肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2(TIPE2)重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制

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肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制中文摘要肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制中文摘要目的：研究肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）对胃癌细胞的作用及其分子机制。方法：分离人外周血单个核细胞（PBMCs）提取总RNA，RT-PCR扩增人TIPE2cDNA，将其亚克隆至pMD19-T载体进行DNA测序鉴定。以测序正确的pMD19-T-TIPE2为模板，PCR扩增TIPE2CDS片段，在SalI、XhoI酶切位点之间插入至pAdTrack-CMV转移质粒中构建pAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒，并经PCR、双酶切、DNA测序鉴定。将构建正确的pAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒经PmeI单酶切线性化后与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒共转化至BJ5183大肠杆菌中进行同源重组，制备腺病毒同源重组质粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-TIPE2（pAd-TIPE2）。BJ5183来源的pAd-TIPE2再转化至Top10大肠杆菌进行扩增，然后PacI单酶切回收大片段用脂质体转染293正常人胚肾细胞进行TIPE2重组腺病毒（AdVTIPE2）包装。AdVTIPE2在293细胞中多轮感染和扩增，并用氯化铯（CsCl）密度梯度超速离心纯化。RT-PCR检测AGS、HGC27、SGC-7901人胃癌细胞和GES-1正常人胃粘膜上皮细胞中内源性TIPE2的表达；RT-PCR和Westernblot检测AdVTIPE2重组腺病毒介导的TIPE2在293和AGS细胞中的表达。分别利用MTT、AnnexinV-PE/7-AAD双染的流式分析、划痕实验、Transwell侵袭实验检测腺病毒介导的TIPE2表达对AGS胃癌细胞生长、凋亡、移动和侵袭能力的影响，并Westernblot检测对Bcl-2、Bcl-XL、,Bax、Bak、Caspase-9、Caspase-3、PARP、p-ERK1/2、ERK1/2、p-AKT、AKT、p-GSK3β、GSK3β、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail1、Snail2/Slug、Twist、Zeb1蛋白表达的影响。结果：（1）从外周血单个核细胞（PBMCs）中成功克隆出特异性的684bp人TIPE2cDNA（含有555bpCDS），亚克隆至pMD19-Tvector中测序与GenBank(NM_024575.4)I 中文摘要肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制报道的序列完全一致。（2）成功构建了pAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒（插入555bpCDS）和pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-TIPE2（pAd-TIPE2）腺病毒同源重组质粒，及获得了表达人TIPE2的重组腺病毒AdVTIPE2。（3）AdVTIPE2能成功介导人TIPE2在293和AGS哺乳动物细胞中转基因和表达。（4）GES-1正常人胃粘膜上皮细胞表达TIPE2，而AGS、HGC27、SGC-7901胃癌细胞均不表达TIPE2。（5）AdVTIPE2显著抑制AGS胃癌细胞生长（感染72h，较PBS对照的相对生长活力为42.7±4.5%）和诱导凋亡（感染48h，凋亡率为49.2±4.5%）。（6）AdVTIPE2显著抑制AGS胃癌细胞移动（较PBS对照的相对移动能力为65.3±5.5%）和侵袭（较PBS对照的相对侵袭能力为56.5±6.5%）。（7）AdVTIPE2明显上调AGS胃癌细胞Bax、剪切型Caspase-9、剪切型Caspase-3、剪切型PARP、E-cadherin和下调Bcl-XL、p-ERK1/2、p-AKT、p-GSK3β、N-cadherin、Vimentin、Snail1、Snail2/Slug、Zeb1，而对Bcl-2、Bak、ERK1/2、AKT、GSK3β、Twist几乎无影响。结论：（1）我们首次发现TIPE2在人胃癌细胞中丢失。（2）TIPE2很可能通过活化内源性凋亡途径和抑制PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK1/2信号途径抑制胃癌细胞生长、诱导胃癌细胞凋亡。（3）TIPE2很可能通过下调上皮间充质转化（EMT）转录因子的表达和促进N-cadherin到E-cadherin的转换来抑制胃癌细胞的转移。关键词：肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）；胃癌；凋亡；转移；上皮间充质转化（EMT）作者：苏兰指导教师：缪竞诚、谢宇锋II 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制英文摘要Thesuppressiveeffectofadenovirus-expressingtumornecrosisfactor(TNF)-alpha-inducedprotein8-like2(TIPE2)ongastriccancercellsanditsunderlyingmechanismAbstractObjective:Toinvestigatetheeffectoftumornecrosisfactor(TNF)-alpha-inducedprotein8-like2(TIPE2)ongastriccancercellsanditsunderlyingmolecularmechanism.Methods:ThetotalRNAwaspurifiedfromhumanperipheralbloodmononuclearcells(PBMCs).ThehumanTIPE2cDNAfragmentwasthenamplifiedbyreversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR),subclonedinpMD19-Tvectorandsequenced.ThehumanTIPE2codingsequence(CDS)fragmentwasamplifiedbyPCRusingpMD19-T-TIPE2plasmidastemplate,subclonedintopAdTrack-CMVtransferplasmidbetweenSalIandXhoIsitesandidentifiedbyPCR,doubleendonucleasedigestionandsequencing,togeneratepAdTrack-CMV-TIPE2recombinanttransferplasmid.ThePmeI-linearizedpAdTrack-CMV-TIPE2plasmidandpAdEasy-1backboneplasmidwerecotransformedintoBJ5183competentbacteriaforhomologousrecombination.TheresultantpAdEasy-1-pAdTrack-CMV-TIPE2(pAd-TIPE2)homologousrecombinantplasmidpurifiedfromBJ5183bacteriawasfurthertransformedintoTop10competentbacteriatoamplifypAd-TIPE2plasmid.ThenpAd-TIPE2plasmidwaslinearizedwithPacIandthelargefragmentwastransfectedinto293humanembryonickidneycellsbyLipofectamine2000,leadingtoformationofrecombinantadenovirusAdVTIPE2expressinghumanTIPE2.TheAdVTIPE2adenoviruswasabundantlyamplifiedin293cellsandpurifiedbycesiumchloride(CsCl)density-gradientultracentrifugation.TheexpressionofendogenichumanTIPE2inAGS,HGC27andSGC-7901humangastriccancercellsandGES-1normalhumanmucousepithelialcellsweredetectedbyRT-PCR.Adenovirus-mediatedhumanTIPE2expressionin293cellsandAGSgastriccancercellsweredetectedbyRT-PCRandWesternblot,respectively.Theeffectofadenovirus-mediatedhumanTIPE2expressionongrowth,apoptosis,migrationandIII 英文摘要肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制invasioninAGSgastriccancercellswasexaminedby3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide(MTT)assay,flowcytometricanalysisofAnnexinV-PE/7-AADdoublestaining,woundhealingassayandTranswellchamberassay,respectively.Theeffectofadenovirus-mediatedhumanTIPE2expressiononexpressionofBcl-2,Bcl-XL,Bax,Bak,Caspase-9,Caspase-3,PARP,p-ERK1/2,ERK1/2,p-AKT,AKT,p-GSK3β,GSK3β,E-cadherin,N-cadherin,Vimentin,Snail1,Snail2/Slug,TwistandZeb1inAGSgastriccancercellsweredeterminedbyWesternblot.Results:(1)Thespecific684bphumanTIPE2cDNAfragmentcontaining555bpCDSwassuccessfullyclonedfromhumanPBMCsandsubclonedintopMD19-Tvector,whichisconsistentwiththesequencereportedinGenBank(NM_024575.4).(2)ThepAdTrack-CMV-TIPE2containing555bphumanTIPE2CDSrecombinanttransferplasmidandpAdEasy-1-pAdTrack-CMV-TIPE2(pAd-TIPE2)adenoviralhomologousrecombinantplasmidwassuccessfullyconstructed,andtherecombinantadenovirusexpressinghumanTIPE2(AdVTIPE2)wasobtained.(3)AdVTIPE2wascapableofeffectivelydirectinghumanTIPE2genetransferandexpressioninmammaliancellssuchas293cellsandAGSgastriccells.(4)HumanTIPE2wasdetectedinGES-1humanmucousepithelialcellsbutnotinAGS,HGC27andSGC-7901humangastriccancercells.(5)AdVTIPE2significantlyinhibitedAGSgastriccancercellgrowth(relativevitality,42.7±4.5%PBScontrolathour72postinfection)andinducedAGSapoptosis(apoptoticrate,49.2±4.5%athour48postinfection).(6)AdVTIPE2remarkablysuppressedAGSgastriccancercellmigration(relativemigratoryability,65.3±5.5%PBScontrol)andinvasion(relativeinvasiveability,56.5±6.5%PBScontrol).(7)AdVTIPE2exhibitedobviouseffectonupregulationofBax,cleavedCaspase-9,cleavedCaspase-3,cleavedPARPandE-cadherinaswellasdownregulationofBcl-XL,p-ERK1/2,p-AKT,p-GSK3β,N-cadherin,Vimentin,Snail1,Snail2/SlugandZeb1,butnotonBcl-2,Bak,ERK1/2,AKT,GSK3βandTwist,inAGSgastriccancercells.Conclusions:(1)Toourknowledge,weforthefirsttimedemonstratedtheTIPE2waslostinhumangastriccancercells.(2)TIPE2wascapableofdirectlyinhibitedgastriccancercellgrowthandinducedgastriccancerapoptosisverypossiblyviaactivationofintrinsicapoptoticpathwayanddownregulationofPI3K/AKTandRas/Raf/MEK/ERK1/2signalingpathway.(3)TIPE2suppressedgastriccancermetastasisverypossiblythroughIV 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制英文摘要downregulationofepithelial-mesenchymaltransition(EMT)transcriptionfactorsandswitchfromN-cadherintoE-cadherin.Keywords:tumornecrosisfactor(TNF)-alpha-inducedprotein8-like2(TIPE2);gastriccancer;apoptosis;metastasis;epithelial-mesenchymaltransition(EMT)Writtenby：LanSuSupervisedby：Jing-chengMiao、Yu-fengXieV 目录研究背景...............................................................................................................................1参考文献............................................................................................................................3第一部分人TIPE2基因的克隆及其重组腺病毒的构建..............................................51材料和方法....................................................................................................................51.1材料..........................................................................................................................51.2仪器..........................................................................................................................61.3方法..........................................................................................................................72结果..............................................................................................................................142.1TIPE2基因的克隆和鉴定.....................................................................................142.2AdVTIPE2重组腺病毒载体的构建和鉴定..........................................................193讨论..............................................................................................................................25参考文献..........................................................................................................................26第二部分腺病毒介导的TIPE2表达对胃癌细胞的体外研究....................................281材料和方法..................................................................................................................281.1材料........................................................................................................................281.2仪器........................................................................................................................291.3方法........................................................................................................................302结果..............................................................................................................................342.1高纯度、高滴度AdVTIPE2重组腺病毒的获得...............................................342.2TIPE2基因在胃癌细胞中的表达.........................................................................352.3AdVTIPE2重组腺病毒感染胃癌细胞形态学和GFP表达观察........................362.4腺病毒介导的TIPE2转基因在胃癌细胞中的表达鉴定...................................372.5TIPE2重组腺病毒体外对胃癌细胞的生长抑制效应.........................................382.6TIPE2重组腺病毒诱导胃癌细胞的凋亡的作用.................................................382.7TIPE2重组腺病毒抑制胃癌细胞的移动.............................................................392.8TIPE2重组腺病毒抑制胃癌细胞的侵袭.............................................................40 2.9TIPE2重组腺病毒对胃癌细胞凋亡相关蛋白的影响.........................................402.10TIPE2重组腺病毒对胃癌细胞EMT相关蛋白的影响.....................................413讨论..............................................................................................................................42参考文献..........................................................................................................................44缩略词语.............................................................................................................................46致谢.................................................................................................................................48 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制研究背景研究背景肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TNFAIP8L2，TIPE2）是一种重要的抗炎因子，最早在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠的炎症脊髓中通过高通量基因芯1片鉴定。TIPE2属于TNFAIP8（TIPE）家族的第三个成员，目前为止该家族共发现2TIPE、TNFAIP8L1（TIPE1）、TIPE2和TNFAIP8L3（TIPE3）四个成员。人TIPE2基因定位于1号染色体1q21.2-1q21.3，编码氨基酸序列与人TIPE呈现53%相同、78%1相似的高度同源性；与小鼠TIPE2的氨基酸序列94%相同。TIPE2含有死亡效应结构域（DED）样结构域，与caspase-8、c-FLIP等的DED相似，但具有独特的协助蛋1,3白结合的巨大疏水中央腔体结构。DED蛋白是关键的信号转导子，参与细胞死亡和炎症。因而，TIPE2独特的DED样结构域介导了TIPE2的重要生物学功能。已有1,2,4的研究报道显示，TIPE2在机体免疫调控和肿瘤发生、发展中将发挥着重要的作用。TIPE2是一种选择性高表达于淋巴样和髓样细胞的新型DED蛋白免疫调控负性分子，在天然和获得性免疫系统中维持免疫内环境稳态方面发挥着关键的作用。研究发现，TIPE2是一种关键的TLR和TCR信号负性调节因子，参与预防天然、获得性1,5免疫反应过度和维持免疫稳态。利用TIPE2基因敲除小鼠模型，发现小鼠TIPE2缺陷引起机体多种器官炎症、脾肿大、早亡，及对感染性休克（败血症）的高反应性；1TIPE2缺陷的巨噬细胞和T细胞增强对TLR和TCR信号的敏感性。TIPE2可通过结合caspase-8抑制免疫细胞AP-1、NF-κB、JNK、p38MAPK的活化和促进Fas诱1导的T细胞凋亡进行免疫负性调控。除直接抑制TLR和TCR信号外，TIPE2可直接结合和阻断RacGTP酶的活性来决定巨噬细胞吞噬、氧爆作用的强度，进而控制6机体对细菌的天然免疫。另外，TIPE2能通过抑制PI3K-RacGTP酶途径来调控机体7++树突状细胞对RNA的天然免疫。TIPE2还可通过调控CD4CD25Treg调节性T细胞免疫抑制分子CTLA-4、Foxp3、TGF-β、IL-10的表达来维持和增强Treg的免疫抑8制活性，参与机体的免疫负性调控。值得一提的是，TIPE2可通过抑制JNK、p38MAPK、NF-κB信号途径诱导精氨酸代谢转换，减少合成NO合成酶（增加合成精氨910酸酶），进而抑制NO自有基产生来抑制炎症反应。最近报道TIPE2是miR-21的1 研究背景肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制靶基因，miR-21可通过NF-κB-miR-21-TIPE2轴直接抑制TIPE2表达进而抵抗T细胞凋亡参与T细胞的活化。基于TIPE2是维持免疫稳态的负性调节因子，TIPE2表达异常与系统性红斑狼疮（SLE）、HBV肝炎、哮喘、动脉粥样硬化、糖尿病肾小球综11-15合症（DN）等多种免疫性疾病密切相关。近年来，抗炎症因子TIPE2逐渐被认为是一种潜在的抑癌基因。Chen课题组报4道，TIPE2是原癌基因Ras的抑制因子，可通过结合Ras下游效应分子鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）RalGDS家族蛋白（RGL）的Ras相互作用结构域（RID）阻滞Ras/RGL形成活性复合体抑制RGL活性及RGL-PDK1-AKT和RGL-RaLGTP酶途径，参与抑制细胞的存活和运动。并且TIPE2过表达可诱导肝癌细胞死亡和抑制Ras原癌4,16基因诱导的肿瘤发生。TIPE2作为Rac1GTP酶的内源性抑制剂还可通过靶向抑制Rac1GTP酶活性，减少F-actin聚合及基质金属蛋白酶9（MMP9）和尿激酶纤维16蛋白溶酶原激活剂（uPA）的表达抑制肝癌细胞的转移。与癌旁组织相比，TIPE24,16在人肝癌组织中表达下调；肝癌TIPE2表达下调、丢失与肝癌转移明显相关。另外，TIPE2能够通过抑制caspase-8的活性抑制TLR4炎症信号所介导的结肠癌进展17。与肝癌中TIPE2表达报道不一致的是，肾细胞癌（RCC）组织中TIPE2的表达较正常对照组却明显升高，与I型IFN诱导基因MX1（黏液病毒抗性蛋白1）的表达18呈负相关，而与肿瘤TNM分期呈正相关。提示，TIPE2是一种具有抑制肿瘤生长和转移的新型抑癌基因，但在肿瘤发生、发展的作用可能与肿瘤类型等因素有关。综上所述，TIPE2是一种新型的肿瘤抑癌基因，但其在肿瘤中的研究国内外仅处于起步阶段，与胃癌发生、发展的相关性更是未见报道。本课题预实验发现，胃癌细胞中TIPE2表达丢失。我们推测，TIPE2功能丢失可能参与了胃癌的病理进程。因此，本课题通过RT-PCR方法首先从外周血单个核细胞（PBMCs）克隆人TIPE2基因，并构建TIPE2重组腺病毒（AdVTIPE2）表达载体，初步研究腺病毒介导的TIPE2过表达体外对胃癌细胞生长、凋亡、移动、侵袭的影响及其分子机制，期望TIPE2可用作胃癌的潜在治疗靶点。2 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制研究背景参考文献[1]SunH,GongS,CarmodyRJ,HilliardA,LiL,SunJetal.TIPE2,anegativeregulatorofinnateandadaptiveimmunitythatmaintainsimmunehomeostasis.Cell2008;133(3):415-426.[2]LouY,LiuS.TheTIPE(TNFAIP8)familyininflammation,immunity,andcancer.MolImmunol2011;49(1-2):4-7.[3]ZhangX,WangJ,FanC,LiH,SunH,GongSetal.CrystalstructureofTIPE2providesinsightsintoimmunehomeostasis.NatStructMolBiol2009;16(1):89-90.[4]Gus-BrautbarY,JohnsonD,ZhangL,SunH,WangP,ZhangSetal.Theanti-inflammatoryTIPE2isaninhibitoroftheoncogenicRas.MolCell2012;45(5):610-618.[5]FreundtEC,BidereN,LenardoMJ.AdifferentTIPEofimmunehomeostasis.Cell2008;133(3):401-402.[6]WangZ,FayngertsS,WangP,SunH,JohnsonDS,RuanQetal.TIPE2proteinservesasanegativeregulatorofphagocytosisandoxidativeburstduringinfection.ProcNatlAcadSciUSA2012;109(38):15413-15418.[7]SunH,ZhuangG,ChaiL,WangZ,JohnsonD,MaYetal.TIPE2controlsinnateimmunitytoRNAbytargetingthephosphatidylinositol3-kinase-Racpathway.JImmunol2012;189(6):2768-2773.[8]LuanYY,YaoYM,ZhangL,DongN,ZhangQH,YuYetal.Expressionoftumornecrosisfactor-alphainducedprotein8like-2contributestotheimmunosuppressivepropertyofCD4(+)CD25(+)regulatoryTcellsinmice.MolImmunol2011;49(1-2):219-226.[9]LouY,ZhangG,GengM,ZhangW,CuiJ,LiuS.TIPE2negativelyregulatesinflammationbyswitchingargininemetabolismfromnitricoxidesynthasetoarginase.PLoSOne2014;9(5):e96508.[10]RuanQ,WangP,WangT,QiJ,WeiM,WangSetal.MicroRNA-21regulatesT-cellapoptosisbydirectlytargetingthetumorsuppressorgeneTipe2.CellDeathDis2014;5:e1095.[11]LiD,SongL,FanY,LiX,LiY,ChenJetal.Down-regulationofTIPE2mRNAexpressioninperipheralbloodmononuclearcellsfrompatientswithsystemiclupus3 研究背景肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制erythematosus.ClinImmunol2009;133(3):422-427.[12]XiW,HuY,LiuY,ZhangJ,WangL,LouYetal.RolesofTIPE2inhepatitisBvirus-inducedhepaticinflammationinhumansandmice.MolImmunol2011;48(9-10):1203-1208.[13]MaY,LiuX,WeiZ,WangX,WangZ,ZhongWetal.TheexpressionandsignificanceofTIPE2inperipheralbloodmononuclearcellsfromasthmaticchildren.ScandJImmunol2013;78(6):523-528.[14]LouY,LiuS,ZhangC,ZhangG,LiJ,NiMetal.EnhancedatherosclerosisinTIPE2-deficientmiceisassociatedwithincreasedmacrophageresponsestooxidizedlow-densitylipoprotein.JImmunol2013;191(9):4849-4857.[15]ZhangS,ZhangY,WeiX,ZhenJ,WangZ,LiMetal.ExpressionandregulationofanovelidentifiedTNFAIP8familyisassociatedwithdiabeticnephropathy.BiochimBiophysActa2010;1802(11):1078-1086.[16]CaoX,ZhangL,ShiY,SunY,DaiS,GuoCetal.Humantumornecrosisfactor(TNF)-alpha-inducedprotein8-like2suppresseshepatocellularcarcinomametastasisthroughinhibitingRac1.MolCancer2013;12(1):149.[17]LiXM,SuJR,YanSP,ChengZL,YangTT,ZhuQ.AnovelinflammatoryregulatorTIPE2inhibitsTLR4-mediateddevelopmentofcoloncancerviacaspase-8.CancerBiomark2014;14(4):233-240.[18]ZhangZ,QiH,HouS,JinX.TIPE2mRNAoverexpressioncorrelateswithTNMstaginginrenalcellcarcinomatissues.OncolLett2013;6(2):571-575.4 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第一部分第一部分人TIPE2基因的克隆及其重组腺病毒的构建1TIPE2最早由Sun等于2008年在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠的炎症脊髓中鉴定，是一种主要选择性高表达于淋巴样和髓样造血细胞的新型DED蛋白免疫负性分子，属于TNFAIP8（TIPE）家族成员。早期的研究发现，TIPE2在控制1TLR和TCR介导的天然和获得性免疫、维持免疫稳态中发挥关键的作用；TIPE2功能异常与系统性红斑狼疮（SLE）、HBV感染、哮喘等慢性免疫性炎症疾病的进展2-4密切相关。近年来研究显示，抗炎症因子TIPE2是原癌基因Ras的抑制剂，可通过结合Ras下游效应分子鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）RalGDS家族蛋白（RGL）的Ras相互作用结构域（RID）阻滞Ras/RGL形成活性复合体抑制RGL活性及5RGL-PDK1-AKT和RGL-RaLGTP酶途径，进而抑制细胞的存活和运动。TIPE2过5,6表达能够明显诱导肿瘤细胞死亡及抑制Ras原癌基因诱导的肿瘤发生，提示TIPE2也是一种新型的潜在抑癌基因。然而，国内外有关TIPE2在肿瘤中的研究报道甚少。为进一步研究TIPE2在肿瘤发生、发展中的作用，本部分首先通过常规RT-PCR技术，从正常人外周血单个核细胞（PBMCs）中克隆人TIPE2基因，并构建TIPE2重组腺病毒（AdVTIPE2）。1材料和方法1.1材料pMD19-T克隆载体、MiniBEST总RNA抽提试剂盒、dNTPmix、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶（SalI、XhoI、HindIII、XbaI）、T4DNA连接酶、DL2000DNAMarker均购自TaKaRa公司；Oligod（T）18、RibonucleaseInhibitor、MMLV逆转录酶、LambdaDNA/HindIIIMarker均购自Thermo公司；PmeI、PacI限制性内切酶购自NewEnglandBiolabs公司；日常型小量质粒抽提试剂盒、PCR产物清洁试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司；培养基（RPMI1640、DMEM）、谷氨酰胺和新生胎牛血清（FBS）均购自LifeTechnology公司；Lipofectamine2000脂质体购自Invitrogen公司；哺乳动物细胞总蛋白裂解试剂盒购自Sigma公司；硝酸纤维素膜（NC膜）、Westernblot化学发光试剂盒均购自上海普利莱基因技术有限公司；抗人TIPE25 第一部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制抗体购自ImmunoWay公司；抗人β-actin抗体购自SantaCruz公司；Ficoll淋巴细胞分离液（密度为1.077）、酵母提取物、胰蛋白胨、NaCl、CaCl2、IPTG、X-gal、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kana）、引物等均购自上海生工生物技术有限公司；细胞培养板、培养瓶、离心管购自CORNING公司；GFP绿色荧光蛋白标记的pAdTrack-CMV转移质粒、腺病毒包装/扩增细胞293由复旦大学生命科学学院微生物学教研室钟江教授惠赠；RGD修饰的腺病毒骨架质粒pAdEasy-1由加拿大萨斯卡彻温大学萨斯卡通癌症中心JimXiang教授惠赠；Top10、BJ5183大肠杆菌和GFP表达的对照空病毒AdV由本室保存；正常人外周血（30ml）由本人提供。1.2仪器立式压力蒸汽灭菌器上海华线医用核子仪器有限公司LD4-2低速离心机THERMOELECTRONCORPORATIONTGL-16G高速离心机THERMOELECTRONCORPORATION二氧化碳培养箱德国贺利氏公司隔水式恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司恒温震荡器太仓市科教器材厂医用净化工作台吴江市金利达空调净化设备有限公司4℃和-20℃冰箱青岛海尔电冰箱股份有限公司-80℃超低温冰箱THERMOELECTRONCORPORATION电子天平上海精密仪器仪表有限公司倒置普通显微镜日本OLYMPUS公司倒置荧光显微镜日本NIKON公司电热恒温水浴箱北京市长风仪器仪表公司电热恒温水浴锅上海医疗器械五厂紫外可见分光光度计上海天普分析仪器有限公司PTC-100PCR仪美国MJ公司核酸电泳装置北京六一仪器厂蛋白电泳装置美国BIO-RAD公司凝胶、ECL发光成像分析仪上海培清科技有限公司6 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第一部分1.3方法1.3.1TIPE2基因的克隆1.3.1.1外周血单个核细胞的总RNA提取由本人提供的枸橼酸钠抗凝外周血30ml用Ficoll分离液（密度为1.077）分离外6周血单个核细胞（PBMCs），PBS清洗后，5X10PBMCs用MiniBEST总RNA抽提试剂盒提取总RNA，并紫外分光光度法测定含量。总RNA提取方法按说明书进行：61.5X10PBMCs加600μlBufferRL裂解液室温裂解2min；2.将裂解液转移到gDNAEraserSpinColumn（含2mlCollectionTube）中，12,000rpm离心1min去除基因组DNA；3.保留滤液，并加入等体积的的70%乙醇混匀；4.将混合液转入RNASpinColumn（含2mlCollectionTube）中，12,000rpm离心1min，弃滤液；5.500μlBufferRWA加入至RNASpinColumn中，12,000rpm离心30s，弃滤液。6.700μlBufferRWB（已加入指定体积的100%乙醇）加入至RNASpinColumn中，12,000rpm离心30s，弃滤液。7.将RNASpinColumn重新安置于2mlCollectionTube上，12,000rpm离心2min。8.将RNASpinColumn安置于1.5ml的RNaseFreeCollectionTube上，在RNASpinColumn膜中央处加入50μl的RNaseFreeddH2O，12,000rpm离心2min洗脱RNA。1.3.1.2反转录合成cDNA第一链10μl总RNA（500ng～2μg），2μlOligo(dT)18（0.1μg/μl），2μldNTPmix（10mM/dATP、dGTP、dCTP、dTTP）混匀，65℃作用5min后迅速冰上冷却；再加入4μl5×RT缓冲液，1μlRibonucleaseInhibitor（40U/μl），并最后加入1μlMMLV逆转录酶（200U/μl）至终体积为20μl，42℃作用1h，70℃作用10min后冰上冷却，获得的cDNA第一链立即行PCR或-80℃冰箱保存待用。1.3.1.3PCR扩增TIPE2基因根据GenBank报道的人TIPE2cDNA序列（NM_024575.4）设计一对特异性引物，TIPE2-1F:5’-GTGACTGACCACATACCCCA-3’和TIPE2-1R:7 第一部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制5’-AGTGTTAGTGCCAGGTGAGC-3’，用于人TIPE2基因的克隆（预计扩增产物为684bp）。以1.3.1.2反转录合成的cDNA第一链2μl为模板，10×PCR缓冲液5μl，TIPE2特异性引物TIPE2-1F、TIPE2-1R各1μl（25μM），dNTPmix1μl，TaqDNA聚合酶1μl（5U/μl），加ddH2O至终体积为50μlPCR体系。PCR条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，共循环30次；最后72℃后延伸10min。取PCR扩增产物5μl跑1.5%琼脂糖核酸凝胶电泳进行凝胶成像和分析。1.3.1.4TIPE2RT-PCR产物的克隆和鉴定将用PCR产物清洁试剂盒纯化的PCR产物与pMD19-T载体（图1）4℃连接过夜。连接体系为10μl：T4DNA连接酶10×缓冲液1μl，纯化PCR产物7μl，pMD19-T载体1μl和T4DNA连接酶1μl。采用常规CaCl2法将连接产物转化感受态大肠杆菌Top10，涂于含氨苄青霉素（Amp）（100μg/ml）、IPTG（1mM）和X-gal（40μg/ml）的LB琼脂平板。37℃温箱培养16h后，挑白斑克隆接种于含氨苄青霉素（100μg/ml）的LB培养基中37℃气浴振荡培养。隔日用日常型小量质粒抽提试剂盒提取质粒，用TIPE2-1F、TIPE2-1R特异性引物PCR和HindIII、XbaI（pMD19-T载体PCR克隆上、下游酶切位点）双酶切鉴定阳性克隆，并用公司通用引物RV-M（5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’）和M13-47（5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’）进行DNA测序鉴定。图1pMD19-T载体图谱PCR产物清洁纯化步骤按说明书进行：8 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第一部分1.将扩增的与理论值大小相符（600-700bp）的TIPE2RT-PCR产物用3倍体积的PCR-A溶液混匀；2.将混匀液5000rpm离心1min过柱吸附，弃去废液；3.加500μlW1溶液4000rpm离心1min，弃去废液；4.加700μlW2溶液（已加入指定体积的100%乙醇）4000rpm离心1min，弃去废液；5.12000rpm离心2min；6.最后将吸附柱置新的1.5ml离心管，在膜中央加30μlddH2O，12000rpm离心2min洗脱PCR产物。CaCl2法制备Top10大肠杆菌感受态细菌和转化步骤：1.转化前一天，Top10按1%接种5mlLB培养基37℃培养过夜；2.按1%的量转种3mlLB新鲜培养基37℃培养；3.OD600nm约为0.2（约培养1.3h）时，将细菌置0℃预冷10min；4.5000rpm离心5min收集菌体；5.加预冷的100mMCaCl2，0℃作用20～30min；6.5000rpm离心5min收集感受态细菌；7.用约200μl100mM预冷CaCl2悬浮菌体，取60μl感受态细菌加入连接产物，0℃作用至少30min；8.42℃热休克90s后，0℃放置2min；9.加500μlLB培养基37℃培养45min；10.5000rpm离心5min收集细菌涂板，37℃培养16h后挑克隆鉴定。日常型小量质粒抽提试剂盒抽提质粒步骤按说明书进行：1.将37℃，Amp抗性培养过夜的5mlTop10白斑克隆菌液5000rpm离心5min沉淀细菌；2.加0.25mlS1溶液（已加RNaseAI）充分破菌，再加0.25mlS2溶液混匀直至溶液透亮，最后加0.35mlS3溶液混匀后，12000rpm离心10min沉淀细菌蛋白和基因组DNA；3.将上清液5000rpm离心1min过柱吸附，弃去废液；4.加500μlW1溶液5000rpm离心1min，弃去废液；9 第一部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制5.加700μlW2溶液（已加入指定体积的100%乙醇）5000rpm离心1min，弃去废液；6.12000rpm离心2min；7.最后将吸附柱置新的1.5ml离心管，在膜中央加50μlddH2O，12000r/min离心2min洗脱质粒DNA。1.3.2TIPE2重组腺病毒（AdVTIPE2）的构建在1.3.1人TIPE2基因克隆的基础上，进一步构建TIPE2重组腺病毒表达载体7（AdVTIPE2）。AdVTIPE2重组腺病毒表达载体构建流程按文献（图2）进行，主要包括：1.pAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒的构建；2.pAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒与pAdEasy-1骨架质粒的同源重组；3.同源重组质粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-TIPE2（pAd-TIPE2）转染293包装细胞出毒。图2重组腺病毒构建流程图10 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第一部分1.3.2.1pAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒的构建根据人TIPE2的CDS序列（NM_024575.4）和pAdTrack-CMV转移质粒的多克隆位点（MCS）（图3A）设计一对TIPE2特异性引物TIPE2-2F:5’-ACCGTCGACGCCACCATGGAGTCCTTCAGCTCAAAG-3’和TIPE2-2R:5’-GCACTCGAGTCAGAGCTTCCCTTCGTCTAGCAGC-3’（两端分别引入SalI、XhoI酶切位点，并引入Kozak序列）。以测序正确的pMD19-T-TIPE2质粒为模板，TIPE2-2F、TIPE2-2R为引物PCR扩增人TIPE2CDS片段（预计扩增产物约为555bp）。图3AdVTIPE2重组构建示意图A，pAdTrack-CMV转移质粒图谱B，AdVTIPE2构建示意图：TIPE2编码序列插入pAdTrack-CMVMCS的SalI、XhoI酶切位点PCR体系：2+10×PCRBuffer（含有Mg）5μldNTPmix(10mMeach)1μlTIPE2-2F（25μM）1μlTIPE2-2R（25μM）1μlpMD19-T-TIPE2质粒模板1μlddH2O40μlTaqDNA聚合酶（5U/μl）1μl终体积50μlPCR条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸35s，11 第一部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制共循环30次；最后72℃后延伸10min。将PCR清洁试剂盒纯化的TIPE2CDSPCR产物和转移质粒pAdTrack-CMV分别用SalI、XhoI37℃双酶切过夜后，割胶回收目的片段，并用T4DNA连接酶将其4℃连接过夜，使TIPE2CDS片段亚克隆至pAdTrack-CMV转移质粒的SalI、XhoI酶切位点间（图3B）。连接重组转移质粒转化大肠杆菌Top10后，涂于含卡那霉素（Kana）（50μg/ml）的LB琼脂平板。37℃温箱培养16h挑单克隆，PCR、双酶切和DNA序列测定（TIPE2-2F、TIPE2-2R作为正、反测序引物）筛选pAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒。双酶切体系：pAdTrack-CMV质粒双酶切TIPE2CDSPCR产物双酶切10×BufferH2μl10×BufferH3μl10×BSA2μl10×BSA3μlpAdTrack-CMV质粒13μlTIPE2CDSPCR产物20μlSalI1.5μlSalI2μlXhoI1.5μlXhoI2μl终体积20μl终体积30μl胶回收目的片段按说明书进行：1.将SalI和XhoI双酶切的TIPE2CDSPCR产物和pAdTrack-CMV转移质粒经1%琼脂糖电泳后，分别割胶TIPE2CDS目的基因片段和线性化pAdTrack-CMV转移质粒大片段，用滤纸吸干后在电子天平上称重；2.根据100mg凝胶重量=100μlDE-A溶液，加3倍体积的DE-A溶液于65℃快速溶解；3.待充分溶解后，加0.5倍DE-A体积的DE-B溶液振荡混匀；4.将混匀液5000rpm离心1min过柱吸附，弃去废液；5.加500μlW1溶液5000rpm离心1min，弃去废液；6.加700μlW2溶液（已加入指定体积的100%乙醇）5000rpm离心1min，弃去废液；7.12000rpm离心2min；12 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第一部分8.最后将吸附柱置新的1.5ml离心管，在膜中央加60～70%体积ddH2O，12000rpm离心2min洗脱DNA。连接体系：10×LigaseBuffer1.5μl纯化的双酶切pAdTrack-CMV线性大片段5μl纯化的双酶切TIPE2CDSPCR产物7μlT4DNA连接酶1.5μl终体积15μl1.3.2.2pAd-TIPE2同源重组腺病毒质粒的构建将上述1.3.2.1构建正确的pAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒用PmeI37℃单酶切2h线性化后，分别与RGD修饰的pAdEasy-1腺病毒骨架质粒CaCl2共转化BJ5183感受态细菌，涂含Kana（50μg/ml）的LB琼脂平板后，挑单克隆抽提质粒，根据核酸琼脂糖电泳分子量大小初步筛选pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-TIPE2（pAd-TIPE2）同源重组克隆，并转化Top10后扩增质粒进行PCR和PacI单酶切鉴定。PmeI单酶切体系PacI单酶切体系10×Buffer42μl10×Buffer13μl100×BSA0.2μl100×BSA0.3μlpAdTrack-CMV-TIPE216.8μlpAd-TIPE225.7μlPmeI1μlPacI1μl终体积20μl终体积30μl1.3.2.3AdVTIPE2重组腺病毒的包装将构建的pAd-TIPE2同源重组腺病毒质粒经PacI线性化后胶回收大片段，按Lipofectamine2000操作说明转染293细胞中进行重组腺病毒包装。转染后在荧光显微镜下观察GFP荧光和转染效率，并于转染10d后收集293细胞，用无菌PBS悬浮后，将细胞悬液在﹣80℃和37℃间反复冻融6次，2000rpm离心10min获取上清。将病毒上清二次感染293细胞后，观察GFP荧光和293细胞病变，分析pAd-TIPE2同源重组腺病毒质粒转染293细胞的病毒包装、出毒情况。再将二次感染获取的病毒上清13 第一部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制再感染293细胞中扩增，获得较高滴度的AdVTIPE2重组腺病毒于﹣80℃保存待用。Lipofectamine2000转染293细胞步骤按说明书进行：51.转染前1d，293细胞以细胞浓度1×10，2ml的量接种于6孔板；2.细胞生长汇片至70%时进行转染：同源重组腺病毒质粒pAd-TIPE2PacI线性化大片段用无血清培养基RPMI1640轻轻混匀，体系为250μl；8μl脂质体用无血清培养基RPMI1640轻轻混匀，体系也为250μl；3.将上述质粒与脂质体轻轻混匀，室温静置35min，使其形成DNA-脂质体复合物；4.用无血清培养基清洗293细胞后，加入DNA-脂质体复合物，并加入0.5ml无血清培养基混匀；5.培养6h后，补加1.5ml含20%FBS的RPMI1640完全培养基；6.转染24h后，用含10%FBS的RPMI1640完全培养基进行换液。1.3.2.4AdVTIPE2重组腺病毒的表达鉴定将获得的较高滴度的AdVTIPE2重组腺病毒和本室已保存的AdV对照空病毒分别感染293细胞48h后，1000rpm离心5min收集上述病毒感染细胞293/AdVTIPE2和293/AdV及未感染病毒的293细胞对照。PBS洗涤2次后，按MiniBEST总RNA抽提试剂盒和哺乳动物细胞总蛋白裂解试剂盒说明书分别提取各组293细胞总RNA和总蛋白，用人TIPE2特异性引物TIPE2-2F、TIPE2-2R进行RT-PCR和用抗人TIPE2特异性抗体进行Westernblot鉴定TIPE2基因的转录和蛋白表达，并用人β-actin特异性引物β-actin-F：5’-TGCGTGACATTAAGGAGAAG-3’和β-actin-R：5’-CTGCATCCTGTCGGCAATG-3’；人β-actin特异性抗体分别作为RT-PCR和Westernblot的内参照。2结果2.1TIPE2基因的克隆和鉴定以正常人外周血单个核细胞（PBMCs）总RNA逆转录的cDNA第一链为模板，TIPE2-1F、TIPE2-1R为特异性引物进行PCR扩增的产物经1.5%琼脂糖核酸电泳，出现一条约为700bp的特异性条带，同预计克隆的TIPE2目的基因片段理论值大小相一致（图4）。该PCR产物亚克隆于pMD19-T载体后，挑取白斑克隆抽提质粒并行PCR14 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第一部分鉴定（图5A）和HindIII、XbaI双酶切（图5B）鉴定。由图5可见，以白斑克隆来源的质粒为模板，TIPE2-1F、TIPE2-1R为引物PCR能扩增出约700bp条带；白斑克隆来源的质粒双酶切同样能释放出该条带。结果表明，RT-PCR产物已亚克隆至pMD19-T载体中。RV-M、M13-47通用引物测序（图6）和blast数据库比对（图7）进一步证明RT-PCR所克隆的基因确为人TIPE2基因，且与GenBank（NM_024575.4）报道的序列完全一致。图4RT-PCR法克隆人TIPE2基因PBMCs：PBMCs总RNA的人TIPE2特异性RT-PCR产物；Marker：DL2000DNAMarker图5pMD19-T-TIPE2重组克隆载体的鉴定A，pMD19-T-TIPE2质粒PCR鉴定，pMD19-T-TIPE2：白斑克隆质粒为模板的PCR产物；Marker：DL2000DNAMarkerB，pMD19-T-TIPE2质粒双酶切鉴定，pMD19-T-TIPE2：白斑克隆质粒HindIII、15 第一部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制XbaI双酶切；Marker：DL2000DNAMarker图6ApMD19-T-TIPE2重组克隆载体RV-M引物测序结果16 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第一部分图6BpMD19-T-TIPE2重组克隆载体M13-47引物测序结果17 第一部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制图7ApMD19-T-TIPE2重组克隆载体RV-M引物测序结果blast比对图7BpMD19-T-TIPE2重组克隆载体M13-47引物测序结果blast比对18 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第一部分2.2AdVTIPE2重组腺病毒载体的构建和鉴定2.2.1pAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒的构建和鉴定以pMD19T-TIPE2质粒为模板，TIPE2-2F和TIPE2-2R为引物PCR能扩增出TIPE2CDS目的基因片段，其大小与预期扩增的TIPE2CDS理论值大小（555bp）相一致（图8A）。重组质粒pAdTrack-CMV-TIPE2经PCR能扩增出约555bp大小的条带（图8B）；经SalI、XhoI双酶切同样能释放出相同大小的片段（图8C），均表明TIPE2CDS目的基因片段已成功亚克隆于pAdTrack-CMV转移质粒中。DNA序列测定（图9）和blast比对（图10）进一步证实成功构建了pAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒。图8pAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒的构建和鉴定A，TIPE2CDSPCR扩增，1：pMD19-T-TIPE2质粒为模板的TIPE2CDSPCR产物；Marker：DL2000DNAMarkerB，pAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒PCR鉴定，1：pAdTrack-CMV-TIPE2质粒为模板的TIPE2CDSPCR产物；Marker：DL2000DNAMarkerC，pAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒双酶切鉴定，1：pAdTrack-CMV-TIPE2质粒SalI、XhoI双酶切；2：pAdTrack-CMV-TIPE2质粒未酶切；Marker：DL2000DNAMarker19 第一部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制图9ApAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒TIPE2-2F引物正向测序结果20 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第一部分图9BpAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒TIPE2-2R引物反向测序结果21 第一部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制图10ApAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒TIPE2-2F引物正向测序结果blast比对图10BpAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒TIPE2-2R引物反向测序结果blast比对22 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第一部分2.2.2pAd-TIPE2同源重组腺病毒质粒的构建和鉴定将PmeI线性化的pAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒分别与RGD修饰的腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌中同源重组后，Kana筛选挑克隆提取质粒，根据核酸琼脂糖电泳分子量大小初步筛选pAd-TIPE2同源重组阳性克隆。由图11A可见，pAdTrack-CMV-TIPE2与pAdEasy-1共转化BJ5183后，所挑的6个Kana抗性克隆均为同源重组阳性克隆。选择图11A初步确定的同源重组阳性克隆3#进一步转化Top10后再抽提质粒进行PCR鉴定（图11B）可见预期大小的TIPE2CDSPCR产物和PacI酶切鉴定（图11C）可获得30kb大小的腺病毒基因组片段和独特的4.5kb大小的ori及Kana卡那霉素抗性编码基因片段。结果表明，成功获得了pAd-TIPE2同源重组腺病毒质粒。图11pAd-TIPE2同源重组腺病毒质粒的构建和鉴定A，pAd-TIPE2同源重组克隆，pAdTrack-CMV-TIPE2：pAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒对照；pAdEasy-1：pAdEasy-1腺病毒骨架质粒对照；1-6#：BJ5183来源的pAd-TIPE2同源重组克隆，均为同源重组腺病毒阳性克隆B，pAd-TIPE2同源重组腺病毒质粒PCR鉴定，1：Top10来源的pAd-TIPE2质粒为模板的TIPE2CDSPCR产物；Marker：DL2000DNAMarkerC，pAd-TIPE2同源重组腺病毒质粒PacI酶切鉴定，1：pAd-TIPE2质粒PacI酶切；Marker：LambdaDNA/HindIIIMarker23 第一部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制2.2.3AdVTIPE2重组腺病毒的包装和鉴定将PacI酶切的pAd-TIPE2同源重组腺病毒质粒大片段经Lipofectamine2000脂质体转染293细胞后，倒置荧光显微镜下可见GFP的表达。转染10d后，收集第一代AdVTIPE2重组腺病毒粗提液。二次感染293细胞4d后，在荧光显微镜下可明显观察到GFP荧光和细胞病变效应（CPE）（图12）。结果表明，pAd-TIPE2同源重组腺病毒质粒转染293细胞后，AdVTIPE2重组腺病毒包装成功。二次感染4-6d后，收集细胞，用PBS悬浮，反复冻融离心获得AdVTIPE2第二代重组腺病毒粗提液。将AdVTIPE2第二代重组腺病毒粗提液再感染293细胞，经扩增获得较高滴度的AdVTIPE2第三代重组腺病毒粗提液于-80℃保存，并且RT-PCR和Westernblot检测腺病毒介导的TIPE2基因在293细胞中的表达。由图13可见，正常人胚肾细胞293本身表达一定量的内源性TIPE2（21kD）。与293未感染病毒对照组和AdV空病毒感染对照组比较，AdVTIPE2感染组TIPE2mRNA转录和蛋白表达水平均显著升高。进一步提示成功构建了AdVTIPE2重组腺病毒，能够介导外源性TIPE2基因在哺乳动物细胞中有效表达。图12AdVTIPE2重组腺病毒二次感染293细胞4d后DIC和GFP照片24 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第一部分图13AdVTIPE2重组腺病毒介导的TIPE2基因在293细胞中的表达鉴定A，RT-PCR检测腺病毒介导的TIPE2基因转录表达B，Westernblot检测腺病毒介导的TIPE2基因蛋白表达3讨论TIPE2是新近发现的免疫调控负性分子和肿瘤抑制因子。表达谱分析发现，TIPE2选择性表达于淋巴样（T细胞、B细胞）和髓样（单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞）8,9的造血细胞。有趣的是，小鼠B细胞不表达TIPE2，而人B细胞表达TIPE2。另外，8小鼠TIPE2在极小部分非淋巴组织（内分泌组织）的细胞如生殖细胞也表达；人TIPE29却在大多数非淋巴组织的细胞也表达，包括肝、脑、食管、胃、结肠等。因而，本9研究以取材方便、表达TIPE2的人外周血单个核细胞（PBMCs）来源的总RNA为模板，通过常规的RT-PCR分子生物学技术特异性克隆了人TIPE2基因，并且DNA序列验证与GenBank（NM_024575.4）报道的序列完全相符。腺病毒载体是一种较好的研究基因功能的过表达载体，在基因治疗中也具有广阔的应用前景。腺病毒载体与其他载体相比具有如下优点：1.宿主范围广，对人致病性低；2.具有感染效率高，对分裂和非分裂细胞都能感染；3.能携带很长的治疗基因和同时表达多个基因；4.不整合到染色体中，无插入致突变性，安全性好；5.能有效进行增殖，滴度高，易加工制备等。pAdEasy-1腺病毒骨架质粒和pAdTrack-CMV7转移质粒组合的复制缺陷型腺病毒载体系统是目前常用的腺病毒表达系统：1.采用的方法是腺病毒骨架质粒（pAdEasy-1，Ad5E1/E3缺陷）与转移质粒（pAdTrack-CMV）在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，容易获得同源重组腺病毒质粒，从根本上克服细胞内同源重组效率低的缺陷；转移质粒pAdTrack-CMV可插入11kb的基因片段或同时插入多个基因片段，装载容量高；转移质粒含有GFP报告基因，便于监测病毒包装成功与否、检测病毒活性滴度及靶细胞感染效率等。因此，本研究在RT-PCR克25 第一部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制7隆人TIPE2基因的基础上，按照经典的腺病毒构建流程，构建pAdTrack-CMV-TIPE2重组转移质粒，并与整合素结合基序Arg-Gly-Asp（RGD）修饰的pAdEasy-1腺病毒10骨架质粒（增强腺病毒对靶细胞、尤其感染不敏感细胞的感染效率）在BJ5183细菌中同源重组，然后转染293细胞中进行包装出毒。我们将pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-TIPE2（pAd-TIPE2）腺病毒同源重组质粒经PacI线性化后，转染293细胞包装后获取的上清二次感染293细胞可明显观察到GFP荧光和细胞病变效应（CPE），表明AdVTIPE2腺病毒包装成功。AdVTIPE2腺病毒介导的人TIPE2基因在293细胞中的表达鉴定结果显示，正常人胚肾细胞293组成性表达一定8量的内源性TIPE2，与文献报道相一致；而AdVTIPE2感染组与293未感染病毒对照组和AdV空病毒感染对照组比较，TIPE2mRNA转录和蛋白表达水平均显著升高。提示成功构建了AdVTIPE2重组腺病毒，能够介导外源性TIPE2基因在哺乳动物细胞中有效表达。综上所述，本研究通过常规的分子生物学和腺病毒重组表达技术，成功克隆了人TIPE2基因和构建了AdVTIPE2重组腺病毒。该研究为进一步探讨新型免疫负性分子和肿瘤抑制因子TIPE2的生物学功能及其在肿瘤发生、发展中的作用奠定了良好的基础。参考文献[1]SunH,GongS,CarmodyRJ,HilliardA,LiL,SunJetal.TIPE2,anegativeregulatorofinnateandadaptiveimmunitythatmaintainsimmunehomeostasis.Cell2008;133(3):415-426.[2]LiD,SongL,FanY,LiX,LiY,ChenJetal.Down-regulationofTIPE2mRNAexpressioninperipheralbloodmononuclearcellsfrompatientswithsystemiclupuserythematosus.ClinImmunol2009;133(3):422-427.[3]XiW,HuY,LiuY,ZhangJ,WangL,LouYetal.RolesofTIPE2inhepatitisBvirus-inducedhepaticinflammationinhumansandmice.MolImmunol2011;48(9-10):1203-1208.[4]MaY,LiuX,WeiZ,WangX,WangZ,ZhongWetal.TheexpressionandsignificanceofTIPE2inperipheralbloodmononuclearcellsfromasthmaticchildren.26 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第一部分ScandJImmunol2013;78(6):523-528.[5]Gus-BrautbarY,JohnsonD,ZhangL,SunH,WangP,ZhangSetal.Theanti-inflammatoryTIPE2isaninhibitoroftheoncogenicRas.MolCell2012;45(5):610-618.[6]CaoX,ZhangL,ShiY,SunY,DaiS,GuoCetal.Humantumornecrosisfactor(TNF)-alpha-inducedprotein8-like2suppresseshepatocellularcarcinomametastasisthroughinhibitingRac1.MolCancer2013;12(1):149.[7]HeTC,ZhouS,daCostaLT,YuJ,KinzlerKW,VogelsteinB.Asimplifiedsystemforgeneratingrecombinantadenoviruses.ProcNatlAcadSciUSA1998;95(5):2509-2514.[8]ZhangG,HaoC,LouY,XiW,WangX,WangYetal.Tissue-specificexpressionofTIPE2providesinsightsintoitsfunction.MolImmunol2010;47(15):2435-2442.[9]ZhangL,ShiY,WangY,ZhuF,WangQ,MaCetal.TheuniqueexpressionprofileofhumanTIPE2suggestsnewfunctionsbeyonditsroleinimmuneregulation.MolImmunol2011;48(9-10):1209-1215.[10]LiuY,YeT,SunD,MaynardJ,DeisserothA.Conditionallyreplication-competentadenoviralvectorswithenhancedinfectivityforuseingenetherapyofmelanoma.HumGeneTher2004;15(7):637-647.27 第二部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第二部分腺病毒介导的TIPE2表达对胃癌细胞的体外研究Chen课题组最早于2012年发现，TIPE2是原癌基因Ras的抑制剂，可通过结合Ras下游效应分子鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）RalGDS家族蛋白（RGL）的Ras相互作用结构域（RID）阻滞Ras/RGL形成活性复合体，抑制RGL活性及1RGL-PDK1-AKT和RGL-RaLGTP酶途径进而抑制细胞的存活和运动。TIPE2过表1,2达能够明显诱导肿瘤细胞死亡及抑制Ras原癌基因诱导的肿瘤发生。提示TIPE2是一种新型的潜在抑癌基因，与肿瘤发生、发展可能密切相关。然而，国内外有关TIPE2在肿瘤中的研究报道甚少，与胃癌发生、发展的相关性更是未见报道。因而，本部分在TIPE2重组腺病毒（AdVTIPE2）构建（第一部分）的基础上，通过腺病毒介导TIPE2在TIPE2丢失的胃癌细胞中过表达，利用MTT、AnnexinV-PE/7-AAD双染、划痕、Transwell和Westernblot等方法，进一步研究TIPE2对胃癌细胞生长、凋亡、移动、侵袭的作用及其相关的分子机制。1材料和方法1.1材料MiniBEST总RNA抽提试剂盒、dNTPmix、TaqDNA聚合酶、DL2000DNAMarker均购自TaKaRa公司；Oligod（T）18、RibonucleaseInhibitor、MMLV逆转录酶均购自Thermo公司；培养基（RPMI1640、DMEM）、谷氨酰胺和胎牛血清（FBS）均购自LifeTechnology公司；氯化铯（CsCl）、MTT和哺乳动物细胞总蛋白裂解试剂盒均购自Sigma公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Beyotime公司；硝酸纤维素膜（NC膜）、Westernblot化学发光试剂盒均购自上海普利莱基因技术有限公司；AnnexinV-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒和基质胶（Matrigel）均购自BD公司；抗人TIPE2抗体购自ImmunoWay公司；抗人Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Bak、β-actin抗体均购自SantaCruz公司；抗人Caspase-9、Caspase-3、PARP、p-ERK1/2、ERK1/2、p-AKT、AKT、p-GSK3β、GSK3β抗体均购自CellSignaling公司；抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail1、Snail2/Slug、Twist、Zeb1抗体均购自Abcam公司；腺病毒包装/28 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第二部分扩增细胞293由复旦大学生命科学学院微生物学教研室钟江教授惠赠；AGS、HGC-27人胃癌细胞和GES-1人胃粘膜正常上皮细胞均购自上海中科院细胞库；SGC-7901人胃癌细胞由苏州大学基础医学和生物科学技术学院细胞生物学教研室杨吉成教授惠赠；引物购自上海生工生物技术有限公司；细胞培养板、培养瓶、离心管、Transwell侵袭小室均购自CORNING公司；BKM0-50、SW41离心管均购自Beckman公司；Slide-A-Lyzer透析卡购自Cole-Parmer公司；TIPE2重组腺病毒（AdVTIPE2）由本研究第一部分构建；对照空病毒AdV由本室保存。1.2仪器立式压力蒸汽灭菌器上海华线医用核子仪器有限公司LD4-2低速离心机THERMOELECTRONCORPORATIONTGL-16G高速离心机THERMOELECTRONCORPORATION超高速离心机美国Beckman公司二氧化碳培养箱德国贺利氏公司隔水式恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司恒温震荡器太仓市科教器材厂医用净化工作台吴江市金利达空调净化设备有限公司4℃和-20℃冰箱青岛海尔电冰箱股份有限公司-80℃超低温冰箱THERMOELECTRONCORPORATION电子天平上海精密仪器仪表有限公司倒置普通显微镜日本OLYMPUS公司倒置荧光显微镜日本NIKON公司电热恒温水浴箱北京市长风仪器仪表公司电热恒温水浴锅上海医疗器械五厂紫外可见分光光度计上海天普分析仪器有限公司PTC-100PCR仪美国MJ公司核酸电泳装置北京六一仪器厂蛋白电泳装置美国BIO-RAD公司凝胶、ECL发光成像分析仪上海培清科技有限公司29 第二部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制1.3方法1.3.1高滴度TIPE2重组腺病毒（AdVTIPE2）的制备1.3.1.1AdVTIPE2的大量扩增和纯化将第一部分构建获得的AdVTIPE2重组腺病毒和本室已保存的AdV对照空病毒2分别多轮感染293细胞扩增一定数量后，再感染长满175cm细胞培养瓶规格的293细胞（30瓶）进行大量繁殖。根据293细胞CPE情况，通常感染扩增48h左右，收获细胞用10-15ml无血清培养基悬浮，﹣80℃和37℃间反复冻融6次后进行氯化铯（CsCl）密度梯度离心纯化，以制备高纯度和高滴度的AdVTIPE2重组腺病毒用于生物学功能实验。CsCl密度梯度离心纯化腺病毒步骤：21.各30瓶175cm细胞培养瓶规格的293细胞扩增来源的腺病毒粗提液AdVTIPE2重组腺病毒和AdV对照空病毒4℃，2000rpm离心10min；2.将病毒上清移入BeckmanBKM0-50离心管4℃，10000rpm离心30min；3.将病毒上清移入15ml离心管放置冰上；4.将2.5ml密度为1.25、1.40的CsCl逐步移入BeckmanSW41离心管；5.将第3步冰上放置的病毒上清（约7ml）轻轻移入至CsCl上层，并用1XTD缓冲液平衡后封口；6.将样品至80Ti转子20℃，50000rpm离心2h；7.用装有23#针头的5ml注射器轻轻插入至乳白色病毒离心带下缘；8.吸取病毒离心带至2ml冻存管中，用0.5ml1XTD缓冲液混匀，并加入BSA至终浓度为1%，置冰上；9.将Slide-A-Lyzer透析卡至500ml透析液中平衡；10.将第8步冰上放置的含1%BSA的病毒上清用18#针头的5ml注射器移入Slide-A-Lyzer透析卡（标记好加样口）；11.置500ml透析液4℃透析30min；12.置1000ml透析液4℃透析1h，重复3次；13.透析完毕后，用18#针头的5ml注射器从原先加样口吸取病毒；14.病毒分装于﹣80℃保存。30 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第二部分1.3.1.2AdVTIPE2的滴度测定5将对数生长期的293细胞胰酶消化后，调整细胞浓度为1×10/ml，以每孔100μl接种于96孔板。培养24h后，将上述CsCl密度梯度离心纯化获得的AdVTIPE2重组-4-5-6-7腺病毒和AdV对照空病毒作10、10、10、10有限稀释后，每个稀释度按每孔100μl接种3孔。37℃，5%CO2细胞培养箱中培养18h后，荧光显微镜下，进行荧光计数，并按病毒滴度（Tu/ml）=（每孔荧光平均数×10）/稀释度计算腺病毒滴度。1.3.2胃癌细胞TIPE2的表达分析收集对数生长期的AGS、HGC-27、SGC-7901人胃癌细胞和GES-1人胃粘膜正6常上皮细胞（细胞数为2×10），MiniBEST总RNA抽提试剂盒提取总RNA和MMLV逆转录酶进行RT；分别以AGS、HGC-27、SGC-7901胃癌细胞和GES-1胃粘膜正常上皮细胞来源的cDNA第一链为模板，TIPE2-3F（5’-GACTGACCACATACCCCACTC-3’）、TIPE2-3R（5’-TCACCAAAGCTAAGTGCCGT-3’）为特异性引物PCR检测和对比分析胃癌细胞和胃粘膜正常上皮细胞中TIPE2的转录表达（预计产物大小384bp），并设β-actin作为内参照。1.3.3AdVTIPE2感染胃癌细胞将处于对数生长期的AGS胃癌细胞，经0.25%胰酶消化后，用10%FBS5RPMI1640完全培养基悬浮，计数后调整细胞浓度为1×10/ml，每孔100μl接种于96孔培养板，37℃，5%CO2培养过夜。次日AdVTIPE2和AdV对照空病毒分别以1、10、25、50、100、200MOI不同剂量感染AGS胃癌细胞，并设未感染腺病毒作为细胞对照组（PBS组）。感染48h后，分别在普通光镜视野下观察AGS胃癌细胞生长形态和荧光视野下观察GFP绿色荧光表达情况，并FCM进一步检测腺病毒感染后AGS胃癌细胞GFP的表达和定量分析感染效率，以判断腺病毒不同感染剂量对AGS细胞生长的影响及其感染效率，旨在筛选最佳腺病毒感染剂量用于AGS胃癌细胞感染和生物学功能研究。1.3.4腺病毒介导的TIPE2转基因表达检测1.3.4.1RT-PCR检测TIPE2的转录表达按1.3.3筛选的腺病毒最佳感染剂量（10MOI）感染AGS胃癌细胞（细胞数为31 第二部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制62×10），分为3组：细胞对照组（PBS组）、AdV对照空病毒组和AdVTIPE2重组腺病毒组。感染48h后，MiniBEST总RNA抽提试剂盒提取总RNA和MMLV逆转录酶进行RT；分别以细胞对照组（PBS组）、AdV对照空病毒组和AdVTIPE2重组腺病毒组来源的cDNA第一链为模板，TIPE2-2F和TIPE2-2R特异性引物PCR检测TIPE2转基因的转录表达（预计产物大小约555bp），并设β-actin作为内参照。1.3.4.2Westernblot检测TIPE2的蛋白表达按1.3.3筛选的腺病毒最佳感染剂量10MOI感染AGS胃癌细胞（细胞数为610×10），分为3组：细胞对照组（PBS组）、AdV对照空病毒组和AdVTIPE2重组腺病毒组。感染48h后，分别收集细胞用哺乳动物细胞总蛋白裂解试剂盒裂解，按710细胞/1ml裂解液的比例加细胞裂解液（含终浓度为1mMPMSF蛋白酶抑制剂）进行裂解，充分裂解后12000rpm离心5min获取总蛋白上清，并用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行定量。总蛋白上清与5×SDS蛋白上样缓冲液混匀，100℃煮沸5min，12000rpm离心5min，再用分离胶为12％的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳（100V，2h）（50μg/lane），并300mA，转膜2h将蛋白转移至硝酸纤维素（NC）膜上，NC膜用5％脱脂奶粉37℃封闭1h；分别用兔抗人TIPE2和小鼠抗人β-actin（内参照）抗体37℃作用1h，TBST洗涤3次，每次5min；再分别加相应HRP标记的二抗37℃作用1h，TBST洗涤3次，每次5min；最后将NC膜与发光工作液（等体积A和B溶液混合）充分接触，室温孵育3min，暗室进行压片曝光、显影和定影。BCA蛋白浓度测定试剂盒总蛋白定量方法：1.50体积BCA试剂A与1体积BCA试剂B混匀配置BCA工作液；2.取10μl蛋白标准品（5mg/mlBSA）至90μl细胞裂解液，使终浓度为0.5mg/ml；3.将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准孔中，不足20μl的标准孔用细胞裂解液补足到20μl；4.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，不足20μl的样品孔用细胞裂解液补足到20μl；5.各孔加入200μlBCA工作液，37℃作用30min；6.测定A562（A540-A595），根据标准曲线计算样品蛋白浓度。1.3.5MTT法检测AdVTIPE2对胃癌细胞生长的影响将处于对数生长期的AGS胃癌细胞，胰酶消化后，用完全培养基悬浮制成单细32 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第二部分4胞悬液，计数后调整细胞浓度按每孔1×10个/100μl接种于96孔板。待细胞贴壁后，按1.3.3筛选的腺病毒最佳感染剂量10MOI感染AGS胃癌细胞，实验分为3组：细胞对照组（PBS组）、AdV空病毒对照组、AdVTIPE2重组腺病毒组，每组均设4个复孔。以此为0时相，37℃，5%CO2培养箱中培养72h。在腺病毒感染不同时间段（24h、48h、72h），观察细胞形态变化和生长繁殖状况，并每孔加入10μlMTT(5mg/ml)，37℃下继续培养6h后再加入10%SDS-HCl终止液100μl/孔，于37℃充分溶解后，在酶标仪570nm下测定吸光度值（OD值）。根据细胞相对生长活力（%）＝（实验组OD值/PBS阴性对照OD值）×100%计算细胞相对生长活力，分析AdVTIPE2重组腺病毒对AGS胃癌细胞生长的抑制作用。1.3.6AnnexinV-PE和7-AAD双染法检测AdVTIPE2对胃癌细胞凋亡的影响将处于对数生长期的AGS胃癌细胞，胰酶消化后，用完全培养基悬浮制成单细52胞悬液，计数后调整细胞浓度按每瓶5×10个/5ml接种于25cm细胞培养瓶。待细胞贴壁后，按1.3.3筛选的腺病毒最佳感染剂量10MOI感染AGS胃癌细胞，实验分为3组：细胞对照组（PBS组）、AdV空病毒对照组、AdVTIPE2重组腺病毒组，每组均设3个复份。感染48h后，收集细胞用AnnexinV-PE/7AAD双染法流式细胞仪检测细胞凋亡，分析AdVTIPE2重组腺病毒诱导AGS胃癌细胞凋亡的作用。AnnexinV-PE/7AAD双染法检测细胞凋亡步骤：1.收集细胞并用冰PBS清洗2遍；2.10XAnnexinVBindingBuffer用ddH2O稀释至1XAnnexinVBindingBuffer；63.细胞用1XAnnexinVBindingBuffer悬浮后调整细胞浓度至1X10/ml；4.取100μl细胞悬液加入5μlAnnexinV-PE和5μl7-AAD，并设未染、单染作为流式时荧光补偿用；5.轻轻混匀后，25℃室温作用15min；6.加入400μl1XAnnexinVBindingBuffer，1h内上流式细胞仪检测。1.3.7划痕实验检测AdVTIPE2对胃癌细胞移动的影响细胞接种前，首先用记号笔在6孔板背后标记。然后将处于对数生长期的AGS5胃癌细胞，胰酶消化后，用完全培养基悬浮，计数后调整细胞浓度为2×10/ml，每孔3ml接种于6孔培养板，37℃，5%CO2培养过夜使其铺满。次日用枪头在标记处划痕，并用PBS清洗2次去除刮下的细胞。按1.3.3筛选的腺病毒最佳感染剂量10MOI33 第二部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制感染AGS胃癌细胞，实验分为3组：细胞对照组（PBS组）、AdV空病毒对照组、AdVTIPE2重组腺病毒组，每组均设3个复孔。感染0、12、24h不同时间段普通倒置显微镜拍照，用ImageJ软件分析细胞移动面积，并计算细胞相对移动能力。1.3.8Transwell实验检测AdVTIPE2对胃癌细胞侵袭的影响将50µl基质胶（Matrigel）和无血清培养基的混合液（50mg/l基质胶和RPMI1640无血清培养基比1:7，基质胶1:8稀释）均匀地铺在侵袭小室（TranswellChamber）（孔径8um）的膜上，37℃成胶。将处于对数生长期的AGS胃癌细胞用RPMI1640无血5清培养基悬浮，细胞计数后调整细胞浓度，分别以2×10/10MOIAdVTIPE2/100µl无5血清培养基（AdVTIPE2重组腺病毒组）、2×10/10MOIAdV/100µl无血清培养基（AdV5空病毒对照组）、2×10/PBS/100µl无血清培养基（细胞对照组）（PBS组）的量接种到侵袭小室上层（基质胶上面），侵袭小室下层用600µl10%FBS的RPMI1640完全培养基覆盖。实验分别设3个复孔。37℃培养24h后取出侵袭小室，用棉签头擦掉侵袭小室上层细胞，4%多聚甲醛固定20min后0.1%结晶紫染色20min，X200光镜下随机计数10个视野的侵袭细胞数取其平均值，并计算细胞相对侵袭能力。1.3.9Westernblot检测AdVTIPE2对胃癌细胞的作用机制1.3.4.2提取的细胞对照组（PBS组）、AdV对照空病毒组和AdVTIPE2重组腺病毒组来源总蛋白分别50μg/lane进行SDS-PAGE电泳和Westernblot，所用一抗为Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Bak、Caspase-9、Caspase-3、PARP、p-ERK1/2、ERK1/2、p-AKT、AKT、p-GSK3β、GSK3β、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail1、Snail2/Slug、Twist、Zeb1、β-actin（内参照）及相应HRP标记的二抗，检测AdVTIPE2重组腺病毒对AGS胃癌细胞凋亡相关蛋白和上皮间充质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）相关蛋白的影响。1.3.10统计学检验所有数据用±s表示，用SPSS13.0统计软件包进行单因素方差分析，P＜0.05视为统计学有差异，P＜0.01视为统计学有显著性差异。2结果2.1高纯度、高滴度AdVTIPE2重组腺病毒的获得AdVTIPE2第三代腺病毒粗提液和本室保存的AdV对照空病毒经多轮感染29334 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第二部分细胞进行大量扩增。腺病毒感染293细胞DIC（CPE）和GFP照片如图1所示，表明AdVTIPE2、AdV能够在293细胞中有效扩增。扩增一定数量后，将病毒粗提液用CsCl密度梯度离心纯化，获得了高纯度、高滴度的AdVTIPE2重组腺病毒和AdV对1010照空病毒，其效价分别可达4.5×10（AdVTIPE2）和7×10（AdV）（pfu/ml）。图1腺病毒感染293细胞DIC和GFP照片2.2TIPE2基因在胃癌细胞中的表达为研究TIPE2基因在胃癌细胞中的表达情况，利用RT-PCR检测AGS、HGC-27、SGC-7901胃癌细胞和GES-1胃粘膜正常上皮细胞TIPE2基因的表达。由图2可见，GES-1胃粘膜正常上皮细胞表达一定量的TIPE2，而本研究选择的AGS、HGC-27、SGC-79013种胃癌细胞均不表达TIPE2基因。图2TIPE2基因在胃癌细胞中的表达GES-1、AGS、HGC-27、SGC-7901：胃粘膜正常上皮细胞和胃癌细胞来源的总RNA的人TIPE2和内参照β-actin特异性RT-PCR产物；Marker：DL2000DNAMarker35 第二部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制2.3AdVTIPE2重组腺病毒感染胃癌细胞形态学和GFP表达观察将AdVTIPE2重组腺病毒和AdV对照空病毒以1、10、25、50、100、200MOI不同剂量分别感染AGS胃癌细胞。感染48h后，在荧光显微镜普通光镜视野下观察1、10（图3）、25MOI不同剂量AdV对照空病毒感染AGS组，细胞均形态正常，生长良好，与未感染腺病毒AGS细胞对照组几乎无差别，而50、100、200MOI剂量感染AGS组细胞圆缩、脱落，呈现剂量依赖的腺病毒本身引起的细胞毒性；在荧光视野下，10（图3）、25、50、100、200MOI不同剂量AdV对照空病毒感染AGS组细胞几乎所有细胞可观察到GFP绿色荧光。结果表明，10、25MOI剂量AdV对照空病毒感染AGS细胞对细胞几乎无毒性，而且呈很高的感染效率。FCM进一步检测10MOI剂量腺病毒感染AGS细胞48h后的GFP阳性率，其可达90%以上（图4）。根据细胞感染效率最高、毒性最低的腺病毒感染剂量为原则，选择10MOI作为腺病毒感染AGS细胞的最佳感染剂量。AdVTIPE2重组腺病毒10MOI感染AGS细胞48h后，荧光显微镜荧光视野下（图3）观察和FCM（图4）检测几乎所有细胞都表达GFP绿色荧光，感染效率同样可达90%以上。有趣的是，AdVTIPE2重组腺病毒10MOI感染AGS细胞48h后，荧光显微镜普通光镜视野下观察，可见明显的由腺病毒介导的TIPE2基因表达产物所引起的细胞毒性；AdV对照空病毒10MOI剂量相同条件下感染AGS细胞生长良好，与未感染AGS细胞对照组相当（图3）。结果初步提示，腺病毒介导的TIPE2基因表达体外具有明显的抑制AGS胃癌细胞生长的效应。图3腺病毒（10MOI）感染AGS胃癌细胞DIC和GFP照片36 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第二部分图4FCM检测腺病毒（10MOI）对AGS胃癌细胞的感染效率2.4腺病毒介导的TIPE2转基因在胃癌细胞中的表达鉴定分别收集AdVTIPE2重组腺病毒、AdV对照空病毒感染48h的AGS胃癌细胞和未感染病毒的对照细胞，用MiniBEST总RNA抽提试剂盒提取其总RNA进行RT，并以制备的3组cDNA为模板，TIPE2-2F、TIPE2-2R为特异性引物鉴定TIPE2转基因和β-actin-F、β-actin-R为引物检测内参照β-actin基因在AGS胃癌细胞中的转录表达。由图5A可见，AdVTIPE2重组腺病毒感染AGS组可产生预期大小的特异性TIPE2RT-PCR产物，而AdV对照空病毒感染组和未感染病毒对照组（PBS组）相应位置均未产生TIPE2RT-PCR产物。RT-PCR鉴定结果表明重组腺病毒能成功介导外源性TIPE2转基因在AGS胃癌细胞中转录表达。分别收集AdVTIPE2重组腺病毒、AdV对照空病毒感染48h的AGS胃癌细胞和未感染病毒的对照细胞，用哺乳动物细胞总蛋白裂解试剂盒提取总蛋白进行SDS-PAGE电泳和Westernblot，检测TIPE2转基因和内参照β-actin基因在胃癌细胞中的蛋白表达。由图5B可见，AdVTIPE2重组腺病毒感染AGS组可出现21kD的与抗人TIPE2抗体特异性结合的条带，而AdV对照空病毒感染组和未感染病毒对照组（PBS组）相应位置均未出现该条带。Westernblot鉴定结果进一步表明重组腺病毒能成功介导外源性TIPE2转基因在AGS胃癌细胞中蛋白表达。图5腺病毒介导的TIPE2转基因在胃癌细胞中的表达鉴定A，RT-PCR检测腺病毒介导的TIPE2转基因转录表达B，Westernblot检测腺病毒介导的TIPE2转基因蛋白表达37 第二部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制2.5TIPE2重组腺病毒体外对胃癌细胞的生长抑制效应为研究AdVTIPE2重组腺病毒体外对胃癌细胞生长的影响，用10MOI最佳腺病毒感染剂量AdVTIPE2重组腺病毒和AdV对照空病毒分别感染AGS胃癌细胞，并设未感染病毒对照组（PBS组）。感染不同时间段（24h、48h、72h），MTT法检测细胞生长活力，并根据MTT测量的OD570nm计算相对生长活力（%PBS），分析TIPE2重组腺病毒对AGS胃癌细胞的生长抑制作用。由图6可见，与PBS细胞对照组和AdV空病毒对照组比较，AdVTIPE2重组腺病毒对AGS胃癌细胞具有明显的生长抑制效应，并呈现时间依赖性。感染48h后，AdVTIPE2重组腺病毒组相对生长活力为74.5±5.5%，其生长抑制率可达25.5%（*，P＜0.01）；感染72h后，AdVTIPE2重组腺病毒组相对生长活力为42.7±4.5%，其生长抑制率可达57.3%（*，P＜0.01）。结果表明，腺病毒介导的TIPE2转基因表达具有显著抑制胃癌细胞生长的作用。图6AdVTIPE2重组腺病毒体外对胃癌细胞的生长抑制作用*，在相同时间段与PBS、AdV组比较，P＜0.012.6TIPE2重组腺病毒诱导胃癌细胞的凋亡的作用为研究AdVTIPE2重组腺病毒诱导胃癌细胞凋亡的效应，用10MOI最佳腺病毒感染剂量AdVTIPE2重组腺病毒和AdV对照空病毒分别感染AGS胃癌细胞，并设未感染病毒对照组（PBS组）。感染48h后，AnnexinV-PE和7-AAD双染法FCM检测TIPE2重组腺病毒对AGS胃癌细胞的凋亡的影响。由图7可见，与PBS细胞对照组（2.5±0.3%）和AdV空病毒对照组（4.6±0.5%）比较，AdVTIPE2重组腺病毒能显著38 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第二部分诱导AGS胃癌细胞凋亡，感染48h诱导早期凋亡和晚期凋亡的总凋亡率可达49.2±4.5%（*，P＜0.01）。结果表明，腺病毒介导的TIPE2转基因表达具有显著诱导胃癌细胞凋亡的作用。图7AdVTIPE2重组腺病毒诱导胃癌细胞凋亡A，AnnexinV-PE和7-AAD检测细胞凋亡代表性图B，早期凋亡和晚期凋亡总凋亡率柱形图，*，与PBS、AdV组比较，P＜0.012.7TIPE2重组腺病毒抑制胃癌细胞的移动为研究AdVTIPE2重组腺病毒对胃癌细胞移动能力的影响，用10MOI最佳腺病毒感染剂量AdVTIPE2重组腺病毒和AdV对照空病毒分别感染AGS胃癌细胞开展划痕实验，并设未感染病毒对照组（PBS组）。由图8可见，AdVTIPE2重组腺病毒感染AGS胃癌细胞后，AGS胃癌细胞体外移动能力明显下降，与AdV空病毒对照组和细胞对照组（PBS组）比较均呈显著性差异（P＜0.01），其相对于细胞对照组（PBS组）的移动能力仅为65.3±5.5%。结果表明，腺病毒介导的TIPE2转基因表达具有显著抑制胃癌细胞移动的效应。图8AdVTIPE2重组腺病毒抑制胃癌细胞的移动A，划痕实验代表性图B，相对移动能力柱形图，*，与PBS、AdV组比较，P＜0.0139 第二部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制2.8TIPE2重组腺病毒抑制胃癌细胞的侵袭为研究AdVTIPE2重组腺病毒对胃癌细胞侵袭能力的影响，用10MOI最佳腺病毒感染剂量AdVTIPE2重组腺病毒和AdV对照空病毒分别感染AGS胃癌细胞开展Transwell侵袭实验，并设未感染病毒对照组（PBS组）。由图9可见，AdVTIPE2重组腺病毒感染AGS胃癌细胞后，AGS胃癌细胞体外侵袭能力明显下降，与AdV空病毒对照组和细胞对照组（PBS组）比较均呈显著性差异（P＜0.01），其相对于细胞对照组（PBS组）的侵袭能力仅为56.5±6.5%。结果表明，腺病毒介导的TIPE2转基因表达具有显著抑制胃癌细胞侵袭的效应。图9AdVTIPE2重组腺病毒抑制胃癌细胞的侵袭A，Transwell侵袭实验代表性图B，相对侵袭能力柱形图，*，与PBS、AdV组比较，P＜0.012.9TIPE2重组腺病毒对胃癌细胞凋亡相关蛋白的影响为研究TIPE2重组腺病毒抑制胃癌细胞生长和诱导胃癌细胞凋亡的分子机制，分别收集AdVTIPE2重组腺病毒、AdV对照空病毒感染的AGS胃癌细胞和未感染病毒的AGS对照细胞，用细胞裂解液裂解细胞提取其总蛋白进行SDS-PAGE电泳和Westernblot检测AGS胃癌细胞Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Bak、Caspase-9、Caspase-3、PARP、p-ERK1/2、ERK1/2、p-AKT、AKT、p-GSK3β、GSK3β凋亡相关蛋白的表达。由图10显示，AdVTIPE2重组腺病毒能明显上调AGS胃癌细胞Bax和下调Bcl-XL、p-ERK1/2、p-AKT、p-GSK3β的表达，诱导Caspase-9和Caspase-3的活化及PARP的切割，而对Bcl-2、Bak、ERK1/2、AKT、GSK3β表达几乎无影响。40 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第二部分图10AdVTIPE2重组腺病毒对胃癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响2.10TIPE2重组腺病毒对胃癌细胞EMT相关蛋白的影响为研究TIPE2重组腺病毒抑制胃癌细胞移动、侵袭、转移的分子机制，分别收集AdVTIPE2重组腺病毒、AdV对照空病毒感染的AGS胃癌细胞和未感染病毒的AGS对照细胞，用细胞裂解液裂解细胞提取其总蛋白进行SDS-PAGE电泳和Westernblot检测AGS胃癌细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail1、Snail2/Slug、Twist、Zeb1EMT相关蛋白的表达。由图11显示，AdVTIPE2重组腺病毒能明显上调AGS胃癌细胞E-cadherin和下调N-cadherin、Vimentin、Snail1、Snail2/Slug、Zeb1的表达，而对Twist表达几乎无影响。图11AdVTIPE2重组腺病毒对胃癌细胞EMT相关蛋白表达的影响41 第二部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制3讨论TIPE2可通过结合Ras下游效应分子RGL的RID结构域下调RGL活性抑制Ras原癌基因诱导的肿瘤发生；可通过抑制RGL活性抑制RGL-PDK1-AKT、RGL-RaL1GTP酶途径抑制肿瘤细胞的存活和运动；可通过直接抑制Rac1GTP酶活性抑制肿2瘤细胞的转移；可通过抑制caspase-8的活性抑制TLR4炎症信号所介导的肿瘤进展3。表明，TIPE2可通过多种机制在抑制肿瘤细胞本身和抑制肿瘤相关的炎症方面均发挥着关键的作用，是一种重要的抑癌因子，其功能异常可能参与了肿瘤发生、发展的多个环节。4TIPE2在多种肿瘤细胞中表达低下、丢失。临床样本分析，TIPE2在人肝癌组1,2织中表达下调，其与肝癌转移进展明显相关。而在肾细胞癌（RCC）组织中TIPE2的表达较正常对照组却明显升高，与I型IFN诱导基因MX1的表达呈负相关，而与5肿瘤TNM分期呈正相关。提示TIPE2在肿瘤发生、发展的促进或抑制作用可能与肿瘤类型等因素有关。本研究我们首次研究了TIPE2在AGS、HGC27、SGC-79013种人胃癌细胞中TIPE2的表达。发现在我们的实验条件下，3种胃癌细胞TIPE2表达均丢失，而正常人胃粘膜上皮细胞表达TIPE2。为进一步研究TIPE2对胃癌细胞的作用，AdVTIPE2重组腺病毒感染AGS胃癌细胞，MTT、AnnexinV-PE/7-AAD双染、划痕、Transwell法检测TIPE2对AGS胃癌细胞的生长、凋亡、移动、侵袭的影响。结果显示，AdVTIPE2腺病毒介导的TIPE2过表达能显著抑制胃癌细胞生长、诱导凋亡、下调肿瘤细胞移动和侵袭的能力。我们的研究结果与TIPE2在肝癌细胞中的作用1,2报道相一致。线粒体是细胞的生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，还是细胞凋亡的调控中心。线粒体细胞色素C释放在细胞凋亡过程中起重要作用。细胞应激反应或凋亡信号能引起线粒体细胞色素C释放到胞质，与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，形成多聚体，促使Caspase-9与其结合形成“凋亡酶体”，引发Caspase-36等活化级联反应，诱导细胞凋亡。Bcl-2家族分为两类，一类是抗凋亡的主要有Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1；一类是促进凋亡的主要包括Bax、Bak、Bad。Bcl-2家族的促凋亡蛋白（Bax、Bak）与抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-XL）的比例决定了细胞是否凋亡的阈值，通过形成同源或异源二聚体调控线粒体膜的穿透性，比例升高促进细胞色42 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第二部分7素C的释放和Caspase-9，3等的活化，诱导细胞线粒体凋亡（内源性凋亡）。Westernblot结果显示，AdVTIPE2重组腺病毒能明显上调AGS胃癌细胞Bax和下调Bcl-XL表达，诱导Caspase-9和Caspase-3的活化及PARP的切割，活化肿瘤细胞内源性凋亡途径。PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK1/2信号通路异常活化在肿瘤发生、发展中所起的重要作用（促生长、抗凋亡等）已被广泛认知。TIPE2能通过抑制免疫细胞1,8-10NF-κB、JNK、p38MAPK、PI3K/AKT等途径调控天然和获得性免疫。虽然TIPE2在免疫细胞中不能抑制ERK1/2信号，但却能抑制血管平滑肌细胞（VSMCs）的11ERK1/2信号。为研究TIPE2在肿瘤细胞中对PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK1/2信号的调控，我们用Westernblot检测了AdVTIPE2感染的AGS胃癌细胞中p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2的表达。发现AdVTIPE2重组腺病毒能明显抑制胃癌细胞p-AKT和p-ERK1/2的水平，下调胃癌细胞PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK1/2的活化。上述结果提示，AdVTIPE2可能通过Bax/Bcl-XL升高介导的内源性凋亡激活及对PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK1/2途径的削弱抑制胃癌细胞生长和诱导胃癌细胞凋亡。12,13肿瘤转移是癌细胞的基本特性，是癌症相关性死亡的首要因素。肿瘤转移是一个复杂的多步骤过程，主要包括肿瘤细胞的粘附，侵袭和迁移。然而，肿瘤转移的调控机制仍旧大大不清楚。研究肿瘤转移的机制来预防/治疗转移是当今肿瘤学的热点和有待解决的问题。以前报道TIPE2是Rac1GTP酶的内源性抑制剂，可通过靶向抑制Rac1GTP酶活性，减少F-actin聚合及基质金属蛋白酶9（MMP9）和尿激酶纤2维蛋白溶酶原激活剂（uPA）的表达抑制肝癌细胞的转移。我们通过划痕、Transwell实验也发现腺病毒介导的TIPE2表达能够显著抑制AGS胃癌细胞的移动和侵袭。上14皮间充质转化（EMT）目前认为是肿瘤转移的重要机制。因此，本研究通过Westernblot检测了腺病毒介导的TIPE2表达对AGS胃癌细胞EMT相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及EMT相关转录因子Snail1、Snail2/Slug、Twist、Zeb1）表达的影响。发现AdVTIPE2重组腺病毒能明显上调AGS胃癌细胞E-cadherin和下调N-cadherin、Vimentin、Snail1、Snail2/Slug、Zeb1的表达。该结果提示AdVTIPE2很有可能通过抑制EMT转录因子的表达和促进N-cadherin到E-cadherin的转换来抑制胃癌细胞的移动和侵袭。综上所述，本研究国内外首次初步探讨了AdVTIPE2重组腺病毒对胃癌细胞的作43 第二部分肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制用。腺病毒介导的TIPE2过表达能够显著抑制胃癌细胞生长、移动、侵袭和诱导凋亡。TIPE2诱导内源性凋亡途径活化及下调PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK1/2信号可能是TIPE2抑制胃癌细胞生长和诱导凋亡的重要机制；TIPE2下调EMT相关转录因子的表达和促进N-cadherin到E-cadherin的转换可能是TIPE2抑制胃癌细胞移动和侵袭（转移）的重要分子机制。TIPE2可能是胃癌的潜在治疗靶点。参考文献[1]Gus-BrautbarY,JohnsonD,ZhangL,SunH,WangP,ZhangSetal.Theanti-inflammatoryTIPE2isaninhibitoroftheoncogenicRas.MolCell2012;45(5):610-618.[2]CaoX,ZhangL,ShiY,SunY,DaiS,GuoCetal.Humantumornecrosisfactor(TNF)-alpha-inducedprotein8-like2suppresseshepatocellularcarcinomametastasisthroughinhibitingRac1.MolCancer2013;12(1):149.[3]LiXM,SuJR,YanSP,ChengZL,YangTT,ZhuQ.AnovelinflammatoryregulatorTIPE2inhibitsTLR4-mediateddevelopmentofcoloncancerviacaspase-8.CancerBiomark2014;14(4):233-240.[4]ZhangG,HaoC,LouY,XiW,WangX,WangYetal.Tissue-specificexpressionofTIPE2providesinsightsintoitsfunction.MolImmunol2010;47(15):2435-2442.[5]ZhangZ,QiH,HouS,JinX.TIPE2mRNAoverexpressioncorrelateswithTNMstaginginrenalcellcarcinomatissues.OncolLett2013;6(2):571-575.[6]LiuX,KimCN,YangJ,JemmersonR,WangX.Inductionofapoptoticprogramincell-freeextracts:requirementfordATPandcytochromec.Cell1996;86(1):147-157.[7]DanialNN,KorsmeyerSJ.Celldeath:criticalcontrolpoints.Cell2004;116(2):205-219.[8]LouY,LiuS,ZhangC,ZhangG,LiJ,NiMetal.EnhancedatherosclerosisinTIPE2-deficientmiceisassociatedwithincreasedmacrophageresponsestooxidizedlow-densitylipoprotein.JImmunol2013;191(9):4849-4857.[9]WangZ,FayngertsS,WangP,SunH,JohnsonDS,RuanQetal.TIPE2proteinservesasanegativeregulatorofphagocytosisandoxidativeburstduringinfection.ProcNatlAcadSciUSA2012;109(38):15413-15418.[10]SunH,ZhuangG,ChaiL,WangZ,JohnsonD,MaYetal.TIPE2controls44 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制第二部分innateimmunitytoRNAbytargetingthephosphatidylinositol3-kinase-Racpathway.JImmunol2012;189(6):2768-2773.[11]ZhangG,ZhangW,LouY,XiW,CuiJ,GengMetal.TIPE2deficiencyacceleratesneointimaformationbydownregulatingsmoothmusclecelldifferentiation.CellCycle2013;12(3):501-510.[12]HanahanD,WeinbergRA.Hallmarksofcancer:thenextgeneration.Cell2011;144(5):646-674.[13]ChafferCL,WeinbergRA.Aperspectiveoncancercellmetastasis.Science2011;331(6024):1559-1564.[14]LamouilleS,XuJ,DerynckR.Molecularmechanismsofepithelial-mesenchymaltransition.NatRevMolCellBiol2014;15(3):178-196.45 缩略词语肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制缩略词语英文缩写英文全称中文全称TNFAIP8L2tumornecrosisfactor肿瘤坏死因子诱导蛋白8(TIPE2)(TNF)-alpha-inducedprotein8-like2样蛋白2PBMCsperipheralbloodmononuclearcells外周血单个核细胞RT-PCRreversetranscription-polymerasechain逆转录-聚合式酶链反应reactionAmpAmpicillin氨苄青霉素KanaKanamycin卡那霉素LBLuria-BertanimediumLB培养基GSTglutathione-S-transferase谷胱甘肽巯基转移酶kDKilodalton千道尔顿FBSfetalbovineserum新生胎牛血清PBSphophatebufferedsaline磷酸盐缓冲溶液AdVadenovirus腺病毒GFPgreenfluorescenceprotein绿色荧光蛋白CPEcytopathiceffect细胞病变效应Tutransductionunit转导单位MOImultiplicityofinfection感染复数CsClcesiumchloride氯化铯SDS-PAGEsodiumdodecylsulphate-十二烷基硫酸钠-聚丙烯polyacrylamidegelelectrophoresis酰胺凝胶电泳ODopticaldensity光密度MTT3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-噻唑蓝2,5-diphenyltetrazoliumbromideEAEexperimentalautoimmune实验性自身免疫性脑脊髓encephalomyelitis炎SLEsystemiclupuserythematosus系统性红斑狼疮46 肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制缩略词语DNdiabeticnephropathy糖尿病肾小球综合症HBVhepatitisBvirus乙肝病毒DEDdeatheffectordomain死亡效应结构域TLRToll-likereceptorToll样受体TCRTcellreceptorT细胞受体GEFguaninenucleotideexchangefactor鸟嘌呤核苷酸交换因子RIDRas-interactingdomainRas相互作用结构域RCCrenalcancercarcinoma肾细胞癌MMPmatrixmetalloproteinase基质金属蛋白酶EMTepithelial-mesenchymaltransition上皮间充质转化47 致谢肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2（TIPE2）重组腺病毒抑制胃癌细胞的作用及其机制致谢首先衷心感谢我的导师缪竞诚教授。缪教授拥有渊博的学识、严谨敬业的治学和工作态度、诲人不倦的师德和谦和的为人处事方式，所有的这些优良品质都深深地影响着我，让我终身受益。在此论文完成之际，衷心感谢导师对我学业的悉心指导和帮助。由衷地感谢苏州大学一附院肿瘤科谢宇锋教授在课题设计、论文撰写和试验操作等诸多环节都倾注了大量的心血，您渊博的学识、严谨的科学思维和对科研工作一丝不苟的工作态度，以及刻苦敬业的精神都非常的令我敬佩。衷心感谢苏州大学肿瘤科研究生吴杰、孟颖、吴梦瑶等一群充满朝气的优秀同学。感谢所有关心和支持我的老师、同学和朋友。最后感谢家人对我的大力支持和帮助。感谢父母的养育之恩；感谢爱人和爱女的理解和鼓励。谨以此文，敬献给所有教导帮助关心和支持我的人！2014年10月于上海奉贤48