中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究

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分类号：Ｒ７５８．６３５２１０３０５一０１脑硕士学位论文中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与ＩＬ３６ＲＮ、ＣＡＲＤ１４、基因相关性研究作者李璐璐指导教师刘红学科名称临床医学（皮肤病与性病学）济南ｉ大学所医学与生命科学科学院学位类别医学硕士答辩时间２０１８年５月２９日 ；Ｃ．分类号：”：２￣ｗｍＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯｆＪ臟Ｎ＾＾；１豐，遍繫硕士学位论文ＳＵ中国汉族人群泛发性脓疱型麵病与／／Ｊ撕、Ｃ４撕４、＇ｉ幻基因相关性研究？：；；作者＾、：指导教师刘红＼，学科名称临床医学笔（皮肤病与性病学）大Ｅ学与生命臟所在学院：东：医学科二学位类别医学硕士；＾／Ｉ答辩时间２０１８年５月２９曰｜ VariantAnalysisofIL36RN,CARD14andAP1S3inaChineseHanPopulationwithGeneralizedPustularPsoriasisByLILuLuUndertheSupervisionofLIUHongAThesisSubmittedtotheUniversityofJinanInPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofMedicineUniversityofJinanJinan,Shandong,P.R.ChinaMay,2018 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名麟德０关于学位论文使用授权的声明本人完全了解济南大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借鉴；本人授权济南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数，可以采用影印据库进行检索、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。ｄ公开□保密（＿年，解密后应遵守此规定）论文作者签名导师签名：曰期：丨 济南大学硕士学位论文目录第一章绪论........................................................................................................................11.1泛发性脓疱型银屑病概述..........................................................................................11.2GPP的分类...................................................................................................................11.3GPP的发病机制...........................................................................................................21.3.1GPP与IL36RN基因..........................................................................................21.3.2GPP与CARD14基因........................................................................................41.3.3GPP与AP1S3基因............................................................................................4第二章实验方案设计与研究方法........................................................................................72.1研究对象......................................................................................................................72.2实验试剂......................................................................................................................72.2.1DNA提取试剂...................................................................................................72.2.2聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR）反应试剂..................82.2.3PCR产物电泳试剂............................................................................................82.2.4PCR产物纯化....................................................................................................82.2.5测序反应试剂....................................................................................................92.3实验仪器......................................................................................................................92.3.1组织病理学检查器材........................................................................................92.3.2DNA提取器材...................................................................................................92.3.3PCR反应和产物纯化和电泳仪器..................................................................102.3.4PCR产物测序仪器..........................................................................................102.4分析软件和电子电子数据库查询信息....................................................................102.5实验方法与步骤........................................................................................................112.5.1全血标本采集..................................................................................................112.5.2皮肤组织病理标本制备..................................................................................112.5.3基因组DNA提取和标化...............................................................................122.5.4IL36RN基因、CARD14基因、AP1S3基因引物设计、稀释和保存..........132.5.5Sanger测序的实验操作流程...........................................................................14I 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究2.5.6统计分析..........................................................................................................19第三章结果......................................................................................................................213.1基本临床资料............................................................................................................213.2测序结果....................................................................................................................213.2.1IL36RN基因测序结果.....................................................................................243.2.2CARD14基因测序结果...................................................................................253.2.3AP1S3基因测序结果.......................................................................................263.3GPP患者的IL36RN、CARD14基因突变率分析...................................................263.3.1GPP患者的IL36RN基因突变率分析............................................................263.3.2GPP患者的CARD14基因突变率分析..........................................................283.4GPP患者的临床表型-IL36RN基因型关联分析......................................................29第四章讨论......................................................................................................................33第五章总结与展望..............................................................................................................37参考文献..................................................................................................................................39致谢......................................................................................................................................43附录......................................................................................................................................44II 济南大学硕士学位论文中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究专业：临床医学（皮肤病与性病学）硕士研究生：李璐璐导师：刘红（研究员）摘要研究背景：泛发性脓疱型银屑病（generalizedpustularpsoriasis,GPP）是一种少见的、危及生命的系统性炎症性疾病。GPP是一种多基因遗传性疾病。有学者提出不合并寻常型银屑病（psoriasisvulgaris,PV）症状的GPP（单纯型GPP）是一种独立类型的脓疱型皮肤病，而合并PV症状的GPP（GPP+PV）是银屑病的严重的表现类型。研究目的：检测中国种群GPP患者IL36RN基因、CARD14基因和AP1S3基因突变，分析以上三个基因突变与GPP发病的关联性；分析单纯型GPP与GPP+PV间基因突变的遗传异质性；分析IL36RN基因型与GPP临床表型的关联。研究方法：对临床收集的107例GPP患者的IL36RN基因、CARD14基因和AP1S3基因所有外显子进行直接测序，检测以上基因突变。采用两独立样本t检验、卡方检验和费舍尔精确检验进行数据统计分析，统计样本的基因突变及临床表现情况。研究结果：在IL36RN外显子结构域，我们发现了3个新发现的罕见突变：p.Arg10Gln、p.Leu78Pro、p.Tyr89X，5个已知的罕见突变：p.Asn47Ser、p.Arg48Trp、p.Pro76Leu、p.Arg102Trp、p.Glu112Lys，1个已知的低频突变：c.115+6T>C。在CARD14外显子结构域，我们发现了3个新发现的罕见突变：c.1356+4C>T、p.Val758Met、p.Ala825Thr，1个已知的低频突变：p.Asp176His(rs144475004)。在AP1S3外显子结构域，我们未发现任何罕见或低频突变。统计分析结果显示，IL36RN基因突变率在GPP和PV患者两组、单纯型GPP和GPP+PV两组均具有显著性差异；CARD14基因突变率在GPP和PV患者两组无差异，在单纯型GPP和GPP+PV两组中有显著差异；IL36RN基因突变型GPP患者较IL36RN基因非突变型GPP患者平均发病年龄更低，病情更易反复发作；携带复合IL36RN基因突变型GPP患者较携带单一IL36RN基因突变型GPP患者病情更易反复发作。III 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究研究结论：本研究通过直接测序发现大部分的GPP患者未检测到以上三个基因突变。IL36RN基因突变与单纯型GPP的发病相关，CARD14基因突变与GPP+PV的发病相关，AP1S3基因突变与中国种群GPP的发病无关。IL36RN基因突变型与GPP病情的严重程度相关。系统地分析了GPP患者的易感基因，为研究GPP的发病机制及GPP分型提供了新的证据。关键词：泛发性脓疱型银屑病；IL36RN；CARD14；AP1S3；基因突变；中国种群IV 济南大学硕士学位论文VariantAnalysisofIL36RN,CARD14andAP1S3inaChineseHanPopulationwithGeneralizedPustularPsoriasisMajorClinicalmedicine(DermatologyandVenereology)GraduateLiLuluSupervisorProf.LiuHongAbstractBackground:Generalizedpustularpsoriasis(GPP)isararelife-threateninginflammatoryskindisorder.GPPisoneofthepolygenicdisease.SomescholarssuggestthatGPPaloneisanindependenttypeofpustulardermatosisandGPPwithPVisaserioustypeofexpressionofpsoriasis.Objective:WeaimedtodetectIL36RN,CARD14andAP1S3mutationsinaChineseHanpopulation;toidentifytheassociationbetweenGPPandtheabovethreegenes,toanalysisgeneticheterogeneitybetweenGPPaloneandGPPwithPVandtoperformedgenotype-phenotypecorrelationsofIL36RNmutations．Methods:CodingexonsofIL36RN,CARD14andAP1S3weresequencedin107ChineseGPPpatients.SubgroupanalysisofIL36RNandCARD14mutationsandgenotype-phenotypecorrelationsofIL36RNmutationswasperformedwithintheGPPcohort.Results:Wedetectedthreenew,fiveknownraremutationsandoneknownlow-frequencymutationintheexonofIL36RN:p.Arg10Gln,p.Leu78Pro,p.Tyr89X,p.Asn47Ser,p.Arg48Trp,p.Pro76Leu,p.Arg102Trp,p.Glu112Lysandc.115+6T>C.Wedetectedthreenewandoneknownlow-frequencymutationsintheexonofCARD14:c.1356+4C>T,p.Val758Met,p.Ala825Thr,p.Asp176His(rs144475004).NorarevariantsinAP1S3wereidentifiedinall107GPPpatients.SignificantdifferencesoffrequenciesofIL36RNmutationswereobservedbetweenGPPandPV/controlsgroups，GPPaloneandGPPwithPVgroups.SignificantdifferenceoffrequenciesofCARD14mutationswereobservedbetweenGPPaloneandGPPwithPVgroups,butnoneofitbetweenGPPandPV/controlsgroups.Threephenotypes--earlyV 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究ageofdiseaseonset,moremarkedlyriskofrecurrenttroubleandsystemicinflammationwerefoundtobesignificantlyassociatedwithIL36RNmutationscarriers.Conclusions:OurresultssuggestedmutationsinIL36RNweredisease-causingfactorsinChinesepatientswithGPPalone,andmutationsinCARD14weredisease-causingfactorswithGPPwithPV.ButAP1S3mutationswerefoundtohavenothingtodowithChineseHanpatientswithGPP.IL36RNmutationscarriersmanifestedastrikinglymoresevereclinicalphenotype.KeyWords:generalizedpustularpsoriasis;IL36RN;CARD14;AP1S3;mutation;ChineseVI 济南大学硕士学位论文英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称GPPGeneralizedpustularpsoriasis泛发性脓疱型银屑病PVPsoriasisvulgaris寻常型银屑病AGPPAldult-onsetGeneralizedpustularpsoriasis成人型泛发性脓疱型银屑病Pediatric-onsetGeneralizedpustularPGPP儿童型泛发性脓疱型银屑病psoriasisIL36RNInterleukin-36receptorantagonist白介素-36受体拮抗剂Caspaserecruitmentdomain-containingCARD14细胞凋亡募集结构域蛋白14protein14Theσ1Csubunitoftheadaptorprotein衔接蛋白复合体1亚单位异AP1S3complex1构体σ1CNF-κBNuclearfactorκB核因子κBMAPKMitogen-activatedproteinkinase丝裂原活化蛋白激酶Deficiencyofinterleukin36receptorDITRA白介素-36受体拮抗剂缺陷antagonistPSORS2Psoriasissusceptibilitylocus2银屑病易感位点2PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应HEHematoxylinandeosin苏木素一伊红EDTAEthylenediaminetetraacete乙二胺四乙酸VII 济南大学硕士学位论文第一章绪论1.1泛发性脓疱型银屑病概述泛发性脓疱型银屑病（generalizedpustularpsoriasis,GPP）是一种少见的，危及生命的系统性炎症性疾病。统计表明，银屑病在我国的患病率约为0.123%，GPP患病率仅为银屑病患病人群的0.69%[1]。GPP在法国患病率与日本人群患病率相似，仅为0.64/100万[2]。疾病皮损表现为炎症性红斑或原有寻常型银屑病（psoriasisvulgaris,PV）皮损的基础上密集的单个可见的针尖至米粒大小的淡黄色的无菌性的脓疱，脓疱融合后可汇合成脓湖。皮损面广大，可累及全身。皮损最常见于四肢屈侧以及身体皱襞处[3]。时常伴有关节、指甲等症状。可伴有迟发性高热以及全身不适等全身症状并白细胞增高以及C反应蛋白升高[4]。组织病理学主要表现为中性粒细胞在表皮浸润形成kogoj海绵状微脓肿或Munro微脓肿。治疗数周或数月后，皮损症状好转或转化为红皮病。上呼吸道感染、其他感染、外伤手术应激状态、妊娠等可再次诱发疾病的复发。发病机制尚不明确，有人认为与银屑病患者长期服用糖皮质类固醇激素突然停药有关。本病病情严重，甚至危及生命，易复发，预后较差。1.2GPP的分类根据Jean的银屑病分类，脓疱型银屑病可分为GPP、掌跖脓疱病（palmoplantarpustulosis，PPP）以及Hallopeau连续性肢端皮炎（acrodermatitiscontinuaofHallopeau,ACH）[5]。PPP以及ACH临床皮损局限于手足，可转化发展为GPP。根据临床表现的不同，Baker和Ryan将GPP分为4型，包括vonZummbusch型、环状型、发疹型以及局限型[5]。GPP还可分为急性GPP、妊娠期GPP、婴幼儿GPP、环状GPP以及局限型GPP[6]。根据是否合并PV症状，GPP可分为单纯GPP（generalizedpustularpsoriasiswithoutpsoriasisvulgaris,GPPalone）和GPP+PV（generalizedpustularpsoriasiswithpreceding，lateroraccompaniedbypsoriasisvulgaris,GPPwithPV）两类[7]。有学者认为单纯型GPP患者较GPP+PV患者发病急，症状重，更易复发；且单纯型GPP的临床皮损与银屑病皮损截然不同，遗传学突变率有所差异，故提出单纯型GPP是区别与银屑病而独立存在的疾病类型。根据GPP的发病年龄，将GPP分为发病年龄＜18周岁的儿童型GPP1 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究（paediatric-onsetGPP,PGPP）以及成人型GPP（adult-onsetGPP,AGPP）[8]。儿童型GPP较成人型GPP，发病更急，全身症状更明显，更易伴发系统性炎症（包括体温>38℃，白细胞>12×109/L），且复发率更高[9]。1.3GPP的发病机制到目前为止，GPP的病因及发病机制还没有完全明确。上呼吸道感染（金黄色葡萄球菌和/或链球菌）已被学者们公认为GPP的诱发加重因素，其他相对少见的诱发因素还包括类固醇激素长期用药后突然停药、疲劳、妊娠、低钙血症、应激刺激、季节变化等。GPP较PV具有更强的炎症反应，GPP还经常合并PV、红皮病型银屑病以及关节型银屑病等其他类型的银屑病[10]。GPP的炎症反应主要表现为以中性粒细胞浸润为主，因此有学者提出了中性粒细胞致病学说[11]。中性粒细胞对GPP的致病作用主要通过增强其趋化性、吞噬、抗原呈递以及参与炎症放大调控等功能。但不少学者对此观点提出了质疑，他们认为对GPP有效的糖皮质激素、环孢素A和维甲酸类药物都不是通过作用于中性粒细胞或其下游炎症因子而抑制疾病发展的，因此中性粒细胞致病机制不能作为GPP发病机制中的核心机制。近年来，随着基因测序和基因诊断技术的发展，GPP的遗传学发病机制也得到了突破性的进展。最早2011年，Marrakchi等[12]应用纯合子定位及直接测序技术对9个突尼斯GPP家族进行测序分析，发现了白细胞介素-36受体拮抗基因(interleukin36receptorantagonistgene,IL-36RN)的纯合错义突变（p.Leu27Pro），此突变通过改变白细胞介素-36受体拮抗剂（interleukin-36receptorantagonist,IL-36Ra）的结构和功能在GPP发病过程中起致病作用。在此之后，越来越多的遗传学证据表明，GPP是一种多基因致病的常染色体隐性遗传病。除IL36RN基因外，GPP发病相关易感基因还包括编码细胞凋亡募集结构域蛋白14（caspaserecruitmentdomain-containingprotein14,CARD14）和编码衔接蛋白复合体1亚单位异构体σ1C（theσ1Csubunitoftheadaptorproteincomplex1，AP1S3）的两个基因。1.3.1GPP与IL36RN基因IL36RN基因负责编码一种可溶性分子IL-36Ra，主要在包括皮肤角质形成细胞内的上皮组织内高表达。IL-36Ra通过与白细胞介素-36受体（interleukin-36receptor,IL-36R）结合，阻断白细胞介素-36（interleukin-36,IL-36）炎症因子的激活，竞争性抑制核因子2 济南大学硕士学位论文κB（nuclearfactorκB,NF-κB）信号通路及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase,MAPKs）信号通路，进而抑制炎症反应。IL-36是白介素-1（interleukin-1,IL-1）家族的主要成员之一，该家族主要包括：IL⁃1α、IL⁃1β、IL⁃1Ra、IL⁃18、IL⁃33、IL⁃37、IL⁃36Ra（IL⁃1F5）、IL⁃36α（IL⁃1F6）、IL⁃36β（IL⁃1F8）、IL⁃36γ（IF⁃1F9）、IL⁃1F10等11个成员[13,14]。其中，IL-36α、IL-36β、IL-36γ等炎症因子与IL-36R结合后招募IL⁃1受体（interleukin-1receptor,IL-1R）辅助蛋白，激活促炎症信号通路（NF-κB和MAPKs信号转导通路），进而上调炎症反应。有学者提出，IL36RN突变引起IL36Rα活性降低（deficiencyofinterleukinthirtysixreceptorantagonist,DITRA），对IL-36R的拮抗能力减低甚至消失，而IL-36等炎症因子促炎症反应增强，可能是引起GPP无菌性脓疱产生的重要原因[12,15]。继Marrakchi等[12]之后，多个学者接连在多个种群GPP患者中发现了IL36RN基因单一或复合突变致病突变，包括欧洲种群常见的突变点p.Ser113Leu，亚洲种群常见的突变点c.115+6T＞C以及突变点p.Arg10X、p.Asn47Ser、p.Arg48Trp、p.Val57Ile、p.Pro76Leu、p.Pro82Leu、p.Arg102Gln、p.Glu112Lys和p.Thr123Arg等[16-19]。随后Sugiura等[7]将日本人群GPP分为两组：单纯型GPP和GPP+PV，并进行IL36RN基因突变频率比较分析，发现大部分单纯型GPP患者携带IL36RN基因突变，且突变率明显高于GPP+PV患者。由此，Sugiura等[7]提出单纯型GPP与GPP+PV存在遗传异质性，支持单纯型GPP是一种区别于银屑病独立存在的炎症性疾病观点。2014年，我们团队在中国人群GPP患者中也验证这这一观点[20]。另外，我国Li等[8]将中国人群GPP分成两组：儿童型GPP和成人型GPP，同时进行IL36RN基因测序并比较两组突变率。结果发现儿童型GPP患者IL36RN基因突变率明显高于成人型GPP患者。另外，多个学者提出IL36RN基因的突变基因型与GPP发病临床表现表型的严重程度相关[9,21,22]。Hussain等[9]于2015年分析了233例GPP患者（包括177例PubMed中报道的进行了IL36RN基因测序的GPP患者以及56例新诊断的GPP患者）的临床表型与IL36RN基因型的关系，再次证实了上述两个结论。另外，Hussain等[9]发现携带IL36RN基因突变的GPP患者比不携带IL36RN基因突变的GPP患者病情更严重，更容易发生系统性炎症。并且携带IL36RN基因复合突变的患者比携带IL36RN基因单一突变的患者平均发病年龄更小，但伴发系统性炎症的可能二者并没有区别。综上所述，IL36RN基因突变不仅与GPP的发病相关，而且与不同临床表型的GPP发病相关性存在差异。3 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究1.3.2GPP与CARD14基因CARD14基因，又叫CARMA2基因，负责编码重要的膜相关衔接蛋白CARD14，是细胞凋亡募集结构域蛋白（caspaserecruitmentdomain，CARD）家族中的一员。CARD14在皮肤角质形成细胞中特异性地表达，通过与细胞因子BCL10和细胞因子MALT1结合构成CARMA2-BCL10-MALT1复合体进而作为激活因子激活NF-κB及MAPKs转导的炎症信号通路，上调炎症反应[23,24]。2014年，Catherine等[25]将CARD14基因定位于银屑病易感位点2（psoriasissusceptibilitylocus2,PSORS2）上，认为CARD14基因是银屑病发病相关的易感基因，CARD14基因突变通过上调CARD14蛋白的表达，过度激活皮肤角质形成细胞中NF-κB信号转导通路，进而导致银屑病的发生。另外，Catherine等[25]在一例3岁反复发病的欧洲散发儿童型GPP患者中检测到了CARD14基因p.Glu138Ala突变。Sugiura等[26]在小样本（30例）的日本人群GPP患者中发现CARD14基因突变点p.Asp176His的突变率在GPP+PV组中明显高于单纯型GPP组的突变率（21.1%vs.0%,P<0.01）以及PV组的突变率（21.1%vs.4%,P<0.05）。因此，Sugiura等[26]认为CARD14基因的p.Asp176His突变是GPP+PV的致病易感突变，与单纯型GPP的发病无关。随后，Berki等[26]进一步分析比较90例东亚种群（42例日本种群和48例中国种群）GPP患者的CARD14基因p.Asp176His突变的突变率与正常对照p.Asp176His突变的突变率，发现CARD14基因p.Asp176His突变与东亚种群的GPP发病相关，但未比较GPP患者与PV患者突变率是否有差异。另外，我们的团队曾在2014年对中国汉族人群GPP患者（62例）以及PV患者（174例）进行了CARD14基因测序并比较分析，发现GPP患者的CARD14基因突变携带率明显高于正常对照（P<0.05），但与寻常型银屑病患者的携带率没有明显差异[27]。综上所述，CARD14基因突变与银屑病发病相关，由于迄今没有充分的证据证明PV患者和GPP患者的CARD14基因突变率存在差异，所以CARD14基因突变与GPP发病的相关性不能明确。1.3.3GPP与AP1S3基因AP1S3基因负责编码衔接蛋白复合体1（adaptorproteincomplex1，AP1）σ1亚单位的一种异构体σ1C。AP1的作用主要是在细胞质内高尔基体和内吞体之间装配和运输转运小泡。Mahil等[28]研究发现AP1S3基因与角质形成细胞的吞噬功能有关，敲除了AP1S3基因的细胞IL-1介导的信号通路上调，IL-36α过表达，进而导致皮肤的炎症反4 济南大学硕士学位论文应。2014年，Setta⁃Kaffetzi等[29]报道了携带AP1S3基因p.Phe4Cys突变和p.Arg33Trp突变的15例脓疱型银屑病（包括2例ACH患者，2例GPP患者，9例PPP患者和2例GPP合并ACH患者），认为AP1S3基因是除IL36RN之外的脓疱性银屑病的致病易感基因。但AP1S3基因在脓疱型银屑病中具有更低的携带率，因此到目前为止报道的病例数有限，需要进一步地扩大样本量。本论文在2014年研究的基础上，重新招募了107例中国汉族散发GPP患者（其中包括31例单纯型GPP和76例GPP+PV患者），并对新招募的这107例GPP患者的全基因组DNA进行了IL36RN、CARD14、AP1S3基因的直接测序，期望通过扩大GPP患者的样本量，进一步阐明以上三个基因与中国汉族人群GPP发病的关系。另外，我们还整理了新招募的这107例GPP患者详细的临床资料，分析了IL36RN基因型与GPP临床表型的关系。5 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究6 济南大学硕士学位论文第二章实验方案设计与研究方法2.1研究对象本论文主要研究2014年01月至2017年03月于山东省皮肤病医院住院（我院）的107例中国汉族散发GPP患者，GPP的诊断均经我院超过2名以上的皮肤科专家同意，临床表现典型且部分经组织病理确诊。患者皮损表现为原有银屑病斑片或炎症性红斑基础上可见密集的单个可见的针尖至米粒大小的淡黄色的无菌性的脓疱，皮损最常见于四肢屈侧以及身体皱襞处，少数患者可见脓疱融合后汇合成的脓湖，严重者皮损可累及全身。偶见患者伴有关节、指甲等症状。大部分患者伴有迟发性高热、全身不适等全身症状，实验室检查见白细胞增高以及C反应蛋白升高。107例GPP患者包括31例从未被诊断过PV，即单纯型GPP；76例GPP患者曾出现过PV症状，即GPP+PV。组织病理学表现为表皮角化不全、角化过度，可见中性粒细胞在表皮浸润形成kogoj海绵状微脓肿或Munro微脓肿。全部107例GPP患者均已签署患者知情同意书。收取患者临床资料，包括患者基本信息（姓名、性别、年龄、民族、籍贯、住址等）以及详细的临床资料（GPP发病年龄、GPP+PV患者的PV发病年龄、GPP的诱发因素、银屑病家族史等）。整理患者住院过程中的检查结果，包括体温、血常规、C反应蛋白、血沉。抽取患者周静脉外周血5ml于抗凝管中，置于-80℃冰箱长时间保存备用。本研究同时统计了我们团队之前的研究数据[20,27]，包括62例GPP患者（17例单纯型GPP患者和45例GPP+PV患者）的IL36RN、CARD14基因测序结果，174例PV患者的IL36RN、CARD14基因测序结果，96例正常对照的IL36RN基因测序结果以及365例正常对照的CARD14基因的测序结果。2.2实验试剂2.2.1DNA提取试剂1）血液样本[保留在EDTAK2（或EDTANa4）抗凝管中的静脉血2）QuickgeneDNA全血试剂盒（蛋白酶EDB、LysisBuffer(LDB)、WashBuffer(WDB)、ElutionBuffer(CDB)、过滤柱、废液槽、收集管）3）无水乙醇(ethanol)（天津市科密欧化学试剂有限公司，PH:20170323）7 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究4）超纯水(ddH2O)2.2.2聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）反应试剂1）引物：能够特异性扩增IL36RN、CARD14、AP1S3基因的全部外显子（华大基因科技，北京）2）TaKaRaTaq酶5U/ul3）dNTPs:含dATP、dCTP、dGTP及dTTP各2.5mmol（宝生生物工程有限公司，大连）4）10×PCRReactionBuffer:500mmol/LKCL,15mmol/LMgCl2，100mmol/LTris-HCL5）超纯水(ddH2O)2.2.3PCR产物电泳试剂1）琼脂糖(UltraPureAgarose)（Invitrogen公司，美国）2）50×TAE缓冲液（Solarbio索莱宝科技有限公司，北京）:缓冲液---Tris-乙酸40mmol/L,EDTA(PH8.0)1mmol/L，使用时按比例稀释成1×缓冲液3）DNAMakerDL2,000（同TaKaRaTaq酶配套）4）PCR产物电泳加样缓冲液(10×loadingBuffer)(北京泰天河生物技术有限公司GalaxyBio，北京)5）GelRed核酸凝胶染色剂，10,000inwater，同TAE缓冲液配套2.2.4PCR产物纯化1.切胶回收试剂（康宁生命科学吴江有限公司）1）AxyPrep凝胶回收试剂盒：凝胶溶化剂(BufferDE-A)，结合液(BufferDE-B)，洗涤液(BufferW1)，去盐液(BufferW2concentrate)，洗脱液(Eluent)，其他（提取柱，1.5ml离心管，2ml离心管）2）异丙醇（天津市津南区咸水沽工业园区，PH:20140312）2.醋酸钠乙醇沉淀法1）乙酸钠(NaAC)(3mol/L,PH=5.2)2）无水乙醇(ethanol)（天津市科密欧化学试剂有限公司，PH:20170323）3）EDTA8 济南大学硕士学位论文2.2.5测序反应试剂1）能够特异性扩增IL36RN、CARD14、AP1S3基因的全部外显子（北京华大基因科技）2）BigdyeTeminatorv3.1：含有四种不同荧光标记的ddNTP（美国应用生物系统公司AppliedBiosystemsABI，美国）3）3730buffer(×10)withEDTA（美国应用生物系统公司AppliedBiosystemsABI，美国）4）HiDiFormamide（美国应用生物系统公司AppliedBiosystemsABI，美国）2.3实验仪器2.3.1组织病理学检查器材1）恒温箱（80℃）、自动脱水机2）LEICARM2135型超薄切片机3）TK-218型摊片/烤片机4）OLYMPUS电光源显微镜（奥林巴斯公司OLYMPUS，日本）5）Canon/佳能摄像机（彩色）2.3.2DNA提取器材1）涡旋振荡器VORTEX-5(其林贝尔仪器制造有限公司，中国)2）高速离心机（ThermoFisher公司，美国）3）SSW–420-2S型电热恒温水槽（上海博讯实业有限公司，中国）4）移液器（10ul,100ul,1,000ul）（Eppendoef公司，德国）5）超低温冰箱（-80℃）（三洋公司，日本）6）Haier冰箱（4℃)、Haier冰柜（-20˚C）（海尔集团公司，中国）7）EDTAK2（或EDTANa4）抗凝真空管8）1.5ml离心管、15ml收集管、50ml试管架9）一次性塑料手套10）KuraboQuickGene-610L（天美科学仪器有限公司，中国）11）NanoDrop8000全波长紫外／可见光扫描分光光度计（ThermoFisher公司，美国）9 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究2.3.3PCR反应和产物纯化和电泳仪器1）PCR仪（Eppendorf公司，德国；ABI9700，美国）2）封板模（Eppendorf公司，德国）3）马头牌JYT-5架盘天平（上海光正医疗仪器有限公司）4）纯水处理系统（ELGALabWater，英国）5）高速离心机（Beckman公司，美国；Eppendorf公司，德国）6）电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）7）QB-9100微孔板快速振荡器（其林贝尔仪器制造有限公司，中国）8）200ulPCR薄壁管（Axygen公司，美国）9）0.5ml、1.5ml离心管（Axygen公司，美国）10）96孔DNA制备板（Axygen公司，美国）11）移液器（2.5ul,10ul,200ul）（Eppendoef公司，德国）12）Haier冰箱（4℃）、Haier冰柜（-20˚C）（海尔集团公司，中国）13）电子天平（上海梅特勒-托利多仪器）14）National微波炉15）FD201稳压稳流电泳仪（上海化科实验器材有限公司）16）Tanon4100全自动数码凝胶成像分析系统（上海天能公司）2.3.4PCR产物测序仪器ABI3500XLGeneticAnalyzer遗传分析机（ABI公司，美国）2.4分析软件和电子电子数据库查询信息1）序列读取软件4Peaks（version1.7.1）2）引物设计：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi3）基因数据库/下载序列（分析）：http://www.ensembl.org/index.html／http://genome.ucsc.edu/4）美国生物技术信息中心：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/5）孟德尔遗传：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/6）蛋白质数据库：http://www.uniprot.org/10 济南大学硕士学位论文6）Genebank:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/7）人类基因组突变库：http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/search.html8）dbSNP：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/9）HapMap数据库：http://www.hapmap.org10）SortingIntolerantFromTolerant(SIFT):http://sift.bii.a-star.edu.sg12）PolyPhen2:http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/bgi.shtml13）PROVEAN:http://provean.jcvi.org/index.php14）TheExomeAggregationConsortium(ExAC):http://exac.broadinstitute.org/2.5实验方法与步骤2.5.1全血标本采集在取得全部107例GPP患者的知情同意之后，抽取患者肘静脉外周血（不得少于5ml）于抗凝管中，放置在-80˚C超低温冰箱内超长时间保存，以备后续使用。2.5.2皮肤组织病理标本制备我院病理科工作人员对患者皮损部位实施局麻手术，切取1×1cm大小的皮肤组织，并迅速将组织浸于10%福尔马林中。皮肤组织标本按固定、水洗、硬化、脱水、透明、包埋、切片、染色的顺序处理。1）固定：切取的皮肤组织在10%的福尔马林溶液之中浸泡4小时以上。注意：固定液常用10％中性福尔马林溶液，在较低温度的环境下，应向固定液中加入1/10体积的95%浓度的乙醇，以避免标本冻结（切忌使用100％无水乙醇）；标本固定的时间需足够长，如4mm厚度的标本需固定不少于6～8小时，厚度大于4mm的标本则需固定10～12小时以上，对于另外一些更大的组织块(如肿瘤组织)则需先将其分割成4-5mm厚的组织片再行固定。2）脱水与透明：室温条件下，将已硬化的组织标本依次在75％、85％、95％浓度梯度的乙醇中各脱水2个小时，然后在100%酒精中脱水2次（无水乙醇I和II），每次各2小时；脱水后二甲苯中浸泡2次（二甲苯I和II），每次各2-3小时。3）石蜡包埋：把二甲苯中浸泡后组织块在70℃的液体石蜡中浸泡4小时以上。4）皮肤组织标本的切片：先将包埋后的标本块冰冻2-3分钟，然后将其切成多个约6mm11 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究厚度的切片，于约50℃的水中完整地展开至载玻片上，最后于烤箱中烤片20-30分钟。5）脱蜡：将从烤箱中取出的皮肤组织标本浸于二甲苯中约10分钟，然后浸于100%乙醇中2分钟，95％的乙醇5秒，最后清水冲洗备用。6）HE染色：①苏木素染色5分钟，清水冲洗。②50℃温水中蓝化5分钟。③伊红染色30秒，清水冲洗。④中性树胶封片。7）读片：低倍显微镜下扫视整张切片，辨清主要、次要病变，中倍和高倍镜下分层次观察并描述。2.5.3基因组DNA提取和标化对107例GPP实验研究对象的外周血全部用以下步骤提取全血基因组DNA：1）实验样本解冻：从-80˚C超低温冰箱中取出长期保存的样本，需先置于-20˚C低温冰箱中24h，再放置于4˚C低温冰箱中24h解冻。2）实验试剂准备：①配置protease（EDB）溶液---向干粉蛋白酶K中加入3.3ml的ddH2O，涡旋混匀直至无固体沉淀，室温放置30-40分钟，4℃冰箱保存。②配置洗涤液（WDB）---按1:1比例混匀WDB和无水乙醇（每种液体160ml）,准备上机使用。③将洗脱液（CDB）倒入50ml圆锥管中准备上机使用。3）实验仪器准备：确保机器可以正常运行，同时废液皿已经放置好。开机后，超纯水清洗机器管道1次，排空后洗涤液（WDB）和洗脱液（CDB）分别清洗相应机器管道1次。将过滤柱和废液槽（各6个）置于试剂架上备用。4）实验样品DNA提取：①制备样本相应数目编号的15ml收集管、1.5ml离心管，并编码；②分别加入300ul的EDB、2ml左右相对应的样本、2.5mlLDB溶液，上下颠倒10次，漩涡振荡3分钟；注意：必须将液体充分振荡混匀以保证基因组DNA完全释放。③56˚C水浴10min；12 济南大学硕士学位论文④再加入2.5ml无水乙醇，上下颠倒10次，漩涡振荡3分钟；⑤上机：将充分震荡后的液体倒入准备好的过滤柱中，同时放置相应编号的1.5ml离心管，选择“DNAWHOLEBLOOD”模式，START键开始，等待收集DNA。⑥将提取的DNA溶液置于4˚C恒温冰箱中保存，如若长时间不用，放于-80˚C超低温冰箱中长期保存。5）DNA原液浓度/纯度测定、模版DNA配置从4˚C冰箱中取出所需DNA（如从-80˚C超低温冰箱中取出长期保存样本，解冻操作方法同前），涡旋震荡，离心，使用ND8000分光光度计测量DNA原始浓度及纯度。根据原液浓度，将其溶液配成浓度为30ng/ul的DNA模板，置于96孔板中备用。2.5.4IL36RN基因、CARD14基因、AP1S3基因引物设计、稀释和保存1）基因序列的获取在Ensembl的官方网站页面(http://asia.ensembl.org/index.html)输入IL36RN、CARD14和AP1S3可得到3个基因的全部外显子序列，选择氨基酸数目长且有NCBI序列参考号的基因序列，并下载.rtf格式的DNA序列。IL36RN基因参考序列号NM_012275，CARD14基因参考序列号NM_024110，AP1S3基因参考序列号NM_001039569。2）引物的In-SilicoPCRSearch：在UCSC数据库In-SilicoPCR页面(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr)输入已知的IL36RN基因[20]、CARD14基因[27]、AP1S3基因[29]全部的外显子的上下游引物，得到上下游中间序列数据。另外，使用NCBIBLASTtheHumanGenome工具与Ensembl的官方网站页面得到的基因序列进行比对，序列与序列100%匹配。由此，仍然沿用先前文献提到的引物序列[20,27,29]。3）引物的稀释与保存选定的引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，按照以下步骤稀释为20umol/L的工作液。具体步骤如下：①按照DNA合成产品使用说明计算不同引物的分子量、质量数和摩尔数，且根据所需的浓度计算需要加入去离子水(ddH2O)的体积量。②将装有薄膜状或粉末状引物的离心管离心5分钟，14,000转，使DNA聚集到管底（以免开盖时引起粉末飞扬丢失），注意轻拿轻放。③小心开启管盖，不要将管口开太大，缓慢加入先前计算好的去离子水(ddH2O)13 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究量。④振荡2次，每次1.5分钟，将其混匀。⑤离心后室温孵育（24小时后开始使用）。⑥取上、下游引物（F、R）各20ul混匀到准备好的离心管中，将其编号分装，放入-20˚C冰箱保存、备用。2.5.5Sanger测序的实验操作流程2.5.5.1PCR1）基本工作原理PCR技术用于扩增两段已知序列（上、下游引物）之间的DNA区域序列。反应混合体系在每一个PCR循环都按顺序在三种不同温度下进行温育，即模板变性、引物退火和引物延伸三个阶段。该反应是在一种可编程序的温度热循环仪中自动进行的。①模板变性阶段：双螺旋结构的两条模板链在94℃条件下热变性7分钟，从而双链解离。②引物退火阶段：上、下游引物（F、R）在不同的退火温度（AnnealingTemperature）条件下与相应的模板链杂交。注意：退火温度的设定一般比所用引物的Tm值低5℃，Tm计算一般采用简化的公式：Tm=2(A+T)+4(G+C)。实验过程中需先采用2℃温度差值的温度梯度法摸索每对引物的最佳退火温度。③延伸阶段：在72℃条件下聚合酶促进与模板链互补的新DNA链合成及序列的延伸。该阶段重复35个PCR循环，使目标片段拷贝数呈指数累积增加。2）PCR的反应体系（12.5ul）见表2.1表2.112.5ulPCR反应体系成分体积ddH2O5ulTaqmix6.5ul引物（F+R）0.5ul模板DNA0.5ul总体积12.5ul3）PCR反应条件14 济南大学硕士学位论文PCR反应在9700型PCR扩增仪（AppliedBiosystems(ABI)公司，美国）上进行，反应条件见表2.2：表2.2PCR反应程序反应阶段反应阶段反应条件反应时间Ⅰ预变性94℃3min变性94℃30sⅡ（35个循环）退火**℃45s延伸72℃45sⅢ最后延伸72℃8min**℃温度为温度梯度法测得的温度4）PCR反应注意事项：①PCR反应可使DNA分子呈指数扩增，因此在实验操作过程中注意防止样本的污染；②PCR产物可放在4℃恒温冰箱中暂存；③PCR反应须在负压环境下进行，避免分子量过低的PCR产物形成气溶胶污染实验室；④PCR反应工作台在实验前或实验后使用紫外线灯照射解离DNA片段，工作台上须有PCR反应专用的离心机、一次性手套、整套移液器等。2.5.5.2PCR产物琼脂糖凝胶电泳观察PCR后，产物在琼脂糖凝胶电泳中是否有条带，条带位置、亮度及是否单一，来判断是否有产物且产物是否是需要的目的片段，以及产物是否具有特异性。1）配置用于电泳槽和制备凝胶所需的足够量的电泳缓冲液；2）配胶：根据样本数量选择需要配置胶块大小，配置成浓度约为12g/L~15g/L，如配置48个梳的大块胶，取1.2g琼脂糖加入到110mL1×TAE溶液中；26个梳长方形胶是将0.7g琼脂糖加入到55ml1×TAE溶液中；13个梳小方形胶则是将0.4g琼脂糖加入到30ml1×TAE溶液中；3）设置微波炉的微波火力及时间进行加热，一般中低火微波3分钟，随时观察，悬浮液至琼脂糖完全溶解变成透明即可；4）将溶液冷却至40˚C-50℃，加入10,000×GelRed，配成1×GelRed，充分混匀；5）将配置好的溶液倒入安置好的胶槽中，此时溶液不宜过冷或过热，检查是否有气泡，室温下静置30分钟以上，将其晾干;15 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究6）待凝胶完全凝固后，小心垂直拔出带有梳子的胶板，用1×TAE溶液润湿凝胶；7）吸取1.5ul的PCR产物加入0.3ul加样缓冲液（loadingbuffer）混匀，用移液器慢慢将1.8ul混合物加入样品槽中，且在其中一个槽中加入DL2000DNAMarker标记PCR产物的大小；8）连接稳压稳流电泳仪正负极，确保PCR产物从黑（-）极电泳到红（+）极跑胶，采用1～5V/cm的电压（按两极间距离计算）。期间密切注意跑胶情况，待loadingbuffer条带至2/3胶长处时，关闭电源；9）在紫外灯下观察凝胶条带，并扫描留取图像，观察条带是否单一。如条带单一，则使用乙醇醋酸钠纯化法纯化剩余的PCR产物。若观察到多个条带，则使用切胶纯化法纯化剩余的PCR产物（需重新跑胶切胶）；10）切胶回收时，则在留取照片后，快速切胶（不要将DNA长时间暴露于紫外灯下以防DNA损伤），切下整个目的片段所在位置的凝胶放入已准备好并标记的1.5ml离心管中，4˚C冰箱暂时保存，尽快从中回收所需DNA。2.5.5.3PCR产物的纯化PCR产物的纯度及用量要求为：OD260/OD280的比值在1.6至2.0之间且纯化后的目的DNA含量需达到10-100ng，先将PCR产物纯化是上机测序前必有的步骤。根据PCR产物的条带情况我们主要采用了2种纯化方法：离心柱纯化法和醋酸钠乙醇沉淀法。方法（1）离心柱纯化法：①将准备好的紫外灯下切下的含有目的DNA片段的琼脂凝胶拿出，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，计算出凝胶重量（提前记录1.5ml离心管重量），此重量作为一个凝胶体积（如100mg=100ul体积）；②向离心管内加入3个凝胶体积的DE-A缓冲液，将凝胶浸入溶液中，混合均匀后于75˚C加热（低熔点琼脂糖凝胶于40˚C加热），每隔2~3分钟间断混合，上下颠倒后，再次放入水浴锅直至凝胶完全溶化，可以放置时间长，让其充分溶化；③步骤2中凝胶充分溶化后，加入0.5个DE-A缓冲液体积的DE-B缓冲液，振荡混合均匀（加入DE-B缓冲液后，混合物颜色变为黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液）；④吸取步骤③中的混合液，转移到DNA制备管中，12,000×g离心1分钟，弃滤液；⑤将制备管置回2ml离心管，加入500ulW1缓冲液，12,000×g离心1分钟，弃滤16 济南大学硕士学位论文液；⑥将制备管置回2ml离心管，加入700ulW2缓冲液（确认W2缓冲液溶液中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇），12,000×g离心1分钟，弃滤液；⑦重复上述步骤再清洗一次，确保盐分被完全清除，消除对后续实验的影响；⑧空转离心一次，12,000×g，1分钟；⑨将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加入25~30ul预热的洗脱液（Eluent），室温静置10分钟，12,000×g离心1分钟，洗脱DNA，弃制备管，保留离心管及洗脱下的DNA。ND800仪器检测DNA浓度，4˚C冰箱保存。方法（2）醋酸钠乙醇沉淀法：①向剩余的PCR扩增产物中加入2ul3M醋酸钠（NaAc）、50ul100%无水乙醇；②12,000×g，4˚C，离心35分钟，迅速倒转96孔板弃掉液体；③加入70ul70%乙醇，12,000×g，4˚C，离心17分钟，重复迅速倒转96孔板弃掉液体；④重复③步骤一次；⑤室温下挥发，至少2~3小时，加入10ul超纯水（ddH2O）溶解DNA。2.5.5.4PCR产物的测序PCR反应1）反应体系（见表2.3）表2.3反应体系（20ul）试剂体积ddH2O14.25ulBigDyeSeqBuffer(5×)3.75ulBigDye(2.5×)0.5ul纯化的PCR产物0.5ul引物(3.2pmol/uL)1.0ul总体积20ul注意：需将20mmol/L浓度的引物稀释成3.2mmol/L，即3.2pmol/ul备用。2）测序PCR反应条件：96˚C1分钟→(96˚C10秒→50˚C5秒→60˚C4分钟)×25个循环→4˚C保存。2.5.5.5测序产物纯化1）向每孔溶液中加入2ul125mMEDTA，2ul3M醋酸钠（NaAc），50ul无水乙醇，放17 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究在MicroporousQuickShakerQB-9001全自动震荡仪上室温振荡15分钟；2）12,000×g，4˚C，离心30分钟，迅速倒转96孔板将上清液倒掉；3）加入70ul70%酒精，12,000×g，4˚C，离心15分钟，迅速倒转96孔板上清液倒掉；4）重复步骤（3）一次；5）室温下挥发至少2~3小时后，加入10ulHi-DiFormamide溶解DNA；6）在PCR仪上变性：95˚C4分钟→4˚C4分钟→4℃∞；7）上机电泳测序。2.5.5.63500XL测序将获得的测序产物在ABI3500XL遗传分析仪上进行测序，步骤如下：1）开机前，将pop胶和正负极缓冲液溶液从4℃冰箱中取出，室温放置30分钟以上；2）更换pop胶，新胶不能晃动；3）打开电脑及3500XL测序软件，待电脑正常运行后打开3500XL测序仪，待指示灯变绿后按下TRAY键，推出四个液槽；4）打开仪器门，更换正负极缓冲液（每周一次）；5）将已转移好的cEQ样品板（防止出现气泡），置于A、B位置，编板后运行3500XL测序程序。2.5.5.7测序结果分析将测序仪测序得到的图形文件导出到包含序列读取软件Chromas软件的主机上，不同的碱基被Chromas软件标记为不同的颜色，红色表示碱基T，黑色表示碱基G，蓝色表示碱基C，绿色表示碱基A，粉色表示软件无法判读，需结合图形自行判定。1）当图形出现杂合双峰，测序图需要满足下述条件来确定其是否是突变：①与背景峰不同，杂合碱基两侧的序列比周围背景峰高，同时杂合碱基处有可辨别的单峰；②与纯合碱基的测序图区别，在杂合碱基的测序结果中，碱基峰会出现明显的下降趋势，同时，杂合碱基的两个峰较两种纯合子的峰均低。2）当发现插入、缺失的突变位点或片段时，需要对其进行外显子反向测序，如果外显子正反向测序突变结果一致，则可以确定此突变位点或片段的存在。3）确定某外显子有突变位点后，需排除其单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）。在正常人中扩增出该外显子，进行DNA直接测序，看该突变位18 济南大学硕士学位论文点的出现率，进而证实其是否为真正的突变位点。2.5.6统计分析所有数据采用SPSS软件包22.0版本分析。除了描述性数据，定量资料以均数（标准差）或百分比（频率）表示。携带/不携带IL36RN基因突变的患者临床表型两组间的差异比较，采用两独立样本T检验或非参数检验。定性资料采用Pearson’s卡方检验或Fisher’s精确检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。19 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究20 济南大学硕士学位论文第三章结果3.1基本临床资料107例GPP患者中包括31例单纯型GPP患者和76例GPP+PV患者，包括31例儿童型GPP患者和76例成人型GPP患者，GPP患者及各亚组患者的年龄、性别比例、发病年龄等基本情况如表3.1所示。表3.1107例GPP患者的基本资料性别年龄GPP发病年龄PV发病年龄种类例数男/女平均值±标准差平均值±标准差平均值±标准差GPP60/4735.31±18.0531.31±18.59--107单纯型GPP13/1831.19±2123.32±20.43--31GPP+PV47/2936.99±16.5734.57±16.8723.83±15.0776成人型GPP40/3643.57±13.8440.45±13.81--76儿童型GPP20/1115.06±8.778.9±3.82--31GPP，泛发性脓疱型银屑病；PV，寻常型银屑病；GPP+PV，GPP发病之前、之后或同时出现的寻常型银屑病症状；成人型GPP，GPP发病年龄≥18周岁；儿童型GPP，GPP发病年龄＜18周岁。3.2测序结果107例GPP患者中只有49例患者检测到罕见（突变率＜1%）或低频（突变频率介于1%和5%之间）错义突变，其中31例携带单一IL36RN基因突变（纯合或杂合），9例携带两个IL36RN基因突变（纯合或杂合），2例携带三个IL36RN基因突变，2例携带单一IL36RN基因突变（纯合/杂合）和1例携带两个IL36RN基因突变（纯合+杂合）的GPP患者分别还携带单个杂合CARD14基因突变，4例携带单个CARD14基因突变。（表3.2）。21 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究表3.2检测到突变位点患者的临床资料及相应的基因突变性年GPP发PV发病编号诱发因素IL36RN突变CARD14突变别龄病年龄年龄上呼吸道感c.115+6T>C纯合单纯型GPP1女476----染+p.Pro76Leu杂合单纯型GPP4女3724--压力c.115+6T>C纯合--单纯型GPP5男187--不详c.115+6T>C纯合--单纯型GPP7男158--药物p.Tyr89X杂合--c.115+6T>C杂合单纯型GPP9男2113--不详--+p.Asn47Ser杂合上呼吸道感单纯型GPP11女129--c.115+6T>C纯合--染单纯型GPP12女5958--不详p.Arg102Trp杂合--上呼吸道感单纯型GPP13男54--c.115+6T>C纯合--染上呼吸道感单纯型GPP16男52--c.115+6T>C纯合--染上呼吸道感单纯型GPP18女6045--c.115+6T>C纯合--染单纯型GPP20女3131--不详c.115+6T>C纯合--上呼吸道感单纯型GPP21男54--p.Asn47Ser杂合--染单纯型GPP23男1211--不详c.115+6T>C杂合--c.115+6T>C杂合单纯型GPP24女2014--不详--+p.Arg48Trp杂合c.115+6T>C杂合单纯型GPP25女4528--不详--+p.Pro76Leu杂合上呼吸道感单纯型GPP28女4343--c.115+6T>C纯合--染单纯型GPP29女2721--创伤刺激c.115+6T>C杂合--单纯型GPP30女7373--不详c.115+6T>C纯合--上呼吸道感单纯型GPP31男1010--p.Asn47Ser杂合--染c.115+6T>C杂合GPP+PV1男322419不详--+p.Arg48Trp杂合GPP+PV3女28276不详c.115+6T>C杂合--22 济南大学硕士学位论文（续表）3.2检测到突变位点患者的临床资料及相应的基因突变GPP+PV6男18116不详c.115+6T>C纯合c.1356+4C>T杂合上呼吸道感c.115+6T>C纯合GPP+PV7男1381--染+p.Pro76Leu杂合GPP+PV8女343424不详p.Asn47Ser杂合--妊娠,上呼c.115+6T>C纯合GPP+PV9女262111--吸道感染+p.Pro76Leu杂合c.115+6T>C杂合GPP+PV16男191211压力+p.Pro76Leu杂合--+p.Glu112Lys杂合上呼吸道感GPP+PV17男262510c.115+6T>C杂合--染上呼吸道感c.115+6T>C纯合GPP+PV19女333315--染,压力+p.Pro76Leu杂合GPP+PV20男323020不详p.Asn47Ser杂合--p.Arg10Gln杂合GPP+PV21女121110不详--+c.115+6T>C杂合GPP+PV23女620不详c.115+6T>C纯合--上呼吸道感GPP+PV26女141310p.Asn47Ser杂合--染上呼吸道感GPP+PV27女24228p.Leu78Pro杂合--染上呼吸道感GPP+PV35男474632p.Asn47Ser杂合--染p.Arg10Gln杂合GPP+PV36男17144不详+c.115+6T>C杂合--+p.Pro76Leu杂合GPP+PV41女605849不详p.Asn47Ser杂合--GPP+PV45男494931不详c.115+6T>C杂合--GPP+PV49男474616不详c.115+6T>C纯合--GPP+PV56男454444不详p.Asn47Ser杂合--GPP+PV57男737262不详c.115+6T>C杂合--GPP+PV58男242417不详c.115+6T>C杂合--GPP+PV60女464635季节改变c.115+6T>C纯合--23 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究（续表）3.2检测到突变位点患者的临床资料及相应的基因突变c.115+6T>C纯合GPP+PV64女373123妊娠p.Val758Met杂合+p.Pro76Leu杂合季节改变,GPP+PV66男666650p.Asn47Ser杂合p.Asp176His杂合压力,暴晒GPP+PV69女281817季节改变--p.Ala825Thr杂合GPP+PV70男434320不详--p.Asp176His杂合GPP+PV71男474715寒冷p.Asn47Ser杂合--GPP+PV72女565633不详--p.Asp176His杂合上呼吸道感GPP+PV76男292923--p.Asp176His杂合染GPP，泛发性脓疱型银屑病；PV，寻常型银屑病；单纯型GPP，只有GPP皮损；GPP+PV，GPP皮损合并GPP发病之前、之后或同时出现的寻常型银屑病皮损。3.2.1IL36RN基因测序结果通过对107例GPP患者进行IL36RN基因测序，共检测到9个罕见或低频非同义突变位点，包括c.115+6T>C/p.Arg10ArgX1，c.29G>A/p.Arg10Gln，c.140A>G/p.Asn47Ser,c.142C>T/p.Arg48Trp,c.227C>T/p.Pro76Leu,c.233T>C/p.Leu78Pro,c.304C>T/p.Arg102Trp,c.334G>A/p.Glu112Lys和c.267T>A/p.Tyr89X，其中p.Arg10Gln，p.Leu78Pro,p.Tyr89X从未报道过（图3.1）。9个检测到的突变点中，突变c.115+6T>C的突变率最高，突变率为29.9%（32例/107例），等位基因突变率为23.4%（50/214）。其次，突变p.Asn47Ser的突变率为10.3%（11例/107例），等位基因突变率为5.1%（11/214）。再次，突变p.Pro76Leu的突变率为7.5%（8例/107例），等位基因突变率为3.7%（8/214）。最后，突变p.Arg10Gln的突变率为1.9%（2例/107例），等位基因突变率0.9%（2/214）。其余突变都只在1例GPP患者中以杂合状态被检测到。我们共检测到45例患者携带IL36RN基因罕见/低频突变，其中33例患者只携带单一IL36RN基因突变，10例患者携带两个IL36RN基因复合突变，2例患者携带三个IL36RN基因复合突变（详见表3.2）。运用点突变预测程序SIFT、PolyPhen2、PROVEAN对3个新发现的少见突变进行了简单的功能预测，p.Tyr89X为终止突变，p.Leu78Pro突变位点呈现可致破坏性，p.Arg10Gln突变为剪切点附近突变呈现可耐受性(表3.3)。24 济南大学硕士学位论文a.p.Arg10Gln杂合突变b.p.Leu78Pro杂合突变c.p.Tyr89X杂合突变图3.1样本中检测到的IL36RN基因新的突变位点3.2.2CARD14基因测序结果通过对107例GPP患者进行CARD14基因测序，共检测到4个罕见或低频非同义突变位点，包括c.1356+4C>T,c.2272G>A/p.Val758Met,c.2473G>A/p.Ala825Thr和c.526G>C/p.Asp176His(rs144475004)。其中c.1356+4C>T,p.Val758Met和p.Ala825Thr是新发现的3个罕见突变（图3.2），突变p.Asp176His是已经被报道的低频突变，以杂合状态在4个GPP+PV患者中检测到，突变频率为3.7%（4例/107例），等位基因频率为1.9%（4/214）。3个新发现的突变分别以杂合状态在1个GPP+PV患者中检测到。运用点突变预测程序SIFT、PolyPhen2、PROVEAN对3个新发现的少见突变进行了简单的功能预测，c.1356+4C>T为剪切点附近突变，突变点p.Val758Met被PolyPhen2认定为可能至破坏性突变，被SIFT、PROVEAN认定为可耐受性突变。突变点p.Ala825Thr被SIFT、PolyPhen2、PROVEAN均认定为可耐受性突变（表3.3）。另外，我们还发现了3个已经报道的SNP位点，包括：p.Arg547Ser(rs2066964),p.Val585Ile(rs34367357),p.Arg820Trp(rs1165207)。a.c.1356+4C>T杂合突变b.p.Val758Met杂合突变c.p.Ala825Thr杂合突变图3.2样本中检测到的CARD14基因新的突变位点25 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究表3.3IL36RN、CARDl4基因新发少见突变特征分析外显功能致病预测基因突变突变类型子区域SIFTPolyPhen2PROVEANtoleratedprobablydamagingneutral2p.Arg10Gln错义突变IL1(0.35)(0.919)(-0.175)IL36RNdamagingprobablydamagingdeleterious4p.Leu78Pro错义突变IL1(0)(0.999)(-6.586)5p.Tyr89X终止突变IL1NANANA剪切位点9c.1356+4C>TnoneNANANA区域突变toleratedpossiblydamagingneutralCARD1416p.Val758Met错义突变none(0.1)(0.501)(-0.268)toleratedneutral18p.Ala825Thr错义突变GUKbenign(0.037)(0.73)(-0.253)3.2.3AP1S3基因测序结果对107例GPP患者进行AP1S3基因测序，未发现任何少见突变、低频突变及SNP位点。3.3GPP患者的IL36RN、CARD14基因突变率分析为了进一步研究中国种群GPP患者IL36RN、CARD14基因突变率情况，以及上述两个基因突变在单纯型GPP和GPP+PV患者之间是否存在遗传异质性，我们整合本研究与我们团队之前的IL36RN、CARD14基因的测序数据[20,27]，包括62例GPP患者（17例单纯型GPP患者以及45例GPP+PV患者），174例PV患者以及461例正常对照（96例IL36RN基因测序患者以及365例CARD14基因测序患者）。本研究107例GPP患者，包括31例单纯型GPP患者以及76例GPP+PV患者。合并之后共169例GPP患者，包括48例单纯型GPP患者和121例GPP+PV患者。利用SPSS22.0统计分析软件对病例组、对照组、病例组各组别之间的IL36RN、CARD14基因的罕见突变（等位基因频率＜1%）和低频突变（等位基因频率介于1%和5%之间）的频率差异进行了统计分析比较。3.3.1GPP患者的IL36RN基因突变率分析本研究中107例GPP患者的IL36RN基因的突变率为42.1%（45例/107例），其中26 济南大学硕士学位论文31例单纯型GPP患者IL36RN基因突变率为61.3%（19例/31例），76例GPP+PV患者IL36RN基因突变率为34.2%（26例/76例）。综合我们之前研究的62例GPP的IL36RN基因突变数据[20]，共169例GPP患者IL36RN基因总的突变率为43.8%（74例/169例），其中48例单纯型GPP患者IL36RN基因突变率为64.6%（31例/48例），121例GPP+PV患者IL36RN基因突变率为35.5%（43/121）。GPP组（169例）与正常对照组，GPP组（169例）与PV组的IL36RN基因突变率比较分析发现，差异皆具有统计学意义（P值分别为1.58×10-10和3.26×10-15），单纯型GPP患者IL36RN基因突变率明显高于GPP+PV患者（P=5.99×10-05，详细见表3.4）。表3.4IL36RN基因突变的突变率分析GPP正常基因型GPP合计PV单纯型GPPGPP+PV对照AA17789516290Aa122738126aa19163600合计4812116917496突变率（%）64.5835.5443.796.906.25P4.29E-142.98E-071.58E-100.84--P(单纯型GPP5.99E-05vs.GPP+PV)P(GPPvs.PV)3.26E-15GPP，泛发性脓疱型银屑病；PV，寻常型银屑病；单纯型GPP，只有GPP皮损；GPP+PV，GPP皮损合并GPP发病之前、之后或同时出现的寻常型银屑病皮损；AA，无突变；Aa，杂合突变；aa，纯合突变。107例GPP患者中共发现9个错义突变，32例检测到了c.115+6T>C突变，突变频率达到29.9%。统计全部169例GPP患者，c.115+6T>C突变的突变频率为33.1%（56例/169例）。比较分析GPP组和正常对照，GPP组和PV组c.115+6T>C突变的突变频率发现差异均有统计学意义（P值分别为9.86×10-10，5.66×10-14），单纯型GPP患者c.115+6T>C突变的突变率明显高于GPP+PV患者（P=5.80×10-05，详见表3.5）。其余的8个突变位点的突变频率在GPP组和正常对照组，GPP组和PV组，单纯型GPP组和GPP+PV组之间差异均没有统计学意义(P>0.05，详细数据表格未列出)。另外，我们分析比较了9个突变点在107例GPP患者中和在ExAC网站中查询到的东亚人群正常对照的突变率。结果发现，突变点p.Asn47Ser和突变点p.Arg102Trp在GPP患者中的突变率与正常对照突变率无显著差异，其余突变点在GPP患者中的突变率皆明显高于正常对照中的突变率（详见表3.6）。27 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究表3.5c.115+6T>C/p.Arg10ArgXl突变的突变率分析GPP正常基因型GPP合计PV单纯型GPPGPP+PV对照AA219211317095Aa8152341aa19143300合计4812116917496突变率（%）56.2523.9733.142.301.04P3.00E-151.00E-069.86E-100.79--P(单纯型GPP5.80E-05vs.GPP+PV)P(GPPvs.PV)5.66E-14GPP，泛发性脓疱型银屑病；PV，寻常型银屑病；单纯型GPP，只有GPP皮损；GPP+PV，GPP皮损合并GPP发病之前、之后或同时出现的寻常型银屑病皮损；AA，无突变；Aa，杂合突变；aa，纯合突变。表3.6IL36RN、CARD14基因各突变点的突变率分析GPP正常对照基因突变P(n=107)（人数）c.29G>A/p.Arg10Gln1.9%0(4326)0.001c.115+6T>C/29.9%2.7%(4302)7.38E-23p.Arg10ArgX1c.140A>G/p.Asn47Ser5.1%10.6%(4311)0.921c.142C>T/p.Arg48Trp1.9%0%(4316)0.001IL36RNc.227C>T/p.Pro76Leu7.5%0%(4320)8.96E-14c.233T>C/p.Leu78Pro0.9%----c.267T>A/p.Tyr89X0.9%----c.304C>T/p.Arg102Trp0.9%0%(4323)0.024c.334G>A/p.Glu112Lys0.9%0%(4315)0.024c.1356+4C>T0.9%0%(4292)0.024c.526G>C/p.Asp176His3.7%3.9%(2050)1CARD14c.2272G>A/p.Val758Met0.9%0%(5285)0.020c.2473G>A/p.Ala825Thr0.9%0%(1169)0.0843.3.2GPP患者的CARD14基因突变率分析本研究中107例GPP患者的CARD14基因突变率为6.54%（7例/107例），其中76例GPP+PV患者CARD14基因突变率为9.21%（7例/76例）。综合我们之前研究的62例GPP的CARD14基因突变数据[27]，共169例GPP患者总的突变率为7.10%（12例/169例），其中121例CARD14基因的突变率为9.92%（12例/121例）。所有单纯型GPP患者中均未检测到CARD14基因突变。GPP组（169例）与正常对照组，GPP组与PV组28 济南大学硕士学位论文的CARD14基因突变率比较分析发现，差异皆没有统计学意义（P值分别为0.07和0.46，见表3.7）。GPP+PV组CARD14基因突变率显著高于正常对照组和单纯型GPP组的突变率（P值分别为0.01和0.02），但与PV组的突变率比较差异并无统计学意义（P=0.119，见表3.7）。分析比较发现突变点p.Asp176His和p.Ala825Thr在107例GPP患者中的突变率和在ExAC网站中查询到的东亚人群正常对照的突变率差异并无统计学意义，但突变点c.1356+4C>T和p.Val758Met在107例GPP患者中的突变率明显高于ExAC网站中查询到的东亚人群正常对照的突变率（详见表3.6）。表3.7CARD14基因突变的突变率分析GPPGPP正常基因型PV单纯型GPPGPP+PV合计对照AA48109165157352Aa01291213aa00000合计48121174169365突变率（%）09.925.177.13.56P0.380.010.380.07--P(单纯型GPPvs.0.02GPP+PV)P(GPPvs.PV)0.46P(GPP+PVvs.PV)0.119GPP，泛发性脓疱型银屑病；PV，寻常型银屑病；单纯型GPP，只有GPP皮损；GPP+PV，GPP皮损合并GPP发病之前、之后或同时出现的寻常型银屑病皮损；AA，无突变；Aa，杂合突变；aa，纯合突变。3.4GPP患者的临床表型-IL36RN基因型关联分析根据IL36RN基因的突变型将107例GPP患者分为三种亚型：A.不携带IL36RN基因突变的GPP患者，共62例；B.携带单一IL36RN基因突变的GPP患者，共33例；C.携带复合IL36RN基因突变的GPP患者，共12例。所有GPP患者的临床流行病特点见表3.8，利用2×2四格表x2检验和Fisher’s精确检验的分析方法分别比较不携带IL36RN基因突变的GPP组（A）与携带IL36RN基因突变的GPP组（B+C），携带单一IL36RN基因突变组（B）与复合IL36RN基因突变组（C）的临床表型发生率是否有差异，详细分析见表3.8。本研究属于单中心研究，所有GPP患者皆来自山东省或周边地区。患者的平均年龄为35.31±18.05岁，统计分析发现携带/不携带IL36RN基因突变组（Avs.B+C）、携29 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究带单一/复合IL36RN基因突变组（Bvs.C）的年龄组间比较无统计学差异（P值分别为0.13和0.203）。107例GPP患者男女比例为1.28：1，男性患者多余女性，但携带/不携带IL36RN基因突变（Avs.B+C）、携带单一/复合IL36RN基因突变的情况（Bvs.C）性别偏向的组间比较统计无差异（P值分别为0.378和0.445）。107例GPP患者的平均GPP发病年龄为31.31±18.59岁，统计分析结果显示，携带IL36RN基因突变的GPP患者的平均发病年龄（27.8±20.31岁）明显低于不携带IL36RN基因突变的患者的平均发病年龄（34.51±17.43岁，P=0.024），携带复合IL36RN基因突变的GPP患者的平均发病年龄（17.92±9.17岁）虽然低于携带单一IL36RN基因突变的GPP患者的平均发病年龄（30.67±21.3岁），但差异并无统计学意义（P=0.143）。107例GPP患者最常见的诱发因素为上呼吸道感染，占所有患者的32.7%（35例/107例）。其余诱发因素包括季节改变、妊娠、暴晒、外伤、手术、药物等。107例GPP患者中只有20.6%的患者有明确的银屑病家族史，且携带/不携带IL36RN基因突变组（Avs.B+C）、携带单一/复合IL36RN基因突变组（Bvs.C）组间比较并无差异（P值分别为0.115和1）。大约50%的患者病情反复发作（发作次数＞2次），统计分析发现携带IL36RN基因突变的患者比不携带IL36RN基因突变的GPP患者更易再次发作，且共12例携带复合IL36RN基因突变的GPP患者中11例患者病情曾反复发作，再次发病率明显高于携带单一IL36RN基因突变患者和不携带IL36RN基因突变患者（P值分别为0.014和0.001）。另外，大部分的GPP患者都曾伴发系统性炎症（体温＞38℃，白细胞计数＞12×109/L），但携带/不携带IL36RN基因突变组（Avs.B+C）、携带单一/复合IL36RN基因突变组（Bvs.C）组间比较统计发现并无统计学意义（P值分别为0.333和0.079）。另外，我们还分析了三组合并PV及PSA临床表现的发生率之间的区别，发现IL36RN基因突变与GPP患者是否合并PSA症状无关，且携带复合IL36RN基因突变的GPP患者合并PV症状的概率与单一IL36RN基因突变的GPP患者合并PV症状的概率间比较无统计学意义（P>0.05），但携带IL36RN基因的GPP患者伴发PV症状的概率明显低于不携带IL36RN基因突变的GPP患者（P＜0.05）。30 济南大学硕士学位论文表3.8所有GPP患者的临床表型与IL36RN基因型关联特点P(A无IL36RN突变的单一IL36RN突变的复合IL36RN突变P(B临床表型vs.GPP(A)GPP(B)的GPP(C)vs.C)B+C)年龄（平均值±标准差）38.03±17.1533.27±20.6126.83±11.890.2030.13性别（男）37(59.7%)18(54.5%)5(41.7%)0.4450.378反复发作（人）24(38.7%)17(27.4%)11(91.7%)0.0140.016GPP发病年龄（平均值±标准差）34.51±17.4330.67±21.317.92±9.170.1430.024诱发因素感染20(32.3%)感染6(18.2%)感染2(16.7%)压力6(9.7%)压力3(9.1%)压力2(16.7%)季节改变6(9.7%)季节改变2(6.1%)妊娠2(16.7%)妊娠4(6.5%)应激1(3.0%)季节改变1(8.3%)应激4(6.5%)药物1(3.0%)酒精2(3.2%)暴晒1(3.0%)暴晒1(1.6%)药物1(1.6%)家族史16(25.8%)4(6.5%)2(16.7%)10.115伴系统性炎症43(69.4%)23(69.7%)12(100%)0.0790.333合并PV50(80.6%)18(29.0%)8(66.7%)0.4670.01合并PSA6(9.7%)1(3.0%)0(0.0)10.253GPP，泛发性脓疱型银屑病；PV，寻常型银屑病；PSA，关节型银屑病。31 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究32 济南大学硕士学位论文第四章讨论GPP作为一种少见的危及生命的，临床以突然发生并反复出现的可泛发全身的红斑基础上粟粒大小的无菌性脓疱为特点，并伴有高热及全身不适的系统性炎症性疾病。迄今为止已被证明与多种基因的突变有关。最早，Marrakchi等[12]报道了9个来自突尼斯的家族性GPP携带IL36RN基因纯合突变p.Leu27Pro，并提出了该病属于常染色体隐形遗传病的观点。随后，多个不同国家的学者报道了多个种群的GPP患者携带不同的IL36RN基因突变[7,8,16-19,30,31]。至此，IL36RN基因突变引起的DITRA被证明与GPP的发病机制密切相关。2012年，Jordan等[25]提出CARD14基因位于PSORS2区域，与银屑病的发病相关。随后，又有多个研究证明CARD14基因突变与银屑病的发病相关[32-35]。并且，Jordan等[25]在1例欧洲散发的儿童型GPP患儿全血DNA中检测到一处新的罕见的CARD14基因错义突变。随后，Sugiura等[26]和Berki等[36]研究表明CARD14基因p.Asp176His突变的突变率在GPP患者或GPP+PV患者中明显高于正常对照，认为Asp176His突变与GPP或GPP+PV的发病有关。由此，作为银屑病发病相关基因，CARD14基因的突变被认为与GPP或GPP+PV的发病相关。2014年，Setta-Kaffetzi等[29]通过全外显子测序在4例ACH患者（其中2例合并GPP）的全血DNA中检测到AP1S3基因突变。IL36RN基因编码的IL-1家族成员IL-36Ra负责拮抗炎症因子IL-36α、IL-36β以及IL36γ，进而抑制促炎症信号通路（NF-κB等介导的信号转导通路）。CARD14基因编码的CARD14蛋白是促炎症信号通路（NF-κB等介导的信号转导通路）的激活因子。AP1S3基因编码AP1蛋白σ1亚单位的异构体σ1C，该蛋白主要在角质形成细胞内表达，通过调节IL-36炎症因子的转录抑制促炎症信号通路（NF-κB等介导的信号转导通路）。AP1S3基因突变导致TOLL样受体3的运输中断，影响固有免疫反应以及细胞自噬，二者皆使IL-36炎症因子表达上调，从而激活NF-κB等介导的信号转导通路[28]。IL36RN基因和AP1S3基因突变使编码蛋白功能缺失（loss-of-function），但CARD14基因突变使CARD14蛋白的功能增益（gain-of-function）。三个基因的突变通过不同的调节方式使NF-κB等介导的信号转导通路激活，最终导致脓疱型银屑病以及相关的脓疱性皮肤病的发病[37]。2017年，Mossner等[38]通过对325例欧洲种群脓疱性皮肤病患者（包括258例PPP33 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究患者，61例GPP患者，2例急性泛发性发疹型脓疱病患者和4例ACH患者）进行IL36RN、CARD14和AP1S3三个基因测序并综合分析，发现大部分的欧洲GPP患者（63.9%，39例）不携带任何以上三个基因的突变，大部分欧洲GPP患者的遗传学发病机制不能通过IL36RN、CARD14和AP1S3三个基因解释。本研究通过对107例中国汉族GPP患者的IL36RN、CARD14和AP1S3基因三个进行直接测序，我们发现只有45.8%（49例）的中国GPP患者携带以上三个基因突变，突变率与欧洲GPP患者比较并无统计学差异（P=0.220）。并且，大部分患者（54.2%，58例）不携带以上三个致病基因突变，这与欧洲GPP患者的研究结果不谋而合。Setta-Kaffetzi等[29]、Mahil等[28]和Mossner等[38]已对共约170例欧洲或亚洲（马来西亚、叙利亚等）种群GPP患者进行了AP1S3基因测序，其中欧洲种群AP1S3基因突变率大约为2.41%，但AP1S3基因突变仅在极少数马来西亚或叙利亚人中被检测到。我们在107例中国种群GPP患者中未检测到任何AP1S3基因罕见、低频及SNP位点突变，从而证明AP1S3基因突变的致病性具有种族差异，与亚洲种群GPP的发病不相关。我们的研究共发现了三个未报道过的IL36RN基因错义突变，即c.29G>A/p.Arg10Gln、c.233T>C/p.Leu78Pro、c.267T>A/p.Tyr89X。突变点p.Arg10Gln在2例GPP患者检测到，被SIFT、PROVEAN功能预测认定为可耐受性错义突变，但被PolyPhen2功能预测认定为很可能致病性突变，且其在GPP患者中的突变率明显高于东亚人群正常对照中的突变率。由此，我们认为该突变点不能排除具有潜在致病可能。突变点p.Leu78Pro只在1例GPP+PV患者中检测到，其功能预测被SIFT、PROVEAN认定为可致破环性错义突变位点，被PolyPhen2认定为很可能致破坏性突变，因此我们认为该突变点具有潜在致病可能。突变点p.Tyr89X为终止错义突变位点，在1例单纯型GPP患者中检测到，这例患者曾多次发病，病情较重，药物可诱发发病，曾被误诊为急性泛发性发疹型脓疱病，我们认为该患者病情可能与此致病突变有关。但该突变导致IL36RN表达的具体机制还有待研究。另外，本研究还发现了曾在欧洲人群中报道过[19]，但无亚洲GPP患者报道的突变点c.142C>T/p.Arg48Trp，共有2例GPP检测到此位点突变，1例为单纯型GPP患者，1例为GPP+PV患者。其余几个突变，c.115+6T>C,p.Asn47Ser,p.Pro76Leu,p.Arg102Trp和p.Glu112Lys在中国和日本种群的研究中均被报道过，突变频率与我们的结果类[8,17,21,39]。研究结果证实，在所发现的突变中c.115+6T>C的突变率最高。突变点c.115+6T>C位于IL36RN基因3号外显子下游的内含子区域，Shiratori等[40]研究发现，突变影响3号和4号外显子的拼接，从而导致4号外显子不能发生转录34 济南大学硕士学位论文和翻译，进而影响IL36Rα蛋白的表达。107例中国汉族GPP患者中，11例GPP患者携带IL36RN基因复合突变，值得注意的是，我们发现2例GPP患者同时携带三个IL36RN基因突变，这是迄今为止发现的最多的突变个数[30]。我们的研究共发现了三个未报道过的CARD14基因错义突变，即突变点c.1356+4C>T,p.Val758Met和p.Ala825Thr。三个突变点均是杂合状态下，各在1例GPP+PV患者中检测到。突变点c.1356+4C>T为内含子区域剪切点附近突变，该突变点在GPP患者中的突变率明显高于东亚人群正常对照中的突变率，我们认为该突变点可能影响CARD14蛋白的表达，但具体机制不详。突变点p.Val758Met被PolyPhen2功能预测认定为可能至破坏性突变，被SIFT、PROVEAN功能预测认定为可耐受性突变，而且该突变点在GPP患者中的突变率明显高于东亚人群正常对照中的突变率。由此，我们认为该突变点存在潜在致病可能，但其致病机制有待继续研究。突变点p.Ala825Thr被SIFT、PolyPhen2、PROVEAN均认定为可耐受性突变，且该突变点在GPP患者中与东亚正常对照中的突变率比较差异无显著差异，但由于东亚正常对照样本量的限制，我们认为不能完全排除该突变点存在致病可能。另外，突变点p.Asp176His被认为是亚洲（日本和中国）种群GPP的致病突变位点[36]，并且在日本种群GPP+PV患者中的突变率高达21%[26]。但我们的研究并未验证此观点，分析比较107例GPP患者与东亚人群2,050例正常对照突变点p.Asp176His的突变率发现，二者并无差异（P=1，表3.6）。并且，突变点p.Asp176His在GPP+PV中的突变率仅为4.96%（6例/121例），明显低于日本人群GPP+PV的突变率（P=0.03）。由此，我们认为突变点p.Asp176His在GPP发病机制中的致病影响有待继续研究验证。根据是否合并PV症状，GPP可分为两种类型：单纯型GPP和GPP+PV。单纯型GPP通常起病较急，儿童多见，病情更易反复发作，高热、乏力等全身症状较明显。而GPP+PV通常发病缓慢，常由在银屑病治疗过程中突然停用糖皮质激素引起脓疱泛发全身，成人多见，脓疱消退后不易复发，高热、乏力等全身症状常不明显。这两种类型是同属于GPP的不同亚型还是属于截然不同的两种疾病谱，至今仍存在争议。2013年，Sugiura等[7]首次提出在日本种群中这两种类型表现出IL36RN基因的遗传异质性，单纯型GPP患者携带IL36RN基因的突变率（81.8%）明显高于GPP+PV患者的突变率（15%）。我们之前的研究[20]和本次研究在中国人群中两次证实了此观点。2014年，Sugiura等[26]再次提出了CARD14基因p.Asp176His突变点在GPP+PV患者中和单纯型GPP患者中存在遗传异质性，p.Asp176His突变点只在GPP+PV患者中检测到，突变率35 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究高达21.1%。但综合我们两次研究结果，p.Asp176His突变点只在6例GPP+PV患者中检测到，突变率（4.96%）虽然高于单纯型GPP患者的突变率（0%），但比较分析并无统计学差异（P=0.185）。我们统计两次研究结果得到的CARD14基因测序数据，发现所有的罕见、低频CARD14基因突变均发生在GPP+PV患者中，突变率为9.9%明显高于单纯型GPP患者（0%）和正常对照（3.56%）的CARD14基因的突变率（P值分别为0.02和0.01），但与PV组中CARD14基因的突变率无差异（P=0.119,表3.7）。由此，我们认为CARD14基因突变与GPP+PV及PV，即PV相关的银屑病的发病相关。从而首次在遗传学上为GPP+PV是PV严重的表现型提供了证据。进而，也证明了单纯型GPP与GPP+PV存在CARD14基因遗传异质性。Hussain等[9]分析了233例已报道的GPP患者的基因型-表型的关联发现，携带IL36RN基因突变的GPP患者的病情更严重（发病年龄更小，更易发生系统性炎症表现），更易伴发PV症状；携带IL36RN基因突变点的个数与GPP患者是否发生系统性炎症无关，但与GPP患者的发病年龄相关，携带IL36RN基因突变点的个数越多，GPP患者的平均发病年龄越低。Mossner等[38]对61例欧洲GPP患者进行IL36RN基因型-表型分析发现随着GPP患者携带IL36RN基因突变的个数的增加，患者的GPP平均发病年龄也更低。为了在中国种群中验证以上观点，我们收集了107例GPP患者的详细临床资料，分析发现与上述研究结果相同，IL36RN基因突变型与GPP患者GPP临床表型明显相关。随着携带IL36RN基因突变的个数的增加，GPP平均发病年龄呈反向变化。但出于GPP患者样本量的限制，携带单一/复合IL36RN基因突变的GPP患者发病年龄间比较并无差异。同时，携带IL36RN基因突变的状态（有/无，携带单个/多个）与GPP患者的复发情况相关。携带IL36RN基因突变的GPP患者较非携带IL36RN基因突变的患者病情更易反复发作，携带IL36RN基因复合突变的GPP患者较携带单一IL36RN基因突变的患者病情更易反复发作。携带IL36RN基因突变的状态（有/无，携带单个/多个）与GPP患者伴发系统性炎症可能相关。携带IL36RN基因突变的个数越多，伴发系统性炎症的GPP患者概率越高，但比较无统计学意义，需进一步扩大样本量研究。另外，与Hussain等[9]的研究结果相同，GPP患者是否伴发PV的临床表型与GPP患者是否携带IL36RN基因突变有关，与携带IL36RN基因突变的个数不同。其余临床表型与IL36RN基因突变型分析并无关联。36 济南大学硕士学位论文第五章总结与展望本研究通过对107例中国汉族GPP患者进行IL36RN、CARD14和AP1S3基因直接测序，发现仍有大部分患者不携带任何基因突变，并且107例中国汉族GPP患者不携带任何AP1S3基因突变。这表明大部分GPP患者的发病机制不能通过迄今发现的三个GPP致病基因解释，并且AP1S3基因突变与中国或亚洲GPP患者的发病无关。上述结论与Mössner等[38]研究结果相似。本研究中，我们共发现了3个未报道IL36RN基因突变和3个未报道CARD14基因突变。从突变率及功能预测两方面分析了所有突变点的致病可能。综合之前的研究结果[20,27]，我们分析发现单纯型GPP和GPP+PV两组具有IL36RN基因和CARD14基因遗传异质性。单纯型GPP患者较GPP+PV患者具有更高的IL36RN基因突变率，且具有更低的CARD14基因突变率。另外，IL36RN基因突变型GPP患者较IL36RN基因非突变型患者表现出更严重的GPP临床表型，GPP平均发病年龄更低，病情更易反复发作，伴发系统性炎症的概率更高（但统计分析无差异）。携带复合IL36RN基因突变的GPP患者较携带单一IL36RN基因突变的GPP患者病情更易反复发作，GPP发病年龄更低（差异无统计学意义），伴发系统性炎症的概率更高（但统计分析无差异）。目前越来越多的遗传学证据表明，GPP是一种多基因控制的常染色体隐性遗传病。目前已发现IL36RN基因、CARD14基因以及AP1S3基因突变与GPP的发病相关，这些发现为GPP疾病的诊断、发病机制的阐明、发病风险的预测以及基因靶向治疗奠定了遗传学基础。虽然目前对于GPP疾病的发生机制研究已深入到基因测序阶段，但是仍有大部分患者的GPP发病不能通过上述三个基因解释，所以可能还存在某些遗传或其他因素与GPP的发病相关，确切的发病机制仍需进一步研究探索。进一步的研究需要建立成熟的GPP疾病动物模型，充分的对GPP疾病的发生发展深入研究。虽然GPP患者与PV患者/正常对照的遗传易感基因存在异质性，但IL36RN基因、CARD14基因以及AP1S3基因突变也在PV患者或正常对照中表达的原因还需要进一步研究。进一步地，不同基因的突变间是否存在某种关联？仍需后续实验深入揭示。我们的研究同样证明了单纯型GPP和GPP+PV亚组间存在IL36RN基因、CARD14基因的遗传异质性，但由于患者基因突变率较低，并且存在种族差异，全球范围内多中心不同种族的合作项目研究将成为今后的发展趋势。另外，本次研究中首次提出了CARD14基因为中国种群GPP37 中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究+PV患者发病的易感基因，并通过CARD14基因突变率分析证明PV与GPP+PV具有相似的遗传学背景，并且明显不同于单纯型GPP，从另一角度阐述了单纯型GPP与GPP+PV为不同疾病的观点。即使如此，由于CARD14基因突变率较低，我们的研究样本量较小，未开展基因突变功能研究，所以仍需后续研究。我们的研究还分析了IL36RN基因突变型与GPP患者临床表型之间的关联，初步认为IL36RN基因突变型与GPP患者临床表现的严重程度相关，IL36RN基因突变型GPP患者的病情较IL36RN基因非突变型患者更重，具有发病年龄更小，更易复发等特点。但由于临床资料的不足，更多更细致的临床表现、治疗以及预后未被纳入，导致分析结果的不全面不准确。我国GPP患者众多，通过大样本高通量测序（全基因组测序和外显子测序）可以帮助理清中国种群GPP疾病发病的遗传模式，甚至找到新的致病基因，从而进一步了解GPP发病机制。通过采集详细的临床资料，进行患者基因型-表型乃至治疗的关联分析，从分子遗传学角度深入，为进一步GPP的遗传咨询、产前诊断、疾病的预防及治疗，以及药物的研发奠定基础。38 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中国汉族人群泛发性脓疱型银屑病与IL36RN、CARD14、AP1S3基因相关性研究附录一、在校期间发表的学术论文[1]LuluLi,JiabaoYou,Xi’anFu,etal.((majorrevission).VariantsofCARD14arepredisposingfactorsforgeneralizedpustularpsoriasis(GPP)withpsoriasisvulgarisbutnotforGPPaloneinaChinesepopulation,BritishJournalofDermatology,IF：4.706.[2]李璐璐,陈声利,吴梅.儿童获得性Blaschko皮炎1例[J].中国皮肤性病学杂志,2017(11):1242-1243.[3]李璐璐,尤家宝,付希安等.AP1S3基因突变与泛发性脓疱型银屑病的相关性研究[J].中国麻风皮肤病杂志,2018,(3):131-134.[4]李璐璐,孙勇虎,刘红等.锌指蛋白结构域MIZ-1型包含蛋白基因研究进展[J].中国麻风皮肤病学杂志,2018,(8).[5]WangH,WangZ,RaniPL,FuX,YuW,BaoF,YuG,LiJ,LiL,SunL,YueZ,ZhaoQ,PanQ,CaoJ,WangC,ChiX,WangY,YangQ,MiZ,LiuH,ZhangF.IdentificationofPTPN22,ST6GAL1andJAZF1aspsoriasisriskgenesdemonstratessharedpathogenesisbetweenpsoriasisanddiabetes.ExpDermatol.2017Nov;26(11):1112-1117.（IF=2.532）[6]WangN,WangZ,WangC,FuX,YuG,YueZ,LiuT,ZhangH,LiL,ChenM,WangH,NiuG,LiuD,ZhangM,XuY,ZhangY,LiJ,LiZ,YouJ,ChuT,LiF,LiuD,LiuH,ZhangF.(majorrevission).PredictingofleprosyinChinesepopulationbasedonaweightedgeneticriskscore，PLOSNeglectedTropicalDiseases,IF:3.834.二、在校期间获奖情况1.2015年-2016年优秀研究生三等奖2.2015年-2016年社会工作先进个人奖44 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