvalueswhichwereobtainedafterstandardizedtreatmentoftherelativeabundanceofeachrowofthespecies.为更直观了解病健山核桃树皮与木质部细菌主要菌群在门水平上的分布，对图3.1进行整理分析得到表3.3，可见健康与发病山核桃树主要细菌门所占比例差异显著（P<0.05）。由表3.3可知健康山核桃树皮，酸杆菌门所占的比例为43%，显著高于酸杆菌门比例分别为0%、24%的发病山核桃树发病与未发病部位树皮（P<0.05）；而发病山核桃树发病与未发病部位树皮的放线菌门所占比例分别为25%和38%，显著高于放线菌门比例为14%的健康山核桃树皮（P<0.05）。健康山核桃树木质部，放线菌门所占的比例为25%，显著高于放线菌门比例分别为0%、13%的发病山核桃树发病与未发病部位木质部（P<0.05）。15 健康与发病山核桃树体pH值、养分与微生物多样性差异表3.3病健山核桃树皮与木质部主要细菌门差异Table3.3Thedifferencesofmajorbacterialfloraatthephylumlevelofhickorybarkandxylem健康树发病树主要细菌门健康部位发病部位未发病部位树皮木质部树皮木质部树皮木质部酸杆菌门43%a0%d0%d0%d24%b13%c放线菌门14%c25%b25%b0%e38%a13%d3.2.1.3细菌群落α-多样性指数差异通过SPSS软件对不同样品在97%序列一致性水平下OTUs的α-多样性指数进行单因素方差分析，包括Ace、Chao、Shannon以及Simpson指数，所得结果如表3.4和表3.5所示。由表3.4可知，健康山核桃树皮的Ace、Chao、Shannon和Simpson指数分别为599、603、6.59和0.98，均显著高于发病山核桃树发病和未发病部位树皮的4个指数。由表3.5可知，健康山核桃树木质部的Ace、Chao、Shannon和Simpson指数分别为440、454、6.35和0.95，均显著高于发病山核桃树发病和未发病部位木质部的4个指数。表3.4病健山核桃树皮细菌多样性指数差异Table3.4Thedifferencesofbacterialdiversityindexofhickorybark树体部位多样性指数AceChaoShannonSimpson健康健康599±15.025a603±21.492a6.59±0.416a0.98±0.004a发病483±29.07b514±47.996b5.77±0.244b0.96±0.005b发病未发病454±32.03b455±38.41c6.06±0.27b0.96±0.006b16 第三章结果与分析表3.5病健山核桃树木质部细菌多样性指数差异Table3.5Thedifferencesofbacterialdiversityindexofhickoryxylem树体部位多样性指数AceChaoShannonSimpson健康健康440±33.695a454±24.055a6.35±0.795a0.95±0.03a发病340±39.951b376±42.06b6.13±0.129b0.86±0.017b发病未发病324±36.592b360±39.39b4.99±0.22c0.89±0.008b3.2.2β-多样性差异3.2.2.1主要细菌群落差异在属水平上，对不同样品细菌进行单因素方差分析，得到主要菌群如表3.6、表3.7所示。由表3.6可见，健康山核桃树皮细菌中蛭弧菌属、酸胞菌属、鞘氨醇单胞菌属的相对多度分别为0.13%、0.01%、15.32%，显著高于相对多度分别为0.001%、0.002%、8.62%和0.005%、0.002%、13.36%的发病山核桃树发病部位和未发病部位（P<0.05）；而健康山核桃树皮细菌中粘细菌属、甲基杆菌属的相对多度分别为0.21%、3.46%，显著低于相对多度分别为7.56%、6.46%和0.49%、5.32%的发病山核桃树发病部位和未发病部位（P<0.05）。因此，蛭弧菌属、酸胞菌属和鞘氨醇单胞菌属为健康山核桃树皮优势细菌属；粘细菌属和甲基杆菌属为发病山核桃树皮的优势细菌属。由表3.7可见，健康山核桃木质部细菌中Massilia、鞘氨醇单胞菌属的相对多度分别为1.2%、4.41%，显著高于相对多度分别为0.003%、3.39%和0.002%、0.16%的发病山核桃树发病部位和未发病部位（P<0.05）；而健康山核桃木质部细菌中甲基杆菌属、Luedemannella、粘细菌属的相对多度分别为1.03%、0.19%、0.09%，显著低于相对多度分别为2.36%、0.35%、2.35%和1.76%、1.81%、0.55%的发病山核桃树发病部位和未发病部位（P<0.05）。因此，Massilia和鞘氨醇单胞菌属为健康山核桃树木质部的优势细菌属；甲基杆菌属、Luedemannella和粘细菌属为发病山核桃树木质部的优势细菌属。17 健康与发病山核桃树体pH值、养分与微生物多样性差异表3.6病健山核桃树皮优势细菌属与相对多度差异Table3.6Thedifferencesofdominatebacterialgeneraandrelativeabundanceofhickorybark健康树发病树优势细菌属健康部位发病部位未发病部位蛭弧菌0.13%±0.004%a0.001%±0.001%b0.005%±0.002%b酸胞菌属0.01%±0.004%a0.002%±0.001%b0.002%±0.001%b鞘氨醇单胞菌属15.32%±3.51%a8.62%±1.64%c13.36%±4.42%b粘细菌属0.21%±0.004%c7.56%±1.72%a0.49%±0.019%b甲基杆菌3.46%±1.44%b6.46%±1.26%a5.32%±0.85%a表3.7病健山核桃树木质部优势细菌属与相对多度差异Table3.7Thedifferencesofdominatebacterialgeneraandrelativeabundanceofhickoryxylem健康树发病树优势细菌属健康部位发病部位未发病部位Massilia1.2%±0.04%a0.003%±0.001%b0.002%±0.001%b鞘氨醇单胞菌属4.41%±1.42%a3.39%±1.08%b0.16%±0.06%c甲基杆菌属1.03%±0.37%c2.36%±0.48%a1.76%±0.11%bLuedemannella0.19%±0.06%c0.35%±0.03%b1.81%±0.84%a粘细菌属0.09%±0.03%c2.35%±0.69%a0.55%±0.05%b3.2.2.2优势细菌属与pH值和养分的相关性分别对病健山核桃树皮与木质部优势细菌属与pH值、养分进行RDA分析，分别得到图3.2、图3.3。图3.2中的第一排序轴可解释树皮细菌优势属的94.66%，第二排序轴可解释5.18%。第一排序轴与还原糖（0.996）呈正相关，与可溶性糖（-0.042）、单宁（-0.328）、含水量（-0.986）、pH（-0.992）呈负相关；第二排序轴与可溶性糖（0.999）、单宁（0.945）、含水量（0.084）呈正相关，与pH（-0.063）、还原糖（-0.219）呈负相关。健康山核桃树皮与单宁、pH、含水量、可溶性糖呈正相关，发病山核桃树皮与还原糖呈正相关。图3.3中的第一排序轴可解释木质部细菌优势属的73.46%，第二排序轴可解释20.29%。第一排序轴与可溶性糖（0.285）、单宁（0.337）、pH（0.513）呈正相关，与还原糖（-0.939）、含水量（-0.601）呈负相关；第二排序轴与可溶性糖（0.959）、含水量（0.799）呈正相关，与pH（-0.859）、单宁（-0.841）、还原糖（-0.343）呈负相关。健康山核桃树木质部与18 第三章结果与分析单宁、pH、可溶性糖呈正相关，发病山核桃树木质部含水量、还原糖呈正相关。因此，pH值、单宁、含水量、可溶性糖和还原糖均为两种山核桃树皮与木质部细菌优势菌群的主要影响因子。其中，鞘氨醇单胞菌属、蛭弧菌属和酸胞菌属、Massilia这4种健康山核桃树优势细菌属与可溶性糖、单宁、pH值呈正相关，Luedemannella、粘结菌属和甲基杆菌属这3种发病山核桃树优势细菌属与还原糖呈正相关。这与不同山核桃树皮与木质部pH、养分的差异结果相一致。图3.2病健山核桃树皮优势细菌属与pH值和养分的相关性Fig.3.2Correlationofthedominatebacterialgeneraatthegenuslevelandenvironmentalvariablesofhickorybark19 健康与发病山核桃树体pH值、养分与微生物多样性差异图3.3病健山核桃树木质部优势细菌属与pH值和养分的相关性Fig.3.3Correlationofthedominatebacterialgeneraatthegenuslevelandenvironmentalvariablesofhickoryxylem为探究pH值、单宁、含水量、可溶性糖和还原糖是否都对细菌优势属有显著影响，对健康与发病山核桃树皮、木质部与影响因子进行蒙特卡罗检验得到表3.8。由表3.8可知，pH、单宁、可溶性糖与还原糖的P值分别为0.047、0.031、0.036与0.045，均小于0.05，因此为显著性影响因子，四者对山核桃树皮细菌优势属影响显著；而含水量的P值分别为0.064，均大于0.05，因此对山核桃树皮优势细菌属的影响不显著。pH、可溶性糖与还原糖的P值分别为0.028、0.047与0.029，均小于0.05，因此为显著性影响因子，三者对山核桃树木质部细菌优势属影响显著；而含水量、单宁的P值分别为0.318和0.145，均大于0.05，因此对山核桃树木质部优势细菌属的影响不显著。20 第三章结果与分析表3.8病健山核桃树皮与木质部细菌优势属蒙特卡罗检验结果Table3.8MonteCarlotestresultofthedominatebacterialgeneraatthegenuslevelandenvironmentalvariablesofhickorybarkandxylem树皮木质部影响因子r2Pr2PpH值0.9570.0470.9850.028单宁0.8210.0310.3740.145含水量0.8440.0640.5620.318可溶性糖0.8760.0360.8720.047还原糖0.9520.0450.8770.0293.3病健山核桃树样品真菌多样性差异3.3.1α-多样性差异3.3.1.1真菌OTU数目差异健康山核桃树、发病山核桃树发病和未发病部位树皮真菌OTU数目分别为279、234和218，可见健康山核桃树皮真菌OTU数目显著高于发病山核桃树发病和未发病部位（P<0.05）。健康山核桃树、发病山核桃树发病和未发病部位木质部真菌OTU数目分别为225、159和115，可见健康山核桃树木质部真菌OTU数目显著高于发病山核桃树，发病部位木质部真菌OTU数目，显著高于未发病部位（P<0.05）。3.3.1.2真菌群落结构差异根据所有样品在属水平的物种注释及多度信息，选取相对多度0.19%的属，从物种和样品两方面进行聚类，绘制成热图见图3.4。由图可见，在属水平上，健康山核桃树皮有7个主要属，分别为Acarospora，Hypocrea，Calcarisporium，Fusicolla，Dermatocarpon，Fusarium，Cladophialophora；发病山核桃树发病部位有12个主要属，分别为Chaenotheca，Exophiala，Verrucaria，Amanita，Trimmatostroma，Bacidia，Arthrocatena，Devriesia，Strelitziana，Capnobotryella，Cladophialophora，Rhinocladiella；发病山核桃树未发病部位有5个主要属，分别为Cyphellophora，Aspergillus，Rhinocladiella，Strelitziana，Devriesia。健康山核桃树木质部有8个主要属，分别为Talaromyces，Alternaria，Podospora，Gibberella，Tremella，Agrocybe，Aspergillus，Archaeorhizomyces；发病山核桃树21 健康与发病山核桃树体pH值、养分与微生物多样性差异发病部位有3个主要属，分别为Phoma，Cylindrocladiella，Archaeorhizomyces；发病山核桃树未发病部位有6个主要属，分别为Lophodermium，Oxyporus，Cladosporium，Mortierella，Candida，Issatchenkia。图3.4病健山核桃树皮与木质部真菌物种相对多度聚类图Fig.3.4Speciesrelativeabundanceclusteringoffungiofhickorytreebarkandxylem注：热图对应的值为每一行物种相对多度经过标准化处理后得到的Z值。Note:ThecorrespondingvaluesinheatmapwereZvalueswhichwereobtainedafterstandardizedtreatmentoftherelativeabundanceofeachrowofthespecies.为更直观了解病健山核桃树皮与木质部真菌主要菌群在门水平上的分布，对图3.4进行整理分析得到表3.9，可见健康与发病山核桃树主要真菌门所占比例差异显著（P<0.05）。由表3.9可知健康山核桃树与发病山核桃树未发病部位树皮，子囊菌门所占的比例分别为100%和100%，显著高于子囊菌门比例为92%的发病山核桃树发病部位树皮（P<0.05）；而发病山核桃树发病部位树皮的担子菌门所占比例为8%，显著高于担子菌门比例分别为0%、0%的健康山核桃树与22 第三章结果与分析发病山核桃树未发病部位树皮（P<0.05）。发病山核桃树发病部位木质部，子囊菌门所占的比例为100%，显著高于子囊菌门比例分别为75%、66%的健康山核桃树与发病山核桃树未发病部位木质部（P<0.05）。健康山核桃树木质部，担子菌门所占的比例为25%，显著高于担子菌门比例分别为0%、17%的发病山核桃树发病与未发病部位木质部（P<0.05）。表3.9病健山核桃树皮与木质部主要真菌门差异Table3.9Thedifferencesofmajorfungalfloraatthephylumlevelofhickorybarkandxylem健康树发病树主要真菌门健康部位发病部位未发病部位树皮木质部树皮木质部树皮木质部子囊菌门100%a75%c92%b100%a100%a66%d担子菌门0%d25%a8%c0%d0%d17%b3.3.1.3真菌群落α-多样性指数差异通过SPSS软件对不同样品在97%序列一致性水平下OTUs的α-多样性指数进行单因素方差分析，包括Ace、Chao、Shannon以及Simpson指数，所得结果如表3.10和表3.11所示。由表3.10可知，健康山核桃树皮的Ace、Chao、Shannon和Simpson指数分别为321、318、4.42和0.92，均显著高于发病山核桃树发病部位和未发病部位树皮的4个指数。由表3.11可知，健康山核桃树木质部的Ace、Chao、Shannon和Simpson指数分别为311、263、5.93和0.96，均显著高于发病山核桃树发病部位和未发病部位木质部的4个指数。表3.10病健山核桃树皮真菌多样性指数差异Table3.10Thedifferencesoffungaldiversityindexofhickorybark树体部位多样性指数AceChaoShannonSimpson健康健康321±13.62a318±8.453a4.42±0.581a0.92±0.019a发病214±27.698c220±24.141c3±0.429b0.75±0.116b发病未发病271±3.529b266±6.007b3.28±0.57b0.89±0.01b23 健康与发病山核桃树体pH值、养分与微生物多样性差异表3.11病健山核桃树木质部真菌多样性指数差异Table3.11Thedifferencesoffungaldiversityindexofhickoryxylem树体部位多样性指数AceChaoShannonSimpson健康健康311±53.633a263±8.001a5.93±0.171a0.96±0.005a发病223±41.024b204±2.125b5.58±0.057b0.66±0.003c发病未发病167±8.882c175±1.181c4.79±0.468c0.86±0.035b3.3.2β-多样性差异3.3.2.1主要真菌群落差异在属水平上，对不同样品真菌进行单因素方差分析，得到主要菌群如表3.12所示。由表3.12可见，健康山核桃树皮真菌中附球菌属的相对多度为0.111%，显著高于相对多度为0.034%、0.048%的发病山核桃树发病部位和未发病部位（P<0.05）；而健康山核桃树、发病山核桃树未发病部位，树皮真菌中德福霉属、Spizellomyces的相对多度分别为1.135%、0.003%和7.365%、0.007%，显著低于相对多度分别为10.44%、0.014%的发病山核桃树发病部位（P<0.05）。因此，附球菌属为健康山核桃树皮优势真菌属；德福霉属、Spizellomyces为发病山核桃树皮的优势真菌属。由表3.13可见，健康山核桃木质部真菌中喙枝孢属的相对多度为4.47%，显著高于相对多度为1.43%和1.86%的发病山核桃树发病部位和未发病部位（P<0.05）；而健康山核桃木质部真菌中茎点霉属、念珠菌属的相对多度分别为0.16%、0.47%，显著低于相对多度分别为1.31%、1.85%和0.51%、0.84%的发病山核桃树发病部位和未发病部位（P<0.05）。因此，喙枝孢属为健康山核桃树木质部的优势真菌属；茎点霉属和念珠菌属为发病山核桃树木质部的优势真菌属。表3.12病健山核桃树皮优势真菌属与相对多度差异Table3.12Thedifferencesofdominatefungalgeneraandrelativeabundanceofhickorybark健康树发病树优势真菌属健康部位发病部位未发病部位德福霉属1.135%±1.707%c10.44%±2.78%a7.365%±1.271%b附球菌属0.111%±0.031%a0.034%±0.03%b0.048%±0.041%bSpizellomyces0.003%±0.002%c0.014%±0.005%a0.007%±0.002%b24 第三章结果与分析表3.13病健山核桃树木质部优势真菌属与相对多度差异Table3.13Thedifferencesofdominatefungalgeneraandrelativeabundanceofhickoryxylem健康树发病树优势真菌属健康部位发病部位未发病部位喙枝孢属4.47%±0.33%a1.43%±0.12%c1.86%±0.19%b茎点霉属0.16%±0.04%c1.31%±0.24%a0.51%±0.13%b念珠菌属0.47%±0.15%c1.85%±0.13%a0.84%±0.03%b3.3.2.2优势真菌属与pH值和养分的相关性分别对病健山核桃树皮与木质部优势真菌属与pH值、养分进行RDA分析，分别得到图3.5、图3.6。图3.5中的第一排序轴可解释树皮真菌优势属的80.43%，第二排序轴可解释13.99%。第一排序轴与还原糖（0.998）、含水量（0.981）、pH（0.908）、单宁（0.672）呈正相关，与可溶性糖（-0.065）呈负相关；第二排序轴与还原糖（0.068）、含水量（0.189）、pH（0.416）、单宁（0.435）、可溶性糖（0.429）均呈正相关。健康山核桃树皮与单宁、pH、含水量、还原糖呈正相关，发病山核桃树皮与可溶性糖呈正相关。图3.6中的第一排序轴可解释木质部真菌优势属的60.6%，第二排序轴可解释31.9%。第一排序轴与还原糖（0.159）、单宁（0.264）、pH（0.993）、含水量（0.997）呈正相关，与可溶性糖（-0.989）呈负相关；第二排序轴与单宁（0.964）、含水量（0.069）呈正相关，与pH（-0.121）、可溶性糖（-0.147）、还原糖（-0.989）呈负相关。健康山核桃树木质部与单宁、pH、还原糖、含水量呈正相关，发病山核桃树木质部可溶性糖呈正相关。因此，pH值、单宁、含水量、可溶性糖和还原糖均为两种山核桃树皮与木质部真菌优势菌群的主要影响因子。其中，附球菌属和喙枝孢属这2种健康山核桃树优势真菌属与含水量、还原糖、单宁、pH值呈正相关，Spizellomyces、德福霉属、茎点霉属和念珠菌属这4种发病山核桃树优势真菌属与可溶性糖呈正相关。25 健康与发病山核桃树体pH值、养分与微生物多样性差异图3.5病健山核桃树皮优势真菌属与pH值和养分的相关性Fig.3.5Correlationofthedominatefungalgeneraatthegeneralevelandenvironmentalvariablesofhickorybark26 第三章结果与分析图3.6病健山核桃木质部优势真菌属与pH值和养分的相关性Fig.3.6Correlationofthedominatefungalgeneraatthegeneralevelandenvironmentalvariablesofhickoryxylem为探究pH值、单宁、含水量、可溶性糖和还原糖是否都对真菌优势属有显著影响，对健康与发病山核桃树皮、木质部与影响因子进行蒙特卡罗检验得到表3.14。由表3.14可知，pH、可溶性糖与还原糖的P值分别为0.048、0.007与0.045，均小于0.05，因此为显著性影响因子，三者对山核桃树皮优势真菌属影响显著；而单宁和含水量的P值分别为0.259和0.896，均大于0.05，因此对山核桃树皮优势真菌属的影响不显著。pH、含水量、可溶性糖与还原糖的P值分别为0.045、0.041、0.024与0.015，均小于0.05，因此为显著性影响因子，四者对山核桃木质部优势真菌属影响显著；而单宁的P值为0.708，均大于0.05，因此对山核桃树皮优势真菌属的影响不显著。27 健康与发病山核桃树体pH值、养分与微生物多样性差异表3.14病健山核桃树皮与木质部真菌优势属蒙特卡罗检验结果Table3.14MonteCarlotestresultofthedominatefungalgeneraatthegeneralevelandenvironmentalvariablesofhickorybarkandxylem树皮木质部影响因子r2Pr2PpH值0.8990.0480.9720.045单宁0.5850.2590.2030.708含水量0.0940.8960.8590.041可溶性糖0.9780.0070.9880.024还原糖0.8990.0450.8790.01528 第四章结论与讨论第四章结论与讨论本论文研究发现健康山核桃树皮、木质部pH值接近中性，均显著高于发病山核桃树（P<0.05）。傅锦婷[98]报道山核桃干腐病病原菌在pH为6环境下生长最好，说明该病原菌适宜在弱酸性环境下生长。侯天侦等[99]提出抗性和非抗性植物的pH值差1个单位,能使酚的毒性增强两倍，当pH值升高时，能加速酚类化合物氧化形成更有毒力的醌类，从而增强植物抗病能力。本论文研究结果与之一致。李雪莹等[100]报道单宁可抑制微生物酶和病毒的生长，增强植物的抗病能力。李海燕认为可溶性糖在植物体内大量存在，其含量变化与植物对某些病害的抗性有关，可溶性糖含量越高，抗病力越强[101]。傅锦婷发现山核桃干腐病菌在葡萄糖培养基上生长最好，因此葡萄糖即还原糖含量高，山核桃树容易发病[98]。侯天侦等报道在可溶性糖类的复合液中，即单糖一蔗糖系统中，单糖含量高，抗病性弱，蔗糖含量高，抗病性强[99]。这些文献很好地解释了本文的研究结果：健康山核桃树体单宁、可溶性糖含量显著高于发病山核桃树，还原糖含量显著低于发病山核桃树（P<0.05）。但是，为什么对于发病山核桃树来说，不管发病还是未发病部位，树皮和木质部的pH值与含水量、单宁、可溶性糖、还原糖这些本论文测定的所有养分指标均无显著差异呢？秦彦杰[102]报道树高超过1.5m以后，主要营养成分含量基本稳定。由此推断，可能是经营措施的不同造成了树体pH值、养分含量的差异，导致了在林间病原菌孢子含量差异不显著的条件下，有些树能保持健康、有些树却发病了。据此进一步大胆假设：可能是树体本身的pH值与养分含量的不正常使树发病，而不是发病造成了树体这些指标的不正常。下一步可进一步研究该假设能否真正成立。经RDA分析和蒙特卡罗检验可知，pH值、可溶性糖、还原糖均对树皮、木质部细菌优势属有显著影响（P<0.05）。蛭弧菌属、酸胞菌属、Massilia和鞘氨醇单胞菌属均为健康山核桃树细菌优势属。已有研究表明，蛭弧菌属细菌是一类专门以攻击、进而裂解其他微生物为生的寄生性细菌，例如，蛭弧菌（Bdellovibriospp.）能裂解包括欧文氏菌、解淀粉欧文氏菌和水稻黄单胞菌等植物病原体[103]，在控制和消除致病菌方面具有潜在的应用价值。冯静等发现酸胞菌属能把乙醇氧化成乙酸，进一步将乙酸或乙酸盐氧化为CO[104]2和H2O，有助于促进植物代谢。Gan等发现Massilia菌属具有木聚糖降解酶基因，赵联正等报道木聚糖降解酶可能作为激发子诱发植物抗病防御[105,106]。Adhikari等报道鞘氨醇单胞菌属既可以抵抗植物病害，又能促进植物生长[107]。下一步可通过这4个菌属与茶藨子葡萄座腔菌的对峙培养等研究，探索它们对山核桃干腐病的影响。甲基杆菌属、Luedemannella和粘细菌属均为发病山核桃树细菌优势属。目前有研究表明，甲29 健康与发病山核桃树体pH值、养分与微生物多样性差异基杆菌属可以利用丝氨酸途径同化甲醛[108]，植物对甲醛的吸收少则抗性弱[109]。IsmetAra等[110]发现Luedemannella菌属嗜葡萄糖、木糖、乳糖、半乳糖、甘露糖等，且会产生黑色素，这是不是山核桃干腐病伤口呈黑色的原因还需要进一步探索验证。朱斌发现粘细菌属会分解植物纤维素[111]，纤维含量减少，会导致植物抗病性减弱[112]。经RDA分析和蒙特卡罗检验可知，pH值、可溶性糖、还原糖均对树皮、木质部真菌优势属有显著影响（P<0.05）。附球菌属和喙枝孢属均为健康山核桃树真菌优势属。肖春萍等[113]报道附球菌属真菌被应用防治植物病害。姚广玉[114]发现，喙枝孢属内生真菌可以产生细胞松弛素类化合物，这些化合物有一定的细胞毒活性，增强植物抗病。下一步可通过这2个菌属与茶藨子葡萄座腔菌的对峙培养等研究，探索它们对山核桃干腐病的影响。德福霉属、Spizellomyces、茎点霉属和念珠菌属均为发病山核桃树真菌优势属。一些研究表明，德福霉属的种类有附生和营腐生的生活方式，有分离自植物叶斑的，德国苹果上分离的拟美洲德福霉D.pseudoamericana能够引起植物煤污病[115]。茎点霉属真菌可寄生多种植物，给林木、农作物、经济作物等造成叶斑、枝枯、茎枯、果腐等危害，影响植物的生长过程[116]。张耀辉报道生物多样性高的系统具有较强的恢复能力，有较强的生态系统的抗逆性[117]。赵莹研究根肿菌、寄主及根部内生微生物组交互作用发现在未显症油菜植株中微生物的种类和含量明显的高于显症植株中的含量，在未显症的油菜植株中分离获得两种木霉属真菌（ReTk1和ReTv2）对病原菌有显著的抑制作用，在未显症的植株上，检测到3个属的酵母菌，即Sporobolomyces、Leucosporidum和Sprodobous等属，存在可以用来控制病害的生防菌[118]。本论文结果表明健康树体具有生态平衡，具有较高的生物多样性，一旦被病原菌侵染后，病原菌的大量繁殖会形成生长优势，有些甚至产生毒素等抑制其他微生物的生长，导致了健康山核桃树皮细菌与真菌OTU数目显著高于发病山核桃树，树皮与木质部的Ace、Chao、Shannon和Simpson指数均显著高于发病山核桃树。综上所述，健康山核桃树能保持健康可能与山核桃树体内的主要菌群有关，而树体的pH值、养分又显著影响着细菌优势属，接下来需进一步探明理化性质、主要菌群等关键因子与山核桃树抗病性的关系，通过改善经营措施优化树体pH值、养分与微生物多样性，促进山核桃树健康生长，从而为山核桃干腐病的生态化防治提供借鉴，促进山核桃产业可持续发展。30 第五章创新与展望第五章创新与展望5.1创新点1.目前，国内外学者关于山核桃抗溃疡病机理、干腐病生物学特性、病害控制等方面的相关报道还比较少。而关于山核桃树体pH值、养分与微生物多样性的差异及相关性的研究，在国内外尚未见报道。2.当前针对山核桃干腐病的防治方法主要为物理方法的刮除病斑和化学方法的喷洒农药，本研究以提高树体健康与免疫力为着眼点，研究了健康与发病山核桃树皮、木质部pH值、养分与微生物多样性的差异，并分析了其相关性，为通过提高山核桃树体的抵抗力来防治山核桃干腐病提供了依据。这种植物病害防治的理念具有一定的创新性。5.2研究展望本论文研究了健康与发病山核桃树皮、木质部pH值、养分与微生物多样性的差异，并分析得到了显著影响山核桃树体细菌与真菌优势属的关键指标，但由于研究时间所限，以下工作有待于接下来进一步完成。1.本论文研究发现，鞘氨醇单胞菌属为健康山核桃树皮与木质部共同的优势细菌属，粘细菌属与甲基杆菌属为发病山核桃发病与未发病部位树皮、木质部共同的优势细菌属，接下来可进行该3种细菌属与山核桃干腐病病原菌茶藨子葡萄座腔菌对峙培养等研究，探索它们对山核桃干腐病的影响。2.开展健康与发病山核桃树体pH值、单宁、可溶性糖、还原糖和细菌、真菌多样性差异的内在机理研究，为山核桃干腐病的生态化综合防治提供理论依据。3.通过施肥、林下生草栽培等营林措施，提高树体pH值与可溶性糖含量，降低还原糖含量，以提高树体对山核桃干腐病的抗性。31 参考文献参考文献[1]李能章,彭远义.植物内生菌研究进展[J].生物技术,2004,14(2):69-71.[2]LEUCHTMANNA.Systematics,distribution,andhostspecificityofgrassendophytes[J].NaturalToxins,1993,1(3):150-62.[3]何劲,刘蕴哲,康冀川.植物内生菌及其在农业和医学上的用途[J].贵州农业科学,2006,34(3):113-115.[4]PETRINIO.Taxonomyofendophyticfungiofaerialplanttissues[J].MicrobiologyofthePhyllospere,1986,175-187.[5]何红,邱思鑫,胡方平,等.植物内生细菌生物学作用研究进展[J].微生物学杂志,2004,24(3):40-45.[6]HALLMANNJ,KLOEPPERJW,RODRGUEZKBANAR.ApplicationoftheScholanderpressurebombtostudiesonendophyticb[J].CanadianJournalofMicrobiology,1997,43(5):411-416.[7]陈丽梅,樊妙姬,李玲.甘蔗固氮内生菌--重氮营养醋杆菌的研究进展[J].微生物学通报,2000,27(1):63-66.[8]张集慧,郭顺星.兰科药用植物的5种内生真菌产生的植物激素[J].中国医学科学院学报,1999,21(6):460-465.[9]史应武,娄恺,李春.内生真菌对甜菜主要农艺性状及氮糖代谢关键酶活性的影响[J].作物学报,2009,35(5):946-951.[10]CHENC,BAUSKEEM,MUSSONG,etal.BiologicalControlofFusariumWiltonCottonbyUseofEndophyticBacteria[J].BiologicalControl,1995,5(1):83-91.[11]龙良鲲,肖崇刚,窦彦霞.防治番茄青枯病内生细菌的分离与筛选[J].中国蔬菜,2003,1(2):19-21.[12]KHARWARRN,GONDSK,KUMARA,etal.AcomparativestudyofendophyticandepiphyticfungalassociationwithleafofEucalyptuscitriodoraHook.,andtheirantimicrobialactivity[J].WorldJournalofMicrobiology&Biotechnology,2010,26(11):1941-1948.[13]ARNOLDAE,MEJALC,KYLLOD,etal.Fungalendophyteslimitpathogendamageinatropicaltree[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2003,100(26):15649-15654.[14]张丽娜.山茶叶部微生物区系与灰斑病发生关系的研究[D];四川农业大学,2009.[15]SANTAMARAJ,BAYMANP.Fungalepiphytesandendophytesofcoffeeleaves(Coffeaarabica)[J].MicrobialEcology,2005,50(1):1.[16]李世贵.两种木霉菌对黄瓜枯萎病菌生防作用及根际土壤微生物影响研究[D];中国农业科学院,2010.[17]石晶盈,陈维信,刘爱媛.植物内生菌及其防治植物病害的研究进展[J].生态学报,2006,26(7):2395-2401.[18]袁志林,章初龙,林福呈.植物与内生真菌互作的生理与分子机制研究进展[J].生态学报,2008,28(9):4430-4439.[19]马冠华,肖崇刚.烟草内生细菌种群动态研究[J].微生物学杂志,2004,24(4):7-11.[20]时涛,彭建华,刘先宝,等.橡胶树内生细菌多样性初探及拮抗菌株的筛选[J].中国森林病虫,2011,30(2):5-9.[21]MCINROYJA,KLOEPPERJW.Surveyofindigenousbacterialendophytesfromcotton32 参考文献andsweetcorn[J].Plant&Soil,1995,173(2):337-342.[22]MISKOAL,GERMIDAJJ.Taxonomicandfunctionaldiversityofpseudomonadsisolatedfromtherootsoffield-growncanola[J].FemsMicrobiologyEcology,2002,42(3):399-407.[23]GERMIDAJ,SICILIANOS.Taxonomicdiversityofbacteriaassociatedwiththerootsofmodern,recentandancientwheatcultivars[J].Biology&FertilityofSoils,2001,33(5):410-415.[24]KUKLINSKYSOBRALJ,ARAJOWL,MENDESR,etal.Isolationandcharacterizationofsoybean-associatedbacteriaandtheirpotentialforplantgrowthpromotion[J].EnvironmentalMicrobiology,2004,6(12):1244–1251.[25]TIANXL,CAOLX,TANHM,etal.Studyonthecommunitiesofendophyticfungiandendophyticactinomycetesfromriceandtheirantipathogenicactivitiesinvitro[J].WorldJournalofMicrobiology&Biotechnology,2004,20(3):303-309.[26]PEREIRAJO,AZEVEDOJL,PETRINIO.EndophyticFungiofStylosanthes:AFirstReport[J].Mycologia,1993,85(3):362-364.[27]梁宇,高玉葆.内生真菌对植物生长发育及抗逆性的影响[J].植物学报,2000,17(1):52-59.[28]TAYLORJE,HYDEKD,JONESEBG.TheBiogeographicalDistributionofMicrofungiAssociatedwithThreePalmSpeciesfromTropicalandTemperateHabitats[J].JournalofBiogeography,2000,27(2):297-310.[29]PROMPUTTHAI,HYDEKD,MCKENZIEEHC,etal.Canleafdegradingenzymesprovideevidencethatendophyticfungibecomingsaprobes?[J].FungalDiversity,2010,41(1):89-99.[30]PROMPUTTHAI,LUMYONGS,DHANASEKARANV,etal.Aphylogeneticevaluationofwhetherendophytesbecomesaprotrophsathostsenescence[J].MicrobialEcology,2007,53(4):579-590.[31]FUENTESRAMREZLE,CABALLEROMELLADOJ,SEPLVEDAJ,etal.ColonizationofsugarcanebyAcetobacterdiazotrophicusisinhibitedbyhighN-fertilization[J].FemsMicrobiologyEcology,2010,29(2):117-128.[32]MANOH,TANAKAF,NAKAMURAC,etal.CulturableEndophyticBacterialFloraoftheMaturingLeavesandRootsofRicePlants(Oryzasativa)CultivatedinaPaddyField[J].Microbes&Environments,2007,22(22):175-185.[33]TANZ,HUREKT,REINHOLDHUREKB.EffectofN-fertilization,plantgenotypeandenvironmentalconditionsonnifHgenepoolsinrootsofrice[J].EnvironmentalMicrobiology,2003,5(10):1009-1015.[34]SEGHERSD,WITTEBOLLEL,TOPEM,etal.ImpactofAgriculturalPracticesontheZeamaysL.EndophyticCommunity[J].Applenvironmicrobiol,2004,70(3):1475-1482.[35]HALLMANNJ,QUADTHALLMANNA,MAHAFFEEWF,etal.Bacterialendophytesinagriculturalcrops[J].CanadianJournalofMicrobiology,1997,43(10):895-914.[36]MALONEYPE,BRUGGENAHCV,HUS.BacterialCommunityStructureinRelationtotheCarbonEnvironmentsinLettuceandTomatoRhizospheresandinBulkSoil[J].MicrobialEcology,1997,34(2):109-117.[37]HUS,BRUGGENAHCV.MicrobialDynamicsAssociatedwithMultiphasicDecompositionof14C-LabeledCelluloseinSoil[J].MicrobialEcology,1997,33(2):134-143.[38]GARLANDJL,MILLSAL.Classificationandcharacterizationofheterotrophicmicrobialcommunitiesonthebasisofpatternsofcommunity-levelsole-carbon-sourceutilization[J].Appl33 参考文献EnvironMicrobiol,1991,57(8):2351-2359.[39]CAMPBELLCD,GRAYSTONSJ,HIRSTDJ.Useofrhizospherecarbonsourcesinsolecarbonsourceteststodiscriminatesoilmicrobialcommunities[J].JournalofMicrobiologicalMethods,1997,30(1):33-41.[40]GARLANDJL.AnalyticalapproachestothecharacterizationofsamplesofmicrobialcommunitiesusingpatternsofpotentialCsourceutilization[J].SoilBiology&Biochemistry,1996,28(2):213-221.[41]SMALLAK,WACHTENDORFU,HEUERH,etal.AnalysisofBIOLOGGNSubstrateUtilizationPatternsbyMicrobialCommunities[J].ApplEnvironMicrobiol,1998,64(4):1220-1225.[42]PANKHURSTCE,YUS,HAWKEBG,etal.CapacityoffattyacidprofilesandsubstrateutilizationpatternstodescribedifferencesinsoilmicrobialcommunitiesassociatedwithincreasedsalinityoralkalinityatthreelocationsinSouthAustralia[J].Biology&FertilityofSoils,2001,33(3):204-217.[43]IBEKWEAOM,KENNEDYAC.Phospholipidfattyacidpro¢lesandcarbonutilizationpatternsforanalysisofmicrobialcommunitystructureunder¢eldandgreenhouseconditions[J].[44]张超蕾,周瑾洁,姜莉莉,等.微生物组学及其应用研究进展[J].微生物学杂志,2017,37(4):74-81.[45]白洋,钱景美,周俭民,等.农作物微生物组:跨越转化临界点的现代生物技术[J].中国科学院院刊,2017,32(3):260-265.[46]雷振河.采用高通量测序技术分析清香型白酒酿造微生物[J].食品与发酵工业,2015,41(9):164-167.[47]吴晓青,周方园,张新建.微生物组学对植物病害微生物防治研究的启示[J].微生物学报,2017,57(6):867-875.[48]CHOWDHURYSP,DIETELK,RNDLERM,etal.EffectsofBacillusamyloliquefaciensFZB42onLettuceGrowthandHealthunderPathogenPressureandItsImpactontheRhizosphereBacterialCommunity[J].PlosOne,2013,8(7):e68818.[49]SCHERWINSKIK,WOLFA,BERGG.AssessingtheRiskofBiologicalControlAgentsontheIndigenousMicrobialCommunities:SerratiaplymuthicaHRO-C48andStreptomycessp.HRO-71asModelBacteria[J].Biocontrol,2007,52(1):87-112.[50]YIND,WANGN,XIAF,etal.ImpactofbiocontrolagentsPseudomonasfluorescens2P24andCPF10onthebacterialcommunityinthecucumberrhizosphere[J].EuropeanJournalofSoilBiology,2013,59(11):36-42.[51]SCHREITERS,SANDMANNM,SMALLAK,etal.Soiltypedependentrhizospherecompetenceandbiocontroloftwobacterialinoculantstrainsandtheireffectsontherhizospheremicrobialcommunityoffield-grownlettuce[J].PlosOne,2014,9(8):e103726.[52]MASSARTS,MARTINEZ-MEDINAM,JIJAKLIMH.Biologicalcontrolinthemicrobiomeera:Challengesandopportunities[J].BiologicalControl,2015,89,98-108.[53]ERLACHERA,CARDINALEM,GROSCHR,etal.TheimpactofthepathogenRhizoctoniasolanianditsbeneficialcounterpartBacillusamyloliquefaciensontheindigenouslettucemicrobiome[J].FrontMicrobiol,2014,5(175):175.[54]BAIY,M¼LLERDB,SRINIVASG,etal.FunctionaloverlapoftheArabidopsisleafandrootmicrobiota[J].Nature,2015,528(7582):364-369.[55]巨云为,赵盼盼,黄麟,等.薄壳山核桃主要病害发生规律及防控[J].南京林业大学学34 参考文献报(自然科学版),2015,39(4):31-36.[56]章顺来.警惕山核桃干腐病加强疫情源头管理[J].浙江林业,2007,(6):30.[57]张璐璐.山核桃干腐病流行规律及田间防治的研究[D];浙江农林大学,2012.[58]张传清,章祖平,孙品雷,等.山核桃干腐病菌对7种杀菌剂的敏感性比较及其对苯醚甲环唑敏感基线的建立[J].农药学学报,2011,13(1):84-86.[59]彭丽.山核桃溃疡病的发生与防治[J].现代农业科技,2010,(6):176.[60]朱诚棋,周乐,苏秀,等.山核桃内生真菌对山核桃干腐病抑制作用初步研究[J].浙江林业科技,2015,35(2):58-61.[61]田甜,沈振明,徐秋芳,等.土壤中山核桃干腐病抑制菌的筛选和鉴定[J].浙江农林大学学报,2012,29(1):58-64.[62]杨淑贞,丁立忠,楼君芳,等.山核桃干腐病发生发展规律及防治技术[J].浙江农林大学学报,2009,26(2):228-232.[63]郑宏兵.山核桃抗溃疡病机理及其相关因素的研究[D];安徽农业大学,2004.[64]王玉嬿,李海燕,舒朝然,等.几种松树松材线虫病木和健木pH值差异的研究[J].植物病理学报,2001,31(4):342-348.[65]PRUSKYD,MCEVOYJL,LEVERENTZB,etal.LocalmodulationofhostpHbyColletotrichumspeciesasamechanismtoincreasevirulence[J].MolPlantMicrobeInteract,2001,14(9):1105-1113.[66]赵越,吴玉霞,何天明.基于质外体pH和铁素分析的‘库尔勒香梨’黄化症诊断研究[J].果树学报,2016,(2):210-216.[67]孔利.新疆林木腐烂病菌主要种Cytosporasacculus致病力分化机理研究[D];石河子大学,2015.[68]庞继先.火碱治果树腐烂病[J].农家参谋,1998,(2):18.[69]刘红宇,陈超燕,刘晓莉,等.樟树黄化病与树皮电阻值、含水量关系的研究[J].安徽农业科学,2006,34(12):2802.[70]赵伟,乌凤章,孙美清,等.松树枝枯病与枝条含水量关系的研究[J].中国森林病虫,2002,21(2):19-21.[71]陈策,刘福昌,邢祖芳,等.苹果树对腐烂病抗病因素初探:树皮愈伤能力与抗扩展关系的研究[J].植物病理学报,1982,12(1):49-55.[72]李春江,项存悌,毛得奖,等.诱导剂对杨树细菌溃疡病寄主体内过氧化物酶活性的影响[J].东北林业大学学报,2000,28(6):45-47.[73]吴玉柱,季延平,刘殷,等.山东杨树主要品种对溃疡病抗性的研究[J].中国森林病虫,2000,19(4):10-13.[74]SCHULTZJC,BALDWINIT.Oakleafqualitydeclinesinresponsetodefoliationbygypsymothlarvae[J].Science,1982,217(4555):149-151.[75]贾之春.外源抗病基因和单宁代谢合成关键酶基因LAR3在毛白杨中协同抗病机理研究[D];西南大学,2011.[76]MIRANDAM,RALPHSG,MELLWAYR,etal.Thetranscriptionalresponseofhybridpoplar(PopulustrichocarpaxP.deltoides)toinfectionbyMelampsoramedusaeleafrustinvolvesinductionofflavonoidpathwaygenesleadingtotheaccumulationofproanthocyanidins[J].MolPlantMicrobeInteract,2007,20(7):816-831.[77]董玉峰,姜岳忠,乔玉玲,等.杨树无性系树皮生理生化特性与溃疡病抗性间的关联[J].东北林业大学学报,2011,39(5):47-49.[78]林雪坚,吴光金,黄生林,等.板栗不同品种抗疫病的研究[J].经济林研究,1993,s(1):35 参考文献313-317.[79]BUTELLIE,TITTAL,GIORGIOM,etal.Enrichmentoftomatofruitwithhealth-promotinganthocyaninsbyexpressionofselecttranscriptionfactors[J].NatureBiotechnology,2008,26(11):1301-1308.[80]ZHANGY,BUTELLIE,DESTEFANOR,etal.AnthocyaninsDoubletheShelfLifeofTomatoesbyDelayingOverripeningandReducingSusceptibilitytoGrayMold[J].CurrentBiology,2013,23(12):1094-1100.[81]马玲,问荣荣,邱本军,等.黄芪多糖提高小叶杨抗病性[J].东北林业大学学报,2016,44(9):82-85.[82]梁军,王媛,贾秀贞,等.溃疡病菌对杨树愈伤组织细胞膜透性、可溶性糖及MDA含量的影响[J].林业科学,2008,44(8):72-77.[83]李佐同,靳学慧,张亚玲,等.水稻幼苗可溶性糖及可溶性蛋白含量与抗瘟性的关系[J].北方水稻,2009,39(4):6-9.[84]周博如,李永镐,刘太国,等.不同抗性的大豆品种接种大豆细菌性疫病菌后可溶性蛋白、总糖含量变化的研究[J].大豆科学,2000,(2):111-114.[85]万贤崇,汪安琳.杨树糖代谢与褐斑病发生的关系[J].南京林业大学学报:自然科学版,1995,(1):37-40.[86]李梅婷.香蕉枯萎病菌毒素在香蕉抗病品种选育和抗病性鉴定中的应用[D];福建农林大学,2010.[87]FABIA,GRAZIANIV,ANSELMIN,etal.Newlyrecognizedbacteriainvolvedintrunkscabandcankerofwhiteandhybridpoplars[J].ForestPathology,2008,38(5):356-370.[88]李永.健康与染溃疡病107杨、中林46杨树皮真菌和细菌群落研究[D];北京林业大学,2013.[89]李寒娥.城市行道树pH值和电导率与交通环境[J].生态科学,2000,19(2):80-83.[90]张治安.植物生理学实验技术[M].吉林大学出版社,2008.[91]陈建勋,王晓峰.植物生理学实验指导[M].华南理工大学出版社,2015.[92]YUY,LEEC,KIMJ,etal.Group-specificprimerandprobesetstodetectmethanogeniccommunitiesusingquantitativereal-timepolymerasechainreaction[J].Biotechnology&Bioengineering,2010,89(6):670-679.[93]POLLEJE,STRUWEL,JINE.IdentificationandcharacterizationofanewstrainoftheunicellulargreenalgaDunaliellasalina(Teod.)fromKorea[J].JournalofMicrobiology&Biotechnology,2008,18(5):821.[94]CAPORASOJG,KUCZYNSKIJ,STOMBAUGHJ,etal.QIIMEallowsanalysisofhigh-throughputcommunitysequencingdata[J].2010,7(5):335-336.[95]MAGOT,SALZBERGSL.FLASH:fastlengthadjustmentofshortreadstoimprovegenomeassemblies[J].Bioinformatics,2011,27(21):2957-2963.[96]EDGARRC.UPARSE:highlyaccurateOTUsequencesfrommicrobialampliconreads[J].NatureMethods,2013,10(10):996-998.[97]王月霞.浙江省主要亚热带森林群落类型的物种和谱系α和β多样性研究[D];浙江大学,2016.[98]傅锦婷.山核桃干腐病的生物学特性与控制研究[D];浙江农林大学,2014.[99]侯天侦,陈聚恒.新疆杨树干破腐问题的结构及生理特性的研究[J].林业科学,1992,28(5):390-396.[100]李雪莹,王文杰,武永刚.植物单宁的生理作用及经济价值[J].西部林业科学,2005,36 参考文献34(1):22-24.[101]李海燕,刘惕若,甄艳.辣椒品种对疫病的抗性研究——氨酸、丙二醛与可溶性糖在抗病中的作用[J].中国农学通报,2006,22(11):315-317.[102]秦彦杰.黄檗主要药用成分的分布规律研究[D];东北林业大学,2005.[103]JURKEVITCHE.TheGenusBdellovibrio[J].2006,2000:3401-3412.[104]冯静,施庆珊,欧阳友生,等.醋酸菌多相分类研究进展[J].微生物学通报,2009,32(9):1390-1396.[105]GANHY,GANHM,TARASCOAM,etal.Whole-GenomeSequencesofFiveOligotrophicBacteriaIsolatedfromDeepwithinLechuguillaCave,NewMexico[J].GenomeAnnouncements,2014,2(6):2-14.[106]赵联正,谢占玲,赵朋.一种新的镰刀菌Q7-31木聚糖酶Xyn9的分离纯化鉴定及酶学特性[J].江苏农业科学,2015,43(5):42-45.[107]ADHIKARITB,JOSEPHCM,YANGG,etal.Evaluationofbacteriaisolatedfromriceforplantgrowthpromotionandbiologicalcontrolofseedlingdiseaseofrice[J].CanadianJournalofMicrobiology,2001,47(10):916-924.[108]欧倩.丝氨酸生产菌MB200的筛选鉴定及丝氨酸羧甲基转移酶基因的研究[D];广西大学,2006.[109]吴平.几种植物对室内污染气体甲醛的净化能力研究[D];南京林业大学,2006.[110]ARAI,KUDOT.Luedemannellagen.nov.,anewmemberofthefamilyMicromonosporaceaeanddescriptionofLuedemannellahelvatasp.nov.andLuedemannellaflavasp.nov[J].JournalofGeneral&AppliedMicrobiology,2007,53(1):39-51.[111]朱斌.粘细菌NUST03的生物学特性和吸附重金属性质及其胞外活性物质的研究[D];南京理工大学,2003.[112]孙丽.水稻蔗糖转化酶GIF1调控抗病性的机制研究[D];浙江大学,2012.[113]肖春萍,杨利民,韩梅,等.人参主要病原菌生防真菌的筛选及鉴定[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2016,44(7):181-192.[114]姚广玉.水仙内生真菌的分离纯化及其次生代谢产物生物活性研究[D];兰州理工大学,2011.[115]李文欢.海南、陕西等省煤污病病原种类多样性研究[D];西北农林科技大学,2013.[116]熊婉.核桃茎点霉黑斑病病原学及防治技术研究[D];华中农业大学,2013.[117]张耀辉.生物多样性及生态平衡原理的探讨[J].农业环境科学学报,1998,17(5):235-236.[118]赵莹.根肿菌、寄主及根部内生微生物组交互作用研究[D];华中农业大学,2017.37 个人简介个人简介林马水，男，1991年3月生，浙江省台州人，共青团员。2015年毕业于浙江农林大学风景园林专业，获工学学士。2015年9月入学就读于浙江农林大学森林保护学专业，攻读森林微生物方向硕士研究生。攻读硕士期间参与的科研项目：1.山核桃干腐病生态化综合防治技术研究与示范推广（2015C32078），浙江省科技厅公益技术研究农业项目；2.山核桃干腐病灾变机理与综合防治技术研究（20172015A01），杭州市社会发展科研主动设计项目；发表论文：1.不同经营模式山核桃林地土壤pH值、养分与细菌多样性差异，生物多样性（共同一作，已录用）2.巨大芽孢杆菌LY02对黑麦草修复重金属污染土壤的影响.水土保持学报，2017，31(5)：340-344（第七作者，已发表）3.健康与发病山核桃树体pH值、养分与细菌多样性差异（第一作者，已投稿）38 致谢致谢时光荏苒，岁月似箭，转眼到了研究生毕业的时间，三年研究生学习生涯匆匆而过，如今我也是一个将要奔三的人了。三年充实而忙碌的学习生活，让我觉得很值得。每一天早晨踏入实验室按着之前实验构思和设计做着实验，有新奇的发现，内心欣喜，愉悦能延续一星期或是更久，但是有时也会碰到实验中的坎坷，一次次地重复，我的耐心也逐渐地得到锻炼。三年里，还有不辞辛劳的老师、热心助人的师兄师姐和师弟师妹的陪伴，让我觉得温暖，幸福，这些点点滴滴汇集成我的研究生学习的回忆，一段值得让我深深纪念和满心感恩的研究生学习生涯。林海萍教授是我最应感谢的人。林海萍教授是一位对治学认真负责，态度严谨，待人诚恳，关爱学生的好老师。在她细心引导，谆谆教诲下，我努力蜕变成一个对科研和生活都怀有热情洋溢、积极向上的硕士研究生。每天林老师早出晚归，全身心地投入科研教学中，这种对科研教学的奉献精神让我明白科研道路艰辛，更需要永不言弃的精神、坚韧不拔的毅力。从我顺利进入论文开题报告到中期考核与她诲而不倦的指导密切相关，希望在她指导下，最后的毕业论文盲审和论文答辩能顺利通过。在科研立题上，林老师细心构思和深刻剖析，让我明白我研究目的，逐渐懂得生态化防治概念，学习生物防治方面的相关知识。当我处于实验的瓶颈期，林老师会给出建议和意见，鼓励我，给我打气。山穷水复疑无路，柳暗花明又一村，只要能重拾信心，端正心态，才有可能等到豁然开朗、攻克难关的时候，实验进度才能稳步前行。在此，我向林老师致以崇高的敬意、诚挚的谢意。感谢森林保护学科所有老师在实验和论文撰写上对我帮助与指导。在此，向各位森林保护学科老师致以我最真挚的感谢。感谢张爽师姐、王彦师兄、徐咪师姐、张璞瑜师姐、朱宁师姐、王秋月师姐、刘欢师姐、娄均翼师兄、蒋达青师姐等在实验过程中的指导；感谢张媚、赵树民等同门在实验中默契合作；感谢陈飞龙、孙付超室友三年来的陪伴与照顾；感谢王冰璇师妹、樊炎迪师妹、汪石莹师妹和本科生柴莺飞、王涛、毛浥雯、冯显邦、王哲对我实验的大力协助。感谢我敬爱的父母，一直在我背后默默付出、支持我在考学路上前行，还记得小时候，父母在生活中身体力行，让我领会到为人勤劳节俭、谦和低调的重要性，以实际行动将这种品质牢牢扎根在我心里，我定将在日后的生活和工作中逐渐展现。39