急、慢性运动对2型糖尿病雄性大鼠胰腺NPY及其Y1受体蛋白表达的影响

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分类号密级学号20090403020045学位论文急、慢性运动对2型糖尿病雄性大鼠胰腺NPY及其Y1受体蛋白表达的影响研究生姓名：郑树荣指导教师：常波教授申请学位级别：硕士申请学位种类：□教育学□理学□医学□体育学□全日制学术型硕士学位□全日制应用型硕士学位申请学位类别：□在职专业硕士学位□同等学力专业（领域）运动人体科学专业：方向运动疲劳的恢复与身体机能的评定论文提交日期：2012年3月9日论文答辩日期：2012年5月19日沈阳体育学院2012年6月 ADissertationinPhysicalEducationEffectofAcuteExerciseandChronicExerciseonNPYandNPY-Y1ReceptorinPancreasofElderMaleRatsZhengShurongSupervisorbyProfessorChangBoShenyangSportUniversityJune2012 独创性声明本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下独立完成的。论文中取得的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：日期：2012年月学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解沈阳体育学院有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人同意沈阳体育学院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。作者和导师同意网上交流的时间为作者获得学位后：半年□一年□两年□学位论文作者签名：导师签名：签字日期：签字日期： 摘要背景：世界卫生组织估计，全球的糖尿病患者呈上升趋势，而且有低龄化发病趋势。2型糖尿病（T2DM）患者目前占90%，胰腺NPY对T2DM发病有一定的作用。关于糖尿病的研究主要集中于下丘脑和血浆等组织中的NPY，运动对糖尿病大鼠胰腺NPY很少，运动对Y1受体影响的研究还未见报道。目的：研究急慢性运动对T2DM大鼠胰腺NPY及其Y1受体蛋白表达的影响。它将为揭示运动干预改善T2DMNPY抵抗机制提供实验依据，也为临床制定T2DM运动干预方案提供理论依据。研究方法：11月龄SD雄性大鼠52只，随机取出12只作为正常对照组，喂养基础饲料。其余大鼠作为高脂膳食组，高脂膳食8周之后进行肥胖造模。造模成功后，注射STZ(30mg/kg体重)诱发大鼠患得T2DM。T2DM造模成功后分成三组：即糖尿病对照组（N=13）、慢性运动组（N=13）和急性运动组（N=14）。慢性运动组大鼠游泳训练，运动8周，6天/周，末次运动结束后36--48小时取材；急性运动组90min间歇游泳运动，运动后12--16小时取材。密封置于-75℃深冻冰箱储存备用。采用分光光度法测血糖、血脂，western-blot法测胰腺NPY和NPY-Y1受体。结果显示：1.与正常对照组相比，糖尿病组血糖、血清胰岛素、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、胰腺NPY显著升高（P<0.01）,高密度脂蛋白、胰腺NPY-Y1受体显著降低（P<0.01）。2.与糖尿病对照组相比，慢性运动组的血清胰岛素、血糖、胆固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯、胰腺NPY蛋白表达显著下降（p<0.01），高密度脂蛋白、胰腺NPY-Y1受体蛋白表达显著上升（p<0.01）；与糖尿病对照组相比，急性运动组血糖、血清胰岛素、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、NPY显著下降（p<0.05），高密度脂蛋白、NPY-Y1受体显著升高（p<0.05）。研究结论：1.高脂膳食结合小剂量诱导的T2DM产生的胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱可能与胰腺的NPY抵抗有关。2.急慢性运动均可降低胰腺NPY，上调NPY-Y1受体的蛋白表达，改善胰腺NPY抵抗，提高胰岛素的敏感性，缓解糖脂代谢紊乱，且急性运动的作用效果可持续16小时。建议：急性运动16小时后对T2DM大鼠胰腺NPY及其受体的影响还有待于进一步研究。关键词：NPY；NPY-Y1受体；T2DM；急性运动；慢性运动Ⅰ AbstractBackground:WorldHealthOrganizationestimatedthatthenumberofdiabetespatientsaroundtheworldwasincreasingandtheywereyoungerthanbefore.Recently,themajorityistheT2DMpatient,onwhichNPYinpancreashasacertaineffect.TheresearchondiabetesisfocusedonNPYinthetissuesofthehypothalamusandplasma,buttherewerefewstudiesontheeffectsofacuteandchronicexerciseonNPYandnoreportsaboutY1receptorproteinexpressioninpancreasofT2DMelderrats.Objective:ToresearchtheeffectsofacuteandchronicexerciseonT2DMoldagedratpancreas,NPYandY1receptorproteinexpression.ItwillrevealtheexerciseinterventioninimprovingT2DMpancreaticNPYresistancemechanismandprovideatheoreticalbasisfortheclinicaldevelopmentofT2DMexerciseinterventionschedule.Methods:12ratsweredividedrandomlyandfedwithbasaldiet.Theyweretakenasthenormalcontrolgroupfromthe5211-month-oldmaleSDrats.Theother40ratswerefedwithhighfatdiet,whichweretakenasHigh-fatdietgroup.ThemodelofobesitywaspreparedafterHigh-fatdietfor8weeks.ThentheratsweredividedintothreegroupsafterSTZ(35mg/kgbodyweight)induction.Theywerediabeticcontrolgroup(n=12),acuteexercisegroup(n=14),andchronicexercisegroup(n=13).Results:①Seruminsulin,glucoseandtriglyceridesweredecreasedsignificantly(p<0.01)andHDL,NPY-Y1receptorproteinexpressionwereincreasedsignificantly(p<0.01)intheacuteexerciseandchronicexercisegroupscomparedwiththenormallycontrolledgroup.②Seruminsulin,glucose,triglycerides,LDL,andNPYproteinexpressioninpancreasweredecreasedsignificantly(p<0.01),HDLandNPY-Y1receptorproteinexpressionwereincreasedclearly(p<0.05)intheacuteexerciseandchronicexercisegroupscomparedwiththediabeticgroup.Conclusions:①T2DMcanproduceinsulinresistanceandglucoseandlipidmetabolismdisorder，whichmaybeassociatedwithpancreaticNPYresistance.②AcuteexerciseandchronicexercisecanreduceNPYproteinexpressioninpancreasandimproveitssensitivity,up-regulationNPY-Y1receptorproteinexpressionandNPYsensibilityNPYresistandtheeffectsofacuteexercisecanlastforabout16hours.Advices:Itneedsresearchfurtheraboutacuteexerciseafter16hoursofT2DMratpancreaticNPYanditsreceptorsinfluence.Keywords:NPY;NPY-Y1Receptor；T2DM;acuteexercise;chronicexercise.II 目录摘要..........................................................IAbstract........................................................I1前言...........................................................11.1选题意义..............................................................11.2论文创新点............................................................21.3预期结果及意义........................................................22研究方法.....................................................32.1研究思路..............................................................32.2研究对象..............................................................32.3研究方法..............................................................32.3.1文献资料法........................................................32.3.2动物实验法........................................................32.3.3数理统计法........................................................73研究结果.......................................................83.1肥胖造模和糖尿病造模情况..............................................83.2各组大鼠胆固醇、甘油三酯、高低密度脂蛋白的变化情况....................93.3各组大鼠胰腺NPY及其Y1受体的变化....................................104分析与讨论...................................................1114.1急、慢性运动对T2DM大鼠血糖、胰岛素水平的影响.......................1114.2急、慢性运动对T2DM大鼠血脂水平的影响................................134.3T2DM大鼠胰腺NPY的变化情况..........................................144.4急、慢性运动对T2DM大鼠胰腺NPY的影响................................164.5T2DM大鼠NPY-Y1受体的变化情况.......................................174.6急、慢性运动对T2DM大鼠胰腺NPY-Y1受体的影响.........................185结论与建议...................................................195.1结论..................................................................195.2建议..................................................................19参考文献......................................................190III 致谢........................................................233作者简介......................................................244攻读学位期间的学术活动情况....................................255IV 1前言1.1选题意义糖尿病是一种常见的内分泌系统代谢障碍性疾病。据世界卫生组织报道，全世界现已有3.46亿人患有糖尿病，其中T2DM患者占90%。地球上每10秒就有一位糖尿病患者因并发症而死亡，同时在这10秒内又会新产生2例糖尿病患者。可见糖尿病发展速度之快，给人类带来的危害之大。如何预防和治疗T2DM就成了当今医务工作者和科研工作者的攻关课题。目前预防和治疗的方法很多，运动疗法是其治疗手段之一。糖尿病分为1型糖尿病（T1DM）和2型糖尿病（T2DM）。糖尿病患者中，T2DM的患者比例较大，治疗T2DM的方法很多，其中，运动对T2DM的改善作用，在医学界已经引起了广泛重视，临床上已经有所应用。T2DM发病原因复杂，病理机制仍有很多未知，肥胖是T2DM发病诱因之一。肥胖者的胰岛素受体数目减少，受体对胰岛素敏感性降低，胰岛素活性下降，分泌增多，从而出现胰岛素抵抗和高胰岛素血症，当β细胞不能够代偿胰岛素抵抗时，就会出现高血糖，长期的高血糖会出现糖耐量下降，最后发展为T2DM。另外，肥胖代谢调控因子—神经肽Y（NPY），是多肽类神经递质，它通过作用于中枢神经及外周组织相关细胞膜上的不同NPY受体，参与或促进对机体多种生理功能的调节。NPY可通过作用于脂肪前体细胞，促使其①分化形成新的脂肪细胞。NPY受体蛋白为单体蛋白，负责接受NPY等其它配体的刺激和细胞内的信号传送，受体与NPY的结合是靠离子吸附作用。其细胞质部分可以与三聚体G②蛋白相互作用，进而通过G蛋白向下传递信号。NPY分布于动物的中枢及周围神经组织、心血管系统、胰腺、心脏等组织和器官中。糖尿病患者的胰岛素抵抗程度直接影响外周血NPY的水平。不同组织器官中的NPY生物学功能不同。下丘脑中的NPY可作为一种较强的促食欲因子，增加食欲和采食量，促进消化，加强同化作用，在肥胖的发生和发展的过程中起着重要作用，下丘脑NPY抑制胰岛素分泌；脂肪组织中，NPY刺激脂肪细胞的血管发生增殖和分化；而胰腺中NPY抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌。此外，下丘脑和胰腺中NPY基因表达也有差别。傅茂等发现STZ糖尿病雌性大鼠胰腺中NPY含量及其mRNA表达在下丘脑NPY下降时反而升高，表明NPY在胰岛内有其局部作用机制。胰腺由外分泌腺和内分泌腺构成。外分泌腺分泌胰液，有消化蛋白质、脂肪和糖的作用。内分泌腺由胰岛组成，胰岛β细胞分泌胰岛素。胰岛素功能是促进骨骼肌和其它组织从血中摄取葡萄糖，加强组织中糖原和脂肪的再合成。胰岛素分泌相对不足、胰岛素抵抗①丁克祥等.人神经肽Y及其受体对脂肪生成影响的研究[J].国际老年医学杂志.2010(3):61-62.②丁克祥等.肥胖代谢调控因子—-人神经肽Y及受体生物学特性的分子水平研究[J].国际老年医学杂志2010(1):13-14.11 以及胰岛素敏感性下降在T2DM的发病机制中都起到重要的作用。运动对于改善T2DM的具有一定的积极作用，张缨研究发现，长期有氧运动后下丘脑NPY蛋白浓度、NPY基因表达量，与糖尿病对照组相比，糖尿病运动组虽未出现显著性差异，但都有下降趋势。长期有氧运动可以使糖尿病大鼠摄食量减少，食欲亢进减弱，改善糖尿病大鼠糖代谢紊乱，同时改善了能量代谢异常。适当的运动训练可以抑制NPY的分泌。运动影响NPY含量变化，其机制可能为：一是应激,运动作为应激因子,促使交感神经产生兴奋,交感神经递质的释放增加，刺激NPY释放增加；二是适应,当机体渐渐适应运动刺激时,因应激刺激产生的NPY含量增加幅度下降，导致NPY含量随即降低；三是当运动达到一定负荷和时间时,运动器官中血循逐渐减少,机体乳酸含量逐渐增多,与乳酸含量变化呈线性关系的另类神经肽--降钙素基因相关肽（ＣＧＲＰ）含量增加，ＣＧＲＰ是机体舒血管功能最强的物质,运动器官中血含量增加,同时血管扩张明显,从而抑①制了与其功能相反的缩血管物质NPY的释放,NPY含量减少。目前，对于NPY的研究集中在下丘脑、血液、脂肪等组织和器官中，胰腺中NPY阳性细胞分泌的NPY对T2DM作用的研究较少，而且结论不一，胰腺中NPY-Y1受体的研究还未见报道。根据NPY在下丘脑、血液、脂肪组织中的作用，推测NPY在胰腺中的作用可能是抑制胰岛素的分泌，T2DM产生NPY抵抗，运动可以使胰岛素抵抗和NPY抵抗得到改善，增强胰岛素NPY的敏感性，增强NPY与受体的结合率，从而改善T2DM症状。1.2论文创新点目前对于胰腺中的NPY研究较少，施加运动干预后对NPY影响的研究更少，运动对胰腺NPY-Y1受体的影响还未见报道。本实验的运动模型与前人的研究有所不同，采用了急性运动和慢性运动两种不同的运动形式，通过急性运动可观察糖尿病大鼠对运动的应激反应，通过慢性运动观察糖尿病大鼠对运动的适应反应。从而推测运动对胰腺NPY及NPY-Y1受体的作用，为揭示运动干预防治糖尿病的机制研究提供实验依据。1.3预期结果及意义1.推测慢性运动训练可改善因T2DM产生的糖、脂代谢紊乱，缓解胰岛素抵抗。2.慢性运动下调胰腺NPY上调其Y1受体的蛋白表达，提高其敏感性。该研究将为揭示运动干预改善T2DMNPY抵抗机制提供实验依据，也为临床制定T2DM运动干预方案提供实验依据。①李志宏,周振华等.运动训练对神经肽Y含量变化的影响及可能机制研究[J].体育世界学术.2009:85-86.2 2研究方法2.1研究思路基础膳食正常对照组111月龄SD（12只）雄性大鼠肥胖造模（52只）注射STZ造模T2DM肥胖组（40只）（40只）高脂膳食分糖尿病对照组2组分子生游泳训练8周15月龄物学实慢性运动组3取材验取材前一次性间歇游泳100min急性运动组42.2研究对象11月龄的SD雄性大鼠(中国人民解放军军事医学动物实验中心提供)，常规分笼喂养，分组为正常对照组（1，n=12），糖尿病对照组（2，n=13），慢性运动组（3，n=13），急性运动组（4，n=14）。为保持各组大鼠样本一致性，最后取材时各组均取8只。正常对照组基础饲料膳食，糖尿病组高脂膳食。饲养环境：室温（22±5）℃，湿度50%±10%，光照12h/d，标准啮齿类饲料饲养，自由饮食。每天定时通风，鼠笼每日消毒。2.3研究方法2.3.1文献资料法通过查阅大量有关文献，了解到这项研究的必要性和可行性，并且得知各项指标测量方法、意义、稳定性及与项目的关系。2.3.2动物实验法2.3.2.1实验仪器3 表1实验仪器名称及生产厂家仪器名称生产厂家MD-100半自动生化分析仪北京鸿澳医疗公司712E型可见分光光度仪AgilentTechnologiesAE200电子分析天平上海天平仪器厂GC-1200γ-放射免疫计数器中国科学技术大学科学实业总公司Bio-rad电泳和电转移装置美国BIO-RAD公司Epsonperfection1670扫描仪日本Epson公司低温高速离心机上海安亭科学仪器厂PRo200型精密组织匀浆器上海季诺科贸有限公司超声粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司2.3.2.2模型的制备11月龄的SD雄性大鼠52只，随机取出12只雄鼠作为正常对照组，喂养基础饲料。其余的全部高脂膳食组。基础饲料采用大鼠常用饲料配方，大麦粉20%、脱水菜（去除水分的包心菜）10%、豆粉20%、酵母1%、骨粉5%、玉米粉16%、麸皮16%、鱼粉10%、食盐2%。基础饲料总能量11.7kJ/g(蛋白质26.99%、脂肪19.8%、碳水化物53.21%)。高脂饲料：100g含猪油20g、鸡蛋10g、盐1.5g、糖9.5g，其余为基础饲料。高脂饲料总能量12.57kJ/g(蛋白质25.53%、脂肪41.48%、碳水化物32.99%)。所有饲料由沈阳前民饲料厂提供。经过8周的肥胖造模。当高脂膳食组体重超过正常对照组体重20％以上，即可确定肥①胖造模成功，然后注射STZ(35mg/kg体重)诱发T2DM。确定糖尿病造模成功的标准：血糖浓度为16.7mmol/L以上。剔除肥胖抵抗鼠后，给予高脂膳食组大鼠腹腔注射小剂量（35mg∕kg）的链脲佐菌素，注射后72小时尾部取血，连续3次测其空腹血糖平均值为17.2mmol∕L，高于16.7mmol∕L，说明糖尿病大鼠造模成功。造模成功后开始运动，采用递增运动负荷形式游泳运动8周，每周运动六天，休息一天，每天上午运动。T2DM造模成功后分成三组：即糖尿病对照组（N=13）、慢性运动组（N=13）、急性运动组（N=14）。对大鼠死亡率统计：正常对照组：0%，取材时剩12只；糖尿病对照组：8.83%，取材时剩11只；慢性运动组：38.4%，取材时剩8只；急性运动组：15.3%，取材时剩11只。大鼠死亡原因不清，可能与训练劳累，湿冷、年老和疾病等有关。取材时为保持各组样本数量一致性，使用抽签的方法，留下8只大鼠，去掉剩下的。所以最后每组各取8只。游泳运动方案见表2和表3。①李益明等.大黄提取片对高脂饮食诱导肥胖大鼠脂代谢及相关基因表达的影响[J].中华医学杂志.2006(9):302--3034 表2每周游泳时间与间隔时间第一周第二周第三周第四周第五周第六周第七周第八周游泳时间min10-3030-4040-5030*240*245*245*245*2间隔时间min0003040454545总游泳时间min10-3040506080909090表3急性运动游泳时间取材前36小时取材前12小时游泳时间min1045*2间隔时间min045总游泳时间min10902.3.2.3取材急性运动组运动结束后12--16h取材;慢性运动组末次运动结束后36--48h取材。取材时，腹腔注射20%戊巴比妥钠（7ml/kg体重）麻醉大鼠，麻醉后尾部取血，测空腹血糖。取眼球血制备血清留作测定血清胰岛素。继而腹腔注射胰岛素（3.3ul/kg大鼠体重），分别在注射后即刻，5min，15min，30min，测量尾部血糖水平。腹腔静脉取血用来制备血清（以测定生化指标）。血清制备方法：3500rpm离心10min后，使用移液枪将上层血清吸出，分离血清。取血后迅速分离出胰腺，保存于-80℃低温冰箱中，待测NPY及其Y1受体。2.3.2.4指标测定（1）血糖的测定：葡萄糖氧化酶法，用湖南湘仪血糖仪测定。（2）血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇测定：按照试剂盒说明操作，用半自动生化分析仪测定。（3）胰腺NPY与Y1受体蛋白含量测定：WesternBlot印迹分析方法。（4）血清胰岛素(眼球取血)的测定：放射免疫法①实验原理：采用竞争性放射免疫分析方法测定人血清或血浆中胰岛素的含量，待测样品、标准品中的胰岛素和125I-胰岛素与有限量的抗体竞争结合，125I-胰岛素一部分与抗体结合为复合物，另一部分游离。加入分离试剂，离心使复合物部分与游离部分分离，弃去上清液，测定沉淀的放射性计数，待测样品和标准品中的胰岛素含量与复合物的放射性强度呈负相关，用一系列不同浓度的胰岛素做标准，可获得标准曲线，从标准曲线上可查出样品中胰岛含量。②操作步骤：待试剂充分溶解，平衡至室温后，即按下表顺序加样及操作。5 表4胰岛素放免分析操作程序表（ul）T管非特异管（NSB）零标准管标准管待测管温育液200100INS标准100待测血样100125I-INS100100100100100INS抗体100100100充分摇匀，37℃温育2小时分离试剂500500500500充分摇匀室温放置15分钟，3500转/分离心20分钟，弃上清液，测各管放射性计数60秒③结果计算：由自动γ计数器预先编制程序，直接给出有关参数，标准曲线及样品浓度。2.3.2.5实验步骤：（1）试剂配置：①电泳缓冲液:Tris54g，硼酸27.5g，0.5MEDTA20ml(pH8.0)，加蒸溜水至1000ml。②上样缓冲液:0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油，6×缓冲液，4℃保存。③分离胶缓冲液(PH8.8):称18.17gTris用蒸馏水溶至80ml，用浓HCl调PH为8.8，再用蒸馏水定容至100ml。④浓缩胶缓冲液(PH6.8):称6.075gTris，蒸馏水溶解至80ml，浓HCl调PH至6.8，再定容至100ml。⑤凝胶:称30g30%丙烯酰胺(Acr)，0.8g0.8%甲叉双丙烯酰胺(Bis)加少许蒸馏水，热溶，溶解后，再用蒸馏水定容至100ml。⑥10%SDS:定容于100ml水中热溶。⑦转印电极液:Tris7.25，甘氨酸33.5，溶于2000ml水中，加甲醇600ml加水至3000ml左右，PH4。⑧TBS:4.84gTris，58.48gNaCl，溶于去离子水中，用HCl调PH至7.5。⑨封闭液:5g脱脂奶粉溶于100mlTBS中。⑩TTBS:0.5mlTween-20加到1LTBS中。⑪抗体buffer:1gBSA溶于100mlTTBS中。⑫2×StockSolution:45.76gNa2B4O7.10H2O，2.44gMgSO4.7H2O。⑬碱磷酶显色液:25mgO–dianidine，25mgβ-naphthylacidphosphate溶于50ml去离子水，加50ml2×StockSolution。6 ⑭：裂解缓冲液：20mmol/LTris-HCL，PH7.5，0.1mmol/LNa3VO4，25mmol/LNaF，25mmol/Lβ-glycerophosphate，2mmol/LEDTA，2mmol/LEGTA，1mmol/LDTT，1mmol/LPMSF，2μg/mlleptin。（2）蛋白的提取：取出液氮中冻存的标本，将组织块剪碎，加入冰预冷的细胞裂解液200μl，冰水浴中超声粉碎。4℃，12000rpm离心1小时，取上清。（3）蛋白浓度的测定：参考试剂盒说明，采用考马斯亮蓝法。标准蛋白为0.56mg/ml，加入考马斯亮蓝G250后室温静置10分钟，于595nm处、1cm光径，空白管调零，测各管吸光度值。（各标本蛋白含量(mg/ml)=OD标本/OD标准品×标准浓度。根据检测结果，用裂解缓冲液调整各标本至相同蛋白浓度。）（4）蛋白变性：取标本蛋白100μl，加入100μl样品缓冲液(2×)，煮沸5分钟。（5）配胶：①10%分离胶10ml:Acr3.2ml，Tris/HCL缓冲液(PH8.8)2.5ml，蒸馏水4ml，APS50μl，SDS100μl，TEMED20μl。②4%浓缩胶10ml:Acr1.4ml，Tris/HCL缓冲液(PH6.8)2.5ml，蒸馏水6ml，APS0.1ml，SDS0.1ml，TEMED20μl。灌注分离胶后，加注少量去离子水，室温下充分聚合后，倾去去离子水，滤纸吸干，灌注浓缩胶，聚合后，拔出梳子。各标本蛋白上样50μl。（6）电泳：上清用12%SDS-PAGE分离，BIO-RAD电泳板，双板条件为150V，30mA，时间为2小时。（7）转印：硝酸纤维素膜在转印液中平衡10分钟，然后胶在负极，膜在正极的原则，经2小时50V的转印后TTBS洗膜1次。（8）封闭：用含5％去脂奶粉的TTBS封闭4℃过夜。（9）一抗孵育：取出膜后，TBS洗膜5分钟×3次，加入一抗（1:400），室温下2小时。（10）二抗孵育:加入碱性磷酸酶标记的二抗（1：2000），室温下2小时。（11）清洗：TTBS洗5分钟×2次，TBS洗5分钟×1次。（12）显色：酶显法，显色剂显色。（13）WesternBlot结果量化分析：采用FlourChemV2.0凝胶成像分析软件（America）分析，记录每条蛋白电泳带的灰度值，进行定量分析。2.3.3数理统计法用SPSS16.0统计软件处理，数据用x±s表示，多组间用单因素方差分析。显著性水平：P<0.05,非常显著性水平：P<0.01。7 3研究结果3.1肥胖造模和糖尿病造模情况表5取材时各组体重、血清胰岛素、血糖情况（x±s）NWeight(g)Insulin（μu/mol）GLU(mmol/l)正常对照组8618.31±8.1918.58±5.806.08±0.96※※※※※※糖尿病对照组8787.37±52.3528.46±4.1917.20±1.42※※＃＃＃＃慢性运动组8765.78±21.3821.38±6.5514.16±1.65※※＃＃急性运动组8780.08±48.4919.68±6.1915.20±1.90注:与正常对照组相比：※※：P﹤0.01，※：P﹤0.05；与糖尿病对照组相比：＃＃：P﹤0.01，＃：P﹤0.05表5所示，与正常对照组大鼠相比，糖尿病模型各组在分组时体重无显著差异（P>0.05）。经8周高脂膳食，糖尿病模型各组大鼠在注射STZ前体重均显著高于正常对照组大鼠（P﹤0.01），且体重已超过正常对照组的20%，达到肥胖评价标准。8周后，与正常对照组相比，糖尿病组、慢性运动组、急性运动组大鼠体重均显著升高（P﹤0.01）；与糖尿病对照组相比，慢性运动组体重略有下降，但无显著差异（P>0.05）。表5所示，与正常对照组相比，糖尿病组胰岛素、血糖显著升高（P<0.01）；与糖尿病组相比，慢性运动组胰岛素、血糖显著降低（P<0.01）、急性运动组血清胰岛素、血糖显著降低（P<0.05）；表6各组大鼠胰岛素耐受性试验血糖值变化情况（x±s）组别即刻(mmol/L)5min(mmol/L)15min(mmol/L)30min(mmol/L)正常对照组6.08±0.965.71±0.885.20±0.474.43±0.85糖尿病对照组17.20±1.4217.1±3.5216.20±3.015.28±3.11慢性运动组14.16±1.6514.3±4.5513.42±5.2210.77±3.66急性运动15.20±3.9715.6±4.4514.71±3.8613.36±4.05表7注射胰岛素即刻、5min、15min、30min后大鼠血糖变化率组别即刻5min15min30min正常对照组——-6.08%-14.4%-27.1%糖尿病对照组——-0.5%-5.8%-11.2%慢性运动组——+0.1%-5.1%-23.9%急性运动组——+2.6%-3.2%-12.1%8 各组大鼠胰岛素敏感性变化趋势0.050-0.05即刻5min15min30min百分比-0.1-0.15-0.2-0.25-0.3正常对照组糖尿病对照组慢性运动组急性运动图1各组大鼠胰岛素敏感性变化趋势图如表6表7图1表现了各组大鼠腹腔注射胰岛素后血糖水平、胰岛素耐受性的变化。在腹腔注射胰岛素后，受到胰岛素的调控，血糖水平下降。在四组中，正常对照组血糖下降幅度最大，说明对胰岛素的敏感性最强，糖尿病对照组敏感性最弱。在外源性胰岛素作用下，血糖变化不明显。注射胰岛素即刻，糖尿病一次性运动组、糖尿病长期运动组大鼠会由于外伤、紧张或胰岛素未发挥作用而导致血糖应激性上升或保持不变。5分钟后，受外源性胰岛素影响，各组大鼠血糖水平开始下降。糖尿病对照组、糖尿病一次性运动组血糖下降幅度相对于正常对照组较小，胰岛素敏感性下降，糖尿病一次运动组比糖尿病对照组血糖变化快。同时发现，糖尿病长期运动组胰岛素敏感性减退现象有所改善，血糖变化幅度较糖尿病对照组增加。3.2各组大鼠胆固醇、甘油三酯、高低密度脂蛋白的变化情况表8各组大鼠TC、TG、HDL-C和LDL-C变化情况（x±s）组别TC(mmol/l)TG(mmol/l)HDL-C(mmol/l)LDL-C(mmol/l)正常对照组1.413±0.1490.624±0.1261.730±0.3380.027±0.022※※※※※※※※糖尿病对照组1.943±0.1651.034±0.1301.029±0.1010.142±0.064＃＃＃＃＃＃＃慢性运动组1.36±0.2890.848±0.1611.358±0.1650.051±0.019＃＃＃＃急性运动组1.488±0.2280.883±0.1131.335±0.2910.060±0.055注：与正常对照组相比：※※：P﹤0.01，※：P﹤0.05；与糖尿病对照组比：＃＃：P﹤0.01，＃：P﹤0.05。如表8所示，与正常对照组相比，糖尿病组大鼠TC、TG、LDL-C显著升高（P<0.01）,HDL-C显著降低（P<0.05），与糖尿病对照组相比，慢性运动组TC、TG、LDL-C显著降低（P<0.01），HDL-C显著升高（P﹤0.05）。急性运动组TC、TG、LDL-C显著降低，HDL-C显著升高（P﹤0.05）。9 3.3各组大鼠胰腺NPY及其Y1受体的变化表9大鼠胰腺NPY及其Y1受体变化情况（x±s）组别NPYNPY-Y1受体正常对照组2796.00±304.454397.30±670.18※※※※糖尿病对照组4913.75±1510.082550.60±386.358＃＃＃＃慢性运动组3103.25±597.733804.21±201.57＃＃＃急性运动组3002.75±146.353356.66±379.15注：与正常对照组相比：※※：P﹤0.01，※：P﹤0.05；与糖尿病对照组比：＃＃：P﹤0.01，＃：P﹤0.05。图２NPY蛋白表达谱带图３NPY-Y1受体蛋白表达谱带图４各组大鼠胰腺NPY及其Y1受体蛋白表达趋势图（注：1正常对照组2糖尿病对照组3慢性运动组4急性运动组）由上表9和图4示：与正常对照组相比，糖尿病大鼠胰腺NPY蛋白表达显著升高（P<0.01），其Y1受体蛋白表达显著下降（P<0.01）。与糖尿病对照组相比，慢性运动组大鼠胰腺NPY蛋白表达显著降低（P<0.01），急性运动组大鼠胰腺NPY-Y1受体蛋白表达显著升高（P<0.05）。10 4分析与讨论经研究发现2型糖尿病（T2DM）大鼠模型比其它啮齿类动物模型更适合用于人类糖尿病的研究，由于SD大鼠造模成功率高，具有造模时间短、副作用小和死亡率低等特点，因此本实验选用SD大鼠。目前T2DM动物模型类型有实验性(化学药物诱发的)糖尿病模型、自发性(遗传性)糖①②尿病模型和转基因糖尿病动物模型，其中，自发性糖尿病模型的应用价值较高，但因价格昂贵，饲养、繁殖条件要求严格，而不能得到广泛应用。转基因糖尿病动物模型实际应用也不多。T2DM病动物模型的建立，通常采用以高脂高糖饲料加小剂量链脲佐菌素（STZ）联合诱发的方法。通过此方法诱导制备的糖尿病大鼠模型被广泛地应用于糖尿病的基础研究中。具有与临床T2DM类似的生化代谢和临床特点,而且发病过程与临床T2DM更加相似,耗时短,方法简便,容易被掌握,重复性好的特点,短期内可诱导出大量的T2DM模型。因此,本实验选用了肥胖SD大鼠注射小剂量STZ诱导的T2DM模型。临床医学将糖尿病分为一型糖尿病和2型糖尿病，一型糖尿病发病原因是胰岛β细胞被破坏，导致胰岛素分泌不足所致。2型糖尿病发病原因是β细胞功能减退，胰岛素发生抵抗所致。高血糖、高血脂是产生胰岛素抵抗，导致胰岛β细胞功能受损的重要因素。血糖就是血液中的葡萄糖，血糖浓度的高低反映了体内糖代谢情况。胰岛素是机体内能够降低血糖的唯一激素，有促进糖、脂肪和蛋白质合成的作用，同时胰岛素还可以减少糖脂肪和蛋白质的分解。2型糖尿病患者由于长期的高脂高糖饮食，导致机体长期处于高血糖水平，因此，为维持机体正常的血糖水平，β细胞分泌胰岛素增多，则形成高胰岛素血症，如果长期处于此状态，发生失代偿，加重β细胞功能损害，导致β细胞功能衰竭，即发生胰岛素抵抗。4.1急、慢性运动对T2DM大鼠血糖、胰岛素水平的影响目前，全球2型糖尿病的患病率在增加，对人类的危害日益凸显，引起人们广泛的重视，科研工作者和广大医疗工作者也在积极地进行2型糖尿病的预防及治疗的研究。本实验采用15月龄SD雄性大鼠，相当于人的老年期，高脂膳食进行肥胖造模成功后，注射小剂量的STZ诱发2型糖尿病模型，据表5表6和表7所示：体重超过正常对照组的20%，达到肥胖评价标准，证明肥胖造模成功。然后，腹腔注射小剂量的STZ(35mg/kg)，尾部取血测定血糖值为17.2mmol/l，高于造模成功的标准值16.7mmol/l，证明糖尿病造模成功。同时T2DM对照组大鼠血清胰岛素浓度和血脂均显著高于正常对照组(P﹤0.05)，提示SD①ReesDA，AlcoladoJC.Animalmodelsofdiabetesmellitus[J].Diab.Med.2005（22）:359-370.②徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社，2002(3):1517.11 大鼠已经具备了T2DM典型的高血糖、高血脂、高胰岛素的典型特征，也进一步证实了T2DM造模成功。急性运动（acuteexercise）是指具有一定强度而对个体构成一定体力负荷的单次运动。急性运动对机体的刺激，使机体产生应激反应，但作用效果消失快。慢性运动（chronicexercise）是长期的循序渐进的运动，使机体的结构和机能产生适应性的改变，这种改变不会在短期内消失。高血糖和高血脂是导致T2DM的重要因素，血糖含量可以反应机体糖代谢状况的重要指标。胰岛素有降低血糖的功能，是机体降低血糖的唯一激素。胰岛素可以促进糖、蛋白质和脂肪的合成，减少其分解。本实验采用高脂膳食结合小剂量的STZ诱导大鼠出现高血糖高胰岛素体征，证明T2DM大鼠造模成功。表4胰岛素的耐受性实验结果提示：与正常对照组相比，糖尿病组大鼠在胰岛素的刺激作用下血糖的下降幅度小于正常对照组，提示糖尿病大鼠体内出现胰岛素抵抗。①冯光斌等研究表明，2型糖尿病大鼠游泳训练6周后，与糖尿病不运动组相比，血清②胰岛素浓度没有显著性差异。GianlucaPerseghin，M．D．等研究发现，运动可以增加胰岛素抵抗的糖尿病患者胰岛素敏感性，使肌肉组织内由胰岛素刺激的葡萄糖合成增加两③倍。李雨实验证明长期有氧耐力运动能降血糖、降胰岛素，运动时间越长降低效果越明④显。李宁川等研究显示,10周后，与对照组相比,糖尿病组大鼠胰岛素水平显著下降，血糖显著升高；与糖尿病组大鼠相比，糖尿病运动组大鼠胰岛素水平明显升高,血糖明显下降,这说明适度的运动训练有降低糖尿病大鼠血糖的作用。本实验研究结果表5显示，与糖尿病对照组相比，慢性运动组大鼠胰岛素显著降低（p<0.01），血糖显著下降（p<0.01）；急性运动组大鼠胰岛素显著下降（p<0.05）。这与大多数学者研究结果一致。推测其原因是运动增加了机体代谢率，提高了对能源物质的需求，糖是机体的重要供能物质，因而促进了糖的分解和血糖的利用，从而降低血糖。经过长期的慢性运动，增强了骨骼肌细胞的转运能力和利用葡萄糖的能力，葡萄糖进入肌细胞增加了糖原的合成与利用，使血糖降低。根据实验各组胰岛素水平的变化可推测出，长期的慢性运动可以降低空腹胰岛素水平，提高胰岛素的敏感性，胰岛素转运葡萄糖的活性增①冯光斌,吴毅等.运动改善糖尿病葡萄糖转运能力的分子生物学机制[M].1998年全国运动疗法学术会议论文汇编.1998:47-49.②GianlucaPerseghin,M.D.Phos-phorylationandMuscleGlycogenSynthesisafterExerciseTraininginInsulin-resistantSubjects[J].NENGLJMed,1996(335):1357～1362.③李雨.耐力训练和药物对T2DM大鼠骨骼肌瘦素及其受体蛋白表达的影响[D].辽宁:沈阳体育学院2010届研究生论文,2010.④李宁川,颜文锦,王金玉.运动训练和心理应激对大鼠下丘脑神经YmRNA的影响[J].中国运动医学杂2006(6):674-677.12 高，减轻了高胰岛素血症。而急性运动则因为机体产生的应激反应，使胰岛素和血糖浓度迅速下降。4.2急、慢性运动对T2DM大鼠血脂水平的影响血脂是指血浆中的脂类物质，包括甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、磷脂（PL）高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和游离脂肪酸（FFA），脂质不溶或微溶于水，他们必须与蛋白质结合以脂蛋白的形式存在，才能在血液中循环。少部分以甘油三酯和胆固醇的形式存在。人体内数量最大的储能物是脂肪，其储量远比糖原大，是安静和运动时重要的供能物质，脂肪多以甘油三酯形式贮存于脂肪组织，运动时机体所需能量迅速增加，脂肪动员将大量脂肪组织中的脂肪分解成甘油三酯和脂肪酸，进入血液，通过血液运输到骨骼肌分解后为机体供能。T2DM患者常伴有脂代谢紊乱，脂代谢异常进一步加重糖代谢紊乱。形成T2DM的恶性循环。T2DM几乎都存在胰岛素抵抗，并始终贯穿于整个病情的发生、发展过程中。由于T2DM大鼠胰腺β细胞功能受损或者产生胰岛素抵抗，血液中胰岛素浓度升高，胰岛素有促使糖、蛋白质和脂肪的合成的作用，同时胰岛素还可以抑制糖、蛋白质和脂肪的分解。机体储存过量的糖转化为脂肪，使得大鼠体重和血脂浓度增加，血脂代谢失衡。血脂代谢紊乱，血清中甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白浓度异常。因为胰岛素抵抗，甘油三酯水解酶活性降低，甘油三酯在组织中的清除率会降低，从而出现高甘油三酯血症。同时，长期高脂高糖饮食，促进了肝脏合成低密度脂蛋白和甘油三酯的增加，导致血浆中低密度脂蛋白和甘油三酯浓度增加。本实验研究结果显示，与正常对照组相比，糖尿病组大鼠的甘油三酯，胆固醇和低密度脂蛋白都显著上升（p<0.05），而高密度脂蛋白的浓度显著下降（p<0.05）。提示T2DM大鼠出现血脂代谢紊乱。而TG升高是胰岛素抵抗的早期表现，可降低胰岛素的生物效应，发生胰岛素抵抗。推测其原因是富含TG的脂蛋白在血中的堆积，富含TG的脂蛋白粒子的清除障碍，使TG水平升高。由于明显长期增高的TG与葡萄糖竞争进入细胞内的机会，使葡萄糖的氧化及利用发生障碍，导致胰岛素抵抗；通常高TG血症脂肪细胞肥大、增生，使胰岛素受体数目和活性相对下降，从而导致胰岛素抵抗。①金其贯等发现长期有氧运动可显著降低10周高脂饮食胰岛素抵抗大鼠的血清TG和②TC含量。庄小花等报道，T2DM患者进行长期有氧运动后，其TG、TC、LDL-C均有明显下降。提示长期有氧运动有利于糖尿病患者机体血脂代谢的改善。田吉明等研究13周龄的①金其贯，张美玲，潘艳娟，等.有氧运动和大豆多肽对高脂饮食大鼠胰岛素抵抗形成和血脂代谢的干预作用[J].北京体育大学学报.2008,(1):40-43.②庄小花,戴金玲,田淑侠等.糖尿病运动疗法中的护理干预[J].中华现代护理学杂志.2008(11)：983-98513 SD雄性肥胖大鼠，在坡度50°的电动跑台上，以20m/min的速度跑40分钟。结果发现：运动后恢复12小时组大鼠血清TG下降明显，运动后即刻和1小时组TC显著下降，运动后恢复20小时组大鼠的LDL显著升高，运动后即刻组HDL显著下降，运动后恢复12小时和24小时①组恢复正常。本实验研究与上述研究的动物模型和运动形式有别，采用的是处于老龄T2DM雄性大鼠，90分钟间歇游泳训练的方式，分别进行急性运动和慢性运动训练，实验研究结果表8显示：与糖尿病对照组相比，慢性运动组的TC、TG和LDL-C显著降低（p<0.01），HDL-C显著升高（p<0.05），急性运动组TC、TG和LDL-C显著降低（p<0.05），HDL-C显著升高（p<0.05）。提示了急性运动和慢性运动对糖尿病大鼠血脂有改善作用。推测运动改善T2DM大鼠血脂的原因可能是，①T2DM几乎都存在胰岛素抵抗，并始终贯穿于整个病情的发生、发展过程中。运动改善了胰岛素抵抗，降低胰岛素浓度，增强胰岛素的敏感性，使甘油三酯水解酶活性增强，甘油三酯在组织中的清除率增加，促进了脂肪的分解。同时，运动降低了肝脏合成低密度脂蛋白和甘油三酯，导致血浆中低密度脂蛋白和甘油三酯浓度降低。②运动引起了脂蛋白代谢关键酶脂蛋白酯酶（LPLa）和卵磷脂胆固醇酰基转移酶②的活性提高，从而加速了LDL-C、TG降解。运动可以通过肾上腺素一CAMPK一PKA、胰岛素一CAMP一PKA、TNF-a途径改善血脂代谢。对脂代谢的调节起作用的激素、蛋白和细胞因子有很多，例如，胰岛素、瘦素、Perilipin(脂滴包被蛋白)在调控脂代谢中起到重要作用。4.3T2DM大鼠胰腺NPY的变化情况神经肽Y(NeuropeptideY,NPY)是一种含36个氨基酸,分子量约为12KD的肽，是与生物体的生长发育和生活行为关系密切的神经递质。NPY广泛分布于哺乳动物的中枢神经系统、周围神经系统以及组织、器官和腺体中,与神经元中其它神经递质共存,同时可以由非神经元细胞合成并释放。NPY能促进动物摄食行为、调控能量平衡;对下丘脑活动产生③作用,影响许多因子和激素的合成与分泌。NPY生物学活性广泛，是下丘脑最主要的神经④化学信号物质之一，与最初食欲的产生、维持有着密切的关系。NPY作为肥胖代谢调控因子在高血脂、糖尿病等老年病的发生和发展过程中发挥重要的调控作用，NPY与相应受体结合引发特定的信号传导后，执行其特有的调节功能和代谢反应及病理生理改变。而它所主导的调控功能及作用机制也是因为NPY能以不同的亲和力及特异性与其相对应受体①田吉明,汪军等.一次性运动对肥胖大鼠脂肪组织HSL和Perilipin基因表达及血脂的影响[J]中国体育科技.2008(3):111-114②谢敏豪,林文弢.运动生物化学[M].北京:人民体育出版社.2008:140-141.③胡春燕,李英文.神经肽Y(NPY)的生理功能研究进展.生物学杂志[J].2011(4):66-67.④BettioA,Beck-SickingerAG.BiophysicalmethodstostudyLigandreceptorinteractionsofneuropeptide[J].Biopolymers.2001:420-437.14 ①结合的缘故。下丘脑部位的NPY多表达于弓状核，下丘脑的其它核团通过突触与其紧密相联，NPY②与不同受体作用后调控摄食行为，下丘脑的NPY水平可以反应机体的营养状况，NPY可以被看作是一种生理性食欲能力的信号分子。有研究表明：中枢给予NPY可刺激小鼠③摄食和寻找食物的能力，但是禁食后可增加小鼠下丘脑区NPY的表达。在外周，NPY等④生物学功能不同，这取决于器官和组织。对于血液组织中的NPY，通过对肥胖和糖尿病⑤⑥大鼠的大量研究，如张雪峰张立福等发现肥胖组与对照组相比，血液NPY水平显著升高。⑦而娄晓民等发现肥胖儿童血中NPY浓度低于对照组，但差异无统计学意义。大量研究表明，糖尿病患者血液NPY水平显著高于对照组，并推测血浆NPY含量变化与糖尿病的发⑧生和发展有关。但是任艳和李秀钧等研究结果显示，不论糖尿病患者或糖耐量正常的一2级亲属NPY水平与正常对照相比均无明显差异,仅在BMI≥25kg/m的糖尿病亚组中升高,且相关分析亦未发现NPY与Leptin、TNF-α、胰岛素、血脂等相关,推测NPY可能与T2DM的发病无明显相关。⑨目前，NPY是促食欲信号中唯一被发现在PVN中选择性分泌的神经递质。通过禁食引起的能量储存消耗能促进NPY合成的增加,并在ARC-PVN轴释放，随着能量储存的增加,NPY分泌迅速下降,继而NPY的合成逐渐正常化。这说明NPY是一种食欲传感器。同时可以改变机体的代谢环境,激活脂蛋白酶,并促进脂肪的合成与储存，影响生物体内激素的分泌、电解质平衡。⑩对于胰腺中的NPY，傅茂等研究证明大鼠胰腺神经肽Y阳性细胞多分布于胰岛的周边，胰腺NPY起到了对糖尿病调节作用，但是随着病程的增加，NPY表达减少，作用降低。NPY由胰岛α细胞分泌，胰岛素由β细胞分泌。体外研究表明,NPY抑制胰岛素的分泌，NPY可通过旁分泌或自分泌作用对胰岛素起到更直接有效的抑制作用。以胰岛NPY缺乏大鼠为研究对象,证实内源性NPY可以抑制胰岛素分泌,也就是胰岛NPY的分泌减少,①ParkJJ,LeeHK,ShinMW,eta1.Short-termcoldexposuremaycausealocaldecreaseofneuropeptideYintherathypothalarnus[J].MolCells,2007:88-93.②WynneK,StanleyS,McGowanB,etal.Appetitecontrol[J].JEndocrinol,2005(184):291-318.③克祥等.神经肤Y及其受体的生物信息学和医学生理学的研究[J].国际老年医学杂志,2010(5):99-104④ElzbietaSucajtys-Szulc，etal.ChronicfoodrestrictiondifferentiallyaffectsNPYmRNAlevelinneuronsofthehypothalamusandinneuronsthatinnervateliver[J].NeuroscienceLetters.2008,433(3):174-177.⑤张雪峰，李君光，崔凯，等.肥胖与Leptin和神经肽Y[J].黑龙江畜牧兽.2006(2)：114-118.⑥张立福.肥胖儿童血浆中神经肽Y的水平及相关因素的分析[J].大连医科大学学报.2005,27(3):230-232.⑦娄晓民，段广才，陈姜等.肥胖儿童食欲素、瘦素和神经肽Y水平及其相互关系[J].大连医科大学学报.2006,37(4):621-624.⑧娄晓民，段广才，陈姜等.肥胖儿童食欲素、瘦素和神经肽Y水平及其相互关系[J].大连医科大学学报.2006,37(4):621-624.⑨Kalra,S.P.,Kalra,P.S.,.Keepingobesityandmetabolicsyndromeatbaywithcentralleptinandcytokinegenetherapy[M].In:Hamilton,I.(Ed.),Curr.Med.Chem.CentralNervousSystemAgent.BenthamSciencePublicationsLtd.,SanFrancisco,CA,pp.2003:189-199.⑩傅茂,李秀钧.不同时期糖尿病大鼠胰腺神经肽Y的变化[J].中山医科大学学报2000（12）:2-4:15 ①胰岛素分泌增加,从而缓解胰岛素抵抗。李军研究表明，发生胰岛素抵抗的T2DM大鼠胰②岛素水平较高,胰腺NPY增多，胰腺NPY含量与胰岛素抵抗程度呈正相关,证明胰腺NPY敏感性下降,不能抑制胰岛素的分泌。本实验结果表9显示：与正常对照组相比，糖尿病对照组NPY水平显著增加（P<0.05）。推测其原因可能是作为肥胖调控因子的NPY参与了上调糖尿病大鼠胰岛素的机制，使得胰岛素控制下的糖脂代谢发生紊乱，胰岛素反作用于胰腺NPY，使NPY蛋白表达增加，敏感性降低，产生NPY抵抗。4.4急、慢性运动对T2DM大鼠胰腺NPY的影响③目前，运动对T2DM大鼠NPY影响的研究主要集中在下丘脑和血液，孙焱等对正常大鼠进行研究发现，与正常对照组相比，运动组和对照组大鼠下丘脑NPY水平均有所提高，但无显著性意义，认为运动对正常大鼠下丘脑NPY水平无直接的独立性的影响。李④宁川等发现，与对照组相比，经八周游泳训练后，大鼠下丘脑NPYmRNA显著增加。⑤Lewiss等的研究也认为无论是控制饮食或跑步都显著增加下丘脑NPY含量(可增加30⑥％～70％)。张缨等研究发现，2型糖尿病大鼠经过长期有氧运动后，与正常对照组相比，糖尿病运动组下丘脑NPY蛋白浓度、NPY基因表达量差异不显著；与糖尿病对照组相比，糖尿病运动组下丘脑NPY蛋白浓度、NPY基因表达量，差异不显著，但有下降趋势，提⑦示有氧运动可以改善下丘脑NPY基因表达，可以改善2型糖尿病病情。李宁川等报道，8周无负重游泳运动后，糖尿病运动组大鼠下丘脑NPYmRNA表达显著低于糖尿病组。⑧Shin等也认为运动训练可抑制因STZ所致糖尿病大鼠下丘脑NPY增加的趋势。因此，运⑨动对下丘脑NPY的作用目前还存在争议。对于血浆NPY，佟长青等发现游泳训练大鼠血⑩浆NPY比对照组降低88％。齐燕妮等研究游泳训练大鼠每次70min，共8周后，与对照组相比，训练组大鼠血浆NPY含量显著降低，推测其原因是长期运动导致机体交感神经兴奋性下降，导致NPY的分泌减少。关于运动对血浆NPY的作用，大多数研究比较一致，①Yumimai,etal.InsulinsecretionisincreasedinpancreaticisletsofneuropeptideYdeficientmice[J].Endocrinology,2007,148(12):5716-5723.②李军.糖耐量受损大鼠胰岛α细胞胰高血糖素及神经肽Y的表达[J].中华内分泌代谢杂志,2004(6):185-189.③孙焱，巫文辉,黄叔怀等.长期不同负荷游泳运动对大鼠肥胖相关蛋白的影响[J].中国运动医学杂志.2004(6)：689-691.④李宁川，颜文锦，王金玉.运动训练和心理应激对大鼠下丘脑神经YmRNA的影响[J].中国运动医学杂志.2006(6):674-677.⑤LewisDE，ShellardL，KoeslagDG，etal．IntenseexerciseandfoodrestrictioncausesimilarhypothalamicneuropeptideYincreasesinrats[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab.1993,264(2):E279-E284．⑥张缨,冯美云.有氧运动对糖尿病大鼠血、脑调节肽的影响[D].中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)2001(1):35-37.⑦李宁川，颜文锦，王金玉.运动训练和心理应激对大鼠下丘脑神经YmRNA的影响[J].中国运动医学杂志.2006(6):674-677.⑧ShinMS,KimH，ChangHK,etal.Treadmillexercisesuppressesdiabetes-inducedincrementofneuropeptideYexpressioninthehypothalamusofrats[J].NeurosciLett.2003，346(3):157-160.⑨佟长青，张引国，郭建增.游泳训练大鼠血浆生物活性肽含量的变化及意义[J].武警医学院学报.2001(3):183-188.⑩齐燕妮,浦钧宗,韩启德.大鼠运动训练与限制活动对血浆神经肽Y、儿茶酚胺浓度及其应激改变的影响[J].中国运动医学杂志.1992(4):213.16 ①认为运动可降低血浆NPY水平。薛忠光等认为血浆NPY含量变化与糖尿病的发生、发展有关。总之，不同组织器官中的NPY作用机制不完全一样，下丘脑中NPY促进食欲，增加采食量，抑制胰岛素分泌；脂肪中NPY刺激脂肪细胞增殖与分化；胰腺中NPY抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌。运动可以使血浆NPY蛋白表达下降，有研究认为运动可以使下丘脑NPY蛋白表达增高，胰腺NPY蛋白表达下降，有的研究结果则相反。②运动对胰腺NPY的影响研究较少，学者研究发现胰腺NPY可通过旁分泌或自身内分泌机制增强对胰岛素分泌的抑制作用而发挥直接作用。NPY作为胰岛细胞内的一种重要调节激素，在糖尿病的发生发展过程中可能发挥一定作用。本实验结果显示，与糖尿病对照组相比，慢性运动组胰腺NPY蛋白含量显著下降（P<0.05）。推测可能是因为慢性运动训练可以使T2DM大鼠胰岛α细胞胰岛素抵抗得到缓解，α细胞合成NPY减少，分泌NPY也减少，结果NPY水平降低，NPY敏感性增加，因此NPY抵抗得到缓解。同时其对胰岛素分泌的抑制作用加强，从而降低胰岛素浓度，改善了大鼠T2DM。4.5T2DM大鼠NPY-Y1受体的变化情况NPY-Y1受体蛋白相对分子量为44.5KD，有较强的疏水性，是性质较稳定的蛋白。引起神经肽Y发挥不同功效的原因很多，其一是NPY必须与相应的受体神经肽Y受体(Receptor)结合，而神经肽Y受体有8种亚型:Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7和Y8,他们③都均属于G蛋白偶联受体家族，所以就构成其多样性。NPY受体亚型介导信息传导与G蛋白偶联有关,能抑制腺苷酸环化酶的生物合成,最终动员或抑制钙离子释放。不同受体起所起的作用不同，不同组织所含受体种类不同，分布④密度也不相同。NPYY1、Y2和Y5受体被认为与NPY诱导摄食和引起肥胖的作用机制⑤有关。实验表明,在NPY-Y1R缺失小鼠中NPY诱导的摄食效应明显减弱;这充分说明,NPY-Y1R在大鼠的食物摄取调控中起着重要作用。目前还没有运动对T2DM大鼠胰腺NPY-Y1受体影响研究的报道，本实验研究结果表9显示：与正常对照组相比，T2DM组大鼠NPY-Y1受体显著下降（P<0.01）；与糖尿病对照组相比，慢性运动组和急性运动组NPY-Y1受体显著升高（P<0.01，P<0.05）。推测是由于NPY被释放后主要通过NPY受体⑥起作用，胰腺胰岛NPY通过激活Y1受体而抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌。NPY-Y1受体①薛忠光，马振勇.糖尿病患者血浆NPY、血清IL-6、TNF-α测定的临床意义[J].放射免疫学杂志.2006(1):44-45.②YumiImai，HiralR.Patel,EvanJ.Hawkins，etal.InsulinSecretionIsIncreasedinPancreaticIsletsofNeuropeptideY-DeficientMice[J].TheEndocrineSociety.2007，148(12)：5716-5723.③胡春燕,李英文.神经肽Y(NPY)的生理功能研究进展[J].生物学杂志.2011(4)④IshiharaA,KanataniA,MashikoS,etal.AneuropeptideYY5antagonistselectivelyanelioratesbodyweightgainandassociatedparametersindiet-inducedobesemice〔J〕.PNAS,2006;103(18):7154-8.⑤KanataniA,MashikoS,MuraiN,etal·RoleoftheY1receptorintheregulationofneuropeptideY-mediatedfeeding:comparisonofwild-type,Y1receptor-deficient,andY5receptordeficientmice〔J〕.Endocrinology,2000;141:1011-6.⑥YumiImai,HiralR.Patel,EvanJ.Hawkins,etal.InsulinSecretionIsIncreasedinPancreaticIsletsofNeuropeptideY-DeficientMice[J].TheEndocrineSociety.2007,148(12):5716-5723.17 与Gi（抑制腺苷酸环化酶的鸟嘌呤核苷酸调节蛋白，称作抑制性蛋白）相连，NPY可与抑制性G蛋白结合，抑制腺苷酸环化酶的活化，从而抑制胰岛素分泌，但NPY-Y1受体表达的下降是否真的影响了胰岛素的释放还有待于进一步的研究。4.6急、慢性运动对T2DM大鼠胰腺NPY-Y1受体的影响目前还没有运动对T2DM大鼠胰腺NPY受体蛋白表达影响研究的报道。本实验研究结果显示：与糖尿病对照组相比，糖尿病慢性运动组和急性运动组的NPY-Y1受体显著升高（P<0.05）。提示急性运动和慢性运动都可以提高NPY-Y1受体的数量；与急性运动组相比，慢性运动组NPY-Y1受体差异不显著，但有上升趋势。提示急性运动和慢性运动在提高NPY-Y1受体数量的作用上没有显著差异。推测其可能原因是,急性运动对机体产生的应激反应，导致NPY分泌减少，其Y1受体数量的增加。慢性运动可以使机体逐渐适应运动刺激,因此由应激刺激导致NPY分泌减少的影响降低，影响受损的NPY-Y1受体数量增加，蛋白表达增强。当达到一定运动强度时,运动器官中血液循环逐渐减少,机体内乳酸含量逐渐增多,降钙素基因相关肽（CGRP）含量增加，CGRP与乳酸含量变化呈线性关系，CGRP是机体舒血管功能最强的物质,由于达到了一定的运动强度，运动器官中血含量明显增加,同时血管扩张,抑制与其功能相反的缩血管物质NPY的释放,NPY含量减①少，NPY-Y1受体增加。从而提高了T2DM大鼠胰腺NPY对胰岛素分泌的抑制作用，进而降低了血胰岛素含量，改善T2DM症状。经相关分析，NPY与其NPY-Y1受体呈显著负相关。这充分说明了运动可以降低NPY-Y1受体的表达，提高NPY的敏感性，加强NPY对胰岛素分泌的抑制，缓解胰岛素抵抗，从而改善T2DM糖脂代谢紊乱。①李志宏,周振华等.运动训练对神经肽Y含量变化的影响及可能机制研究[J].体育世界学术.2009:85-8618 5结论与建议5.1结论5.1.1高脂膳食结合小剂量诱导的T2DM产生的胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱可能与胰腺的NPY抵抗有关。5.1.2急、慢性运动均可降低胰腺NPY，上调NPY-Y1受体的蛋白表达，改善胰腺NPY抵抗，提高胰岛素的敏感性，缓解糖脂代谢紊乱，且急性运动的作用效果可持续16小时。5.2建议急性运动16小时后对T2DM大鼠胰腺NPY及其受体的影响还有待于进一步研究。19 参考文献[1]李益明等.大黄提取片对高脂饮食诱导肥胖大鼠脂代谢及相关基因表达的影响[J].中华医学杂志.2006(9):302--303[2]丁克祥等.人神经肽Y及其受体对脂肪生成影响的研究[J].国际老年医学杂志.2010(3):61-62.[3]丁克祥等.肥胖代谢调控因子—人神经肽Y及受体生物学特性的分子水平研究[J].国际老年医学杂志2010(1):13-14.[4]ReesDA，AlcoladoJC.Animalmodelsofdiabetesmellitus[J].Diab.Med.2005（22）:359-370.[5]赵宝珍,白秀平,荣青峰.实验性T2DM大鼠模型的研究[J].中国药物与临床.2002(6):383-385.[6]徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社，2002(3):1517.[7]冯光斌,吴毅等.运动改善糖尿病葡萄糖转运能力的分子生物学机制[M].1998年全国运动疗法学术会议论文汇编.1998:47-49.[8]GianlucaPerseghin,M.D.Phos-phorylationandMuscleGlycogenSynthesisafterExerciseTraininginInsulin-resistantSubjects[J].NENGLJMed,1996(335):1357～1362.[9]李雨.耐力训练和药物对T2DM大鼠骨骼肌瘦素及其受体蛋白表达的影响[D].辽宁:沈阳体育学院2010届研究生论文,2010.[10]李宁川,颜文锦,王金玉.运动训练对糖尿病大鼠糖代谢和下丘脑神经肽YmRNA的影响.中国运动医学杂志.2008(1):52-54.[11]乔玉成.运动感与代谢综合征机制研究进展[J].体育科学,2005,25(11):66-71[12]金其贯，张美玲，潘艳娟，等.有氧运动和大豆多肽对高脂饮食大鼠胰岛素抵抗形成和血脂代谢的干预作用[J].北京体育大学学报.2008,(1):40-43.[13]庄小花,戴金玲,田淑侠等.糖尿病运动疗法中的护理干预[J].中华现代护理学杂志.2008(11)：983-985.[14]田吉明,汪军等.一次性运动对肥胖大鼠脂肪组织HSL和Perilipin基因表达及血脂的影响[J]中国体育科技.2008(3):111-114.[15]谢敏豪,林文弢.运动生物化学[M].北京:人民体育出版社.2008:140-141.[16]SouzaSC，deVagasLM，YamamotoMT，etal.OverexpressionofPerilipinAandBblockstheabilityoftumornecrosisfactoralphatoincreaselipolvsisin3T3一LJadipocytes.JBiolChem，1998(273):24665~24669.[17]胡春燕,李英文.神经肽Y(NPY)的生理功能研究进展.生物学杂志[J].2011(4):66-67.[18]BettioA,Beck-SickingerAG.BiophysicalmethodstostudyLigandreceptorinteractionsofneuropeptideY[J].Biopolymers.2001:420-437.[19]ParkJJ,LeeHK,ShinMW,eta1.Short-termcoldexposuremaycausealocaldecreaseof20 neuropeptideYintherathypothalarnus[J].MolCells,2007:88-93.[20]WynneK,StanleyS,McGowanB,etal.Appetitecontrol[J].JEndocrinol,2005(184):291-318.[21]丁克祥等.神经肤Y及其受体的生物信息学和医学生理学的研究[J].国际老年医学杂志,2010(5):99-104.[22]ElzbietaSucajtys-Szulc，etal.ChronicfoodrestrictiondifferentiallyaffectsNPYmRNAlevelinneuronsofthehypothalamusandinneuronsthatinnervateliver[J].NeuroscienceLetters.2008,433(3):174-177.[23]张雪峰，李君光，崔凯，等.肥胖与Leptin和神经肽Y[J].黑龙江畜牧兽.2006(2)：114-118.[24]张立福.肥胖儿童血浆中神经肽Y的水平及相关因素的分析[J].大连医科大学学报.2005,27(3):230-232.[25]娄晓民，段广才，陈姜等.肥胖儿童食欲素、瘦素和神经肽Y水平及其相互关系[J].大连医科大学学报.2006,37(4):621-624.[26]任艳，李秀钧等.2型糖尿病家系正常糖耐量一级亲属血清瘦素、肿瘤坏死因子-α、神经肽Y水平及与胰岛素抵抗、β细胞分泌功能相关性的临床研究研究[J].生物医学工程学杂志.2010(12):1341-1345.[27]Kalra,S.P.,Kalra,P.S.,.Keepingobesityandmetabolicsyndromeatbaywithcentralleptinandcytokinegenetherapy[M].In:Hamilton,I.(Ed.),Curr.Med.Chem.CentralNervousSystemAgent.BenthamSciencePublicationsLtd.,SanFrancisco,CA,pp.2003:189-199.[28]傅茂,李秀钧.不同时期糖尿病大鼠胰腺神经肽Y的变化[J].中山医科大学学报2000(12):2-4.[29]Yumimai,etal.InsulinsecretionisincreasedinpancreaticisletsofneuropeptideYdeficientmice[J].Endocrinology,2007,148(12):5716-5723.[30]李军.糖耐量受损大鼠胰岛α细胞胰高血糖素及神经肽Y的表达[J].中华内分泌代谢杂志,2004(6):185-189.[31]孙焱，巫文辉,黄叔怀等.长期不同负荷游泳运动对大鼠肥胖相关蛋白的影响[J].中国运动医学杂志.2004(6)：689-691.[32]李宁川，颜文锦，王金玉.运动训练和心理应激对大鼠下丘脑神经YmRNA的影响[J].中国运动医学杂志.2006(6):674-677.[33]LewisDE，ShellardL，KoeslagDG，etal．IntenseexerciseandfoodrestrictioncausesimilarhypothalamicneuropeptideYincreasesinrats[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab.1993,264(2):E279-E284．[34]张缨,冯美云.有氧运动对糖尿病大鼠血、脑调节肽的影响[D].中国优秀博硕士学位论文全文数据库21 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致谢经过了近一年的准备与完善，终于完成了我的毕业论文。本论文的完成离不开常波导师的悉心指导与帮助，在此真切的感谢我的导师。尤其感谢衣雪洁教授对我的指导，以及张路老师给予的帮助。23 作者简介郑树荣，女，1973年2月4日生，沈阳体育学院运动人体专业，运动疲劳恢复与机能评定研究方向。1998年毕业于大庆师范学院，同年任教于黑龙江省大庆市肇源县第五小学，从教11年。11年的英语教学，使我积累了丰富的教学经验，逐步成长为一名优秀的人民教师。我喜欢学习，钻研，不断追求。所以我利用业余时间努力学习，顺利地考入沈阳体育学院研究生，从此开始了我倍加珍惜的读研生活。在读研期间，通过向各科经验丰富的教师学习请教，我收获很大，无论在基础知识、科研还是在应用软件方面都进步很大。这得益于教我的恩师。他们传授我知识，指引我方向，锻炼我能力，鼓励我成长！使我受益匪浅。这是我能够胜任今后工作的前提基础，也是更好的完成工作的有力保障！24 攻读学位期间的学术活动情况（1）郑树荣.运动性疲劳的恢复手段综述[J].教育科研.2012(2):125（2）2010年11月学术论坛，题目：有氧运动对青少年肥胖减肥效果及血脂的影响25