CD226分子与临床疾病的关系及其分子机制

《CD226分子与临床疾病的关系及其分子机制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

分类号UDC密级公开CD226分子与临床疾病的关系及其分子机制曾汉玉学号2022013031培养类别全日制学位类型学术学位一级学科(专业类)基础医学二级学科(专业)免疫学研究方向CD226分子与临床疾病指导教师陈丽华教授培养单位基础部二O一六年五月 独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：日期： 第四军医大学硕士学位论文目录缩略语表·······························································································1中文摘要·······························································································3ABSTRACT····························································································6前言·······························································································9文献回顾······························································································10一、CD226分子的结构···········································································101.CD226分子的发现和命名·································································102.CD226分子的基因和结构·································································103.CD226分子的表达分布····································································124.CD226分子的配体··········································································12二、CD226分子的功能············································································131.CD226分子参与CTL细胞和NK细胞的功能········································142.+CD226分子参与CD4T细胞的功能····················································153.CD226分子参与其他细胞(内皮细胞、血小板、造血干细胞和肥大细胞等)的功能·····································································································16三、CD226分子与临床疾病······································································161.CD226分子与自身免疫性疾病···························································162.CD226分子与移植排斥反应······························································173.CD226分子与肿瘤··········································································184.CD226分子与感染性疾病·································································18正文······························································································20第一部分CD226mAbLeoA1促进混合淋巴细胞培养中IL-10的分泌及其机制·201材料·························································································································202方法··························································································································213结果·························································································································254讨论·························································································································30第二部分-/-Cd226小鼠EAE发病延缓及其初步分子机制····························321材料·························································································································322方法·························································································································323结果·························································································································354讨论·························································································································37第三部分人CD226基因单核苷酸多态性与肺癌易感性的关系·····················401材料·························································································································40 第四军医大学硕士学位论文2方法·························································································································413结果·························································································································454讨论·························································································································47小结······························································································50参考文献······························································································51个人简历和研究成果···············································································62致谢······························································································64 第四军医大学硕士学位论文缩略语表缩略词英文全称中文全称APCAntigenpresentingcell抗原提呈细胞CDClusterofdifferentiation白细胞分化抗原CTLCytotoxicTlymphocytes细胞毒性T细胞CTLA-4CytotoxicTlymphocytesantigen-4T淋巴细胞抗原-4CNSCentralnervoussystem中枢神经系统DNAM-1DNAXaccessorymolecule-1DNAX辅助分子1Damage-associatedmolecularDAMPs损伤相关分子模式patternsEnzyme-linkedimmunosorbentELISA酶联免疫吸附试验assayExperimentalautoimmune实验性变态反应性脑脊髓EAEencephalomyelitis炎FCMFlowcytometry流式细胞术FITCFluorsceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素FCSFetalcatalserum胎牛血清GVHRGraftversus-hostreaction移植物抗宿主反应HumanumbilicalveinendothelialHUVEC人脐静脉内皮细胞cellsHIV-1Humanimmunodeficiencyvirus-1人类免疫缺陷病毒1型HCMVHumancytomegalovirus人巨细胞病毒HLAHumanleukocyteantigen人类白细胞抗原IDOIndoleamine2,3-dioxygenase吲哚胺2,3双加氧酶LPSLipopolysaccharide脂多糖MLCMixedlymphocytecu1lture混合淋巴细胞培养1 第四军医大学硕士学位论文MSMultiplesclerosis多发性硬化MACSMagneticcellsorting磁珠分选mTORMammaliantargetofrapamycin哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mAbMonoclonalantibody单克隆抗体MyelinoligodendrocyteMOG髓鞘少突胶质细胞糖蛋白glycoproteinPTxPertussistoxin百日咳毒素pDCPlasmacytoiddendriticcells浆细胞样树突状细胞pAbPolyclonalantibody多克隆抗体PlateletandTcellactivationPTA1血小板T细胞活化抗原-1antigen-1PDGFPlatelet-derivedgrowthfactor血小板生长因子PathogenassociatedmolecularPAMPs病原体相关分子模式patternsPVRPoliovirusreceptor脊髓灰质炎病毒受体PBMCPeripheralbloodmononuclearcell外周血单个核细胞TlineagespecificactivationT细胞谱系特异性活化抗TLisA1antigen1原1TLRToll-likereceptorToll样受体TcellimmunoglobulinandITIM含T细胞免疫球蛋白和TIGITdomainITIM结构域蛋白TSDRTreg-specificdemethylatedregionTreg特异性去甲基化区域2 第四军医大学硕士学位论文CD226分子与临床疾病的关系及其分子机制硕士研究生：曾汉玉导师：陈丽华教授第四军医大学基础部免疫学教研室，西安710032资助基金项目：国家自然科学基金（81571531）中文摘要1985年，澳大利亚学者BurnsG教授以混合淋巴细胞培养(MixedLymphocyteCulture,MLC)中活化的淋巴细胞作为免疫原免疫小鼠制备抗活化T细胞表面抗原的单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)，筛选得到一株可特异性识别表达于活化T细胞表面膜分子的mAb，将其命名为LeoA1。随后，发现LeoA1mAb识别的分子亦高水平表达在血小板表面，遂将此分子命名为血小板与T细胞活化抗原1(plateletandTcellactivationantigen1，PTA1)。在2000年第七届国际人类白细胞分化抗原协作组(HLDA7)大会上，由我室提交的抗PTA1mAb和由DNAX研究所提交的抗DNAM-1mAb获准了新的CD编号-CD226，这是首次以我国实验室为主要研究单位获得的新CD分子命名。CD226分子属于免疫球蛋白超家族成员，胞膜外区含有2个V样结构域，分子量约为65kD，主要表达于T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨核/血小板谱系、血管内皮细胞、B细胞亚群和部分造血干细胞。2003年，人CD226分子的两种配体鉴定成功，分别是人脊髓灰质炎病毒受体(PVR/CD155)和CD112。CD226分子与其配体的相互作用参与T细胞的分化和活化、NK细胞对肿瘤细胞和病毒感染细胞的杀伤、单核/巨噬细胞与内皮细胞的粘附、巨噬细胞的分化和血小板的活化与聚集等，与自身免疫性疾病、移植物抗宿主反应以及病毒感染等疾病关系密切。我们前期实验发现，CD226mAbLeoA1能够调控人MLC培养上清中细胞因子3 第四军医大学硕士学位论文的表达。由于MLC体系是一个多细胞培养体系，而IL-10是一个可以由多种免疫细胞合成和分泌的抑制性细胞因子(如参与固有免疫应答的树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞和NK细胞；参与适应性免疫应答的Th1、Th2、Th17、Treg、CD8+T细胞和B细胞)，因此搞清CD226分子影响MLC体系中IL-10分泌的细胞机制十分必要；另一方面，作为具有重要免疫调节功能的细胞因子，IL-10在机体免疫应答的各阶段以及多个部位调节机体的免疫应答强度，进而参与多种疾病的发生和发展，因此进一步观测CD226分子和IL-10在临床疾病中的作用及其机制有助于深入理解CD226分子的功能。鉴于此，本课题围绕CD226分子展开研究，获得了以下的研究结果：(1)在本实验室前期发现CD226mAbLeoA1可以调控MLC体系中细胞因子分泌格局的基础上，我们观测了LeoA1在MLC体系中上调IL-10表达的细胞机制，发现LeoA1作用于MLC体系24h时，CD4+IL-10+T细胞的比例与对照组相比显著升高，而CD14+IL-10+细胞、CD19+IL-10+细胞、CD56+CD16+IL-10+细胞、CD11c+HLA-DR+IL-10+细胞与对照组相比无显著性差异，提示LeoA1促进CD4+IL-10+T细胞的分化；进一步分别去除PBMC中的单核细胞、CD4+T细胞或B细胞亚群，发现分别去除单核细胞和CD4+T细胞后，MLC体系中IL-10的表达水平显著降低，提示单核细胞和CD4+T细胞参与LeoA1促进MLC体系中IL-10的分泌。(2)在应用WT小鼠和Cd226-/-小鼠成功建立小鼠EAE模型的基础上，我们发现Cd226-/-小鼠EAE发病时间比WT小鼠延迟且EAE严重程度减弱；腰髓组织HE染色结果显示，Cd226-/-小鼠在EAE发病高峰期时腰髓组织中炎性细胞的浸润减少；ELISA检测血清中细胞因子水平时，发现Cd226-/-小鼠在EAE发病高峰期体内血清中IL-10表达水平较WT小鼠高。(3)在收集了120名肺癌患者和83名健康志愿者的外周血标本基础上，我们通过提取全基因组DNA并运用PCR-RFLP方法结合统计分析研究人群中CD226单核苷酸多态性位点Gly307Ser(rs763361)与肺癌易感性的关联。结果发现，在非吸烟组人群中，肺癌人群中TT基因型的比例显著高于健康对照组，OR值为3.4846，95%CI为1.1932-10.1762，P值为0.0224。女性肺癌人群中TT基因型的比例(35.14%)与健康人群(14.29%)相比无显著性差异，但P值为0.0610，提4 第四军医大学硕士学位论文示CD226rs763361TT基因型可能与女性人群肺癌的易感性相关。关键词：CD226；白细胞介素10；混合淋巴细胞培养；单核细胞；CD4+T细胞；实验性自身免疫性脑脊髓炎；肺癌；单核苷酸多态性5 第四军医大学硕士学位论文TherelationshipbetweenCD226moleculeandclinicaldiseasesandthemolecularmechanismsCandidateformaster:ZengHanyuSupervisor:ChenLihuaDepartmentofImmunology,theFourthMilitaryMedicalUniversity；Xi’an710032,ChinaSponsoredPrograms:NationalNaturalScienceFoundationofChina(81571531)AbstractIn1985,AustralianprofessorBurnsG.immunizedmicewithactivatedlymphocytesinmixedlymphocyteculture(MLC)topreparemonoclonalantibody(mAb)ofactivatedTcellsurfaceantigen,thenamoleculewhichcouldbespecificallyrecognizedandexpressedonactivatedTcellsurfacemembranewasscreenedoutandnamedasLeoA1.Subsequently,moleculerecognizedbyLeoA1mAbwasalsofoundtobehighlyexpressedonthesurfaceofplatelet,sothismoleculewasnamedastheplateletactivationandTcellantigen1(PTA1).Inthe7thInternationalHumanLeukocyteDifferentiationAntigen(HLDA7)CollaborativeGroupCongressin2000,theanti-PTA1mAbsubmittedbyourlabandtheanti-DNAM-1mAbsubmittedbytheDNAXinstitutewereapprovedtoobtainanewCDnumber-CD226,whichisthefirsttimetonameanewCDmainlybasedonthestudiesofaChineselab.CD226moleculeisamemberoftheimmunoglobulinsuperfamily(IgSF)，whichcontainstwoV-likedomainsintheextracellularregionandthemoleculeweightisabout65kD.CD226moleculeismainlyexpressedinTcells,NKcells,NKTcells,megakaryocyte/plateletlineage,endothelialcells,thesubtypesofBcellandsomehematopoieticstemcells.In2003,twoligandsofhumanCD226moleculewere6 第四军医大学硕士学位论文successfullyidentified,andtheywerehumanpoliovirusreceptor(PVR/CD155)andCD112.TheinteractionsofCD226/CD226LswereinvolvedinthedifferentiationandactivationofTcells,thekillingoftumorcellsandvirus-infectedcellsbyNKcells,theadhesionofmonocyte/macrophagestoendothelialcells,thedifferentiationofmacrophagesandtheactivationandaggregationofplatelets,etc.Moreover,interactionsofCD226/CD226Lswerecloselyrelatedtosomediseases,suchasautoimmunediseases,graft-versus-hostreactionsandviralinfections.OurpreviousstudiesfoundthatCD226mAbLeoA1couldregulateexpressionlevelofcytokinesinhumanMLCsystem.SinceMLCsystemisamulti-cellculturesystemandIL-10isanimmunosuppressivecytokinethatcouldbesynthesizedandsecretedbymultipleimmunecells(dendriticcells,macrophages,mastcellsandNKcells,whichwereinvolvedininnateimmuneresponse;Th1,Th2,Th17,Treg,CD8+TcellsandBcells,whichwereinvolvedinadaptiveimmuneresponse).ItisabsolutelynecessarytofindoutthecellularmechanismofhowCD226moleculecouldinfluencethesecretionofIL-10inMLCsystem.What’smore,asanimportantimmunosuppressivecytokine,IL-10modulatesthestrengthofimmuneresponseinvariousstagesandvarioussitesofbodyimmuneresponse,thusparticipatingintheonsetandprogressofmanydiseases.Therefore,thefurtherstudiesaboutroleswhichCD226andIL-10playinclinicaldiseaseswillhelpustodeeplyunderstandthefunctionsofCD226.Giventhis,ourstudieshavefocusedonCD226andwehaveobtainedthefollowingresults:(1)BasedonthepreviousfindinginourlabthatCD226mAbLeoA1couldregulatecytokinesecretioninMLCsystems,weobservedthemechanismsofhowLeoA1couldupregulateIL-10expression.24hoursafterLeoA1wereaddedintoMLCsystem,wefoundthatthepercentageofCD4+IL-10+Tcellswassignificantlyhighercomparedwithcontrolgroup,whilethepercentagesofCD14+IL-10+cell,CD19+IL-10+cell,CD56+CD16+IL-10+cells,CD11c+HLA-DR+IL-10+cellswerenotsignificantlydifferentfromcontrolgroup,suggestingthatLeoA1mightpromoteCD4+IL-10+Tcelldifferentiation.Inaddition,weremovedmonocytesorCD4+TcellsorBcellsfromPBMC,respectively.ThenwefoundthattheexpressionlevelofIL-10inMLCsystemcouldbesignificantlyreducedafterremovingmonocytecellsorCD4+TcellsfromPBMC.ItsuggestedthatmonocytesandCD4+TcellsmightbeinvolvedinLeoA1promotingthesecretionofIL-10inMLCsystem.7 第四军医大学硕士学位论文(2)AfterEAEmodelwithCD226knockoutmiceandwildtypemiceweresuccessfullyestablished,wefoundthatcomparedwithwildtypemice,theonsettimeofEAEdelayedandtheseverityofEAEdecreasedinCD226knockoutmice.TheHEstainingoflumbarmyeloidtissueshowedthattherewerelessinflammatorycellsinfiltratinginCD226knockoutmiceatthepeakperiodofEAE.ELISAshowedthattheserumexpressionlevelsofIL-10inCD226knockoutmicehigherthanthatinwildtypemiceatthepeakperiodofEAE.(3)Bloodsamplesof120lungcancerpatientsand83healthyvolunteerswerecollected,thenweextractedgenomicDNAandexaminedtherelationshipbetweenCD226singlenucleotidepolymorphismsGly307Ser(rs763361)andtheriskoflungcancerbyPCR-RFLPcombinedwithstatisticalanalysis.Wefoundthatinnon-smokinggroup,theratioofTTgenotypeishigherinlungcancerpatientsthanthatinhealthycontrols(OR=3.4846,95%CI:1.1932-10.1762,P=0.0224).Infemalegroup,therewasnosignificantdifferenceofTTgenotyperatiobetweenlungcancerpatients(35.14%)andhealthycontrols(14.29%),butthePvalueis0.0610,whichsuggestingCD226rs763361TTgenotypemaybeassociatedwiththesusceptibilityofwomenlungcancer.Keywords:CD226;IL-10;MLC;monocytes;CD4+Tcells;EAE;lungcancer;SNP8 第四军医大学硕士学位论文前言近年来，有关CD226分子的功能研究越来越受到广大免疫学者的关注，从最早发现参与CTL细胞的细胞毒作用到新近研究其影响Treg细胞的稳定性和单核细胞的炎性状态等，这些研究丰富了CD226分子在机体免疫应答中的作用。从临床疾病的角度来讲，CD226分子涉及多种免疫紊乱相关的疾病，如各种肿瘤和多种自身免疫性疾病的发生和发展。因此，CD226分子的功能及其与临床疾病关系的研究具有现实意义。鉴于此，本课题围绕CD226分子与临床疾病的关系，从(1)CD226mAbLeoA1促进混合淋巴细胞培养体系中IL-10的分泌及其机制；(2)Cd226-/-小鼠EAE发病延缓及其初步分子机制；(3)人CD226基因单核苷酸多态性与肺癌易感性的关系三个方面展开研究。本研究结果将为全面了解CD226分子的生物学功能及其与临床疾病的关系提供重要的实验依据。9 第四军医大学硕士学位论文文献回顾一、CD226分子的结构1.CD226分子的发现和命名CD226，即TLisA1、PTA-1、DNAM-1，属于免疫球蛋白超家族的成员，是分子量约为65kD的粘附分子，该分子胞膜外包含2个免疫球蛋白V样结构域[1,2]。BurnsG.于1985年最早发现CD226分子表达于T细胞表面，证明其与CTL的活化相关，于是命名其为T细胞谱系特异性活化抗原1(Tlineagespecificactivationantigen1,TLisA1)[3]。随后的研究证实CD226分子表达于血小板[1]，且参与血小板的活化与聚集，故被称为血小板和T细胞活化抗原1(plateletandTcellantigen1,PTA1)。1996年，研究发现DX11mAb可以阻断CTL杀伤肿瘤细胞[1]，将该分子命名为DNAX辅助分子1(DNAXaccessorymolecule-1,DNAM-1)。1997年，经Burns等证实，TLISA1和DNAM-1是同一分子[2]。2000年，在第七届国际人类白细胞分化抗原协作组会议上，将该分子正式统一名称为CD226[4]。2.CD226分子的基因和结构CD226在人和小鼠基因中属于保守序列，分别位于染色体的18q22.3和18E4。人CD226的cDNA全长为2664bp，含有一个开放阅读框，编码由18个氨基酸组成的前导序列和318个氨基酸组成的成熟CD226蛋白。人的CD226基因含有7个外显子和6个内含子，其中外显子7编码胞浆区的41个氨基酸[5]。2002年，我室首次鉴定成功小鼠Cd226基因，其cDNA全长2487bp，含有1002bp的开放阅读框，编码由18个氨基酸组成的前导序列和315个氨基酸组成的CD226蛋白[6]。2006年，我室成功鉴定了人CD226基因的启动子序列[7]，发现该分子具有两个启动子序列，并命名为P1和P2，分别位于-810至-287bp和+33至+213bp处。P1和P2两个启动子均可被佛波酯(phorbolester，PMA)和钙离子载体所调节。此外，P1与P2之间还存在一个负性调控元件。生物信息学分析表明，在CD226基因序列中，包含转录因子活化蛋白1(activatingprotein-1，AP-1)、Sp1、多瘤增强剂激活3(polyomaenhancer10 第四军医大学硕士学位论文activator3，PEA3)和Ets-1的结合位点。转录因子AP-1促进人肝癌细胞中P1和P2区的转录，上调CD226的表达。有趣的是，转录因子Ets-1促进AP-1诱导的P2区转录的活性，但抑制AP-1调控的P1区的转录活性(位于一个10bpAP-1/Ets-1的混合位点CCTTCCTTCC)[7]。据文献报道，存在于CD226基因外显子区的单核苷酸突变有三种，包括CD226rs763361，rs34794968，rs727088[8]。研究证实CD226基因的这三种单核苷酸多态性与多种自身免疫性疾病的易感性相关[8]。CD226rs763361/Gly307Ser非同义突变与Ⅰ型糖尿病(type1diabetes，T1D)、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)[9-11]、多发性硬化(multiplesclerosis，MS)、自身免疫性甲状腺炎(autoimmunethyroiddisease，AITD)和系统性硬化(systemicsclerosis，SSc)[12]等自身免疫性疾病的易感性相关。因为这种等位基因编码的非同义突变可编码CD226蛋白的胞浆尾部(外显子7)，这一突变可能会影响T细胞或其他细胞的功能[9]。其它假设推测这种突变可能会扰乱增强子和(或)沉默子的结合位点，继而改变RNA的剪接[9]。除此之外，rs763361甘氨酸替换为丝氨酸后可能也干扰了CD226分子322酪氨酸位点和329丝氨酸位点的磷酸化，以及下游信号通路中的翻译后修饰[13,14]。CD226rs727088这一单核苷酸多态性可能具有在转录水平影响CD226表达的功能[15],研究中发现其与肿瘤易感的相关性极强。CD226rs34794968的单核苷酸突变单独作用，并不影响疾病的发生发展，但其可与上述两种突变协同发挥作用[8]。MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码内源性的小RNA，能够通过结合未翻译的靶基因的3’端非编码区调节转录后翻译过程。越来越多的证据表明miRNAs可以调节NK细胞活化性受体和功能相关基因的表达[16]。研究发现miR-422a的靶点是CD226前体RNA的3’端，并发现下调miR-422a可引起NK细胞中CD226的表达显著增加，进而上调NK细胞识别和杀伤肿瘤细胞的能力[17]。人的CD226分子属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，全长318个氨基酸，其中胞膜外结构域含有230个氨基酸，包括2个免疫球V样结构域和8个N连接的糖蛋白位点；跨膜区结构域含有28个氨基酸；胞膜内结构域含有60个氨基酸，推测该结构域包含有4个酪氨酸残基和1个丝氨酸残基，磷酸化后能够募集信号蛋白。这一反应发生的基础是CD226与其配体的相互作用。膜型和可溶型的CD226分子结合nectin-2分子免疫球蛋白V样结构域[18]。CD226分子包膜外第一个结构域是其发挥识别配体、粘附11 第四军医大学硕士学位论文作用、免疫突触形成和细胞毒作用的结构基础[19]。3.CD226分子的表达分布CD226分子广泛表达于造血细胞，如T细胞[20]、自然杀伤(naturalkiller，NK)细胞[26]、NKT细胞、B细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞(dendrticcells，DC)、巨核/血小板谱系[23,24]、造血前体细胞等[3,21-25]。近期研究表明，高表达CD226分子的NK细胞可以分泌高水平炎性细胞因子，增强IL-15的信号通路，并显著促进NK细胞增殖，有可能是成熟NK细胞的标志之一[26]。有研究认为在小鼠外周血中，CD226分子选择性地高表达于炎性单核细胞(inflammationmonocytes，iMos)，而非“巡逻”中的单核细胞(patrollingmonocytes，pMos)；在人的外周血中得到了同样的结果，CD14+CD16-iMos高表达CD226而CD14loCD16+pMos表达极低水平的CD226分子[27]。4.CD226分子的配体2003年，BottinoC等证实人CD226分子的配体是CD155(Necl-5,PVR)和CD112(nectin-2)，它们的分子量近似，分别为70KD和65/60KD；属于nectin样蛋白家族的成员和nectin蛋白家族的成员(它们的成员分别包括Necl1、Necl2、Necl3、Necl4、Necl5和nectin1、nectin2、nectin3、nectin4)[28,29]。2005年，Tahara-HanaokaS等学者证实小鼠CD226分子的配体也是CD155和CD112[30]。CD155和CD112分子广泛表达于多种组织细胞，如神经细胞、内皮细胞、上皮细胞、抗原提呈细胞、成纤维细胞、病原体感染的细胞和多种肿瘤细胞[28,31-36]。它们也表达于免疫细胞，如单核细胞、DCs和活化的T细胞[34]。CD155分子是一个跨膜糖蛋白，也是脊髓灰质炎病毒的细胞受体，胞膜外结构域介导细胞与胞外基质玻连蛋白的粘附，而其胞内结构域结合动力蛋白。CD112分子是浆膜黏着连接的组成部分，它与病毒在细胞间的传播有关。CD226分子与其配体的相互作用介导NK细胞和其它免疫细胞间的信号传递，并具有维持内稳态的功能[34]。文献报道，对于CD226分子这一受体而言，配体CD155的亲和力高于CD112的亲和力[22,32,37]。既往研究亦表明，阻断CD155分子的信号通路可钝化NK细胞介导的杀伤肿瘤作用。然而，阻断CD112分子信号通路不能够抑制NK细胞介导的杀12 第四军医大学硕士学位论文伤作用，说明CD155是CD226介导的NK细胞毒作用的主要配体[38]。也表明CD226的配体通过与活化性受体CD226的相互作用介导NK细胞识别和杀伤靶细胞[17]。与诱导NKG2D配体过程相似，靶细胞受细胞应力作用激发了细胞固有免疫应答，可导致CD226分子的配体异常表达[39]，表现在多种病理因素，例如肿瘤发生、炎症相关疾病、病毒感染和其它具体“压力因素”均可诱导CD226分子的配体，尤其是CD155分子的异常表达[17]。首先，包括致瘤转换、化学疗法、氧化应激、病毒感染和抗原刺激T细胞的异常增殖引起的DNA损伤，通过DNA损伤感受器可刺激CD155和CD112的基因转录[40-43]。近年来报道，一氧化氮(nitricoxide，NO)可诱导CD155分子的高水平表达，通过DNA损伤反应网络的活化发挥抗肿瘤活性[44]；KrizhanovskyV和他的同事发现，细胞衰老可上调CD155分子的表达，介导NK细胞杀伤肝星形细胞[45]，抑制肝纤维化的进程；Toll样受体(toll-likereceptor，TLR)与病原体相关分子模式(pathogenassociatedmolecularpatterns，PAMPs)[46]和损伤相关分子模式(damageassociatedmolecularpatterns，DAMPs)的相互作用增加了CD155分子的表达[46]。人巨细胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)[47]和免疫缺陷病毒1型(humanimmunodeficiencyvirus-1，HIV-1)[48]的感染可以诱导下调CD155分子和CD112分子的表达。此外，通过Nef和Vpu蛋白，HIV-1能够下调细胞毒细胞表面CD226分子的表达，并下调被感染细胞表面CD155的表达。这种方式可以帮助感染HIV-1的细胞逃避NK细胞依赖的细胞毒作用[49]。除CD226分子外，CD155或CD112分子[49]可结合TIGIT(TcellIgandITIMdomain,TIGIT)分子，抑制NK细胞和T细胞的增殖、抑制细胞因子IFN-γ、IL-6、TNF-α等的分泌，主要介导NK细胞和T细胞的抑制信号[49]。CD155分子亦可结合CD96分子，促进NK细胞与靶细胞的粘附[50]。CD96也属于免疫球蛋白超家族的成员，胞膜外区含有3个免疫球蛋白样的环状结构[50]。此外，CD155可以与整合素αvβ3、血小板生长因子(platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)受体形成三元复合体参与细胞生长和运动的调节[51]。二、CD226分子的功能近年来，越来越多的研究已开始关注CD226分子的功能，从最初研究CTL和NK细胞的杀伤功能到近期研究的Treg细胞的稳定性和抑制功能等。以下是CD22613 第四军医大学硕士学位论文分子在不同细胞中的生物学功能。1.CD226分子参与CTL细胞和NK细胞的功能在人体，CD226分子高水平表达于NK细胞和CD8+T细胞表面[1]。在小鼠中，40-50%的NK细胞和全部的CTL细胞组成性表达CD226分子[52]。CD226分子作为粘附分子促进CD8+T细胞的迁移、活化、增殖、分化和效应功能的发挥。CTL细胞需要通过粘附分子迁移到炎症感染局部或肿瘤微环境中建立紧密接触[53]。在二级淋巴器官，粘附分子介导CTL细胞与专职抗原提呈细胞的相互作用，最终使它们活化、增殖和分化。CD226/CD155的相互作用对于CD8+T细胞增殖和抗原特异性CD8+T细胞的免疫应答十分重要[33]。在人HIV-1病毒慢性感染的过程中，由CD226介导的CD8+T细胞的共刺激信号通路被中断。因此，CD8+T细胞表面CD226分子的表达下调损耗CTL的效应功能[54]。越来越多的证据表明CD226分子参与NK细胞的生物学功能[26,55,56]。CD226与CD155和/或CD112的结合，协同NKp30分子的作用，可诱导NK细胞溶解未成熟DC，促进成熟DC的增殖[57]。CD226/CD226Ls轴涉及NK与T细胞的交联。在移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease，GVHD)[58]和其他自身免疫性疾病中[59]，NK细胞能够识别并杀伤经抗原刺激的活化/增殖的T细胞，促进辅助性T细胞的分化。CD226分子也与CD96、TIGIT、CRTAM等分子协同作用参与对NK细胞功能的调节[19,26,34,56,60,61]。细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后，CD226缺陷的小鼠体内IFN-γ+NK细胞比例与野生型小鼠相比显著降低[61]。CD96被认为能够抑制NK细胞分泌IFN-γ，因此，CD96和CD226分子是相互反向调节NK细胞中IFN-γ分泌的[61]。TIGIT，CD96和CRTAM均能够识别nectin和Necl家族分子，调节NK细胞的功能，这进一步复杂了CD226分子在NK细胞生物学功能中的研究[61]。近年报道，CD226分子与这三种分子的协同作用，平衡了体内NK细胞的活化[56]。研究表明，CD226分子、2B4分子、NKG2D分子或者NKp46分子的单独活化均不能激发NK细胞的活化[62]。这些分子中的两个分子必须参与NK细胞细胞毒作用和诱导细胞因子的分泌，剩余的分子则促使NK细胞迅速改变其胞内环境；这证明在这些活化性受体中，就NK细胞活化而言，它们没有“等级差异”[62]。近期研究表明CD226分子参与NK细胞的驯化和分化、免疫突触的形成、细胞14 第四军医大学硕士学位论文因子分泌以及与DC和T细胞的交联。AnfossiN等最早认识到CD226分子与NK细胞的驯化相关，认为CD226分子在已驯化和未驯化的NK细胞中表达形式不同[63]。随后，EnqvistM等检测了NK细胞表面一系列的活化性受体与粘附分子，发现只有CD226的表达涉及驯化过程中自身特异性抑制性受体的表达；这些发现表明CD226分子是已驯化NK细胞的一个固有标志，与其成熟后的细胞毒功能相关[55]。CD226分子参与免疫突触的形成，阻断CD226分子就能够阻碍免疫突触的形成，导致NK细胞和靶细胞粘附下降，继而降低CD226分子介导的溶细胞作用[19,64]。多种分子参与对NK细胞表面CD226分子表达的调节，如TGF-β、GM-CSF/IL-2(hGIFT2)融合蛋白、糖皮质激素和肿瘤微环境等[65-69]。在人类，IL-2或IL-15单独或GM-CSF/IL-2融合蛋白、糖皮质激素可上调NK细胞表面CD226分子的表达；而吲哚胺2,3-双加氧酶、TGF-β和一些肿瘤细胞表面表达的CD155分子能够下调NK细胞CD226的表达[65-69]。2.CD226分子参与CD4+T细胞的功能2005年，DardalhonV等学者认为在小鼠体内CD226分子是Th1细胞的特异性的表面标记[52]。2006年，ShibuyaK.等学者认为小鼠新鲜的CD4+T细胞也表达低水平的CD226分子，初始T细胞表达CD226分子，大部分极化的Th1、Th2细胞也表达CD226分子[70]。2015年，FuhrmanC研究发现CD226分子表达于记忆性的CD4+T细胞[71]。2013年，SutavaniR等证明，人I型调节性T细胞(type1regulatoryTcells，Tr1)的表面标记是CD4+CD49b+LAG-3+CD226+[72]。Tr1是一类在IL-10存在条件下的慢性活化的CD4+T细胞，具有低增殖能力、高分泌IL-10、低表达IL-2和IL-4的功能[73]。CD226分子在人I型调节性T细胞表面高表达，并参与对髓系抗原提呈细胞的杀伤[74]。Tr1具有下调免疫应答、维持外周免疫耐受等作用，在治疗自身免疫性疾病、肿瘤以及克服同种异体组织器官移植排斥反应等方面具有应用前景[72]。近期研究发现，表达于人Treg细胞表面的CD226和TIGIT分子与其稳定性和抑制功能相关。CD226+TIGIT-的Treg亚群其纯度和抑制功能在扩增以后均会减弱，并伴随IL-10和效应性细胞因子的增多，提示CD226分子的表达影响了Treg效应功能的发挥[71]。CD226-TIGIT+Tregs细胞亚群高表达水平的Foxp3[71]、helios并伴有Treg15 第四军医大学硕士学位论文特异性去甲基化区域(Treg-specificdemethylatedregion，TSDR)去甲基化程度显著升高。体外抑制实验表明Treg细胞TIGIT的表达与其强烈的抑制活性相关。另一方面，活化的tTreg细胞，CD226的表达水平上调，因此在寻找阻断CD226减弱传统效应T细胞活性的过程中，要注意阻断剂量，避免Treg的功能被同时减弱[71]。3.CD226分子参与其他细胞(内皮细胞、血小板、造血干细胞和肥大细胞等)的功能静止的人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVEC)[75]微弱表达CD226分子，但当其活化后，CD226分子表达显著增加，并参与活化内皮细胞和淋巴细胞的粘附。2003年，BottinoC等发现CD155分子和CD112分子表达于早期血管内皮细胞的细胞连接处。CD226分子或CD155分子的单抗可以抑制NK细胞的跨内皮迁移，说明在某种程度上，CD226分子参与NK细胞的跨内皮迁移[28]。CD226分子也表达于血小板。CD226分子与其mAb交联可诱导血小板活化，接着凝血酶诱导CD226酪氨酸磷酸化，继续介导血小板的粘附[23]。随后研究证明CD226分子介导血小板和巨核系细胞与血管内皮细胞的粘附[24]。人肥大细胞和嗜酸性粒细胞可同时表达CD226分子及其配体CD112分子。在过敏性炎症的后期和慢性发展期，肥大细胞与组织浸润的嗜酸性粒细胞形成了一个调节单元，在嗜酸性粒细胞的存在下，肥大细胞FcεRI介导的脱颗粒被增强，并且该效应部分由CD226/CD112相互作用引发Fyn、LAT和磷脂酶Cγ2(phospholipaseCgamma2，PLCγ2)依赖的信号途径参与了上述过程[76]。三、CD226分子与临床疾病近年来，越来越多的研究表明CD226分子与自身免疫性疾病、移植排斥反应、肿瘤和感染性疾病相关。1.CD226分子与自身免疫性疾病人类自身免疫性疾病是由许多等位基因突变引起的复杂的遗传疾病。这种突变在一定程度上来说，是机体对微生物感染作出的一种反应。多种突变随机的累积在一个人的基因中，就会使其患自身免疫性疾病的风险增加[77]。研究发现多种基因的突变与自身免疫性疾病相关，如CTLA-4、CD58、CD40、CD244、肿瘤坏死因子(tumor16 第四军医大学硕士学位论文necrosisfactor，TNF)配体和CD226等，这些免疫基因的共刺激信号共同促成了人类自身免疫性疾病的发病机制[77]。近年来，测序技术的不断发展使得研究基因与疾病的关系日趋简单化。CD226基因的多态性与自身免疫性疾病易感性的研究也进入了新的阶段。CD226rs763361是307位甘氨酸替换为丝氨酸。这一突变可能与一系列的免疫相关疾病的发生发展相关，例如SLE、SSc、T1D和RA等[78-81]。系统性硬化症是一种影响结缔组织的慢性自身免疫性疾病，特征是真皮组织纤维化和皮肤增厚。在Cd226-/-小鼠模型中，纤维化的特征减弱；而野生型小鼠则展现纤维化的特征。由此推测，CD226的表达促进SSc的病情发展[79]。在RA的体外模型中，CD226和CD226Ls分别表达于NK细胞和RA患者的成纤维样滑膜细胞(fibroblast-likesynoviocytes，FLS)，提示RA-FLS细胞可被NK细胞识别并杀伤[82]。许多研究发现自身免疫性疾病与NK细胞的功能紊乱相关，推测CD226分子307位甘氨酸到丝氨酸的突变可能引起NK细胞的功能紊乱[83]。2.CD226分子与移植排斥反应同种异体的骨髓移植(bonemarrowtransplantation，BMT)是许多遗传和获得性血液恶性肿瘤的有效治疗方式。然而，这种治疗的结局很大程度上依赖于移植物抗宿反应(graftversus-hostreaction，GVHR)的发生和发展程度[84]。研究表明，一方面供者移植物CD226分子的缺失能够减弱MHC匹配或不匹配引起的GVHD。受者清髓预处理后GVHD的结局主要依赖CD4+T细胞介导，尤其是供者Foxp3+的Treg细胞的调节，而并非CD8+T细胞的效应。CD226分子的缺失可以促进骨髓移植后Treg细胞的增殖和抑制功能[85]。另一方面通过CD226/CD155的相互作用NK细胞可以破坏同基因的抗原提呈细胞和活化的T细胞[59]，以此发挥抗GVHD效应，控制GVHD的发展[86]。另外，在小鼠GVHD模型中，检测CD8+T细胞表面CD226的功能，发现CD226的共刺激信号诱导GVHD的恶化，当阻断CD226时可减弱GVHD的效应[85,87]。以上提示，CD226分子可以通过影响NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的功能，影响移植排斥的结局。17 第四军医大学硕士学位论文3.CD226分子与肿瘤CD226分子与其配体的相互作用涉及体内外NK细胞介导的识别、调控与杀伤肿瘤细胞，着重强调于外在和内在的细胞机制的联系[88]。CD226Ls表达于多种肿瘤细胞表面，如肺癌、人初期白血病、骨髓瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、结直肠癌和尤文肉瘤[17]。在小鼠淋巴瘤中，Tahara-HanaokaetS等认为体内CD226分子的作用是抑制肿瘤的发展[89]。肿瘤细胞表面表达高水平的CD155分子和CD112分子，可以引起肿瘤排斥，这一过程是NK细胞介导的CD226依赖的机制[89]。表达CD155的神经母细胞瘤可以被NK细胞有效地杀伤，阻断CD155或CD226可以显著抑制NK细胞的杀伤功能[38]。Iguchi-ManakaA等发现Cd226-/-小鼠体内在诱导表达CD226分子配体的肿瘤形成后，发现NK细胞的细胞毒活性很低。他们证明了Cd226-/-小鼠比野生型小鼠更易患肿瘤，表明CD226分子在肿瘤监视中具有重要作用[90]。与膜型CD226分子发挥抗肿瘤作用相似，可溶型的CD226分子与CD155/CD112分子同样以剂量依赖的方式抑制肿瘤细胞生长[91]。然而，肿瘤细胞可以建立多种机制逃避CD226介导的杀伤作用。最有效和最常见的策略是下调细胞毒性淋巴细胞表面CD226分子的表达[92]。在小细胞肺癌中，通过NK细胞和肿瘤细胞的相互作用，或者通过分泌免疫调节因子TGF-β和吲哚胺2,3双加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase，IDO)下调CD226的表达，最终逃避NK细胞有效地杀伤、免疫监视并促进肿瘤发展[69]。血清中可溶型的CD155可阻断CD226介导的识别作用，帮助肿瘤细胞逃逸免疫攻击[93]。近期，应用[94]T细胞装备嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)治疗肿瘤的方法有了重大突破。文献报道，CD226CART细胞具有不同的信号分子，如CD3ζ,CD28,CD40和4-1BB，展现了较高水平的细胞毒活性[95]。NK细胞作为杀伤肿瘤细胞的“主力军”，但与CART细胞相比，NK细胞装配CARs，其抗肿瘤作用不及前者[94]，这似乎与抗肿瘤免疫理论是矛盾的。4.CD226分子与感染性疾病既往报道，CD226分子在抑制淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocyticchoriomeningitisvirus，LCV)、人巨细胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)[96]、18 第四军医大学硕士学位论文丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)[97]和人类免疫缺陷病毒1型(humanimmunodeficiencyvirus-1，HCV-1)等感染中发挥重要作用[54]。既往研究表明，CD226分子的缺失会导致淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的清除延迟和高水平的病毒滴度[98]。CD226分子在感染早期NK细胞介导的抗病毒免疫反应中发挥着重要作用，如NK细胞能够识别和杀伤HCMV感染的髓系DCs，所以能够减弱病毒对免疫系统的侵袭[96]。病毒或细菌的成分与DC表面的TLR结合可上调CD226Ls的表达，以便被表达CD226分子的NK细胞识别和杀伤[46]。干扰素α活化的NK细胞有效地识别和杀伤HCV感染的肝细胞，研究发现其依赖活化性受体CD226[97]。19 第四军医大学硕士学位论文正文第一部分CD226mAbLeoA1促进混合淋巴细胞培养中IL-10的分泌及其机制1材料1.1外周血标本和细胞健康人外周血均取自西京医院输血科并获得知情同意。单向MLC培养体系的刺激细胞为Daudi(人B淋巴瘤细胞)，由本实验室冻存，在本校钴源室用60Co照射后备用。1.2试剂人IL-10ELISA检测试剂盒购自美国Biolegend公司(货号:430604)。抗SEDmAb、LeoA1mAb均由我室制备并保存。RPMI1640不完全培养基、胰酶-EDTA混合液购自HyClone公司。人外周血淋巴细胞分离液购买于天津灏洋生物制品科技有限责任公司。四季青无支原体新生牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。青链霉素混合液(100X)购自北京博艾尔科技有限责任公司。PMA-离子霉素混合液和布雷菲德菌素A(BrefeldinA，BFA)(1000X)购自美国Biolegend公司。PerCP/Cy5.5anti-CD4、FITCanti-CD56、APCanti-CD16、PerCP/Cy5.5anti-CD16、FITCanti-CD14、FITCanti-CD19、PerCP/Cy5.5anti-CD11c、FITCanti-HLA-DR、PEanti-CD16、PEanti-IL-10及各种同型对照抗体购自美国Biolegend和eBioscience公司。人CD4+T细胞磁珠分选试剂(货号：130-045-101)、B细胞磁珠分选试剂(货号：130-050-301)和单核细胞磁珠分选试剂(货号：130-050-201)均购自德国Miltenyi生物技术公司。20 第四军医大学硕士学位论文1.3主要溶液配制10%FCS1640完全培养基：10%FCS+90%RPMI1640+1%青链霉素混合液FCM洗液：450mL1×PBS+25mLFBS+25mL4%NaN3固定液：1000mL1×PBS+20g葡萄糖+10mL甲醛+0.2gNaN3磁珠分选缓冲液：PBS+2%FCScellstainingbuffer：500mLPBS+5%FCS+0.5gNaN30.05%吐温-PBS液：500mLPBS+250μL吐温201.4主要仪器酶标读数仪Bio-Rad公司MACS手动细胞分选器德国Miltenyi生物技术公司FACSCaliber流式细胞仪美国BD公司2方法+2.1免疫磁珠阳性分选CD4T细胞、单核细胞和B细胞2.1.1外周血单个核细胞的分离1)取抗凝管中的新鲜外周血与等体积的生理盐水于15mL离心管中混匀；2)向15mL离心管中加入与外周血等体积的人淋巴细胞分离液；3)将稀释好的外周血吸出，沿离心管壁缓慢、轻柔地加到淋巴细胞分离液上层，尽量保持分离液面的完整；4)2000rpm，20min，去“刹车”档，离心；5)轻轻旋转离心管，小心吸取“云雾层”细胞，即单个核细胞(介于上层血浆与中层淋巴细胞分离液之间)于另一离心管中。尽量减少吸入上层血浆中的血小板及下层的淋巴细胞分离液。6)向“云雾层”细胞中加入5倍体积的生理盐水，充分混匀后，1500rpm，5min，离心，弃去上清；7)重复上述操作一次；8)1640完全培养基重悬细胞，并计数。21 第四军医大学硕士学位论文2.1.2分别去除CD4+T细胞、B细胞或单核细胞的外周血单个核细胞的制备1)新鲜分离正常人PBMC，细胞计数后，重悬，300g，离心10分钟，弃去上清；2)磁珠分选缓冲液重悬细胞为80μL/107个细胞；3)加入人CD4免疫磁珠(或CD19免疫磁珠或CD14免疫磁珠)20μL/107个细胞，充分混匀后，4°C，孵育15min；4)用磁珠分选缓冲液重悬细胞1-2mL/107个细胞，300g，10min，离心，弃上清；5)将细胞重悬于500μL/108个细胞，准备分选；6)将500μL重悬好的细胞缓慢滴入用磁珠分选缓冲液润湿的MS柱子里，待其缓慢滴入下方的Eppendolf管中；7)待柱子中液体滴完后，加入500μL磁珠分选缓冲液，自然滴入下方的Eppendolf管中，重复3次(此为去除CD4+T的PBMC，或去除CD14+单核细胞的PBMC，或去除CD19+B细胞的PBMC)，离心重悬后待用；8)将MS柱子从磁架拿下后，向其中加入1mL磁珠分选缓冲液，用活塞冲洗柱子里的细胞于新Eppendolf管中(此为CD4+T细胞，或CD14+单核细胞，或CD19+B细胞)。9)取去除CD4+T的PBMC，或去除CD14+单核细胞的PBMC，或去除CD19+B细胞的PBMC各5×105用于FCM，鉴定细胞纯度。注：为了降低去除CD4+T的PBMC细胞中CD4+T细胞的比例，分选过程中应过MS柱子2次；去除CD19+B细胞和去除CD14+单核细胞过MS柱子一次即可。2.2混合淋巴细胞培养体系的建立1)PBMC与Daudi的混合淋巴细胞培养将分离的新鲜PBMC浓度调整为2×106/mL，Daudi细胞浓度调整为2×105/mL。将Daudi细胞和PBMC以1:1或1:2的体积比混合，使其终浓度分别为1×105/mL和1×106/mL或者分别为2×105/mL和1×106/mL。混合细胞液加入准备好的24孔板中，每孔设1mL培养体系，并在相应孔中分别加入过滤除菌的LeoA1及抗SEDmAb，抗体终浓度为20μg/mL。每个时间点·每个处理组分别设3个复孔。于培养6h、12h、24h、48h、72h时分别吸取MLC上清液，-20°C冻存待测细胞因子IL-10的水平。22 第四军医大学硕士学位论文2)分别去除CD4+T细胞、B细胞或单核细胞的PBMC与Daudi的混合淋巴细胞培养MLC的体系建立同上。2.3胞内细胞因子IL-10流式染色1)将MLC培养24h的各组细胞用PMA(25ng/mL)、离子霉素(500ng/mL)和BFA(1：1000)处理5小时；2)各管中加入相应的处理组细胞，1200rpm，5min，离心，弃去上清；3)各管中分别加入工作浓度的抗体：PerCP/Cy5.5anti-CD4、FITCanti-CD56和APCanti-CD16、FITCanti-CD14、FITCanti-CD19、PerCP/Cy5.5anti-CD11c和FITCanti-HLA-DR及各组相应的同型对照抗体，4°C孵育30min；4)1.5mLcellstainingbuffer重悬细胞，250g，5min，4°C，离心，弃去上清；5)重复上述操作一次；6)加入BD公司的细胞因子染色专用破膜/固定液，250μL/管，振荡，4°C孵育30min；7)1mL专用破膜洗液重悬细胞，400g，5min，4°C，离心，弃去上清；8)1mL专用破膜洗液重悬细胞，100μL/管。各管分别加入商品化抗体PEanti–IL-10和其同型对照抗体，振荡，4°C孵育30min；9)1.5mL专用破膜洗液重悬细胞，400g，5min，4°C，离心，弃去上清；10)1.5mLcellstainingbuffer重悬细胞，400g，5min，4°C，离心，弃去上清；11)500μL/管的流式固定液重悬细胞，上机进行FCM检测。2.4培养上清中IL-10的检测1)包被：将IL-10ELISA试剂盒中的包被抗体，按说明书稀释后，加入96孔ELISA板中，100μL/孔，4°C，过夜；2)0.05%吐温-PBS液洗板5次；3)封闭：将试剂盒中的5×AssayDiluent用ddH2O稀释为1×工作液，每孔200μL，室温放置1h；4)0.05%吐温-PBS液洗板4次；23 第四军医大学硕士学位论文5)加标准品及待检样品，室温放置2h。标准品的稀释：用1×工作液稀释标准品的浓度为300pg/mL，继续将标准品倍比稀释为150pg/mL，75pg/mL，37.5pg/mL，18.75pg/mL，9.375pg/mL，4.6875pg/mL。将这7个浓度的标准品分别加入ELISA板中，并用1×AssayDiluent设空白对照，100μL/每孔，做标准曲线。样本的稀释：为使样本的浓度在检测范围内，将样本稀释5倍，10倍，20倍，选择合适的稀释比例，每样本×每稀释倍数设计3个复孔。样本稀释液用1×AssayDiluent；6)0.05%吐温-PBS液洗板3-5次；7)加入检测抗体：将检测抗体按说明书用1×AssayDiluent稀释，100μL/孔，室温放置1h；8)0.05%吐温-PBS液洗板3-5次；9)加酶标二抗Avidin-HRP：将Avidin-HRP按说明书用1×AssayDiluent稀释，100μL/孔，室温放置30min；10)0.05%吐温-PBS液洗板5-7次；11)显色：加底物SubstrateSolution，100μL/孔，室温放置15min；12)终止：加入2MH2SO4，50μL/孔；13)读数：用酶标仪在450nm波长下读数。24 第四军医大学硕士学位论文3结果3.1CD226mAbLeoA1促进混合淋巴细胞培养中IL-10的表达图1.1CD226mAbLeoA1对促进混合淋巴细胞培养中IL-10表达将分离的PBMC(1×106)与钴源室照射过的Daudi细胞(1×105)在CD226mAbLeoA1或者同型对照抗体抗SED单抗存在的条件下，混合培养6h、12h、24h、48h、72h。收集培养上清，ELISA检测培养上清中IL-10的表达。由图可见，培养上清中IL-10的表达在24h时最高(n=3)。25 第四军医大学硕士学位论文3.2CD226mAbLeoA1作用后MLC体系中分泌IL-10的细胞亚群的鉴定图1.2CD226mAbLeoA1上调MLC体系中CD4+IL-10+T细胞比例将分离的PBMC(1×106)与钴源室照射过的Daudi细胞(1×105)在CD226mAbLeoA1或者同型对照抗体抗SED单抗存在的条件下，混合培养24h。PMA(50ng/mL)、离子霉素(500ng/mL)和BFA(1：1000)作用5h。收集各组细胞，胞內细胞因子染色结合流式细胞术分析检测CD4+IL-10+T细胞(图A)、CD14+IL-10+细胞(图B)、CD19+IL-10+细胞(图C)、CD56+CD16+IL-10+细胞(图D)和CD11c+HLA-DR+IL-10+细胞(图E)的比例。实验结果显示，CD226mAbLeoA1刺激MLC体系24h后，CD4+IL-10+T细胞的比例增加，而B细胞、单核细胞、DC、NK细胞中IL-10+细胞的比例与对照组相比无显著性差异。26 第四军医大学硕士学位论文3.3不同细胞亚群在LeoA1促进混合淋巴细胞培养中IL-10分泌的作用图1.3去除CD4+T细胞逆转MLC中CD226mAbLeoA1促进IL-10分泌的作用MACS方法阳性分选人CD4+T细胞，取不含CD4+T细胞的PBMC细胞，即CD4deletePBMC。PBMC(1×106)、CD4deletePBMC(1×106)与钴源室照射过的Daudi细胞(1×105和2×105)在加入CD226mAbLeoA1或抗SED单抗的条件下，混合培养24h，ELISA检测培养上清IL-10的浓度。图A示，CD4deletePBMC细胞中CD4+细胞的比例。MACS阳性分选后，CD4deletePBMC中CD4+细胞的比例约为8%。图B、C分别表示当CD4deletePBMC和PBMC分别与Daudi细胞，即反应细胞：刺激细胞为10:1和5:1混合培养后，培养上清中IL-10的表达水平。由图可见，反应细胞：刺激细胞为5:1时，抗人SED单抗处理CD4deletePBMC作为反应细胞的MLC体系与PBMC作为反应细胞的MLC体系相比较，IL-10的表达无显著性差异，提示CD4deletePBMC为反应细胞的MLC体系中两种抗体的Fc段并不影响IL-10的表达。当用LeoA1分别处理CD4deletePBMC为反应细胞的MLC体系和PBMC为反应细胞的MLC体系后，发现前者IL-10的表达显著下降，且具有统计学意义，提示CD4+T细胞在CD226mAbLeoA1的表达促进MLC体系中IL-10表达中发挥作用。27 第四军医大学硕士学位论文图1.4去除CD14+细胞显著逆转MLC中CD226mAbLeoA1促进IL-10分泌的作用MACS方法阳性分选人CD14+单核细胞，取不含CD14+单核细胞的PBMC细胞，即CD14deletePBMC。PBMC(1×106)、CD14deletePBMC(1×106)与照射过的Daudi细胞(1×105和2×105)在加入CD226mAbLeoA1或抗人SED单抗的条件下，混合培养24h，ELISA检测培养上清IL-10的浓度。图A示，CD14deletePBMC细胞中CD14+细胞的比例。MACS阳性分选去除CD14+细胞后PBMC中CD14+细胞的比例约为2%。图B、C表示当CD14deletePBMC和PBMC分别与Daudi细胞为10:1和5:1混合培养后，培养上清中IL-10的表达水平。由图可见，当反应细胞：刺激细胞为10:1时，CD226mAbLeoA1处理CD14deletePBMC为反应细胞的MLC体系时，与对照组的MLC体系相比较，IL-10的表达无显著性差异；但同型对照抗体处理CD14deletePBMC和PBMC为反应细胞的MLC体系时，IL-10的表达有显著性差异，提示CD14+细胞对MLC体系中IL-10的分泌十分重要；当反应细胞：刺激细胞为5:1时，与反应细胞：刺激细胞为10:1的结果相似。28 第四军医大学硕士学位论文图1.5B细胞不影响CD226mAbLeoA1作用的MLC体系中IL-10的分泌MACS方法阳性分选人CD19+B细胞，取不含CD19+B细胞的PBMC细胞，用CD19deletePBMC表示。PBMC(1×106)、CD19deletePBMC(1×106)与照射过的Daudi细胞(1×105和2×105)在加入CD226mAbLeoA1或抗人SED单抗的条件下混合培养24h，ELISA检测培养上清IL-10的浓度。图A示，CD19deletePBMC细胞中CD19+细胞的比例。MACS阳性分选去除CD19+B细胞后PBMC中CD19+细胞的比例约为1%左右。图B、C分别表示当CD19deletePBMC和PBMC分别与Daudi细胞为10:1和5:1混合培养后，培养上清中IL-10的表达水平。由图可见，当反应细胞：刺激细胞为10:1时，CD19deletePBMC和PBMC两组同型对照处理组的MLC体系相比较，IL-10的表达无显著性差异；当LeoA1作用于CD19deletePBMC和PBMC为反应细胞的MLC体系时，IL-10的表达亦无显著性差异，提示B细胞可能不参与CD226mAbLeoA1促进MLC体系中IL-10的表达。当反应细胞：刺激细胞为5:1时，与10:1反应细胞：刺激细胞的结果相似。以上实验结果证明B细胞不影响CD226mAbLeoA1作用的MLC体系中IL-10的分泌。29 第四军医大学硕士学位论文4讨论混合淋巴细胞培养是同种异基因个体间由于其表达的MHCII类分子不同，使得其在体外混合培养后，T细胞发生增殖的反应。MLC的反应强度也会因为反应体系中初始T细胞、刺激细胞和二者的比例不同而不同。免疫反应保护宿主免受多种病原体的入侵，但过度的免疫反应会损伤机体。故免疫反应的内稳态对于机体的健康至关重要。IL-10是一种重要的细胞因子，尤其在防止过度炎症反应的发生及自身免疫性疾病发生和发展中发挥重要作用[99]。在微生物存在的条件下，IL-10基因敲除的小鼠会发生炎症性肠病和其他过度的炎症反应[100]。文献报道，IL-10限制免疫反应的作用是不可或缺的，因为其缺陷后不能被其他免疫调节机制所补偿[101]。IL-10最初被认为是Th2型的细胞因子[102]，但随后更多的证据表明IL-10的产生与耐受或调节性T细胞相关[103]。众所周知，IL-10的表达并非Th2或Tregs所特有的，而是在多种细胞均有广泛的表达，如适应性免疫应答中的Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Tregs、CD8+T细胞和B细胞等；固有免疫应答细胞中的树突状细胞、单核巨噬细胞、肥大细胞和自然杀伤细胞等[101]。细胞因子IL-10可以调节多种免疫细胞的功能，如树突状细胞和巨噬细胞通过自分泌或非自分泌的方式，抑制Th1型的细胞反应，抑制Th2细胞及过敏反应；Th1、Th2、Th17分泌的IL-10也可形成一个反馈回路，限制巨噬细胞和树突状细胞对T细胞的活化；IL-10存在的条件下可促进IL-10+Tregs的分化[101]。本实验研究CD226mAbLeoA1影响MLC体系中IL-10表达的细胞机制，我们发现在CD226mAbLeoA1作用后24h时，IL-10的表达最强，故将作用24h作为后续研究的时间点。在研究CD226mAbLeoA1在MLC体系中IL-10的影响时，我们用了正反双向的验证方法：正向胞内细胞因子染色结合流式细胞术分析，发现CD4+IL-10+T细胞的比例具有统计差异，提示CD4+T细胞(包括Th2、Treg)可能是IL-10的主要来源细胞之一；分别去除CD4+T细胞、单核细胞或B细胞后ELISA检测培养上清中IL-10的表达发现，单核细胞的去除对整体MLC体系中IL-10的表达具有显著的降低作用，说明单核细胞在MLC体系中IL-10的表达具有“基础桥梁”的作用。近期有研究表明在小鼠和人的外周血中，CD226分子选择性地高表达于炎性单30 第四军医大学硕士学位论文核细胞，而非“巡逻”中的单核细胞，即在人的外周血，CD14+CD16-炎性单核细胞高表达CD226而CD14loCD16+“巡逻”中的单核细胞表达极低水平的CD226[27]。非经典的CD14+CD16++亚群对于炎性T细胞的活化属于弱刺激[104]，因此，健康人CD16+单核细胞对T细胞的增殖大部分是负性调节的[105]。健康者CD14+CD16++的单核细胞降低T细胞和CD3+IFN-γ+细胞的增殖，同时增加TNF-α、IL-10、IL-1β的表达。同时还认为CD14+CD16++的单核细胞具有调节CD14++CD16-亚群的效应[106]。上述研究给我们的提示：CD226分子的表达影响单核细胞亚群的状态，非炎性的CD16+单核细胞则继续影响T细胞和IFN-γ+T细胞的增殖。本实验室前期研究发现LeoA1在MLC体系中上调IL-10表达的同时下调IFN-γ的表达，在我们的研究中又发现参与LeoA1上调MLC体系中IL-10的最主要细胞是单核细胞和CD4+T细胞。由此，我们猜测LeoA1可能影响了单核细胞的亚群，继而影响CD4+IL-10+T细胞的比例。本研究证实在MLC体系中，CD226mAbLeoA1上调MLC体系中IL-10的表达是单核细胞和CD4+T细胞参与的。在此过程中，CD226mAbLeoA1促进MLC体系中IL-10的分泌是建立在CD14+单核细胞存在的基础上的。那么，CD226mAbLeoA1是否影响单核细胞亚群发生变化；是如何影响CD4+IL-10+T细胞的活化增殖；以及单核细胞与CD4+IL-10+T细胞的增殖有怎样的联系都需要进一步研究。31 第四军医大学硕士学位论文第二部分Cd226-/-小鼠EAE发病延缓及其初步分子机制1材料1.1动物正常健康雌性C57BL/6小鼠(6-8周龄)，购自本校实验动物中心。Cd226-/-雌性小鼠购自南京大学模式动物中心。实验动物均饲养于本校实验动物中心。1.2试剂MOG35-55肽由合肥国肽生物科技有限责任公司合成，每支1mg分装。卡介苗冻干粉(H37RA)购自Difco公司。完全弗氏佐剂CFA和百日咳毒素(pertussistoxin，PTx)购自Sigma公司。戊巴比妥钠购自康宁公司。小鼠IL-10、IFN-γ、IL-17、IL-4ELISA检测试剂盒购自Biolegend公司、R&DSystems公司和eBioscience公司。4%多聚甲醛：将多聚甲醛20g溶于500mL双蒸水中，60℃加热，并滴加数滴NaOH至溶液清亮。1.3仪器PT1200E手持式乳化机瑞士KINEMATICA公司激光共聚焦显微镜Olympus公司FV1000型2方法2.1EAE模型的建立和评分1)准备6-8周龄的C57BL/6小鼠5只和Cd226-/-小鼠5只。2)准备抗原：取抗原肽MOG35-552mg，用0.15M的PBS溶解，并涡旋彻底溶解；称取H37RA0.005g，溶解于1mL完全弗氏佐剂CFA中。用不同的玻璃注射器分别吸入溶解好的抗原肽和H37RA-CFA的混合液，利用三通管充分混匀，全部推入一只32 第四军医大学硕士学位论文注射器内。用高速搅拌机搅拌以乳化抗原。乳化次数为2次，每次20min，中间间隔可为15min。乳化成油包水状态后，将枪头沾取一滴，置于水中，不散开，则抗原乳化良好。3)小鼠皮下免疫：先用1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，100μL/每只。在小鼠腋窝和腹股沟四点对应的背部皮肤区域，皮下注射抗原肽混合物，50uL/处，每只小鼠共200uL。皮下免疫后，腹腔注射PTx200ng/只；48h后，再次腹腔注射PTx，剂量同前。小鼠免疫当天记为d0。免疫结束后需对小鼠情况每天进行观察并做临床评分。EAE模型的临床评分：0分：无临床症状；1分：尾巴瘫痪；2分：尾张力完全消失/步态异常；3分：后肢一瘸一拐或部分瘫痪；4：后肢完全瘫痪；5：死亡。2.2小鼠中枢神经系统组织的取材和HE染色1)麻醉小鼠：取EAE模型中症状达高峰期的小鼠(约免疫第18天以后)，腹腔注射1%戊巴比妥钠。准备注射器并连接三通管。2)小鼠CNS取材：将麻醉的小鼠置于解剖台上，腹面向上。找到小鼠剑突的位置，轻轻提起，用剪刀沿小鼠肋骨两侧边缘剪开，打开膈肌后暴露小鼠胸腔。找到心搏最明显位置，由此处刺入连接三通管的小针头，剪开右心耳，拧动阀门后灌注PBS约20mL，液体从右心耳流出、肝脏逐渐变白，四肢有抽动说明灌注有效。继续灌入4%多聚甲醛约20mL，避免空气进入，可感觉到小鼠变硬。取出小鼠脑组织和脊髓，放入4%多聚甲醛溶液中浸泡后固定，4℃过夜。3)HE染色：取4%多聚甲醛浸泡后固定的小鼠脊髓(腰髓)组织，常规石蜡包埋，5μm切片。切片后将标本放于60℃烤箱中放置3h，取出后立即放入二甲苯中15分钟，再次二甲苯浸泡15分钟(呈透明状时即可拿出，否则继续浸泡)；将切片放入酒精和二甲苯等体积的混合液中浸泡5分钟；拿出切片乙醇梯度脱去二甲苯；甩干水分后苏木精染色15分钟；冲洗后，1%盐酸酒精浸润10秒镜检分化，冲洗；浸润1%氨水数秒冲洗后过蒸馏水2遍，各3分钟；去水分后1%伊红染色3分钟(可含0.1%冰醋酸)防脱色；70%酒精冲洗伊红染液，梯度乙醇浸润脱水；切片于酒精-二甲苯等体积混合液中5分钟，二甲苯浸泡5分钟2次；取出切片，在二甲苯未干的情况下迅速吸取树胶滴于组织上，盖上盖玻片，待凝固后观察。33 第四军医大学硕士学位论文2.3小鼠血清的收集小鼠血清的收集：1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，100μL/每只。打开胸腔，用注射器刺入左心室，抽吸血液。抽取的血液样本静置1小时，3000rpm，离心15min。将上层血清轻轻吸出，300μL/管分装，-20℃保存待检测。2.4ELISA检测小鼠血清中细胞因子表达水平1)包被：将小鼠ELISA试剂盒中的包被抗体，按说明书稀释后，加入96孔ELISA板中，100μL/孔，4°C，过夜；0.05%吐温-PBS液洗板5次；2)封闭：将试剂盒中的5×AssayDiluent用ddH2O稀释为1×工作液，每孔200μL，室温放置1h；0.05%吐温-PBS液洗板4次；3)加标准品及待检样品，室温放置2h。按说明书稀释标准品，并设置空白对照孔，每个样本设置3个复孔。0.05%吐温-PBS液洗板3-5次；4)加入检测抗体：将检测抗体按说明书用1×AssayDiluent稀释，100μL/孔，室温放置1h；0.05%吐温-PBS液洗板3-5次；5)加酶标二抗Avidin-HRP：将Avidin-HRP按说明书用1×AssayDiluent稀释，100μL/孔，室温放置30min；0.05%吐温-PBS液洗板5-7次；6)显色：加底物SubstrateSolution，100μL/孔，室温放置15min；7)终止：加入2MH2SO4，50μL/孔；8)读数：用酶标仪在450nm波长下读数。34 第四军医大学硕士学位论文3结果3.1Cd226-/-小鼠EAE模型临床评分图2.1Cd226-/-小鼠EAE症状减轻自小鼠免疫第1天开始，每日观察小鼠的活动情况，根据临床评分记录小鼠的临床评分，评分越高说明其症状越重。由图所示我们观察了WT组小鼠(共5只)和Cd226-/-组小鼠(共5只)的活动状况，记录并绘制了两组小鼠的临床评分曲线。从图2.1可以看到，Cd226-/-组小鼠的发病时间(临床评分>0分)稍晚于WT组小鼠的发病时间；同时Cd226-/-组小鼠EAE疾病严重程度明显低于WT组的疾病严重程度。35 第四军医大学硕士学位论文3.2Cd226-/-小鼠EAE模型中脊髓炎性细胞浸润图2.2Cd226-/-小鼠EAE发病高峰期（免疫第18天）腰髓炎性细胞浸润减少取MOG35-55免疫第18天小鼠腰髓组织，石蜡包埋，切片后进行HE染色。可以看到Cd226-/-小鼠腰髓的炎性细胞浸润减少，提示Cd226-/-小鼠腰髓中的炎症反应较WT小鼠的炎症反应弱。36 第四军医大学硕士学位论文3.3Cd226-/-小鼠EAE模型血清中细胞因子的表达水平图2.3Cd226-/-小鼠EAE发病高峰期（免疫第18天）体内IL-10含量显著高于野生型小鼠分别取免疫第18天的Cd226-/-小鼠和WT小鼠，心脏取血后，ELISA检测小鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-17和IL-4的水平。结果发现，Cd226-/-小鼠血清中IL-10的表达水平显著高于WT小鼠，IFN-γ和IL-17的表达水平显著低于WT小鼠，而IL-4的水平在两组中无显著性差异，表明CD226分子对于IL-10的表达具有抑制作用。4讨论实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimentalautoimmuneencephalomyelitis，EAE)[107]是人类MS疾病的动物模型，是一种由自体反应性CD4+T细胞攻击CNS髓磷脂37 第四军医大学硕士学位论文为特征，导致CNS轴索的免疫损伤的慢性自身免疫性疾病。效应CD4+T细胞亚群的Th17细胞和Th1细胞被发现与炎症病灶介导EAE的发生发展有关，且可以在炎症病灶处检测到Th17和Th1细胞表达的细胞因子IL-17和IFN-γ[108]。研究证实，过继转移CNS抗原反应性Th1和Th17，能够诱导EAE的发生[109]，而IL-17的中和抗体处理EAE小鼠也可以减轻其疾病状态[110]，因此有学者认为Th17细胞是EAE发病和病理状态维持的最主要致病细胞[111]。Treg细胞的抗炎作用能够对抗Th17和Th1细胞在EAE中的致炎作用，研究发现CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在EAE发病的高峰期显著下降，而在EAE的慢性缓解期增加；同时，Th17特异性的转录因子ROR-γt水平在EAE发病的早期阶段显著增加，而在高峰期和慢性缓解期则无显著性变化。细胞因子TGF-β在缓解期的表达增高，IL-17A的表达在EAE发病高峰期显著上升，以上说明在EAE致病过程中，Th17细胞和Treg细胞的功能处于不平衡状态[112]。近年来研究发现二甲双胍通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)[113]的活化并降低其下游靶分子缺氧诱导因子1α(hypoxia-induciblefactor-1α，HIF-1α)的活化，调节Th17细胞和Treg，减缓EAE发展。MHC不匹配的混合嵌合体能够恢复胸腺自身反应性CD4+T细胞的阴性选择，扩增胸腺中的Tregs细胞防止EAE复发[114]。重组T细胞受体配体(recombinantTcellreceptorligands,RTLs)，能够逆转EAE的临床症状和炎细胞的组织浸润，并且现在已经进入到了MS病人的临床试验阶段[115]。研究者发现MOG35-55免疫的小鼠，从第1天开始，连续5天注射RTL551(两个结构域的I-Ab共价连接MOG35-55肽)可以减弱EAE的临床症状，阻止脾脏免疫细胞向外迁移，显著降低血液中CD4+T细胞表面CD226和T-bet的表达，抑制血液和脾脏中CD4+CD44+记忆T细胞的成熟[115]。近几年，固有免疫应答在EAE发生发展中的作用亦受到关注。固有免疫系统的受体和炎症小体感受器可以对病原体和压力等因素做出应答，这与包括MS和EAE一系列的自身免疫性疾病相关[116,117]。IL-1β协同IL-23信号通路诱导细胞因子IL-17的分泌[118]，并促进初始CD4+T细胞向Th17细胞分化，同时通过IL-1R1途径活化CD4+记忆性T细胞直接增强IL-17的分泌[119]。研究显示[120]，向中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)炎症部位注射预加载髓磷脂蛋白的浆细胞样DC(plasmacytoiddendriticcells，pDC)可以改善EAE小鼠的症状。CD226作为共刺激分子，表达于多种免疫细胞。既往研究也表明CD226分子与38 第四军医大学硕士学位论文多种自身免疫性疾病相关，如T1D、SLE、AITD等。实验室前期实验证实CD226多克隆抗体(polyclonalantibody，pAb)体内注射通过抑制Th1和Th17细胞的分化，促进CD4+IL-10+T细胞的分化有效地减轻了小鼠EAE发病。为了验证以上结果，我们应用Cd226-/-小鼠，通过构建EAE模型，发现Cd226-/-小鼠EAE模型组的平均评分低于WT小鼠组的临床平均评分，且发病时间晚于WT小鼠组的发病时间。HE染色结果显示，WT小鼠腰髓炎性细胞的浸润细胞数目多于Cd226-/-小鼠腰髓，表明去除CD226分子可以减弱EAE小鼠炎性细胞在CNS的侵袭和浸润，防止脱髓鞘反应的发生，继而延迟发病时间、缓解症状。这进一步支持了前期整体动物实验的结果。最后我们检测了几种CD4+T细胞亚群代表性细胞因子的表达水平，发现Cd226-/-小鼠血清中IL-10水平较高，而IFN-γ和IL-17的表达水平较低，间接提示CD226分子参与对IL-10、IFN-γ和IL-17A等细胞因子表达的调节，继而影响Th1、Th17和Treg细胞的平衡。总之，本实验应用Cd226-/-小鼠通过建立EAE模型，发现CD226分子对EAE的发生和发展具有促进作用，很可能是通过抑制细胞因子IL-10的表达发挥作用的。39 第四军医大学硕士学位论文第三部分人CD226基因单核苷酸多态性与肺癌易感性的关系1材料1.1临床标本的收集西京医院肺癌患者和健康人外周血标本共203份，-20℃保存。其中，根据临床标准诊断为肺癌的患者有120名，男性83名，女性37名。健康人共83名，男性55名，女性28名。健康人随机抽取于西京医院体检中心且无呼吸系统疾病、恶性病和自身免疫性疾病等病史。患者和健康人年龄、性别和吸烟史等信息见表3.2。1.2试剂TIANampBloodDNAKit血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，DP348)和UniversalDNAPurificationKitDNA纯化回收试剂盒(离心柱型，DP214)均购自北京天根生化科技有限公司；PremixTaqDNAPolymerase、限制性内切酶MspⅠ(1150A)和DL1000DNAmarker、DL500DNAmarker均购自日本TaKaRa公司；引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成；琼脂糖购自上海生物工程股份有限公司。其他试剂如无水乙醇均够自国产分装试剂。1.3主要溶液配制10×TBE液(PH8.3)：Tris108g+Na2EDTA•2H2O7.44g+硼酸55g，溶于1升去离子水中。1.4主要仪器普通PCR仪Bio-Rad公司40 第四军医大学硕士学位论文凝胶成像系统Tanon公司电子恒温水浴锅天津泰斯特仪器有限公司5417DCentrifuge台式高速离心机德国Eppendorf公司XW-80A涡旋混合器上海医科大学仪器厂Milli-Q纯水仪Millipore公司-20℃冰箱Thermo公司2方法2.1血液全基因组DNA的提取1)将存储于-20℃的肺癌病人或正常人的外周血标本放于室温条件下，待其融化为液体状；2)移液器吸取500μL的外周血标本于1.5mLEP管中，加入500μL双蒸水充分混匀，10000rpm，1min,离心，弃去上清；3)向沉淀中加入500μL细胞裂解液，颠倒混匀，10000rpm，1min，离心，弃去上清；4)向沉淀中加入200μL缓冲液GS，轻轻振荡混匀；5)继续加入200μL蛋白酶K溶液，振荡混匀；6)加入200μL缓冲液GB，轻轻振荡混匀，56℃放置10min至沉淀溶解，溶液变清亮；7)向上述液体中加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀；8)将所得液体全部吸入吸附柱CB3中（放入收集管中），12000rpm，30s，离心，弃去收集管中液体；9)加入600μL漂洗液PW吸附柱CB3中（放入收集管中），12000rpm，30s，离心，弃收集管中液体；10)重复上述步骤一次；11)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm，30s，离心，弃去液体；12)吸附柱CB3放于滤纸上晾干，约5分钟；13)将吸附柱CB3放于1.5mLEP管中，向吸附膜中间位置悬空滴加60μL双蒸水或41 第四军医大学硕士学位论文TB液，室温放置4min；14)将EP管放入离心机中12000rpm，2min，保留EP管中的液体；15)用Nanodrop2000软件，检测所得DNA样本的浓度，-20℃保存。2.2PCR-RFLP法检测不同个体CD226rs763361的基因型2.2.1单核苷酸多态性位点及其引物1)查询CD226基因序列，查阅文献确定引物2)所需引物：CD226rs763361的扩增引物：Forward:5’-CTGCGAGAGAAGGTTGGATAGTTGAC-3’Reverse:5’-CTTGTCCCATATCATGCCTGCATT-3’2.2.2PCR扩增反应体系：Primer11μLPrimer21μLPremixTaq(TaKaRaTaqTMVersion2.0plusdye)25μLDNA模板1μL灭菌双蒸水22μL合计50μL反应条件：预变性94℃,5min变性94℃,30s退火60℃,1min35个循环延伸72℃,1min延伸72℃,10min2.2.3琼脂糖电泳1)将10×TBE稀释为1×TBE42 第四军医大学硕士学位论文2)制胶称取琼脂糖0.3g倒入三角烧瓶内，加入已配好的1×TBE20ml,在微波炉中加热熔化，加入DNA染料，充分混匀。将其倒入电泳槽内插入梳子，排尽气泡后待凝固。约1h后，琼脂糖凝固，小心拔出梳子，避免破坏凝胶。3)上样、电泳将样品与DNAmarker各10μL加入上样孔内，接通电源，DNA样品由负极向正极泳动。电泳条件：电压：120V，电泳：45min。电泳结束后在凝胶电泳成像仪上观察电泳条带及位置。本实验目的片段为213bp。2.2.4PCR产物DNA的回收1)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中加入500μL的平衡液BL（放于收集管），12000rpm，1min，离心，弃收集管中废液，并将其重新放回收集管中；2)向PCR标本中加入其4倍体积的PC液（约160μL），充分振荡混匀；3)将所得溶液加入吸附柱CB2中（放入收集管中），室温2min，12000rpm，离心，弃去收集管中液体；4)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW（放入收集管中），12000rpm，1min，弃去废液；5)重复4）中步骤；6)将吸附柱CB2放入收集管中，12000rpm，空转2min，离心，弃去收集管中液体；7)于室温放置数分钟，晾干；8)将晾干的吸附柱CB2放入1.5mLEP管中，向其中间悬空滴加30μL的灭菌双蒸水，室温2min；12000rpm，2min，离心；9)将上述DNA溶液吸出，继续加入吸附柱CB2中，室温2min，12000rpm，2min，离心；收集DNA溶液，-20℃保存。43 第四军医大学硕士学位论文2.2.5限制性内切酶分析1)酶切反应反应体系：MspⅠ1μl10×TBuffer2μL0.1%BSA2μLDNA15μL合计20μL酶切反应体系混匀后，37℃烤箱过夜。2)琼脂糖(2%)电泳，检测各标本的基因型。2.3统计学分析统计分析采用STATA13.0软件。SNP编码考虑以下4种生物学模型：相加模型(additivemodel)、共显性模型(co-dominantmodel)、显性模型(dominantmodel)、隐性模型(recessivemodel)。肺癌患者组和健康对照组组间定量资料采用均数±标准差描述。为探索肺癌与CD226基因SNPrs763361之间的关系，建立了单因素logistic回归模型(univariatelogisticregressionmodel)。进一步，拟合多因素logistic回归模型(multivariatelogisticregressionmodel)，校正年龄、性别、吸烟史的影响效应，以评价肺癌与CD226基因SNPrs763361之间的统计学关联。接着分别按年龄、性别、吸烟史、病理类型做分层分析。所有假设检验P值取双侧，显著性差异性检验水准设为5%，可信区间(confidenceinterval,CI)可信度视为95%。44 第四军医大学硕士学位论文3结果3.1特异性引物扩增不同个体基因组中CD226基因图3.1特异性引物扩增不同个体基因组中CD226基因图3.1全基因组DNA(50ng/mL)经PCR扩增后，琼脂糖电泳鉴定PCR产物纯度。图1中，“M”代表DL1000的DNAmarker，“1-8”道代表不同个体的CD226基因。图1所示，条带均一性较好，纯度较佳，可用于后续实验。3.2PCR-RFLP法检测不同个体CD226rs763361的基因型图3.2PCR-RFLP法检测不同个体CD226的基因型如图3.2，MspⅠ限制性内切酶酶切反应-琼脂糖电泳鉴定酶切反应后的基因型。图中，“M”代表DL500marker，“1、3、4”中两条带分别是140bp和73bp，基因型为CC型；“2”中的条带是213bp，基因型为TT型；“5、6、7”中的条带为三条：213bp、140bp、73bp，基因型为CT型。45 第四军医大学硕士学位论文3.3统计学结果表3.1健康对照组与肺癌患者组的基因型基因型健康对照组肺癌患者组校正后OR(95%CI)P值总数(83)(%)总数(120)(%)CC26(31.33)41(34.17)CT41(49.40)44(36.67)0.7028(0.3647,1.3544)0.2921TT16(19.28)35(29.17)1.4883(0.6819,3.2487)0.3180CT+TT57(68.67)79(65.83)0.9179(0.5017,1.6793)0.7810表1肺癌患者组与健康对照组CC型、CT型、TT型、CT+TT型的统计结果。可以看到在单因素分析结果中，未见健康对照组与肺癌患者组在CD226rs763361中CC型、CT型、TT型、CT+TT型的基因差异。表3.2CD226rs763361与肺癌易感性的相关性分析健康对照组肺癌患者组校正后变量CC+CTTTCC+CTTTOR(95%CI)P值总样本67(80.72)16(19.28)85(70.83)35(29.17)1.8196(0.9188,3.6034)0.0860女性24(85.71)4(14.29)24(64.86)13(35.14)3.4090(0.9449,12.2987)0.0610男性43(78.18)12(21.82)61(73.49)22(26.51)1.4039(0.6169,3.1950)0.4187≤5637(82.22)8(17.78)41(69.49)18(30.51)2.1061(0.8086,5.4854)0.1272>5630(78.95)8(21.05)44(72.13)17(27.87)1.4488(0.5539,3.7896)0.4498不吸烟组32(84.21)6(15.79)31(62.00)19(38.00)3.4846(1.1932,10.1762)0.0224a吸烟组35(77.78)10(22.22)54(77.14)16(22.86)1.0251(0.4093,2.5670)0.9578小细胞肺癌28(70.00)12(30.00)1.8860(0.7805,4.5569)0.1587腺癌32(68.09)15(31.91)2.0305(0.8772,4.7003)0.0981鳞癌25(80.65)6(19.35)0.9741(0.3291,2.8834)0.9622腺鳞癌0(0.00)2(100.00)a.在非吸烟组，肺癌患者组中TT基因型的频率高于健康对照组TT基因型的频率，p值小于0.05表2CD226rs763361与肺癌易感性的相关性研究中，将年龄、性别、吸烟史和病理分型进行分层分析。可以看到，在非吸烟组，肺癌患者组中TT基因型的频率高46 第四军医大学硕士学位论文于健康对照组TT基因型的频率，p值小于0.05。女性人群中，两组的TT基因型的统计p值为0.0610，提示TT基因型与女性肺癌的易感性可能有相关性。4讨论肺癌是全世界最普遍的肿瘤之一，在2012年有超过1.8百万的新增病例和近1.6百万的病人死亡，所有新增病例中有超过1/3的病例发生在中国，给病人、家庭、社会和国家造成了极大的负担[121]。在中国，肺癌已成为肿瘤死亡最主要的病因。快速增长的发病率：中国年度报告显示，在2011年有65万余新诊断肺癌病人，其中有44万余男性病人和近21万女性病人，肺癌的患病率平均48.32人/每10万人[122]。中国女性的发病率显著高于一些欧洲国家的女性，尽管其吸烟率较低[122]。根据国家癌症登记中心统计，从1989年到2008年，男性肺癌病人和女性肺癌病人的平均生存时间增加，男性从65.32岁增加到67.87岁，女性从65.14岁增加到68.05岁。遗憾的是，在<45岁的年轻人群中，肺癌的发病率显著增加[123]。此外，肺癌死亡总数迅速增加：中国31个省市的调查研究显示，肺癌死亡率从2008年的35.1人/百万到2011年的39.27/百万[124,125]。城镇地区肺癌已代替胃癌成为最普遍肿瘤[124]。既往，肺癌被认为是一种对免疫系统不敏感的肿瘤，然而现在越来越多的证据表明肺癌是具有免疫原性的[126]。因为，在非小细胞肺癌中CD8+T细胞在基质中的侵润增加是一个标志预后良好的标记，而Treg细胞侵润的增加则与肿瘤的复发相关[127]。近期，MotzG等描述了Treg细胞在肿瘤侵润中的新机制。他们发现肿瘤血管低表达Fas配体(Fasligand,FasL/CD95L)，这与CD8+T细胞的低程度侵润和Foxp3+Treg的广泛分布相关。同时，肿瘤来源的血管内皮生长因子A(vascularendothelialgrowthfactorA，VEGF-A)[128]、IL-10和前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)共同促进内皮细胞上FasL的表达。内皮细胞FasL的表达可能选择性杀伤CD8+T细胞，而非高表达c-FLIP的Treg细胞[128]。迄今为止，发现位于CD226基因外显子处的单核苷酸突变有三种：如rs763361、rs737088、rs34794968[15]。一系列的流行病学研究表明CD226rs763361与多种自身免疫性疾病和肿瘤相关，例如1型糖尿病(type1diabetes，T1D)[11]、系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，SLE)[12]、原发性青少年关节炎(juvenileidiopathic47 第四军医大学硕士学位论文arthritis，JIA)[11]等。近些年，据文献报道CD226rs727088是一个功能性的突变，可以导致CD226在转录和蛋白水平的降低[15]。已发表文献报道CD226rs763361与胃癌和宫颈鳞状细胞癌相关[129,130]。近期报道，CD226rs763361与非小细胞肺癌的易感性相关[15]。据文献报道，CD226rs34794968单独与疾病的易感性无关，但可以与其他两种多态性突变一起发挥协同效应[8]。Bossini-CastilloL等学者报道TCG单体型(包含CD226基因的3个位点的多态性突变：rs763361、rs727088、rs34794968)与系统性的肺纤维化相关[8]。本研究表明CD226单核苷酸动态性位点rs763361与肺癌的发生相关。肺癌患者中TT/CC+CT基因型的频率在非吸烟人群中的比例高于对照组的TT/CC+CT基因型(P=0.0224,OR=3.4846,95%CI:1.1932-10.1762)，提示在非吸烟人群的肺癌病人中，CD226rs763361TT基因型与其相关。在分层分析中，女性肺癌患者中，TT/CC+CT基因型的频率在非吸烟人群中的比例高于对照组的TT/CC+CT基因型(OR=3.4090,95%CI=0.9449-12.2987,P=0.0610)，具有一定的相关趋势。以上研究表明CD226rs763361可能与部分人群肺癌的发生相关。那么CD226rs763361位点T等位基因的突变为什么会与疾病相关呢？有专家猜测这一突变增加了TT基因型的表达，改变了CD226蛋白胞浆尾部磷酸化的位点，继而影响了LFA-1的物理结合结构[14]。一方面，这些改变可能破坏了CD226分子与LFA-1的协同表达，导致NK细胞的驯化和细胞毒功能受损[55]；另一方面，CD226磷酸化位点的改变可能削弱了T细胞的活化，进而打破T细胞表面共刺激分子CTLA-4和CD28的平衡。因为在小鼠的1型糖尿病模型中，CD226rs763361位点的突变，可以导致T细胞表面CTLA-4的功能异常[131]。CD226分子作为NK细胞和细胞毒性T细胞的粘附分子和触发受体，在NK细胞介导的肿瘤识别和杀伤中具有重要作用，例如骨髓瘤、成神经细胞瘤、尤文氏瘤[1,38,132]。在CTL的活化和粘附中，CD226分子是维持NK细胞受体和T细胞受体结合其配体和传递胞內信号所必需的[133]。CD226在肿瘤免疫的重要性也体现对在体内NK、T细胞的影响[89]。NK细胞对一系列不同分型的肿瘤细胞具有细胞毒作用[33]，且在肿瘤治疗干预中的作用已日趋显著，如黑素瘤、髓系白血病[33,88]。新近证据已表明CD226在T细胞和NK细胞介导的肿瘤免疫中，尤其是在表达CD155的肿瘤细胞的免疫中发挥重要作用[89,132,48 第四军医大学硕士学位论文134]。许多上皮来源的肿瘤细胞系表达CD112和CD155，可以被NK细胞或CTL细胞通过CD226依赖的方式所溶解[1]。转移性神经母细胞瘤高表达CD155分子，这在一定程度上有利于CD226分子介导的NK细胞的溶解[35,38]。据文献报道，一些过表达CD155的肿瘤细胞通过形成可溶性CD155分子，从而阻断CD226分子与肿瘤细胞表面CD155的结合，阻止NK细胞对肿瘤细胞的识别[33,135]。有研究显示，CD226与CD155的相互作用对于NK细胞识别并杀伤新鲜的卵巢癌细胞非常重要[134]。因此，以上结果为未来卵巢癌或其他肿瘤的免疫治疗提供了新的思路[89,134]。更重要的是，自身反应性T细胞的产生受CD226/CD155相互作用的影响，显示了CD226在免疫应答中的重要性[89]。有研究证实在小鼠肿瘤模型中，肿瘤的发展与CD226受体的和NKG2D受体的表达缺失有关[90]。另外，与野生型小鼠相比，CD226基因缺陷小鼠更易患有由甲基胆蒽和二甲苯诱导表达CD155的纤维肉瘤和乳头淋瘤[90]。这些结果表明CD226在肿瘤发展过程中的免疫监视中具有重要作用[136]。除此之外，在新近研究中发现Vg9Vd2γδT细胞表达CD226分子，同时CD155而非CD112参与CD226分子介导的γδT细胞功能[137]。γδT对肝细胞癌的细胞毒作用和IFN-γ的分泌依赖CD226分子的表达[88,137]。因此CD226分子在NK细胞的肿瘤监视中发挥重要作用。根据以上证据我们猜想，CD226单核苷酸多态性是否影响CD226分子与其配体的相互作用和（或）NK细胞上NKG2D受体的表达，影响体内NK细胞、γδT细胞的细胞毒作用，进而影响肿瘤细胞发生发展中的免疫监视。总之，我们的研究证实CD226rs763361与非吸烟人群的肺癌发病相关。提示CD226分子可能成为监测肿瘤的一个指标，或者极有可能成为肿瘤免疫治疗的一个靶点。49 第四军医大学硕士学位论文小结本课题围绕CD226分子，观测其与临床疾病的关系及其分子机制，获得了以下研究结果：一、CD226mAbLeoA1调节人MLC体系中IL-10的表达1.CD226mAbLeoA1上调MLC体系中IL-10的表达；2.CD226mAbLeoA1上调MLC体系中CD4+IL-10+T细胞的比例；3.单核细胞和CD4+T细胞在CD226mAbLeoA1上调MLC体系中IL-10表达中发挥重要作用。二、CD226分子参与小鼠EAE模型的发病1.Cd226-/-小鼠EAE发病时间延迟且EAE症状减轻；2.Cd226-/-小鼠EAE模型中脊髓炎性细胞浸润减少；3.Cd226-/-小鼠EAE模型血清中细胞因子IL-10表达水平上调。三、CD226rs763361与非吸烟人群肺癌的易感性相关1.CD226rs763361TT基因型与非吸烟人群肺癌的易感性相关，P值为0.0224；2.在女性群体中，TT基因型在肺癌人群中的比例(35.14%)高于健康人(14.29%)，P值为0.0610，提示CD226rs763361TT基因型可能与女性肺癌易感性相关。50 第四军医大学硕士学位论文参考文献1.ShibuyaA,CampbellD,HannumC,etal.DNAM-1,anoveladhesionmoleculeinvolvedinthecytolyticfunctionofTlymphocytes[J].Immunity.1996,4:573-581.2.SherringtonPD,ScottJL,JinB,etal.TLiSA1(PTA1)activationantigenimplicatedinTcelldifferentiationandplateletactivationisamemberoftheimmunoglobulinsuperfamilyexhibitingdistinctiveregulationofexpression[J].JBiolChem.1997,272:21735-21744.3.BurnsGF,TrigliaT,WerkmeisterJA,etal.TLiSA1,ahumanTlineage-specificactivationantigeninvolvedinthedifferentiationofcytotoxicTlymphocytesandanomalouskillercellsfromtheirprecursors[J].JExpMed.1985,161:1063-1078.4.MasonD,AndreP,BensussanA,etal.CDantigens2001[J].JLeukocBiol.2001,70:685-690.5.菅金龙,朱勇,李德敏,etal.人CD226基因SNP和启动子序列分析[J].细胞与分子免疫学杂志.2002:203-207.6.张新海,李德敏,欧阳为明,etal.小鼠CD226(PTA1)的基因克隆及其异型[J].中国免疫学杂志.2002:371-375.7.JianJL,ZhuCS,XuZW,etal.IdentificationandcharacterizationoftheCD226genepromoter[J].JBiolChem.2006,281:28731-28736.8.Bossini-CastilloL,SimeonCP,BerettaL,etal.AmulticenterstudyconfirmsCD226geneassociationwithsystemicsclerosis-relatedpulmonaryfibrosis[J].ArthritisResTher.2012,14:R85.9.ToddJA,WalkerNM,CooperJD,etal.Robustassociationsoffournewchromosomeregionsfromgenome-wideanalysesoftype1diabetes[J].NatGenet.2007,39:857-864.10.SmythDJ,PlagnolV,WalkerNM,etal.Sharedanddistinctgeneticvariantsintype1diabetesandceliacdisease[J].NEnglJMed.2008,359:2767-2777.11.QiuZX,ZhangK,QiuXS,etal.CD226Gly307Serassociationwithmultipleautoimmunediseases:ameta-analysis[J].HumImmunol.2013,74:249-255.12.DieudeP,GuedjM,TruchetetME,etal.AssociationoftheCD226Ser(307)variantwithsystemicsclerosis:evidenceofacontributionofcostimulationpathwaysinsystemic51 第四军医大学硕士学位论文sclerosispathogenesis[J].ArthritisRheum.2011,63:1097-1105.13.XuZ,JinB.Anovelinterfaceconsistingofhomologousimmunoglobulinsuperfamilymemberswithmultiplefunctions[J].CellMolImmunol.2010,7:11-19.14.ShibuyaK,LanierLL,PhillipsJH,etal.PhysicalandfunctionalassociationofLFA-1withDNAM-1adhesionmolecule[J].Immunity.1999,11:615-623.15.LofgrenSE,Delgado-VegaAM,GallantCJ,etal.A3'-untranslatedregionvariantisassociatedwithimpairedexpressionofCD226inTandnaturalkillerTcellsandisassociatedwithsusceptibilitytosystemiclupuserythematosus[J].ArthritisRheum.2010,62:3404-3414.16.BeaulieuAM,BezmanNA,LeeJE,etal.MicroRNAfunctioninNK-cellbiology[J].ImmunolRev.2013,253:40-52.17.XiongP,SangHW,ZhuM.Criticalrolesofco-activationreceptorDNAXaccessorymolecule-1innaturalkillercellimmunity[J].Immunology.2015,146:369-378.18.LiuJ,QianX,ChenZ,etal.Crystalstructureofcelladhesionmoleculenectin-2/CD112anditsbindingtoimmunereceptorDNAM-1/CD226[J].JImmunol.2012,188:5511-5520.19.HouS,GeK,ZhengX,etal.CD226proteinisinvolvedinimmunesynapseformationandtriggersNaturalKiller(NK)cellactivationviaitsfirstextracellulardomain[J].JBiolChem.2014,289:6969-6977.20.RalstonKJ,HirdSL,ZhangX,etal.TheLFA-1-associatedmoleculePTA-1(CD226)onTcellsformsadynamicmolecularcomplexwithprotein4.1Gandhumandiscslarge[J].JBiolChem.2004,279:33816-33828.21.ShibuyaK,ShirakawaJ,KameyamaT,etal.CD226(DNAM-1)isinvolvedinlymphocytefunction-associatedantigen1costimulatorysignalfornaiveTcelldifferentiationandproliferation[J].JExpMed.2003,198:1829-1839.22.ReymondN,ImbertAM,DevilardE,etal.DNAM-1andPVRregulatemonocytemigrationthroughendothelialjunctions[J].JExpMed.2004,199:1331-1341.23.ScottJL,DunnSM,JinB,etal.Characterizationofanovelmembraneglycoproteininvolvedinplateletactivation[J].JBiolChem.1989,264:13475-13482.24.KojimaH,KanadaH,ShimizuS,etal.CD226mediatesplateletandmegakaryocyticcelladhesiontovascularendothelialcells[J].JBiolChem.2003,278:36748-36753.25.MaD,SunY,LinD,etal.CD226isexpressedonthemegakaryocyticlineagefromhematopoieticstemcells/progenitorcellsandinvolvedinitspolyploidization[J].EurJ52 第四军医大学硕士学位论文Haematol.2005,74:228-240.26.MartinetL,FerrariDeAndradeL,GuillereyC,etal.DNAM-1expressionmarksanalternativeprogramofNKcellmaturation[J].CellRep.2015,11:85-97.27.VoAV,TakenakaE,ShibuyaA,etal.ExpressionofDNAM-1(CD226)oninflammatorymonocytes[J].MolImmunol.2016,69:70-76.28.BottinoC,CastriconiR,PendeD,etal.IdentificationofPVR(CD155)andNectin-2(CD112)ascellsurfaceligandsforthehumanDNAM-1(CD226)activatingmolecule[J].JExpMed.2003,198:557-567.29.WangL,ZhangW,WuDA,etal.Molecularcloning,characterizationandthree-dimensionalmodelingofporcinenectin-2/CD112[J].VetImmunolImmunopathol.2009,132:257-263.30.Tahara-HanaokaS,MiyamotoA,HaraA,etal.IdentificationandcharacterizationofmurineDNAM-1(CD226)anditspoliovirusreceptorfamilyligands[J].BiochemBiophysResCommun.2005,329:996-1000.31.Tahara-HanaokaS,ShibuyaK,OnodaY,etal.FunctionalcharacterizationofDNAM-1(CD226)interactionwithitsligandsPVR(CD155)andnectin-2(PRR-2/CD112)[J].IntImmunol.2004,16:533-538.32.KrausAK,ChenJ,EdenhoferI,etal.TheRoleofTCellCostimulationviaDNAM-1inKidneyTransplantation[J].PLoSOne.2016,11:e0147951.33.GilfillanS,ChanCJ,CellaM,etal.DNAM-1promotesactivationofcytotoxiclymphocytesbynonprofessionalantigen-presentingcellsandtumors[J].JExpMed.2008,205:2965-2973.34.PendeD,CastriconiR,RomagnaniP,etal.ExpressionoftheDNAM-1ligands,Nectin-2(CD112)andpoliovirusreceptor(CD155),ondendriticcells:relevancefornaturalkiller-dendriticcellinteraction[J].Blood.2006,107:2030-2036.35.FuchsA,ColonnaM.TheroleofNKcellrecognitionofnectinandnectin-likeproteinsintumorimmunosurveillance[J].SeminCancerBiol.2006,16:359-366.36.CatrosV,DessartheB,ThedrezA,etal.Nectinsandnectin-likereceptorsDNAM-1andCRTAM:newwaysfortumorescape[J].MedSci(Paris).2014,30:537-543.37.SethS,GeorgoudakiAM,ChambersBJ,etal.HeterogeneousexpressionoftheadhesionreceptorCD226onmurineNKandTcellsanditsfunctioninNK-mediatedkillingofimmaturedendriticcells[J].JLeukocBiol.2009,86:91-101.38.CastriconiR,DonderoA,CorriasMV,etal.Naturalkillercell-mediatedkillingof53 第四军医大学硕士学位论文freshlyisolatedneuroblastomacells:criticalroleofDNAXaccessorymolecule-1-poliovirusreceptorinteraction[J].CancerRes.2004,64:9180-9184.39.RauletDH,GasserS,GowenBG,etal.RegulationofligandsfortheNKG2Dactivatingreceptor[J].AnnuRevImmunol.2013,31:413-441.40.SorianiA,ZingoniA,CerboniC,etal.ATM-ATR-dependentup-regulationofDNAM-1andNKG2DligandsonmultiplemyelomacellsbytherapeuticagentsresultsinenhancedNK-cellsusceptibilityandisassociatedwithasenescentphenotype[J].Blood.2009,113:3503-3511.41.SorianiA,FiondaC,RicciB,etal.Chemotherapy-elicitedupregulationofNKG2DandDNAM-1ligandsasatherapeutictargetinmultiplemyeloma[J].Oncoimmunology.2013,2:e26663.42.CroxfordJL,TangML,PanMF,etal.ATM-dependentspontaneousregressionofearlyEmu-myc-inducedmurineB-cellleukemiadependsonnaturalkillerandTcells[J].Blood.2013,121:2512-2521.43.VassenaL,GiulianiE,MatusaliG,etal.Thehumanimmunodeficiencyvirustype1VprproteinupregulatesPVRviaactivationoftheATR-mediatedDNAdamageresponsepathway[J].JGenVirol.2013,94:2664-2669.44.FiondaC,AbruzzeseMP,ZingoniA,etal.NitricoxidedonorsincreasePVR/CD155DNAM-1ligandexpressioninmultiplemyelomacells:roleofDNAdamageresponseactivation[J].BMCCancer.2015,15:17.45.KrizhanovskyV,YonM,DickinsRA,etal.Senescenceofactivatedstellatecellslimitsliverfibrosis[J].Cell.2008,134:657-667.46.KamranN,TakaiY,MiyoshiJ,etal.Toll-likereceptorligandsinduceexpressionofthecostimulatorymoleculeCD155onantigen-presentingcells[J].PLoSOne.2013,8:e54406.47.TomasecP,WangEC,DavisonAJ,etal.Downregulationofnaturalkillercell-activatingligandCD155byhumancytomegalovirusUL141[J].NatImmunol.2005,6:181-188.48.Prod'hommeV,SugrueDM,StantonRJ,etal.HumancytomegalovirusUL141promotesefficientdownregulationofthenaturalkillercellactivatingligandCD112[J].JGenVirol.2010,91:2034-2039.49.MatusaliG,PotestaM,SantoniA,etal.Thehumanimmunodeficiencyvirustype1NefandVpuproteinsdownregulatethenaturalkillercell-activatingligandPVR[J].JVirol.54 第四军医大学硕士学位论文2012,86:4496-4504.50.FuchsA,CellaM,GiurisatoE,etal.Cuttingedge:CD96(tactile)promotesNKcell-targetcelladhesionbyinteractingwiththepoliovirusreceptor(CD155)[J].JImmunol.2004,172:3994-3998.51.OgitaH,TakaiY.Nectinsandnectin-likemolecules:rolesincelladhesion,polarization,movement,andproliferation[J].IUBMBLife.2006,58:334-343.52.DardalhonV,SchubartAS,ReddyJ,etal.CD226isspecificallyexpressedonthesurfaceofTh1cellsandregulatestheirexpansionandeffectorfunctions[J].JImmunol.2005,175:1558-1565.53.BrycesonYT,MarchME,LjunggrenHG,etal.Activation,coactivation,andcostimulationofrestinghumannaturalkillercells[J].ImmunolRev.2006,214:73-91.54.CellaM,PrestiR,VermiW,etal.LossofDNAM-1contributestoCD8+T-cellexhaustioninchronicHIV-1infection[J].EurJImmunol.2010,40:949-954.55.EnqvistM,AskEH,ForslundE,etal.CoordinatedexpressionofDNAM-1andLFA-1ineducatedNKcells[J].JImmunol.2015,194:4518-4527.56.MartinetL,SmythMJ.Balancingnaturalkillercellactivationthroughpairedreceptors[J].NatRevImmunol.2015,15:243-254.57.BalsamoM,ZambelloR,TeramoA,etal.AnalysisofNKcell/DCinteractioninNK-typelymphoproliferativediseaseofgranularlymphocytes(LDGL):roleofDNAM-1andNKp30[J].ExpHematol.2009,37:1167-1175.58.LozanoE,JollerN,CaoY,etal.TheCD226/CD155interactionregulatestheproinflammatory(Th1/Th17)/anti-inflammatory(Th2)balanceinhumans[J].JImmunol.2013,191:3673-3680.59.ArdolinoM,ZingoniA,CerboniC,etal.DNAM-1ligandexpressiononAg-stimulatedTlymphocytesismediatedbyROS-dependentactivationofDNA-damageresponse:relevanceforNK-Tcellinteraction[J].Blood.2011,117:4778-4786.60.NabekuraT,KanayaM,ShibuyaA,etal.CostimulatorymoleculeDNAM-1isessentialforoptimaldifferentiationofmemorynaturalkillercellsduringmousecytomegalovirusinfection[J].Immunity.2014,40:225-234.61.ChanCJ,MartinetL,GilfillanS,etal.ThereceptorsCD96andCD226opposeeachotherintheregulationofnaturalkillercellfunctions[J].NatImmunol.2014,15:431-438.62.LongEO,KimHS,LiuD,etal.Controllingnaturalkillercellresponses:integrationofsignalsforactivationandinhibition[J].AnnuRevImmunol.2013,31:227-258.55 第四军医大学硕士学位论文63.AnfossiN,AndreP,GuiaS,etal.HumanNKcelleducationbyinhibitoryreceptorsforMHCclassI[J].Immunity.2006,25:331-342.64.RamsbottomKM,HawkinsED,ShimoniR,etal.Cuttingedge:DNAXaccessorymolecule1-deficientCD8+Tcellsdisplayimmunologicalsynapsedefectsthatimpairantitumorimmunity[J].JImmunol.2014,192:553-557.65.WilsonEB,El-JawhariJJ,NeilsonAL,etal.HumantumourimmuneevasionviaTGF-betablocksNKcellactivationbutnotsurvivalallowingtherapeuticrestorationofanti-tumouractivity[J].PLoSOne.2011,6:e22842.66.HromadnikovaI,PirkovaP,SedlackovaL.InfluenceofinvitroIL-2orIL-15aloneorincombinationwithHsp-70-derived14-merpeptide(TKD)ontheexpressionofNKcellactivatoryandinhibitoryreceptors[J].MediatorsInflamm.2013,2013:405295.67.PenafuerteC,Bautista-LopezN,BoulasselMR,etal.Thehumanorthologofgranulocytemacrophagecolony-stimulatingfactorandinterleukin-2fusionproteininducespotentexvivonaturalkillercellactivationandmaturation[J].CancerRes.2009,69:9020-9028.68.MoustakiA,ArgyropoulosKV,BaxevanisCN,etal.EffectofthesimultaneousadministrationofglucocorticoidsandIL-15onhumanNKcellphenotype,proliferationandfunction[J].CancerImmunolImmunother.2011,60:1683-1695.69.CremerI,FridmanWH,Sautes-FridmanC.TumormicroenvironmentinNSCLCsuppressesNKcellsfunction[J].Oncoimmunology.2012,1:244-246.70.ShibuyaK,ShibataK,Tahara-HanaokaS,etal.Commenton"CD226isspecificallyexpressedonthesurfaceofTh1cellsandregulatestheirexpansionandeffectorfunctions"[J].JImmunol.2006,176:3855;authorreply3856.71.FuhrmanCA,YehWI,SeayHR,etal.DivergentPhenotypesofHumanRegulatoryTCellsExpressingtheReceptorsTIGITandCD226[J].JImmunol.2015,195:145-155.72.SutavaniRV,BradleyRG,RamageJM,etal.CD55costimulationinducesdifferentiationofadiscreteTregulatorytype1cellpopulationwithastablephenotype[J].JImmunol.2013,191:5895-5903.73.GaglianiN,MagnaniCF,HuberS,etal.CoexpressionofCD49bandLAG-3identifieshumanandmouseTregulatorytype1cells[J].NatMed.2013,19:739-746.74.MagnaniCF,AlberigoG,BacchettaR,etal.KillingofmyeloidAPCsviaHLAclassI,CD2andCD226definesanovelmechanismofsuppressionbyhumanTr1cells[J].EurJImmunol.2011,41:1652-1662.56 第四军医大学硕士学位论文75.RapuanoKM,HuckinsJF,SargentJD,etal.IndividualDifferencesinRewardandSomatosensory-MotorBrainRegionsCorrelatewithAdiposityinAdolescents[J].CerebCortex.2015.76.BacheletI,MunitzA,MankutadD,etal.MastcellcostimulationbyCD226/CD112(DNAM-1/Nectin-2):anovelinterfaceintheallergicprocess[J].JBiolChem.2006,281:27190-27196.77.MaierLM,HaflerDA.Autoimmunityriskallelesincostimulationpathways[J].ImmunolRev.2009,229:322-336.78.DuY,TianL,ShenLX,etal.AssociationoftheCD226singlenucleotidepolymorphismwithsystemiclupuserythematosusintheChineseHanpopulation[J].TissueAntigens.2011,77:65-67.79.AvouacJ,ElhaiM,TomcikM,etal.CriticalroleoftheadhesionreceptorDNAXaccessorymolecule-1(DNAM-1)inthedevelopmentofinflammation-drivendermalfibrosisinamousemodelofsystemicsclerosis[J].AnnRheumDis.2013,72:1089-1098.80.ElhaiM,ChiocchiaG,MarchiolC,etal.TargetingCD226/DNAXaccessorymolecule-1(DNAM-1)incollagen-inducedarthritismousemodels[J].JInflamm(Lond).2015,12:9.81.MattanaTC,SantosAS,FukuiRT,etal.CD226rs763361isassociatedwiththesusceptibilitytotype1diabetesandgreaterfrequencyofGAD65autoantibodyinaBraziliancohort[J].MediatorsInflamm.2014,2014:694948.82.NielsenN,PascalV,FasthAE,etal.BalancebetweenactivatingNKG2D,DNAM-1,NKp44andNKp46andinhibitoryCD94/NKG2Areceptorsdeterminenaturalkillerdegranulationtowardsrheumatoidarthritissynovialfibroblasts[J].Immunology.2014,142:581-593.83.FogelLA,YokoyamaWM,FrenchAR.Naturalkillercellsinhumanautoimmunedisorders[J].ArthritisResTher.2013,15:216.84.ShlomchikWD.Graft-versus-hostdisease[J].NatRevImmunol.2007,7:340-352.85.KoyamaM,KunsRD,OlverSD,etal.PromotingregulationviatheinhibitionofDNAM-1aftertransplantation[J].Blood.2013,121:3511-3520.86.RuggeriL,CapanniM,UrbaniE,etal.Effectivenessofdonornaturalkillercellalloreactivityinmismatchedhematopoietictransplants[J].Science.2002,295:2097-2100.87.NabekuraT,ShibuyaK,TakenakaE,etal.CriticalroleofDNAXaccessorymolecule-1(DNAM-1)inthedevelopmentofacutegraft-versus-hostdiseaseinmice[J].57 第四军医大学硕士学位论文ProcNatlAcadSciUSA.2010,107:18593-18598.88.ChanCJ,AndrewsDM,McLaughlinNM,etal.DNAM-1/CD155interactionspromotecytokineandNKcell-mediatedsuppressionofpoorlyimmunogenicmelanomametastases[J].JImmunol.2010,184:902-911.89.Tahara-HanaokaS,ShibuyaK,KaiH,etal.TumorrejectionbythepoliovirusreceptorfamilyligandsoftheDNAM-1(CD226)receptor[J].Blood.2006,107:1491-1496.90.Iguchi-ManakaA,KaiH,YamashitaY,etal.AcceleratedtumorgrowthinmicedeficientinDNAM-1receptor[J].JExpMed.2008,205:2959-2964.91.HouS,ZhengX,WeiH,etal.RecombinantsolubleCD226proteindirectlyinhibitscancercellproliferationinvitro[J].IntImmunopharmacol.2014,19:119-126.92.MirjacicMartinovicKM,BabovicN,DzodicRR,etal.DecreasedexpressionofNKG2D,NKp46,DNAM-1receptors,andintracellularperforinandSTAT-1effectormoleculesinNKcellsandtheirdimandbrightsubsetsinmetastaticmelanomapatients[J].MelanomaRes.2014,24:295-304.93.QuP,HuangX,ZhouX,etal.LossofCD155expressionpredictspoorprognosisinhepatocellularcarcinoma[J].Histopathology.2015,66:706-714.94.KlingemannH.ArenaturalkillercellssuperiorCARdrivers?[J].Oncoimmunology.2014,3:e28147.95.WuMR,ZhangT,AlconA,etal.DNAM-1-basedchimericantigenreceptorsenhanceTcelleffectorfunctionandexhibitinvivoefficacyagainstmelanoma[J].CancerImmunolImmunother.2015,64:409-418.96.MagriG,MuntasellA,RomoN,etal.NKp46andDNAM-1NK-cellreceptorsdrivetheresponsetohumancytomegalovirus-infectedmyeloiddendriticcellsovercomingviralimmuneevasionstrategies[J].Blood.2011,117:848-856.97.StegmannKA,BjorkstromNK,CiesekS,etal.Interferonalpha-stimulatednaturalkillercellsfrompatientswithacutehepatitisCvirus(HCV)infectionrecognizeHCV-infectedanduninfectedhepatomacellsviaDNAXaccessorymolecule-1[J].JInfectDis.2012,205:1351-1362.98.WelchMJ,TeijaroJR,LewickiHA,etal.CD8TcelldefectofTNF-alphaandIL-2inDNAM-1deficientmicedelaysclearanceinvivoofapersistentvirusinfection[J].Virology.2012,429:163-170.99.HawrylowiczCM,O'GarraA.Potentialroleofinterleukin-10-secretingregulatoryTcellsinallergyandasthma[J].NatRevImmunol.2005,5:271-283.58 第四军医大学硕士学位论文100.SellonRK,TonkonogyS,SchultzM,etal.Residententericbacteriaarenecessaryfordevelopmentofspontaneouscolitisandimmunesystemactivationininterleukin-10-deficientmice[J].InfectImmun.1998,66:5224-5231.101.SaraivaM,O'GarraA.TheregulationofIL-10productionbyimmunecells[J].NatRevImmunol.2010,10:170-181.102.FiorentinoDF,BondMW,MosmannTR.TwotypesofmouseThelpercell.IV.Th2clonessecreteafactorthatinhibitscytokineproductionbyTh1clones[J].JExpMed.1989,170:2081-2095.103.RoncaroloMG,GregoriS,BattagliaM,etal.Interleukin-10-secretingtype1regulatoryTcellsinrodentsandhumans[J].ImmunolRev.2006,212:28-50.104.RossolM,KrausS,PiererM,etal.TheCD14(bright)CD16+monocytesubsetisexpandedinrheumatoidarthritisandpromotesexpansionoftheTh17cellpopulation[J].ArthritisRheum.2012,64:671-677.105.TrauneckerE,GardnerR,FonsecaJE,etal.BlockingofLFA-1enhancesexpansionofTh17cellsinducedbyhumanCD14(+)CD16(++)nonclassicalmonocytes[J].EurJImmunol.2015,45:1414-1425.106.BurbanoC,VasquezG,RojasM.ModulatoryeffectsofCD14+CD16++monocytesonCD14++CD16-monocytes:apossibleexplanationofmonocytealterationsinsystemiclupuserythematosus[J].ArthritisRheumatol.2014,66:3371-3381.107.GaoQ,ZhangY,HanC,etal.BlockadeofCD47amelioratesautoimmuneinflammationinCNSbysuppressingIL-1-triggeredinfiltrationofpathogenicTh17cells[J].JAutoimmun.2016.108.SteinmanL.Nuancedrolesofcytokinesinthreemajorhumanbraindisorders[J].JClinInvest.2008,118:3557-3563.109.JagerA,DardalhonV,SobelRA,etal.Th1,Th17,andTh9effectorcellsinduceexperimentalautoimmuneencephalomyelitiswithdifferentpathologicalphenotypes[J].JImmunol.2009,183:7169-7177.110.KnierB,RothhammerV,HeinkS,etal.NeutralizingIL-17protectstheopticnervefromautoimmunepathologyandpreventsretinalnervefiberlayeratrophyduringexperimentalautoimmuneencephalomyelitis[J].JAutoimmun.2015,56:34-44.111.BecherB,SegalBM.T(H)17cytokinesinautoimmuneneuro-inflammation[J].CurrOpinImmunol.2011,23:707-712.112.LuP,WangM,ZhengP,etal.Th17/Tregunbalanceisinvolvedinthepathogenesis59 第四军医大学硕士学位论文ofexperimentalautoimmuneencephalomyelitis[J].XiBaoYuFenZiMianYiXueZaZhi.2014,30:1013-1017.113.SunY,TianT,GaoJ,etal.MetforminamelioratesthedevelopmentofexperimentalautoimmuneencephalomyelitisbyregulatingThelper17andregulatoryTcellsinmice[J].JNeuroimmunol.2016,292:58-67.114.WuL,LiN,ZhangM,etal.MHC-mismatchedmixedchimerismaugmentsthymicregulatoryT-cellproductionandpreventsrelapseofEAEinmice[J].ProcNatlAcadSciUSA.2015,112:15994-15999.115.SinhaS,MillerLM,SubramanianS,etal.RTL551treatmentofEAEreducesCD226andT-bet+CD4TcellsinperipheryandpreventsinfiltrationofT-bet+IL-17,IFN-gammaproducingTcellsintoCNS[J].PLoSOne.2011,6:e21868.116.YangCA,ChiangBL.Inflammasomesandhumanautoimmunity:Acomprehensivereview[J].JAutoimmun.2015,61:1-8.117.GuoH,CallawayJB,TingJP.Inflammasomes:mechanismofaction,roleindisease,andtherapeutics[J].NatMed.2015,21:677-687.118.SuttonCE,LalorSJ,SweeneyCM,etal.Interleukin-1andIL-23induceinnateIL-17productionfromgammadeltaTcells,amplifyingTh17responsesandautoimmunity[J].Immunity.2009,31:331-341.119.Acosta-RodriguezEV,NapolitaniG,LanzavecchiaA,etal.Interleukins1betaand6butnottransforminggrowthfactor-betaareessentialforthedifferentiationofinterleukin17-producinghumanThelpercells[J].NatImmunol.2007,8:942-949.120.DuraesFV,LippensC,SteinbachK,etal.pDCtherapyinducesrecoveryfromEAEbyrecruitingendogenouspDCtositesofCNSinflammation[J].JAutoimmun.2016,67:8-18.121.HongQY,WuGM,QianGS,etal.PreventionandmanagementoflungcancerinChina[J].Cancer.2015,121Suppl17:3080-3088.122.TorreLA,BrayF,SiegelRL,etal.Globalcancerstatistics,2012[J].CACancerJClin.2015,65:87-108.123.ZhangJ,ChenSF,ZhenY,etal.Multicenteranalysisoflungcancerpatientsyoungerthan45yearsinShanghai[J].Cancer.2010,116:3656-3662.124.ChenW,ZhengR,ZengH,etal.AnnualreportonstatusofcancerinChina,2011[J].ChinJCancerRes.2015,27:2-12.125.LiY,DaiM,ChenY,etal.Estimatesoflungcancermortalityattheprovincelevelin60 第四军医大学硕士学位论文China[J].ZhongguoFeiAiZaZhi.2011,14:120-126.126.WinterH,vandenEngelNK,RusanM,etal.Active-specificimmunotherapyfornon-smallcelllungcancer[J].JThoracDis.2011,3:105-114.127.DeclerckS,VansteenkisteJ.Immunotherapyforlungcancer:ongoingclinicaltrials[J].FutureOncol.2014,10:91-105.128.MotzGT,SantoroSP,WangLP,etal.TumorendotheliumFasLestablishesaselectiveimmunebarrierpromotingtoleranceintumors[J].NatMed.2014,20:607-615.129.ShiS,ZhouB,ZhangK,etal.AssociationbetweentwogeneticvariantsofCD226geneandCervicalSquamousCellCarcinoma:acase-controlstudy[J].Gene.2013,519:159-163.130.ZhangC,DingZ,LvG,etal.CD226rs727088A>GpolymorphismincreasesthesusceptibilitytogastriccancerinChinesepopulations[J].Gene.2015,557:92-97.131.UedaH,HowsonJM,EspositoL,etal.AssociationoftheT-cellregulatorygeneCTLA4withsusceptibilitytoautoimmunedisease[J].Nature.2003,423:506-511.132.El-SherbinyYM,MeadeJL,HolmesTD,etal.TherequirementforDNAM-1,NKG2D,andNKp46inthenaturalkillercell-mediatedkillingofmyelomacells[J].CancerRes.2007,67:8444-8449.133.MaitiAK,Kim-HowardX,ViswanathanP,etal.Non-synonymousvariant(Gly307Ser)inCD226isassociatedwithsusceptibilitytomultipleautoimmunediseases[J].Rheumatology(Oxford).2010,49:1239-1244.134.CarlstenM,BjorkstromNK,NorellH,etal.DNAXaccessorymolecule-1mediatedrecognitionoffreshlyisolatedovariancarcinomabyrestingnaturalkillercells[J].CancerRes.2007,67:1317-1325.135.BauryB,MassonD,McDermottBM,Jr.,etal.IdentificationofsecretedCD155isoforms[J].BiochemBiophysResCommun.2003,309:175-182.136.CarlstenM,NorellH,BrycesonYT,etal.PrimaryhumantumorcellsexpressingCD155impairtumortargetingbydown-regulatingDNAM-1onNKcells[J].JImmunol.2009,183:4921-4930.137.ToutiraisO,CabillicF,LeFriecG,etal.DNAXaccessorymolecule-1(CD226)promoteshumanhepatocellularcarcinomacelllysisbyVgamma9Vdelta2Tcells[J].EurJImmunol.2009,39:1361-1368.61 第四军医大学硕士学位论文个人简历和研究成果个人简历2008年9月至2013年7月河北医科大学临床医学专业2013年9月至2016年7月第四军医大学免疫学专业硕士研究生期间论文发表情况英文文章1.ZengH*,ZhangR,JinBQ,ChenLH.Type1regulatoryTcells:anewmechanismfortheperipheralimmunetolerance.CellMolImmunol.2015Sep;12(5):566-71.2.ZengH*,LiuQ*,ZhouG,ZhaoF,WangH,ChenLH.CorrelationbetweenCD226polymorphism(rs763361)andthesusceptibilityoflungcancerinChinesepopulation.Accepted3.ZhangR*,ZengH*,ZhangY*,ChenK,ZhangC,SongC,FangL,ZhuangR,XuZ,YangK,JinB,WangQandChenLH.CD226ligationprotectsagainstEAEbypromotingIL-10expressionviaregulationofCD4+Tcelldifferentiation.Oncotarget,2016Mar1.doi:10.186324.WangY*,GongJ,ZengH,LiuR,JinB,ChenLH,WangQ.Lipopolysaccharideactivatestheunfoldedproteinresponse(UPR)inhumanperiodontalligamentfibroblasts.JPeriodontol,2015Dec22:1-14.中文文章1.曾汉玉,刘媛,郭雯娓,王晓红,陈丽华.反复自发性流产患者外周血CD14+细胞表面CD49b和淋巴细胞活化基因3表达水平降低.细胞与分子免疫学,2016,32(3)：369-3722.李卓,曾汉玉,马樱,刘媛,张戎,刘美宁,陈丽华.2种检测人肾综合征出血热IgG抗体ELISA试剂盒的比较.传染病信息,2015,28(2)：92-962 第四军医大学硕士学位论文硕士研究生期间参加会议情况国内会议1.曾汉玉,张戎,金伯泉,陈丽华等.CD226分子通过促进IL-10分泌延缓小鼠EAE发病.第九届全国免疫学学术大会论文集.2.ZengH,ZhangR,JinBQ,ChenLH.CD226ligationprotectsagainstEAEbypromotingIL-10expressionviaregulationofCD4+Tcelldifferentiation.第十届全国免疫学学术大会—自身免疫性疾病分会场报告.获奖情况1.陕西省第二届研究生创新成果一等奖(排名第二)。2.参加“全国高等教育医学数字化规划教材(国家医学电子书包)”的编写。63 第四军医大学硕士学位论文致谢时光如流水，岁月了无痕。一转眼，在四医大已经渡过了三年充实而美好的时光，在这里丰富了自己的人生阅历，开阔了眼界，认识了许多值得信任可爱的朋友。本课题是在导师陈丽华教授的耐心指导和悉心关怀下完成的。导师严谨治学的精神、忘我的工作热情以及孜孜不倦的探索精神深深打动并影响我，是我一生学习的榜样。衷心感谢导师三年来对我学业上的不断教诲和生活上的亲切关怀，对我自身缺点的包容以及努力时的肯定。衷心感谢金伯泉教授在我研究生期间的关怀与鼓励，您谦虚的教学态度及严谨的治学精神令我们心生敬畏的同时又奋进。感谢免疫教研室主任杨琨教授和杨安钢教授在我研究生阶段的无私帮助和大力支持。感谢方亮教员在课题思路和实验上的点拨，感谢张赟副教授、宋朝君副教授和庄然副教授、李琦高级实验师在课题中的帮助。感谢王颖博士、张戎博士、刘蓉蓉博士在学习和生活中对我的帮助和启发。感谢黄晓峰教授、曹云新高级实验师、苗咏梅教员、孟艳玲实验师三年来给予的指导和帮助。马樱教员、张春梅博士、张宇丝博士、孙元杰博士、席文锦博士、赵聪博士、杨舒雅硕士、唐康硕士等同门给予的热心帮助。感谢胡金涛实验师、单抗组技术人员及其他各位科室教授、研究生、工作人员的帮助和支持。最后感谢我的父母以及朋友们，在我人生路途上的无私帮助和不断鼓励。64