《先天性巨结肠疾病相关基因PTPRR维持肠神经前体细胞多能性的作用及机制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号R725.7UDC616密级公开先天性巨结肠疾病相关基因PTPRR维持肠神经前体细胞多能性的作用及机制田姣培养类别全日制学位类型专业学位一级学科(专业类)临床医学二级学科(专业)儿科学研究方向消化系统疾病指导教师江逊副教授（主任医师）培养单位唐都医院儿科二O一七年五月 第四军医大学博士学位论文目录缩略语表·······························································································1中文摘要·······························································································3英文摘要·······························································································6前言·····································································································9文献回顾······························································································10正文····································································································33第一部分先天性巨结肠患者结肠组织差异基因的筛选及人群验证···················331材料····························································································332方法····························································································353结果····························································································434讨论····························································································51第二部分PTPRR在HSCR患者不同肠段结肠组织或神经前体细胞中的表达特点及意义··································································································531材料····························································································532方法····························································································573结果····························································································624讨论····························································································75第三部分PTPRR对肠神经前体细胞生物学行为调控的作用及机制·················781材料····························································································782方法····························································································813结果····························································································844讨论·····························································································97小结··································································································101参考文献····························································································103个人简历和研究成果·············································································113致谢··································································································115 第四军医大学博士学位论文缩略语表缩略词英文全称中文全称bFGFbasicfibroblastgrowthfactor基础型成纤维生长因子BMP2Bonemorphogeneticprotein2骨形态发生蛋白2CNSCentralnervoussystem中枢神经系统DABDiaminobenzidine二氨基联苯胺DAPI4,6-diamino-2-phenylindole4',6-二脒基-2-苯基吲哚DMEMDulbeccomodifiedEaglemediumDulbecco改进Eagle培养液EDN3Endothelin3内皮素3EDNRBEndothelinreceptortypeB内皮素受体BEdU5-ethynyl-2’-deoxyuridine5-乙炔基-2'-脱氧尿苷ENCCEntericNeuralcrestcell肠神经嵴细胞ENSEntericnervoussystem肠神经系统ERKextracellularsignal-regulatedkinase细胞外信号调节激酶GDNFGlialcell-linederivedneurotrophicfactor胶质细胞源性神经营养因子GFAPGlialfibrillaryacidicprotein神经胶质酸性蛋白GFRa-1Glialcellline-derivedneurotrophicfactor胶质细胞源性神经营养因receptoralpha-1子受体alpha-1GIGastrointestine胃肠道HMGHighmobilitygroup高迁移率族HSCRHirschsprung’sdisease先天性巨结肠症ICCImmunocytochemistry免疫细胞化学IHCImmunohistochemistry免疫组织化学-1- 第四军医大学博士学位论文缩略词英文全称中文全称JNKc-JunN-terminalkinasec-Jun氨基末端激酶KIMkinaseinteractionmotif激酶相互作用区域L1CAML1CellAdhesionMolecular细胞粘附分子L1MAPKMitogenActivatedProteinKinase丝裂原活化蛋白激酶NBNeuroblastoma神经母细胞瘤NCAMNeuralcelladhesionmolecules神经细胞粘附分子NCCNeuralcrestcell神经嵴细胞NGFNervegrowthfactor神经营养因子NRG1Neuregulin-1神经调节蛋白-1PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction多聚酶链反应PGP9.5Proteingeneproduct9.5蛋白基因产物9.5PNSperipheralnervoussystem外周神经系统PTPsProteintyrosinephosphatases蛋白酪氨酸磷酸酶PTPRRProteintyrosinephosphatase蛋白酪氨酸磷酸化酶R受体型receptor-typeR型RETRearrangedduringtransfection原癌基因RETRT-qPCRReal-timeQuantitativePolymeraseChain实时荧光定量PCRReactionRNAiRNAinterferenceRNA干扰siRNAsmallinterferingRNA小干扰RNASMASmoothmuscleactin平滑肌肌动蛋白Sox10Sry-relatedhighmobilitygroupbox10性别决定区Y基因相关高可变区基因10TUJ1NeuronspecificclassIIIbetatubulin神经元特异性βIII微管蛋白-2- 第四军医大学博士学位论文先天性巨结肠疾病相关基因PTPRR维持肠神经前体细胞多能性的作用及机制博士研究生：田姣导师：江逊副教授辅导教师：舒震博士后第四军医大学唐都医院儿科，西安710032资助基金项目：国家自然科学基金（81170331）中文摘要【研究目的】先天性巨结肠症（Hirschsprung’sdisease，HSCR）是最常见的肠神经系统（Entericnervoussystem，ENS）发育障碍性疾病。大多数观点认为，肠神经前体细胞ENCCs介导的ENS发育障碍是疾病发生的内在原因。而受众多转录因子与生长因子调控其生物学行为的ENCCs，其发育的复杂性决定了HSCR病因学的复杂性及多因素性。导致疾病类型及严重程度的差异由多种遗传因素及环境因子共同引起。为了更好地理解该疾病，有必要从多角度多层次全面解析ENS形成过程中ENCCs的生物学行为影响机制，从而为HSCR病因及病机研究作进一步探索。【研究方法】本课题拟以HSCR为研究对象，采用基因芯片技术对临床标本的差异表达基因进行筛选，经过扩大样本人群验证目的基因差异表达后从临床标本检测、肠神经嵴干细胞实验、RNA干扰实验等多层次研究手段，通过分析人体肠道组织PTPRR的表达模式及分布特点，以及干预PTPRR基因表达对神经嵴干细胞生物学行为的影响，从分子水平、细胞水平观察PTPRR基因在ENS发生中发挥的重要作用。-3- 第四军医大学博士学位论文【研究结果】1.通过基因芯片技术筛选获得HSCR相关的lncRNA与mRNA表达谱。总共获得2个lncRNA和3个mRNA，其表达量的差异经扩大样本验证后在病变组织与对照组织中有统计学意义。生物信息学分析提示目的基因PTPRR主要参与ERK信号通路可逆的蛋白磷酸化调节，与神经元的增殖分化密切相关。2.PTPRRmRNA及蛋白表达水平在HSCR痉挛段显著降低，免疫荧光染色发现PTPRR主要表达于肌间神经丛内的神经节细胞与Sox10阳性的神经前体细胞存在共表达3.在原代培养的神经前体细胞中，PTPRR主要表达于神经前体细胞胞质部位，与Sox10呈共表达，诱导分化后PTPRR蛋白及mRNA表达水平较未分化的神经细胞显著降低。4.具有诱导外周神经嵴细胞向神经元细胞分化的BMP2及GDNF干预ENCCs后，球体中TUJ1阳性表达明显增多，同时出现明显的分化形态；而球体中GFAP的阳性表达明显减少甚至缺失。具有诱导外周神经嵴细胞向胶质细胞分化的NRG1干预ENCCs，荧光染色见球体中TUJ1阳性表达显著减少；而球体中GFAP的阳性表达明显增加，同时出现明显的分化形态。5.PTPRR在三种细胞因子干预后ENCCs中阳性表达均明显减少，同时Sox10的阳性表达率也出现相应减少。免疫印迹及RT-qPCR结果同免疫荧光染色，并且在这三种细胞因子中以GDNF的干预作用最显著。6.将过表达或下调PTPRR表达腺病毒转染ENCCs后，下调组PTPRRmRNA及蛋白表达量均显著下降；而过表达组PTPRRmRNA及蛋白表达量的均显著上调，表明成功实施基因干预技术。7.EdU染色及免疫荧光法检测基因干预后ENCCs的增殖及分化情况，过表达组ENCCs中无明显分化细胞形态，同时Sox10阳性标记细胞数量显著增加，细胞增殖能力增加；而下调组ENCCs出现大量分化细胞，其中以TUJ1阳性表达的增加更显著，同时伴随Sox10阳性标记细胞数量显著减少以及细胞增殖能力的下降。8.在PTPRR基因干预前提下，通过免疫荧光染色及免疫印迹检测GDNF诱导磷酸化ERK1/2的激活发现，在PTPRR基因过表达组，pERK1/2在细胞中的阳性荧光染色及蛋白水平均显著减少，与PTPRR基因下调组中pERK1/2的阳性荧光染色及蛋白水-4- 第四军医大学博士学位论文平均显著增加结果相反，两组差异均具有统计学意义。【结论】PTPRR表达水平的下降与HSCR疾病的发病状态显著相关，并且表达于ENCCs的PTPRR通过负性调控ERK1/2的磷酸化，抑制神经前体细胞分化，发挥维持肠神经前体细胞多能性的功能。本研究为HSCR发病机制的研究提供新的思路和潜在治疗靶点。关键词：先天性巨结肠症；肠神经嵴细胞；肠神经系统；蛋白酪氨酸磷酸化酶受体型R；细胞外信号调节激酶1/2-5- 第四军医大学博士学位论文TheroleandmechanismofHSCRassociatedPTPRRinthemultipotentofENSprogenitorCandidateformaster:TianJiaoSupervisor:JiangXunTutor:ShuZhenDepartmentofpediatrics,Tangduhospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,ChinaSponsoredPrograms:NationalNaturalScienceFoundationofChina（81170331）AbstractAimsHirschsprungdisease(HSCR)isthemostcommonidentifiabledevelopmentaldisorderoftheEntericnervoussystem(ENS).ThecauseofthediseaseliesintheproblemsofthedevelopmentalpathwayswherebyNCCscolonizingthewholedevelopinggutandgivingriseintovarioussubtypesofneuronsandgliafortheformationofthefunctionalENS.ThediseaseetiologyofHSCRiscomplexandmultifactorial,wheregeneticandenvironmentalfactorscontributetothediseaseetiologywithdifferentseverityandforms.However,tillnow,onlyseveralHSCRgeneshavebeenidentifiedandtheydonotaccountforalloftheobservedcasesandtypesofHSCR,andthediseasemechanismshavenotyetbeenfullyelucidated.Forbetterunderstandingofthisdisease,tremendouseffortsareneededtoidentifyHSCRsusceptibilitygenes,aswellastounravelcellularandmoleculareventsunderlyingthenormalENSdevelopment.MethodsToelucidatethediseasemechanismsofHSCR,theexpressionprofileoflncRNAsand-6- 第四军医大学博士学位论文mRNAsinHSCRwasobtainedusingmicroarrayandthenvalidatedin30casesHSCRusingRT-qPCR.ThedysregulatedmRNAsPTPRRwasstudiedinclinicaltissuesamplesandprogenitorofENSusingmolecularbiologicaltechniqueandgeneticinterventiontechniquewithregardtoexploretheroleofPTPRRinbiologicalfunctionofENCCsandthedevelopmentandofENSandtoelucidatethemolecularmechanismofHSCR.Results1.Apanelof2-lncRNAsand3-mRNAswereidentifiedtodistinguishHSCRfromnormaltissueswithremarkablesensitivityandspecificity.ThebioinformaticsanalysisrevealsthatPTPRRwasmainlyinvolvedinreversibleproteintyrosinephosphorylationofERKsignalingpathwaywhichwasrelatedtotheproliferationanddifferentiationofneurons.2.Whencomparedtothenormaltissueanddivergentsegmenttissue,theexpressionlevelsofPTPRRaloneortogetherwithSox10wasreducedsignificantlyinthecolonofHSCRtissuesasreflectedbywestern-blotorimmunofluorescenceanalyses.3.PTPRRproteinwasmainlyexpressedincytoplasmicareaofprimarycultureENCCsandwithco-expressionpatternwithSox10.TheexpressionlevelofPTPRRproteinandmRNAwasdecreasedsignificantlyafterdifferentioninducing.4.BMPsandGDNFswereconfirmedtoplayaroleintheneuronaldifferentiationonENCCs.ThepositiveTUJ1expressionwasincreasedsignificantlywhereastherewasasignificantdecreaseofGFAPafterBMP2andGDNFmodulation.TherewasasignificantdecreaseofTUJ1andincreaseofGFAPinENCCsafterNRG2modulation.5.TheexpressionofPTPRRorSox10wasconsistentdecreasedsignificantlyasreflectedbywestern-blotorimmunofluorescenceorRT-qPCRanalysesafterneurotrophicfactorsmodulationandGDNFiswiththemostsignificance.6.Aftertransfected,PTPRRmRNAandproteinlevelweresignificantlyincreasedinAdv-PTPRRExp-RNAENCCscomparedwithcontrolvectororblankcontrolgroup;PTPRRmRNAandproteinlevelofAdv-PTPRRshRNAENCCsweresignificantlylowerthanthatincontrolvectororblankcontrolgroup.7.TheENCCswerewithoutobviousdifferentiatedpatternsinAdv-PTPRRExp-RNA-7- 第四军医大学博士学位论文groupandwithsignificantdecreasedTUJ1orGFAPpositiveimmunofluorescencewhiletheSox10andEdUpositiveimmunofluorescencewasincreasedsignificantly.TUJ1orGFAPpositiveimmunofluorescencewasincreasedsignificantlyinAdv-PTPRRshRNAgroupwhiletheSox10andEdUpositiveimmunofluorescencewasdecreasedsignificantly.8.TheexpressionofERK1/2activatedbyGDNFwasdecreasedsignificantlyasreflectedbywestern-blotorimmunofluorescenceanalysesaftergeneticmodulationinAdv-PTPRRExp-RNAgroupwhileitwasincreasedsignificantlyinAdv-PTPRRshRNAgroup.ConclusionsCollectively,thedifferentialexpressiongenePTPRRobtainedbyusingmicroarraywasrelatedtoHSCRwithremarkablesignificance.Meanwhile,theseresultsconfirmedtheroleofPTPRRtomaintainmultipotentoftheENSprecursorcellsandestablishthePTPRRproteinsasnegativeregulatorsofMAPK/ERK1/2signallingcascadesinneuronaldifferentiationanddemonstratetheirinvolvementinpathophysiologyofHSCRKeywords:Hirschsprung’sDisease;Entericneuralcrestcell;Entericnervoussystem;Proteintyrosinephosphatasereceptor-typeR;Extracellularsignal-regulatedkinase-8- 第四军医大学博士学位论文前言肠神经系统（ENS）是外周神经系统（PNS）的重要成员，能够独立于中枢神经系统（CNS）对消化道的复杂生理功能进行调控。组成ENS的数百万计神经元与胶质细胞起源于多能干细胞样细胞，即肠神经嵴细胞entericneuralcrestcells(ENCC)。在ENS发育期间，一系列转录因子与生长因子在不同时空上调控ENCCs的增殖、迁移与分化，从而为建立起有功能的神经网络系统发挥作用。先天性巨结肠症（HSCR，先天性肠无神经节细胞症）是最常见的ENS发育障碍性疾病，在新生儿中的发病率为1:5000。该病的病理表现为累及不同长度结肠的肠神经节细胞的缺失，可导致病变肠段的痉挛狭窄，出现肠道梗阻现象，而近端肠段被迫扩张形成巨结肠的表现。大多数观点认为，由肠神经前体细胞（ENCCs）介导的ENS发育障碍是疾病发生的内在原因。而受众多转录因子与生长因子调控其生物学行为的ENCCs，其发育的复杂性决定了HSCR病因学的复杂性及多因素性。导致疾病类型及严重程度的差异由多种遗传因素及环境因子共同引起。为了更好地理解该疾病，大量研究致力于疾病易感基因及其相关细胞分子机制的探索中。基于遗传学的筛查，目前已发现数个与疾病相关的基因，并且在动物水平，已明确其在ENS发育中的直接作用。但鉴于ENCCs介导的ENS发育的复杂性，对疾病病理机制研究还需要从多角度多层次进行全面解析，而将ENS形成过程中ENCCs的生物学行为影响机制作为研究的基础，是寻找HSCR病因的根本内容。-9- 第四军医大学博士学位论文文献回顾1先天性巨结肠（HSCR）先天性巨结肠(Hirschsprung’sdisease，HSCR）又称为希尔施普龙病，是由肠神经节细胞缺失或减少引起的小儿先天性肠道疾病。HSCR90%以上病变发生在直肠和乙状结肠的远端部分，因病变的肠段持续痉挛而使管腔变得狭窄，粪便不能通过而影响肠管正常蠕动，大量积聚在上段结肠。肠管狭窄段的近端因肠内容物积聚而代偿性增大、肥厚，从而形成了先天性巨结肠。但真正病变是在狭窄段的肠管。HSCR是由遗传和环境因素综合作用引起的多因素疾病，在新生儿中的患病率约为1/5000。1.1HSCR的发现历史1886年丹麦儿科医生HaraldHirschsprung描述了两例死于肠梗阻的结肠肥大患儿，并指出该病可能是胚胎发育异常引起的。此后，先天性肠无神经节细胞症被称为Hirschsprung’sdisease，纪念他首次描述疾病临床表现的贡献。虽然Harald指出该病可能是先天性肠道发育异常引起的，但他对该病的认识有局限性，他认为病变的部位在于扩张肠段。直到20世纪40年代，随着研究的不断深入，对HSCR的认识才迎来了里程碑式的发展。Ehrenpreis通过对HSCR患儿反复对比灌肠后得出结论，病变不是位于扩张部分肠段而在于狭窄部位。并且他首次确认了HSCR肠神经节缺失的组织病理学诊断结果。随后，1948年OrvarSwenson医生发明了一种治疗HSCR全新的外科手术方法，即我们后来所熟知的“Swenson手术”，直到今天它仍是治疗HSCR的基础。Swenson也进行了相关实验，表明在神经节细胞缺失段肠蠕动波消失[1]。1.2HSCR的分类根据不同肠段神经节细胞缺失的范围，HSCR大致可分为以下五种类型：①超短段型，神经节缺失段仅限于直肠末端3～4cm；②短段型，神经节缺失段仅限于直肠远端；③常见型，神经节缺失段出现在自肛门向上至乙状结肠远端；④长段型，神经节缺失段可累及乙状结肠近端、降结肠、横结肠，甚至部分升结肠；⑤全结肠型，-10- 第四军医大学博士学位论文神经节缺失段可累及整个结肠甚至末端回肠。1.3HSCR的流行病学世界范围内，HSCR在新生儿内的发病率约为1/5000，居小儿消化道畸形的第二位。但在不同的人种中，HSCR的发病率是不同的，白种人新生儿的发病率约为1.5/10000，非洲裔美洲人发病率约为2.1/10000，亚洲新生儿发病率最高，约为2.8/10000[2]。HSCR发病率除了种族差异外，还有显著的性别差异，男性与女性的发病率约为4/1[3]。不同类型的的HSCR发病率也不相同，其中短段型约占HSCR病例的80%。短段型HSCR在男女中的发病率约为5.5/1，而长段型该比例则相对较低，为1.75/1[4]。70%的HSCR是单发，另外30%的HSCR还可合并其他综合症。约7-15%的HSCR患者合并有唐氏综合症，其他相关的疾病还包括CCHS、Waardenburg综合征IV、多发性内分泌肿瘤、消化道畸形、腭裂、多指、心脏间隔缺损和颅面畸形等[5]。HSCR发病的风险因素和围生期特点目前研究较少，且结果不一。Goldberg的研究表明，产妇年龄和后代出现HSCR的风险有关联，而这却不能被别的研究者所证实[6,7]。一些研究结果显示，孕妇肥胖和后代发育异常关系密切，但这并非HSCR所特有[7,8]。与正常新生儿相比，HSCR患儿出生时胎龄一般较小[9]。一项系统性回顾研究发现，HSCR病人中早产儿占4-19.4%（总发病率为14%）[10]。此外，早产的HSCR患儿与HSCR足月儿相比，相关异常更加明显。1.4HSCR的病因学HSCR发病机制尚不完全清楚，对于其原因目前主要有三种基本理论解释。第一种理论认为是由于神经嵴细胞迁徙障碍导致肠神经节细胞缺失引起的；第二种理论认为是微环境的改变（细胞外基质缺乏或存在某种因子），以及改变对神经元迁移和成熟带来的不利影响而引起的；第三种观点推断可能是因为细胞的选择性死亡而导致肠神经节细胞分化和形成障碍引起的[11]。HSCR发病的确切机制虽然目前尚无定论，但有一点是明确的：HSCR是环境和遗传因素引起的多因素疾病。1.4.1HSCR相关基因约70-80%的HSCR病例是散发型，其余的则为家族性遗传。HSCR的遗传方式可以是常染色体显性或隐性，甚至是多基因遗传。有HSCR家族史的后代患病风险高达4%，是普通人群的200倍[4]。一些罕见的长段型HSCR，如全结肠无神经节细胞症，家族遗传率可高达15%-21%。对于女性HSCR患者，其兄弟姐妹患病的风险达7.5%，-11- 第四军医大学博士学位论文高于男性HSCR的2.5-6%[12]。目前已发现超过12个易感基因与HSCR的发生有关，它们是RET(10q11.2)，GDNF(5q13.1)，NRTN(19q13)，SOX10(22q13)，EDNRB(13q22)，EDN3(20q13)，ECE1(1q36)，ZFHX1B(2q22)，PHOX2B(4q12)等[13]（图1）。图1HSCR疾病相关基因及人群外显率(Amiel,J.,etal.JMedGenet,2008.45(1):p.1-14)1.4.1.1RET基因RET基因是HSCR中第一个被鉴定出来的突变基因，约50%的家族性HSCR和15-20%的散发性病例伴随着RET基因突变[13]。RET/GDNF通路对于神经嵴细胞及其衍生物的存活、增殖、迁移、分化以及定植发挥重要作用。RET基因突变包括插入、无义、错义和剪接突变等多种形式，在这些突变带来的后果中，RET失功能突变引起-12- 第四军医大学博士学位论文的单倍剂量不足可能是诱发HSCR的主要原因。研究表明，一些HSCR病例RET基因突变可导致受体蛋白错误折叠、向细胞膜的转运、与ATP的结合、与效应蛋白的结合以及受体循环等过程受阻[14]。对RET基因突变小鼠模型的研究表明，酪氨酸激酶结构域突变纯合子小鼠表现为全肠道神经节细胞缺乏，丝氨酸697位突变影响PKA的结合，进而影响与细胞增殖分化相关信号分子的级联反应，最终导致直肠末端肠神经元丧失[15]。此外，病例对照研究表明，在RET基因的非编码区(如启动子和内含子)单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNPs）与HSCR疾病易感性密切相关：如RET基因启动子区（rs10900296，rs10900297）以及Sox10在内含子1（rs2435357）和外显子2（rs1800858）的结合位点[16,17]。对不同人种RET基因SNPs研究发现，特定区域RET基因SNPs单倍体与特定人种HSCR发病高度相关；比如在中国人中，RET基因内含子1的rs2435357位点SNPs单倍体占中国散发HSCR人群的66%[18]。平均约有45%亚洲血统，24%欧洲血统的人在rs2435357位点携带突变等位基因T，这说明RET基因SNPs单倍型可能有相同的起源[3]。在rs2435357位点携带突变等位基因T的人群患HSCR的风险比正常人高4倍[19]。另外rs2435357的遗传效应男性显著高于女性[3]。与罕见的RET基因编码区位点突变相比，rs2435357位点变异的概率比RET基因其他区域高20倍[3]。约有11%的携带已知RET基因编码区突变的HSCR患者在rs2435357位点同时也携带风险等位基因T，也就是说一个基因可能有多处突变，这些遗传变异对于HSCR外显率有协同作用[3]。体外实验表明，rs2435357位点T等位基因突变能干扰转录因子Sox10与RET基因MCS+9.7位点的结合，进而影响RET基因的反式表达[19]。携带风险等位基因T的个体其肠组织RET表达相对较低，而纯合子突变个体其RET基因表达比杂合子更低[20]。另外，干扰其它转录因子结合的SNPs也会影响RET基因表达，如研究发现位于RET基因内含子1的SNPrs2506004(C>A)影响转录因子NXF,、ARNT2和SIM2与RET的结合，从而降低RET基因表达[21]。与RET基因不同，其配体GDNF编码基因单独突变很难引起疾病，HSCR患者中-/-携带GDNF突变基因的非常罕见[13]。虽然GFRα基因缺陷小鼠表现出与RET小鼠相同的表型，但迄今为止，HSCR病人中尚未发现GFRα基因突变者。1.4.1.2EDNRB/ET-3基因EDNRB/ET-3通路在ENS发育过程中也发挥重要作用，该通路的激活决定肠神经-13- 第四军医大学博士学位论文系统前体在消化道远端的定植。在HSCR病人中，约有5%的患者携带EDNRB或者编码ET-3的基因杂合子突变[13,22]。然而仅这两个基因的突变不足以引起疾病，此外，这些突变的外显率是性别依赖的(男性高于女性)，杂合突变具有不完全外显的特点。成熟的ET3是由其前体pro-ET3经内皮素转化酶1(endothelinconvertingenzyme1，ECE1)加工而来。有报道显示一例HSCR病人存在ECE1基因失功能突变，这说明ECE1基因异常参与HSCR的发生[23]。1.4.1.3转录因子相关基因参与HSCR发病的基因中，很多基因编码的转录因子能够调控RET基因表达，比如Sox10、Phox2b、PAX3等。研究表明，Sox10与RET非编码区启动子结合后能增加RET表达，Sox10基因突变-/-存在于HSCR合并WS4的患者中。纯合子Sox10小鼠，NCC衍生细胞在发育的后期+/-是无法存活的，杂合子Sox10小鼠在后肠远端则表现出无神经节细胞症[24,25]。关Dom/+联性研究发现Sox10与EDNRB基因相互作用的潜在位点。HSCR模型小鼠Sox10（Dominantmegacolonmice），EDNRB基因上C57BL/6J等位基因的存在与该模型小Dom/+鼠无神经节细胞症外显率和严重度的增加相关。Sox10小鼠与EDNRB基因突变小鼠的杂交后代表现出比单突变体更加严重的肠神经节细胞缺乏症和色素沉着障碍[26]，这可能是因为迷走神经嵴细胞在“侵入”前肠之前的凋亡率增加所导致。Phox2b表达在进入肠道之前的迷走神经嵴细胞，Phox2b缺失导致ENCCs上RET表达的缺陷。HSCR患者中很少发现Phox2b基因单独突变的，但Phox2b基因突变可引起HSCR合并CCHS或者神经母细胞瘤[27]。Benailly报道，在一例合并HSCR的患者，发现Phox2b基因杂合突变与疾病的发生相关，这说明，Phox2b基因单剂量不足可能会影响疾病的外显率[28]。此外，在Phox2b基因的内含子调控区发现一个SNP与HSCR相关[18]。病例对照研究表明，RET突变的外显率可能受HOXB基因簇（homeoboxgenes）各基因座相互作用的影响[18]。人类Hoxb5基因3’端侧面区域是一段高度保守序列，参与RET基因转录调控，该区域特殊的SNPs与HSCR发生高度相关[29]。Hoxb5能与转录因子NKX2-1(NK2Homeobox1)协同调控RET基因转录；Hoxb5基因缺陷小鼠，RET表达降低，NCCs迁移出现障碍，呈现出与人类HSCR相似的表型[29]。转录因子NKX2-1参与调控RET基因转录与表达。HSCR合并其它综合症的患者-14- 第四军医大学博士学位论文中存在NKX2-1基因失功能的情况，在RET基因启动子的NKX2-1结合位点发现了HSCR相关的SNPs[30]。1.4.2肠道微环境改变神经嵴细胞需要进行长距离的迁移才能最终在整个肠道定植，肠道微环境的变化能影响神经嵴细胞的迁移、分化和定植等过程。细胞外基质被认为是重要的微环境因素，肠神经前体细胞的迁移分化与细胞外基质密切相关。研究表明，HSCR病变肠管胞外间隙有纤维连接蛋白和细胞黏合素等基质蛋白的异常大量累积，这说明细胞外基质异常参与了HSCR发病[31]。另外，细胞外基质蛋白如层连蛋白和IV型胶原能促进NCCs轴突生长和神经元分化；细胞黏附分子与成纤维细胞生长因子通过激活相关受体能促进神经突的生长，而在HSCR神经节细胞缺失的肠段细胞黏附分子表达减少[32]。神经营养素如神经生长因子（NGF）、神经营养因子-3(neurotrophin-3，NT-3)等，具有神经元存活、生长的作用。研究表明，在ENS发育中，NGFmRNA表达下调能引起前体细胞凋亡数目增多，进而导致神经节细胞减少或缺失，这可能使因为NGF的减少使处于增殖状态的神经前体细胞神经营养不足所致[33]。在HSCR神经节细胞缺失肠段也发现NT-3表达的减少。1.4.3环境因素环境因素与HSCR发病风险之间的关系目前研究较少。维生素A是人体必需的一种营养物质，是维A酸（retinoicacid，RA)的前体。有研究表明RA对于ENS迁徙是必不可少的，提出在怀孕早期确保母体足够的维生素A水平能防止一些HSCR的发生[34]。苯甲酮-3是一种存在于防紫外线个人护理产品中的化学成分，研究表明，孕妇孕前使用含苯甲酮-3的护理产品，其子女患HSCR的风险增加[35]。怀孕期间母体甲状腺功能减退可能是导致HSCR的原因之一，在一项研究先天性甲状腺功能减退与HSCR关系的报告中，Kota等人提出了甲状腺素水平对肠道发育的重要作用[36]。这也解释了，为什么唐氏综合症患者（此类患者一般甲状腺功能低下的风险增高）同时患HSCR的概率增大[37]。孕期母体的药物使用情况可能是与HSCR相关的另一环境因素。动物实验发现，怀孕期间母体摄入布洛芬（抗炎药）或霉酚酸酯（免疫系统抑制剂）能引起胚胎ENS发育畸形（类似HSCR的病理状态）[38]。也有研究者推测，5-羟色胺再摄取抑制剂-15- 第四军医大学博士学位论文的使用与HSCR的发生也有关系[39]。1.5HSCR的临床特点大多数HSCR病例（90%）其诊断是在新生儿期明确的，主要表现为新生儿肠梗阻的相关症状：如腹部膨胀（76%）、呕吐（69%）、胎粪排出障碍（57%）以及HSCR相关的小肠结肠炎（10%）；还有少部分病例（90%）是在幼年或成人期由于慢性便秘、长期腹胀以至出现营养障碍后才明确诊断的[40]。新生儿HSCR出现腹部膨胀是由于病变肠管痉挛狭窄导致近端肠管内容物聚积，肠壁扩张而引起，其腹胀一般在出生后的24h内即可出现，可引起呼吸窘迫或发绀；呕吐症状轻重不一，重者可呕吐胆汁甚至粪便，停止喂食后呕吐和腹胀等症状减轻。正常新生儿在出生后的24-48h内排出大量黑色胎粪，而HSCR患儿出现胎粪排出延迟、排出量减少甚至不能排出等功能障碍。还有部分患儿出现便秘和腹泻交替进行的特殊病程。HSCR患者在幼儿期或更大年龄时主要表现为亚急性或慢性低位不全肠梗阻的特点，患者反复性便秘伴腹胀进行性加重，可出现消瘦、厌食、营养不良和发育迟缓等症状。最突出的体征表现为高度膨胀的腹部同瘦小的胸部、四肢所形成的极不对称的体型，腹壁薄弱，腹壁静脉显示清晰，可伴有呼吸困难和下肢水肿等病征。1.6HSCR的临床诊断HSCR诊断方法包括直肠抽吸活检、钡剂灌肠、肛管直肠测压、肛门指诊等。HSCR患儿肛门指诊多发现直肠壶腹部悬空，指诊可刺激排便反应，部分患者在指头拔出时排出大量粪便与气体。肛管直肠测压显示肛门内括约肌舒张异常，正常的直肠肛管松弛反射消失、直肠壁顺应性反应消失或降低、泛乏性收缩波出现以及排便时缺乏肠道推进性蠕动波；诊断阳性率达90%。钡剂灌肠一般可见狭窄段、移行段和扩张段的典型病理表现，其中狭窄段改变较为僵硬有的呈腊肠样，有的呈不规则收缩，主要是神经节细胞缺失所致痉挛引起，可根据病变肠段的长短来确定巨结肠的类型；扩张段肠管呈显著性增大肥厚，因粪便潴留所致；移行段位于病变狭窄段和扩张段之间，是无神经节向有神经节过渡区域，呈漏斗状或袖筒状。因肠动力障碍，钡剂灌肠24h后结肠远端可仍见残留；部分病例可见钡剂并非覆盖在粪便表面或结肠边缘，而是与粪便混合在一起；这也是种可靠的巨结肠表现。-16- 第四军医大学博士学位论文正常肠黏膜内乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE）呈阴性，而在HSCR病变肠管狭窄段可见AChE阳性神经纤维，为诊断HSCR的重要依据，确诊率达95%，对新生儿HSCR诊断有重要价值。直肠粘膜肌层活检是诊断HSCR的金标准，活检标本中发现肠神经节细胞缺失则可确诊。1.7HSCR的治疗HSCR的治疗分为非手术治疗和手术治疗两种方式。非手术治疗一般采用扩肛法，适用于超短段型和短段型新生儿和婴儿患者，对肠壁肌层进行扩张后通过反复刺激直肠敏感点，进而引起强烈的排便反射；优点是损伤小、费用低，无并发症风险，缺点是部分患者效果不佳。手术治疗主要分为经肛和经腹会阴联合两种方式，主要包括以下几种类型。Swenson手术，1948年Swenson在确认了HSCR真正的病变部位后，首创了托出型直肠、乙状结肠切除术，后经改良，采取套叠式拖出肠管，并将肛肠吻合改为前高后低的斜式吻合。改良后手术创伤，感染以及并发症的风险大大降低。Swenson手术适用于常见型、短段型和部分长段型HSCR患者。Duhamel手术，即结肠切除、直肠后托出术，此法盆腔分离少，操作简单，且保留了直肠前壁的压力感觉功能，吻合口破裂的概率低，并发症较低[41]。缺点是遗留盲带和闸门，容易形成“盲带综合症”。后经多次改良，基本消除直肠盲带和闸门。Duhamel及其改良手术适用于各年龄段HSCR患儿，也可作为其他手术失败后的再次手术方法。Rehbein手术，即结肠切除、盆腔内低位直肠结肠吻合术，经腹切除扩张的结肠及直肠上段，近端结肠与直肠作腹膜外吻合，缺点是切除无神经节肠管不彻底，便秘复发率高，术后需长期扩肛，原法已少有人采用。其改良方法扩大了直肠吻合口，术后排便正常。其改良方法对1〜3岁年龄阶段HSCR患儿比较适合。Soave手术，即直肠粘膜剥离、结肠于直肠肌鞘内拖出切除术，该手术操作简单，不损伤肛门括约肌、输尿管、输精管等[42]，与其他方法相比，无需直肠、结肠复杂的吻合，利于术后恢复，缩短治疗时间。因此，本方法适用于年龄较小的婴幼儿及新生儿合并肛门直肠畸形的病例。但存在鞘内感染、直肠肛门术后狭窄以及污粪等并发症[41]。-17- 第四军医大学博士学位论文Torre手术，即经肛门巨结肠根治术，1998年由Torre首创[43]。该手术经肛门剥离直肠粘膜，游离病变结肠拖出肛门行I期或II期切除吻合，适用于扩张段较短的患儿。全部手术于腹腔外进行，创伤小，无污染，恢复快。目前经肛门结肠拖出术在腹腔镜辅助下已经成为HSCR根治术中的一个新的标准术式。综上，多基因改变与肠道微环境的相互作用，导致个体胚胎期神经嵴细胞发育、迁移受阻，受累结肠肠壁肌间和粘膜下神经丛神经节细胞缺如，最终出现病变结肠的肠蠕动障碍，肠道持续痉挛狭窄，近端结肠肠道内容储留，肠腔扩张，形成巨结肠。目前，已发现至少有12个基因突变与该病形成有关，其中，编码酪氨酸激酶受体和内皮素受体的RET和EDNRB基因是关键作用基因，但是目前在基因相关研究领域所获得的线索及证据并不能全面及详细解释疾病不同类型的发病机制及疾病发生过程，为临床诊疗的贡献还不尽人意，提示还需要大量研究致力于涵盖内容更广泛层次更深入的研究。目前临床上对该疾病的治疗主要采用外科切除手术。无论是病变肠段的全切、次全切以及改良后的腹腔镜和单纯经肛拖出术[44,45]，这些技术的目的是使患者遭受的手术打击尽可能减小，但其远期效果仍有待评估。术后吻合口瘘或狭窄，以及小肠结肠炎这些手术主要的短期并发症[46]以及慢性便秘，大小便失禁和污粪等远期并发症，对于治疗后患儿的生活质量的影响仍深远而长久，因此新的侵袭性小的治疗方式的出现具有重要的临床意义。近年来，针对肠神经嵴干细胞(ENCC）的移植替代治疗来诱导肠神经系统正常发育，是HD治疗的新方向和热点研究领域。目前，用于移植治疗研究的ENS前体细胞有全能胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESC)、中枢神经系统干细胞(centralneuralsystemstemcalls，CNSSC）、骨髓间充质干细胞中的多潜能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPS）、来源于HSCR患者正常肠段的ENS前体细胞等，已成为研究ENS发育障碍及HSCR疾病病因的有力工具。在此基础上研究遗传及环境因素在ENS发育障碍中的作用及机制，能够为疾病的诊疗提供强有力的依据。那么，成为HSCR疾病根源的肠神经系统其发生发育的过程及影响因素是什么？相关调控机制又如何？本部分内容将从以下方面进行具体讲述。2肠神经系统-18- 第四军医大学博士学位论文2.1肠神经系统的结构和功能肠神经系统(Entericnervoussystem，ENS)是外周神经系统的重要组成部分，它既受中枢神经系统的支配，又能自主协调完成复杂的胃肠道功能，如胃肠蠕动、营养吸收、液体分泌、血流变化等。数以万计的神经元和胶质细胞交织在一起形成ENS的神经节网络。大多数肠神经节相互连接，沿着胃肠道壁形成两个神经丛：包绕在整个胃肠道平滑肌周围的肠肌间神经丛和主要分布在肠黏膜的粘膜下神经丛[47]；肠肌间神经丛主要支配平滑肌，而粘膜下神经丛含有感觉神经元，可感受肠粘膜表面的压力和牵张刺激，这两类神经丛相互联系，共同调节胃肠道功能。在哺乳类动物，目前至少已发现了15种不同的肠神经元，根据它们的功能，这些神经元又可分为传入神经元、中间神经元及运动神经元等[47]。存在于小肠和大肠部位的初级传入神经元具有广泛的神经投射，以便能迅速侦测到肠壁感受到的生理或物理刺激。中间神经元将来自初级传入神经元的信息输入进行整合后对运动神经元发出指令，进而对胃肠蠕动和粘膜腺分泌进行调节。这三类神经元构成了ENS完整的反射微环路。肌间神经丛的神经纤维主要由星状胶质细胞提供支持。大多数的神经胶质细胞存在于ENS肌间和黏膜下层，并与神经节细胞的胞体、轴突以及神经纤维束联系；这些细胞也可穿插存在于平滑肌层和粘膜肌层之间。除对肠神经元提供营养和支持外，肠胶质细胞还能提供递质前体物质以维持正常的神经传递[48]。另外，在发育过程中，肠胶质细胞还能保护肠神经元免受氧化应激的损害，从而促进其存活[49]。有文献报道显示，肠肌间和粘膜下神经胶质细胞以及Cajal间质细胞（InterstitialcellsofCajal，ICC）数量的减少与病人肠道运动功能障碍密切相关[50]。越来越多的证据表明，肠胶质细胞在调节胃肠动力方面发挥着举足轻重的作用。ENS的发育受系列转录因子和生长因子的精密调控以保证细胞正常增殖、迁移和分化，从而形成有功能的神经网络。ENS发育异常能导致诸多严重的先天性疾病，先天性巨结肠症是其中最常见的疾病，在活产儿中的发病率高达1:5000，HSCR以肠道不同长度的神经节细胞的减少或缺如为典型特征。研究ENS发育过程中相关的信号通路和基因调控有助于我们加强对HSCR发病机理的认识，为寻找治疗疾病的新策略奠定基础。2.2神经嵴细胞-19- 第四军医大学博士学位论文神经嵴细胞(Neuralcrestcells，NCCs)是一种胚胎发育过程中过渡性的多能细胞，经诱导后发生迁移并分化成多种细胞系，神经嵴细胞的衍生物包括外周神经系统的神经元及所有的神经胶质细胞、中枢神经系统的一小部分神经元、肾上腺髓质细胞、嗜铬细胞、黑色素细胞、部分中胚层衍生物（牙乳头、牙囊、骨骼、脑脊膜）等[51]遍及了外、中、内三个胚层的衍生结构。在原肠胚阶段，NCCs逐渐形成于神经板边缘和非神经外胚层之间。在一系列信号通路（Wnts，BMPs，FGFs）的诱导下，NCCs离开背部的神经管，沿着腹侧即神经管与体节之间的空隙和背外侧即体节与外胚层之间的空隙这两条路径进行迁移[52]。在迁移过程中，NCCs逐失去多能性，根据其轴向起源及随后的迁移路径，NCCs分化潜能受到限制，只能分化为特定细胞系。根据从头到尾的顺序，NCCs可大致分为四类：头颅神经嵴细胞、迷走神经嵴细胞、躯干神经嵴细胞和骶尾神经嵴细胞。头颅神经嵴细胞沿着背外侧途径迁移至额鼻部、鳃弓、眶周区域和面部，分化为黑色素细胞、神经元、胶质细胞以及面部的多种中胚层细胞，从而形成头面部骨骼、软骨、结缔组织及部分脑神经节[53]。迷走神经嵴细胞可分化为神经元、胶质细胞、平滑肌细胞等，是肠神经系统（ENS）祖细胞的主要来源[53]。躯干神经嵴细胞沿着背外侧路径迁移形成表皮黑色素细胞，沿着腹侧路径迁移则分化为外周神经系统的感觉神经元、胶质细胞、背根神经节、交感神经节等。尾骶神经嵴细胞在ENS发育的后期，迁移至肠道远端，参与远端小肠神经元和神经胶质细胞的形成[54]。-20- 第四军医大学博士学位论文图2神经嵴细胞的来源，演化及分化示意图图A展示神经嵴细胞在胚胎发育期的起源；图B展示了脊椎动物头尾轴不同轴向水平起源的神经嵴细胞类型；图C、D展示SoxE家族蛋白调控神经嵴细胞分化的命运及相关细胞事件；图E展示分化过程中的重要事件：上皮向间质细胞类型的转化。(Sauka-SpenglerTetal.Cell.2010,29;143(3):486-486)2.3肠神经系统祖细胞的起源研究发现，肠神经系统祖细胞主要起源于迷走神经嵴细胞和尾骶神经嵴细胞，-21- 第四军医大学博士学位论文其中绝大部分源于第1-7体节相邻的迷走区神经嵴，一小部分前端和远端肠管的祖细胞由躯干神经嵴和尾骶神经嵴细胞分化而来(如图2A)[55]。进一步研究表明，不同肠段祖细胞源于迷走和尾骶神经嵴不同的细胞亚群[56,57]。在鸡胚，源于第1-2体节相应位置的神经嵴细胞衍生为食道和肠道前端，而第3-6体节的神经嵴细胞则是整个肠道祖细胞的主要来源，与第6-7体节对应部位的神经嵴细胞则负责肠道末端[58]。在小鼠，整个肠道的祖细胞主要源于第1-5体节对应部位的神经嵴，而第6-7体节对应部位的神经嵴细胞则主要与食道相关[59]。鸡远端肠管肌间神经丛约有17%的神经元来源于尾骶神经嵴[58]，而小鼠的这一数值目前尚未见文献报道。2.4肠神经系统的发育2.4.1ENS发育过程中的时间节点及相关事件以小鼠为例，在胚胎发育的第8.5天，迷走神经嵴细胞（NCCs）从神经管的背侧边缘分离，沿着上皮与体节、体节与神经管、前后体节之间的间隙进行迁移。随后，临近第1-4体节水平的NCCs迁移穿过咽弓，临近第4-7体节水平的NCCs则向腹侧迁移越过背主动脉[60]。在胚胎发育第9或9.5天，NCCs开始侵入原肠口端并向尾端移行，此时起这些细胞可被称为肠神经嵴细胞（EntericNeuralCrestCells，ENCCs）（图3）。在ENS发育过程中，随着肠道长度和形态的变化，ENCCs由从头到尾的方向沿着肠道移行，ENCCs首先在原肠口端（即前肠，包括食管和胃）定植，接着在肠道中段（即中肠，包括小肠、盲肠、升结肠、横结肠）定植，最后在肠道尾端（即后肠，包括降结肠、直肠）定植，整个定植过程在胚胎发育的第15天基本完成[54,59]（图3）。值得注意的是，中肠后后肠的一小部分ENCCs起源于骶尾神经嵴细胞。这部分骶尾神经嵴细胞与迷走神经嵴细胞的迁移模式不同，它们在胚胎发育的第9-9.5天与神经管分离，然后沿着外部神经元产生的神经纤维迁移[57]。在胚胎发育的第11.5天左右，这部分细胞到达肠道尾端区域，但并不能立刻定植，而是要等起源于迷走神经嵴的ENCCs在肠道完成定植之后，它们才能在该区域定植[54,61]（图3）。如此看来，骶尾神经嵴细胞在肠道的定植需接受迷走神经嵴的信号指导。然而，剔除迷走区神经管，骶尾神经嵴细胞向肠尾端区域的迁移和定植并不受影响，这表明，虽然源于骶尾神经嵴的ENCCs在肠道定植需要等待一段时间，但和迷走神经嵴并无直接信号联系[58]。而在人胚胎发育的过程中，从第5周开始，NCCs沿迷走神经迁徙进入前肠，然-22- 第四军医大学博士学位论文后沿头至尾方向迁移，7周左右迁移至回肠末端，8周左右至结肠中段，然后需要4周的时间从此处至整个肠道末端，至第12周整个迁移过程基本完成[62]。图3ENCCs的迁移路径及时间节点在胚胎期E9.0-E9.5一部分源于迷走神经嵴的ENCCs（如绿色所示）进入前肠，并在E11.0-E11.5迁移至中肠，至E14.5迁移完成；在后肠的神经嵴细胞迁移过程中跨肠系膜ENCCs（紫色所示）起主导作用；而在E11.5后肠部位出现的源于尾骶神经嵴的ENCCs（蓝色所示）在E13.5进入后肠，并协同迷走神经嵴来源的ENCCs完成对后肠的迁移。(LiuJAetal.Gastroenterology2015;149:1837–1848)2.4.2肠神经嵴细胞的迁移ENCCs的迁移对ENS发育和发挥正常功能至关重要，不同位置的ENCCs迁移模式不同，位于前部的细胞相互之间粘附紧密，以细胞“链”或“股”的方式向肠道尾端移动。研究表明，胚胎小鼠ENCCs上表达的细胞黏附分子L1（L1CAM）对细胞链的形成至关重要，干扰L1的活性能显著减缓ENCCs的迁移速率。另外，细胞链最前的“前驱细胞”其迁移速度可变，轨迹不定，表现为动态的迁移模式[63]。紧挨着“前驱细胞”的细胞群与“前驱细胞”间歇性地保持平行移动，这可能有助于引导ENCCs的迁移方向[63]。Nishiyama等人研究发现了ENCCs迁移的一种新模式---“跨肠系膜迁移”，在胚胎发育的第11天，一部分ENCCs采取快捷方式，直接从肠道中段跨越肠系膜迁移至肠道尾部，这部分ENCCs对结肠神经系统的发育贡-23- 第四军医大学博士学位论文献很大[64]（图3）。有意思的是，当一部分尾部ENCCs与头部细胞分离后，他们的迁移速率明显减慢，一些与任何ENCCs都没有接触的单个细胞群则停止迁移[63]。这表明，细胞之间的相互接触是ENCCs链状迁移所必需的，因此，控制细胞间黏附作用的相关分子在迁移过程中发挥着重要作用。研究发现，ENCCs上表达多种细胞黏附分子，如β1-integrin、L1CAM、N-cadherin和PSA-NCAM/NCAM，它们都是细胞之间黏附接触所必需的因子。剔除β1-integrin导致ENCCs迁移减慢、积聚增多，进而引起ENS结构异常，出现巨结肠样表征[65]。L1CAM除了与细胞间黏附有关外，同时还是参与ENS发育的Sox10/内皮素信号通路的调控基因，干扰L1CAM活性显著抑制ENCCs的迁移速率[63,66]。将ENCCs的N-cadherin基因敲除，其迁移明显延迟。适当水平的PSA-NCAM/NCAM对ENCCs的正常迁移也是必须的，上调PSA-NCAM水平使ENCCs的迁移能力受到抑制[67]。另外ENCCs的迁移还需要骨形成蛋白(Bonemorphogenticproteins，BMP)信号通路的参与，BMP与PSA-NCAM相互作用，在ENS发育过程中促进神经节聚集[67]。2.4.3肠神经嵴细胞的增殖成熟的肠神经系统包含数以百万计的不同类型的神经元和胶质细胞，这些细胞均由少量的肠道前体细胞增殖分化而来。肠道前体细胞的数量由胚胎发育的第10.5天“侵入”原肠口端的神经嵴细胞数量决定，这群细胞的增殖不仅对产生足够数量和种类的神经元及胶质细胞至关重要，对ENCCs的定植也举足轻重[58]。在鸡胚，剔除部分预迁徙的迷走神经嵴细胞引起结肠神经节细胞缺乏症。在小鼠直接或间接原因引起的肠前体细胞增殖减少能导致全肠神经元数量下降以及肠道终端区域神经节细胞缺失[68]。ENCCs的增殖需要RET/GDNF信号通路的参与，将RET基因完全敲除会导致肠前体细胞的大量凋亡，从而引起ENCCs在肠道的不完全定植。体内剔除GDNF基因后ENCCs的增殖能力减弱，小肠神经元数量显著下降[68]。Sox10杂合子小鼠肠管远端神经元数量减少，因为Sox10能使ENCCs维持持续的增殖状态而避免分化[69]。迁移流中不同位置的ENCCs增殖能力有所不同，最前部细胞的增殖能力是最强的，其增殖速度明显高于迁移流后部的细胞，这可能是因为前部的细胞所受阻力相对较小，增殖空间更大，这群细胞引导着ENCCs“侵入”未被定植的肠道区域[70]。-24- 第四军医大学博士学位论文2.4.4肠神经嵴细胞的分化ENS是除了中枢神经系统之外最复杂的神经系统，成熟的ENS被称为人类的“第二大脑”。在ENS，不同类型的神经元和神经胶质细胞交织成神经节，形成两束主要的神经丛。外层为肌间神经丛，位于纵行肌和环行肌之间，内层为粘膜下丛，位于小肠粘膜下层。这两束神经丛相互联系，协调控制肠道运动、液体交换、激素分泌等。ENCCs的分化是ENS发育过程中的一个重要环节。在小鼠胚胎发育的第10-10.5NTR天，大部分的ENCCs尚未分化，这些未分化的ENCCs共表达Sox10、RET、p75和Phox2b。同时，表达神经丝蛋白、泛素水解酶PGP9.5和RNA结合蛋白HuC/HuD的前体细胞出现在距ENCCs迁徙“细胞流”背后很近的区域[71]。当源于迷走神经嵴的NTRENCCs“侵入”胚胎原肠口端后，前体细胞分化即刻开始，同时伴随着Sox10、p75表达降低，神经丝蛋白、PGP9.5、HuC/HuD表达升高，Ret和Phox2b表达维持相对恒定。另一部分前体细胞继续以较慢的速度迁移，并保持旺盛的分裂能力，在合适的条件下，这些细胞退出细胞周期分化为不同的肠神经元亚型。在ENS发育的过程中伴随着多种神经元的出现，比如酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元仅仅出现在小鼠胚胎发育的第10.5到12.5天；一氧化氮合酶阳性神经元、钙结合蛋白阳性神经元和5-羟色胺能神经元在胚胎发育的第12天左右才开始出现[72]。胆碱乙酰转移酶阳性细胞在胚胎发育的第10.5天出现在小肠中，神经肽Y和P物质分别在胚胎发育的第13天和第14天左右出现[71]。还有些神经元的标记物出现在胚胎发育的后期，如降钙素基因相关肽、乙酰胆碱转运体（VAChT）在胚胎发育的第17.5和18.5天出现。不同类型的神经元在肠道内分部相对均匀，但目前控制神经元在肠道内分部的机制尚不完全清楚。在小鼠胚胎发育的第14.5天，小肠内约有50%的ENCCs表达神经元标志物，这一数量一直到发育的后期都变化不大[73,74]（如图4）。-25- 第四军医大学博士学位论文图4ENCCs向ENS发育分化的谱系示意图(HeanueTAetal.NatRevNeurosci.2007Jun;8(6):466-79)胶质细胞的分化晚于神经元，并伴随着Phox2b和RET表达的下降。表达脑脂肪酸结合蛋白这一标志物的胶质前体细胞在胚胎发育的第11.5天出现，与神经前体细胞不同，这些细胞距迁徙―细胞流‖较远。而发育未成熟胶质细胞的标记物胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)直到胚胎发育的第16天才出现[73]。胶质细胞具有支持、滋养和保护神经元的作用，同时还能吞噬清除凋亡的神经元。最近的研究表明，根据位置和形态，肠神经胶质细胞可分为四个亚型。I型和II型肠神经胶质细胞分别为星状和纤维状细胞，分布在神经节间；III型分布在神经节外，在肌间和粘膜下丛形成网络；IV型沿环形和纵向平滑肌之间的神经纤维分布[75]。与中枢神经系统不同，ENS在成年时仍具有再生功能。实验条件下，当成年小鼠ENS受损后，肠神经胶质细胞能反分化形成神经元[76]，但并不是所有胶质细胞都具备这种能力，在特定信号诱导下，只有神经节外Sox10阳性的细胞才能转化为肠神经元[77]。Laranjeira等人的研究也表明，成年小鼠肠道具备转化为神经元的那部分胶质细胞呈Sox10阳性，但却不能被经典标记物GFAP所标记[76]。为什么只有少部分特定的胶质细胞能转化为肠神经元，目前尚不清楚。神经元数目的异常、特定神经元类型的丢失、神经元/胶质细胞比例的变化等都-26- 第四军医大学博士学位论文可能导致神经节细胞减少症、神经节细胞缺失症或神经节功能障碍，严重影响胃肠运动、营养吸收和激素分泌，进而引起一系列与ENS相关的疾病[74,78]。2.5ENS发育过程中的信号通路和转录因子ENS发育受多条信号通路的调控，它们共同作用控制着ENS发育的各个环节（图5）[61]。图5参与ENS发育的信号途径及转录因子示意图ENCCs膜表面表达酪氨酸激酶（TK）受体Ret，该受体与其配体GDNF结合后发生二聚体构像改变并协同该配体的共受体GFRα1完成信号通路的激活。被磷酸化激活的受体胞内区酪氨酸由红色小圆点代表，被去磷酸化失活的酪氨酸由蓝色小圆点代表。ENCCs同样也表达G蛋白偶联受体Ednrb，该受体可被内皮素(Et)-3结-27- 第四军医大学博士学位论文合并激活。转录因子Sox10表达于核内，可通过增强子与Ret/Ednrb通路的信号分子结合并激活。这些信号通路参与ENCCs的存活、增殖、迁移或分化等过程。(LiuJAetal.Gastroenterology2015;149:1837–1848)2.5.1RET/GDNF/GFRá1通路RET/GDNF/GFRá1是调控ENS发育最重要的一条信号通路。胶质细胞源性神经营养因子（glialcellline-derivedneurotrophicfactor，GDNF）由肠道间质产生，属于TGFβ超家族。RET是一种表达在迁徙ENCCs上的跨膜受体，它包含一个细胞内酪氨酸激酶结构域，一个细胞外钙粘蛋白结构域和富含半胱氨酸的结构域。根据不同的剪接方式，RET基因编码RET9、RET51和RET43三种蛋白亚型，它们之间的区别在于羧基末端的胞内区和邻近酪氨酸1062（Y1062）位蛋白质序列的不同，这决定下游不同效应激酶的激活[79]。RET有四种常见的配体，它们都属于GDNF家族配体（GDNFfamilyofligands，GFLs），分别是GDNF、neurturin(NRTN)、artemin(ARTN)和persephin(PSPN)。这些配体通过与糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚定的同源受体（GDNFfamilyofReceptors，GFR）结合激活RET，GDNF、NRTN、ARTN和PSPN分别与GFRα1、GFRα2、GFRα3和GFRα4结合[80]。GFL-GFRα的复合物与RET结合后，触发其二聚化反应，引起RET酪氨酸激酶结构域的磷酸化，下游信号通路被激活[80]，而由蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）介导的去磷酸化作用，是调控该通路避免过度激活，或因生长发育需求需要适度失活的稳态维持事件。GDNF-GFRα-RET信号通路控制着ENCCs的存活、迁移、增殖和分化，对ENS的正常发育不可或缺。约15-35%的散发性HSCR和50%的家族性HSCR是由RET酪氨酸激酶结构域编码基因的突变引起的，而存在于RET基因内含子1部位的杂合子等位基因与70%的HSCR病例有关[19]。三种RET亚型中，RET9的作用可能更加重要，研究表明，仅表达RET9的转基因小鼠ENS也能正常发育，而缺少RET9其肠神经元基本全部丧失[79]。在小鼠，RET在肠道祖细胞和神经元高度表达，GFRα1主要在ENCCs和肠间充质表达，而GDNF主要在肠间充质表达。RET，GDNF或GFR281基因敲除的纯合子小鼠肠道神经节细胞完全缺失。RET基因缺陷的小鼠，在胚胎发育的第10.5天其ENCCs+/-不能进入中肠，并且神经前体细胞的数量显著减少[59]。GDNF杂合子小鼠ENCCs以及肠神经元的数量大约减少一半，表现为肠神经节细胞缺乏症[81]。梯度降低RET-28- 第四军医大学博士学位论文基因表达量的实验发现，要保证肠神经元的存活至少需50%的RET基因表达。基因工9/CFPfl/CFPfl/CFP程小鼠RET和RET分别表达正常水平30%和50%的RET，研究表明，RET9/CFP小鼠无明显ENS发育异常，而RET小鼠在胚胎发育后期结肠部位相当数量的ENCCs细胞死亡，从而导致肠道无神经节细胞症[82]。即使迷走神经嵴细胞在全肠道定植后，敲除GFR291仍然能够引起肠道远端神经元的大量死亡，从而引起结肠神经节细胞缺失，表现出类似HSCR的症状[83]。反过来，营养因子GDNF处理能够促进ENCCs的增殖，增加肠外植体中神经前体细胞的数量。fl/CFPENCCs的肠道定植与Ret基因表达也密切相关，RET小鼠ENCCs的定植与正9/CF常小鼠无明显不同，RET小鼠ENCCs在后肠的定植出现延迟，胚胎发育的第15.5天结肠ENCCs完全消失[82]。GFR291基因缺陷的肠道祖细胞对GDNF信号无应答，并表现出严重的定植障碍，它们滞留在肠壁内，失去向肠道尾端移行的能力[84]。小鼠ENCCs在全肠沿头尾方向的定植于胚胎发育的第14.5天基本结束，随后从肌间神经丛向心性迁移形成粘膜下神经节。研究显示，ENCCs向粘膜下区域的迁移也需要GDNF信号通路的参与，GFR291基因缺陷ENCCs的运动功能显著降低[84]。此外，迁徙流最前部的ENCCs可以沿GDNF的浓度梯度到达肠道的靶区域；该通路还能促进ENCCs的―跨肠系膜迁移‖,以便其在肠道的远端区域更有效地定植[64]。ENCCs向神经元和胶质细胞的分化也主要是由该条通路调控[74]。比如，表达神经元型一氧化氮合酶的肠神经元在小鼠胚胎发育的第11.5天出现在回肠部位，而此类神经元的数量是由RET信号通路的强弱决定的[57]。该通路还能够促进轴突生长，引导交感神经元发育。2.5.2EDNRB/ET-3通路内皮素受体B（EndothelinReceptorB，EDNRB)和其配体内皮素-3（endothelin-3，ET-3)组成的ET-3/EDNRB信号通路是ENS发育过程中另外一条十分重要的通路。EDNRB是一种G蛋白耦联受体，在ENS发育中，表达在神经嵴细胞的多种衍生物上。ET1-3属于含有21个氨基酸的活性肽，虽然ET1、ET2和ET3都能与EDNRB很好的结合，但ET3和EDNRB结合启动的信号通路在ENS发育中更加重要。像GDNF-GFRα-RET信号通路一样，ET-3/EDNRB通路参与ENS发育的各个方面。ENCCs的迁移受ET-3/EDNRB信号通路调控，在小鼠，当ENCCs向肠道远端移行定植的过程中，ET-3在盲肠和结肠近端大量表达。EDNRB和ET-3基因突变小鼠ENCCs-29- 第四军医大学博士学位论文迁徙延迟，分化受阻，结肠远端神经节细胞缺失[85]。EDNRB和ET-3条件性基因敲除的小鼠和大鼠，ENCCs的定植均出现延迟。EDNRB基因缺陷的ENCCs迁移速度减慢，轨迹发生改变。目前尚不清楚，ET-3/EDNRB通路的异常是如何引起ENCCs迁移和定植障碍的。一些研究显示，ET-3能抑制GDNF引起的转录因子诱导的ENCCs迁移，这表明ET-3/EDNRB通路的激活有可能会降低ENCCs对GDNF的敏感性[86]。该通路能抑制前体细胞的过早分化，研究发现丧失Et-3功能的突变体小鼠，其细胞迁徙流最前端的ENCCs出现过早的神经元分化；而当Et-3存在的情况下，ENCCs向神经元的过早分化消失[87]。ET-3/EDNRB信号通路对ENCCs的增殖作用尚存在争议。有研究表明，ET-3能促进神经嵴细胞的增殖，抑制该通路会导致Sox10阳性ENCCs增殖减少[86]。然而，也有一些研究表明，EDNRB/ET-3基因突变对于小鼠胚胎发育期ENCCs的增殖影响不大[88]。如此来看，ET-3对ENCCs增殖的影响可能是间接的，或者是只限于特定的细胞谱系、特定的发育阶段。以上结果说明，ET-3/EDNRB通路可能负责将肠道前体细胞维持在一种持续增殖的状态，防止它们过早分化，以保证有足够数量细胞迁移覆盖整个胃肠道，为后续定植做准备。2.5.3转录因子Sox10Sox10属于Sox家族，该家族成员的共同特点是含有和Sry(sex-determinationregionofYchromosome)基因的HMG（highmobilitygroup）结构域相似的DNA结合域，引导Sox蛋白和特异DNA结合并导致DNA构像变化，因而Sox蛋白属于结构性转录因子的一种。Sox家族共分为A-J不同亚族，Sox10与Sox8、Sox9同属于SoxE亚族。在人类，Sox10杂合子突变体表现出Waardenburg综合征II/IV的典型症状，Sox10杂合性缺失的小鼠和斑马鱼也和人的表型类似，出现结肠神经节细胞缺失、色素沉着异常等缺陷[13,85]。Sox10表达在与神经管分离之前的神经嵴上，在神经嵴细胞的发育过程中发挥重要作用。在胚肠期，Sox10表达在迁移的ENCCs以及成熟的肠胶质细胞上[73]。Sox10基因敲除的纯合子小鼠其神经嵴细胞在―侵入‖前肠之前就开始大量凋亡，致使ENS不能正常发育[89]。功能性研究表明，Sox10能维持ENCCs的增殖能力，阻止其过早分化。Sox10杂合突变小鼠胚胎期ENCCs的数量显著降低，细胞体的尺寸明显变小[87]。另外，在小鼠ENCC上异位表达Sox10能在不改变细胞谱系定向的前提下抑制神经元和胶质细胞-30- 第四军医大学博士学位论文的生成[87]。在ENS发育的后期阶段，Sox10只在肠神经胶质细胞的前体细胞上表达，可想而-/知，Sox10对于细胞命运的特化与ENCCs向胶质细胞的分化不可或缺[90]。在Sox10-小鼠，背根神经节无胶质细胞表达，外周神经胶质细胞完全丢失，这表明胶质细胞+/-的生成被严重破坏。将源自Sox10杂合子小鼠的NCCs在培养皿中培养，与正常组相比，即使在神经胶质细胞诱导因子(如Neuregulin-1)存在的情况下，其胶质细胞的数量亦显著下降[91]。Sox10是调控ENS发育过程中多个基因（如RET、EDNRB、Sox10）表达的关键转录因子。在RET基因内含子1的增强子元件内有两个Sox10的结合位点（Bindingsites,BS）[19]。靠近5’端的Sox10-BS1与转录因子Sox10的核心结合序列完全匹配，而靠近中间区域的Sox10-BS2则不能完全匹配。然而体外实验却发现，剔除Sox10-BS2导致报告基因的大幅下调，而剔除Sox10-BS1则不影响报告基因的表达，这说明Sox10-BS2是功能性调控位点[19]。同样，在EDNRB基因的增强子序列内有三个假定的Sox10结合位点，位于相对于转录起始位点-1200bp到-250bp的区域内[92]。突变分析显示，每个位点对于ENS中EDNRB基因的表达都很重要。位于-701到-644bp区域的位点II是远端回肠EDNRB基因暂时表达以及迁徙的ENCCs上EDNRB持续表达所必需的。位点I（-929bp到-897bp之间）和位点III（-428bp到-389bp之间）是结肠EDNRB基因表达所必需的[92]。在Sox10基因位点发现了9个增强子（MCS1-9），功能分析表明，它们对Sox10基因的组织特异性表达发挥重要作用[93]，它们的功能虽有所重叠，但也具有显著的时空差异。特别是MCS4和MCS7，它们控制着小鼠和斑马鱼ENSSox10基因的表达[93]，在HrySox10小鼠模型中剔除增强子MSC7，引起ENS和皮肤Sox10表达的全部丧失，导致肠远端神经节细胞缺失和严重的色素减退[93]。与SoxE亚族所有蛋白一样，转录因子Sox10可以采取二聚体或单体的形式与目标序列结合。Sox10-MCS7或Sox10-MCS4内SoxE结合序列的定点突变可导致增强子活性的大幅下降[93]。此外，Sox10-MCS4内还包含另外三个Sox结合位点，删除其中任意一个都将严重影响ENS报告基因的表达。2.5.4其它相关转录因子Hoxb5在迁移的ENCCs和发育第4-7周的人胚肠表达，Hoxb5能反式激活RET基因启动子，通过与Nkx2-1相互作用增强RET转录，随后调控ENCCs的迁移和分化。-31- 第四军医大学博士学位论文Phox2b(paired-likehomeobox2B)是一个同源结构域转录因子，在发育的ENS以及成年肠神经元上表达。Ret基因在迁徙ENCCs上的表达需要Phox2b的参与，杂合子Phox2b聚丙氨酸扩增突变引起人类先天性中枢性低通气综合征（congenitalcentralhypoventilationsyndrome，CCHS）[28]。PAX3（pairedbox3）也是ENS发育所必需的一种转录因子，在预迁移的NCCs，PAX3能抑制细胞外基质多能聚糖的表达，从而促进NCCs的迁徙。PAX3对神经嵴干细胞以及其衍生物的发育也至关重要。与转录因子Sox10一起，PAX3能调控RET基因,对ENS发育中NCCs的存活、迁移、增殖、分化等发挥重要作用。ZFHX1B基因缺失突变能影响NCCs的正常迁徙，引起HSCR合并Mowat-Wilson综合征，表现为小头畸形、智力低下、畸形面部特征[94]。ZFHX1B基因敲除小鼠迷走NCCs以及ENS前体细胞均不发育。综上，肠神经系统的发生发育是由环境及遗传因素共同调控，ENS发育的时空特点及参与功能的多样性体现了这两方面因素的多维性及复杂性，并由此决定了HSCR病因的复杂性。为了更好地理解该疾病，对疾病病理机制研究还需要从多角度多层次进行全面解析，而将ENS形成过程中ENCCs的生物学行为影响机制作为研究的基础，是寻找HSCR病因的根本内容。-32- 第四军医大学博士学位论文正文第一部分先天性巨结肠患者结肠组织差异基因的筛选及人群验证前言先天性巨结肠（HSCR）是新生儿期常见的先天性疾病，病理发生是在胚胎发育时期，肠神经元的前体细胞-肠神经嵴细胞（entericneuralcrestcells，ENCCs）在前肠至后肠的迁移过程中出现障碍而导致粘膜下和肌间神经丛副交感神经节细胞缺失而形成的病理状态。大量研究表明，胚胎早期消化道微环境改变及遗传因素在HSCR发生发展中起重要作用，对肠神经发育的基因网络调控的研究能促进对该病病因及发病机制的认识。一方面在该研究领域，已发现十多种基因与HSCR的发病相关，如RET，EDNRB，GDNF，NRG1，SOX10，GLI等基因，同时近年来多项研究相继发现一些非编码基因如miR-192/215、miR-206、miR-141、miR-124、miR-218-1等也可影响ENCCs的迁移和增殖为疾病病理机制的研究提供了新的方向[95-98]。另一方面，从临床角度考虑，由于疾病的严重程度和性别比差异并不遵从孟德尔遗传规律，提示疾病的发生并不是由单基因因素引起，而遗传因素及其调控机制可能在疾病发生中有更重要的作用。因此本研究采用基因芯片技术，对临床标本中差异基因表达谱进行筛查，以期为HSCR病因及分子机制研究、临床诊治及预防提供更加充实的理论依据。1材料1.1实验对象选择2015年1月至2016年1月于西安交通大学医学院第二附属医院小儿外科行根治手术的患儿，共30例。这些患儿均经术前钡灌肠和术后病理切片诊断HSCR。HSCR患儿的无神经节细胞肠道组织标本(其中3例用于芯片检测，其余病例用于扩大样本量验证)和非HSCR肠梗阻正常结肠全层组织标本（3例）于术中切除后立即-33- 第四军医大学博士学位论文收集，用无菌生理盐水清洗后，冻存于液氮，过夜后存放于-80℃冰箱长期保存。本研究获得医院伦理委员会批准，标本采集均经患儿家长签属知情同意书。1.2主要试剂及耗材1.2.1化学试剂及耗材0.9%生理盐水四川科伦药业股份有限公司4%多聚甲醛科昊生物工程有限公司TrizolReagentInvitrogenNucleoSpin®RNAclean-upMACHEREY-NAGELNucleospin®ExtractIIMACHEREY-NAGEL晶芯®生物芯片通用标记试剂盒CapitalBioCy3-dCTPGEHealthcareCy5-dCTPGEHealthcare10%SDSCapitalBio20xSSCCapitalBioAgilentone-colorRNASpike-inkitAgilentAgilenttwo-colorRNASpike-inkitAgilent异丙醇天津天力化学试剂有限公司三氯甲烷天津天力化学试剂有限公司无水乙醇天津天力化学试剂有限公司RNase/DNasefreeDEPCH2OPromega反转录试剂盒TakaraSYBRgreenPCRMasterMix试剂Takara无菌脱脂纱布河南飘安集团有限公司1.8ml冻存管corning10cm眼科剪RWDLifeScience10cm精细镊RWDLifeScienceEP管(RNasefree)corning6L液氮罐（便携式）东亚机电工贸有限公司-34- 第四军医大学博士学位论文1.2.1主要仪器低温高速离心机Eppendoff解剖显微镜宁波舜宇细胞超声粉碎仪宁波新芝Milli-Q纯水仪Millipore精细电子天平METTLERTOLEDOSpectrophotometerND-1000NanoDropConcentrator5301EppendorfPeltierThermalCyclerPTC-225MJHybridizationOvenG2545AAgilentAgilentG2565CAMicroarrayScannerAgilentPipetteP-2.5,P-20,P-200,P-1000EppendorfPCR扩增仪ABI9700NanoDrop2000超微量分光光度计Thermo实时定量PCR仪ABI7500FAST2方法2.1lncRNA+mRNA表达谱芯片检测2.1.1样本totalRNA的提取和质检用Trizol(Invitrogen，USA)提取目的组织块中的总RNA。并进一步采用NucleoSpin®RNAclean-up试剂盒（740.948.250）对总RNA进行过柱纯化。然后用分光光度计方法对所提取总RNA进行定量，用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。2.1.2TotalRNA合成cDNA2.1.2.1FirstStrandcDNA的反转录合成在200µL无核酸酶的离心管中依次加入以下试剂：1)取5µLTotalRNA(100-500ng)，加入到离心管中。2)取1µL晶芯®基因表达谱外参（Cat.No.360030）加入该离心管，同时根据下表加入相应体积的Agilentspike-in。-35- 第四军医大学博士学位论文双通道spike-in加入体积对应表TotalRNAMaximumFirstSecondThirdMixvolumevolumeofRNA(µL)2008.31:201:251:1023007.31:201:251:1034006.31:201:251:1045005.31:201:251:1053)在冰上配制反转录MasterMix，轻轻混匀，短暂离心后置于冰上。反转录MasterMix:组分名称体积lncRNA+mRNAFirstStrandBufferMix4µLFirstStrandEnzymeMix1µLTotalVoulme5µL4)取5µL反转录MasterMix，加入到含有TotalRNA样品的离心管中。反转录最终反应体积为10µL。5)轻柔吹吸混匀2-3次，短暂离心后置于冰上。6)将配制好的反转录离心管置于PCR仪上，25℃条件下反应1h，42℃条件下反应1h，4℃反应保持5min以上。取出反转录离心管，短暂离心后置于冰上，准备下一步进行SecondStrandcDNA合成反应。2.1.2.2SecondStrandcDNA的合成1)在冰上配制SecondStrandMasterMix，轻柔混匀，短暂离心后置于冰上。SecondStrandMasterMix：组分名称体积Nuclease-freeWater32.5µLSecondStrandBufferMix12.5µLSecondStrandEnzymeMix5µLTotalVoulme50µL2)将50µLSecondStrandMasterMix加到2.1.2.1步骤中的反应管中，混合后总体积为60µL；轻柔吹吸混匀2-3次，短暂离心后置于冰上。3)将第二链合成离心管置于PCR仪上，16℃条件下反应1h，65℃条件下反应10min，4℃保持5min以上。4)PCR仪反应结束后将反应管迅速冻存于-20℃。-36- 第四军医大学博士学位论文2.1.3体外cRNA的转录合成1)配制体外转录MasterMix，轻柔混匀，短暂离心将溶液收集于管底。体外转录MasterMix：组分名称体积T7BufferMix24µLT7EnzymeMix6µLTotalVoulme30µL2)将30µL体外转录MasterMix加到2.1.2.2步骤的反应管中，吹吸混匀，短暂离心置于冰上。3)将配制好后的离心管置于PCR仪上，40℃反应16h，4℃保持。4)反应结束后，短暂离心，采用NucleoSpin®RNAclean-up试剂盒（MN公司，740.948.250）对产物进行纯化，采用紫外分光光度计对纯化后的cRNA产物进行定量。2.1.4cRNA反转录1)取10µgcRNA纯化产物，调整体积至22µL，加入到200µL无核酸酶离心管中，并加入2µLRandomPrimer混匀，置于PCR仪上，在70℃5min，25℃5min，4℃2min条件下反应后，短暂离心后冰上放置。2)配制cRNA反转录MasterMix，轻柔混匀，短暂离心后冰上放置。cRNA反转录MasterMix：组分名称体积2nd-CycleBufferMix8µL2nd-CycleEnzymeMix8µLTotalVoulme16µL3)将16µL反转录MasterMix加入2.1.3步骤反应后的离心管中，总体积为40µL，轻柔吹吸混匀2-3次后短暂离心。4)将配制好的cRNA反转录离心管置于PCR仪上，在25℃条件下反应10min，40℃条件下反应1.5h，70℃条件下反应10min，4℃条件下反应5min后将离心管置于冰上。5)将2µLRNaseH加入反应后的cRNA反转录离心管中，轻柔混匀后短暂离心，置于PCR仪上，在37℃条件下反应45min，95℃条件下反应5min，4℃条件下维持5min。-37- 第四军医大学博士学位论文6)反应结束后，立即进行纯化操作。7)cDNA的纯化使用Nucleospin®ExtractII(MN公司，Cat.No.740609.250)试剂盒进行，纯化后cDNA产物的定量使用紫外分光光度计进行。2.1.5荧光标记1)将4µLRandomPrimer加入到14µLcDNA产物中，轻柔混匀，短暂离心后置于PCR仪上，在95℃条件下变性3min，冰上放置5min。2)依次加入下列试剂，轻柔吹打2-3次混匀。组分名称体积5×KlenowBuffer5µLCy5-dCTP（或Cy3-dCTP）1µLKlenowFragmen1.2µL3)短暂离心后，置于PCR仪上，在37℃条件下反应1.5h，70℃条件下反应5min。4℃保持。4)反应结束后，使用Nucleospin®ExtractII(MN公司，Cat.No.740609.250)试剂盒以及紫外分光光度计分别对反应产物进行cDNA纯化以及纯化后的产物进行荧光掺入量和核酸定量。2.1.6芯片杂交2.1.6.1标记产物杂交准备将单管标记（cy3-dCTP）纯化洗脱产物抽真空浓缩或补水体积至27.5µL，作为单通道芯片杂交反应的备用试剂。2.1.6.2杂家体系配制、杂交反应1)将2.1.6.1步骤中准备好的标记产物，与下表中试剂混合。组分用量2XGExHybBuffer55.0µLFormamide27.5µLSample27.5µLTotalVolumePrepared110µL2)在杂交盖片围栏中加入100µL杂交液，安装好Agilent杂交盒后，轻轻水平转动杂交盒，检查各个亚阵的杂交腔体内液体是否流动。3)对称安装杂交盒于杂交炉的转子上，在托盘中加入适量超纯水后，45℃条件下杂交过夜。-38- 第四军医大学博士学位论文2.1.7芯片清洗及扫描1)杂交反应结束后，使用博奥SlideWasher8芯片洗干仪对芯片进行清洗，按以下程序清洗：洗液I：2×SSC,0.2%SDS,42℃120s,清洗2遍。洗液II：2×SSC,0.2%SDS,42℃80s,清洗3遍。清洗完成后，离心甩干，待扫描。2)使用Agilent芯片扫描仪（G2565CA）对清洗后的芯片进行扫描，得到杂交图片。2.1.8芯片数据分析使用AgilentFeatureExtraction(v10.7)软件对杂交图片进行分析并提取数据。使用AgilentGeneSpring软件对所提取数据进行归一化和差异分析。2.2差异表达基因的扩大样本验证2.2.1差异表达基因的进一步筛选人为提高入选条件：探针荧光初始信号值≥100，差异倍数≥3。2.2.2样本totalRNA的提取1)取出冻存组织标本，称取100mg后，放入1.5mL去RNA酶的离心管中。2)每个离心管中加入1mLTrizol，冰上静置5min后，用眼科剪剪碎组织后继续静置30min。3)每管中加入1/5体积Trizol（约200μl）的氯仿，上下颠倒混匀后静置20分钟4)将离心管放入低温离心机中，以12000r/min的转速，4℃离心15min，收集各组离心管中澄清上清液，移入1.5ml的去RNA酶的离心管中。5)加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀后静置30分钟，以12000r/min的转速，4℃离心15min，。6)缓慢小心地倾去液体，每管加入1ml的无水乙醇（或者DEPC水配制的75%乙醇），以12000r/min的转速，4℃离心10min7)缓慢小心地倾去液体。将离心管倒扣于滤纸上，约10分钟后待白色沉淀变透明。8)加入60℃预热的DEPC水40-100μl，溶解沉淀。-39- 第四军医大学博士学位论文2.2.3RNA质量检测采用NanoDrop2000超微量分光光度计对提取的总RNA进行质量及浓度检测。取各待测样品各2ul进行检测，以2μlDEPC水做空白对照。读取OD260与OD280的比值，介于1.8-2.0范围内说明所测样本RNA纯度较好，可进行进一步实验。同时所记录得RNA浓度（ng/μl），根据实验需要用无菌水对其进行适当稀释。保存于-70℃低温冰箱备用。2.2.4反转录用Takara的反转录试剂盒，20μL的反应体系（配制过程在冰上操作），反应液配制如下：ReagentsVolume5×PrimeScriptRTMasterMix4μLTotalRNA2μLRNasedH2O14μL反应条件为：37℃下反应15min，85℃下反应5s。反应完成后4℃保存。2.2.5Real-timePCRmRNA引物由上海海宁公司设计合成，引物序列及参数：REG4F:5’-CACTGTGCTGAGATGAGCTCCAATA-3’；R:5’-GGCTGTGCAGGAGTTAGCAGAA-3’，CXCL1F:5’-CAAACCGAAGTCATAGCCACAC-3’；R:5’-GGATTTGTCACTGTTCAGCATCTT-3’，SLC6A19F:5’-CTGGTGTGCCTGCCATAGGA-3’；R:5’-ATGCCCATAAAGCCTGCATTTC-3’，PTPRRF:5’-CAGCCAGCCGAATTCTCACA-3’；R:5’-AGTTCCATGACGCGGAATATCAA-3’，-40- 第四军医大学博士学位论文DGAT1F:5’-ATCCTTGAGATGCTGTTCTTCA-3’；R:5’-TGAGCCAGATGAGGTGATTG-3’，VIPF:5’-ACCCTGTACCAGTCAAACGTCACTC-3’；R:5’-GAAGTTGTCATCAGCTTTGCTCCA-3’，AQP8F:5’-CCTGCTTGTTGGACTGCTCATTA-3’；R:5’-ATCCCACGAGCTCTGCTTCAC-3’，LOC647264F:5’-CGTCCACACCTCAGAAGCA-3’；R:5’-AGCCAGTTCCATAGCCACAG-3’，ATP12AF:5’-AGCAGAGTTCAAGCCAGGAC-3’；R:5’-ATCAAGCACCCAATCAGACC-3’，lncRNA引物及内参GAPDH由上海生工生物工程股份有限公司设计合成，引物序列及参数：ENST00000552785.1F:5’-GCCTTGTGGAAGTGAGAAGG-3’；R:5’-TGGAAGCGTTTGTTGGGTAT-3’，uc003uxs.3F:5’-CGCCTCAGCCTTCAGAGTAG-3’；R:5’-ATCACACCATTGCACTCCAG-3’，ENST00000417786.1F:5’-TGTGTGTTGGCTTCCTGAGA-3’；R:5’-TGTTCTGGGTCACATGGCTA-3’，ENST00000453732.1F:5’-TCTGAGCTGGACAGTGAGGA-3’；R:5’-GGAAGCGTTTGTTGGGTATC-3’，-41- 第四军医大学博士学位论文ENST00000434195.1F:5’-CTGTGTGTGTTGGCTTCCTG-3’；R:5’-TGTTCTGGGTCACATGGCTA-3’，ENST00000423523.1F:5’-CTGGAGTGCAATGGTGTGAT-3’；R:5’-ACAAAAACTAGCCGGGTGTG-3’，GAPDHF:5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’；R:5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’，使用前，按照说明向各管引物中加入适量无菌水将其配制成为10uM的浓度。2)配制反应液：用Takara的反转录试剂盒，20μL的反应体系（配制过程在冰上操作），反应液配制如下：ReagentsVolumeSYBR10.0μLPCRForwardprimer(10μM)0.8μLPCRReverseprimer(10μM)0.8μLcDNA2.0μLROX0.4uldH2O6μL3)PCR扩增反应参数的设置：（两步法PCR扩增）标准程序：第一步：预变性95℃变性30s第二步：PCR扩增95℃3s;60℃30s,总循环为40个以病变组织为实验组，正常结肠组织为对照组，处理过程注意低温及避光中进行。所检测目的基因均以GAPDH作为内参，以△△CT法进行定量比较相对表达量。2.2.6统计学处理基因相对表达量根据需要采用独立样本t检验及独立样本Wilcoxon秩和检验。应-42- 第四军医大学博士学位论文用SPSS19.0软件进行统计学分析，符合正态分布的定量资料以表示，P<0.05为差异有统计学意义。3结果3.1患者临床特征30例HSCR患儿平均年龄为10.6月(0.7-26.7月)，其中6例大于1岁，24例小于1岁；男24例，女6例；长段型7例，短段型23例。患儿均无伴发症，其父母均无HSCR病史3.2组织芯片结果与正常肠管组织相比，有217个lncRNAs和122个mRNAs在HSCR无神经节细胞肠管组织中呈差异表达，其中表达上调的lncRNAs有13个mRNAs有16个；表达下调的lncRNAs有204个，mRNAs有106个（FoldChange>=2且P值<0.05）。提高入选条件进一步筛选后得到6个lncRNA和9个mRNA。差异表达结果见表1，表2，散点图（图1）和火山图（图2）表1HSCR中差异表达lncRNAslncRNAIDFC(abs)Regulationp-valuesENST00000552785.14.48up0.029uc003uxs.33.01up0.035ENST00000417786.13.19down0.008ENST00000453732.13.35down0.007ENST00000434195.16.34down0.019ENST00000423523.13.11down0.026入选条件：探针荧光初始信号值≥100，差异倍数≥3或≤0.3表2HSCR中差异表达mRNAsGeneFC(abs)Regulationp-valuesSymbolREG43.24up0.049CXCL13.22up0.030SLC6A197.15down0.017-43- 第四军医大学博士学位论文PTPRR4.27down0.038DGAT14.16down0.039VIP8.49down0.004AQP85.26down0.015LOC6472645.95down0.011ATP12A3.19down0.020入选条件：探针荧光初始信号值≥100，差异倍数≥3或≤0.3图1差异表达基因的散点图A:差异lncRNA表达的散点图B:差异mRNA表达的散点图实验和对照样本的信号值散点图，其中上调基因标注为红色，下调基因标注为绿色，表达无差异基因标注为黑色。-44- 第四军医大学博士学位论文图2差异表达基因的火山图A:差异lncRNA表达的火山图B:差异mRNA表达的火山图由芯片数据组间t检验分析得到p-value值与探针信号差异的Foldchange值两个因素共同-45- 第四军医大学博士学位论文绘制的火山图，用于展示两组样品数据的显著性差异。在火山图里﹐其中纵坐标显示着由t-test计算出来的log2ofp-values﹐横坐标则显示在两个条件比较下log2转换后的改变值。3.3聚类及富集分析结果根据6个样品表达模式的相关性进行差异聚类，对照组与HSCR组lncRNA和mRNA聚类图存在显著差异（见图3）。在对差异基因的富集分析中，疾病相关通路主要体现在FGF（fibroblastgrowthfactor）受体与其配体的相互作用，以及补体系统相关通路上（见图4）。GO分析中，差异主要由体液免疫反应、营养物质的转运与代谢、FGF对内皮细胞的趋化作用等方面组成（见图5）。而在疾病的富集分析中，可显著聚集在HSCR上（P=0.0007，图6），进一步证明筛选结果的可靠性。-46- 第四军医大学博士学位论文图3差异基因聚类图A为差异lncRNA在HSCR病变组（S1、S2、S3）与对照组（C1、C2、C3）表达的聚类图B为差异mRNA在HSCR病变组（S1、S2、S3）与对照组（C1、C2、C3）表达的聚类图图中绿色代表与对照相比表达下调，红色代表表达上调，黑色为无差异图4疾病相关通路富集图纵坐标为方框内数据库的分类内容，横坐标为基因数目所占百分比经log2转换后的改变值图5疾病相关GO富集图图中纵坐标为GO数据库的分类内容，横坐标为基因数目所占百分比经log2转换后的改变值-47- 第四军医大学博士学位论文图6显著富集到的疾病图中纵坐标为方框内所示数据库的分类内容，横坐标为基因数目所占百分比经log2转换后的改变值3.4qRT-PCR结果根据进一步筛选结果，选择ENST00000552785.1,uc003uxs.3,ENST00000417786.1,ENST00000453732.1,ENST00000434195.1,ENST00000423523.1在30例样本中做扩大样本qRT-PCR验证。结果表明，狭窄段ENST00000552785.1相对表达量高于扩张段，差异具有统计学意义(t=3.70，P<0.0001)；狭窄段ENST00000434195.1相对表达低于扩张段，差异具有统计学意义(t=4.82，P<0.0001)；而uc003uxs.3,ENST00000417786.1,ENST00000453732.1,ENST00000423523.1相对表达在二者之间无明显差异，结果见图7。总共获得3个mRNA，其表达量的差异经扩大样本验证后在病变组织与对照组织中有统计学意义，其中狭窄段DGAT1、PTPRR相对表达低于扩张段，差异具有统计学意义(t=12.91，P<0.0001；t=2.81，P<0.0001)，CXCL1的表达在狭窄段较扩张段增加，差异具有统计学意义(t=3.70，P<0.001)结果见图8。-48- 第四军医大学博士学位论文图7lncRNA在HSCR与对照中qRT-PCR验证结果（n=30）A为ENST00000552785.1的相对表达量，与对照相比，其表达量显著增高B为ENST00000434195.1的相对表达量，与对照相比，其表达量显著降低C为uc003uxs.3的相对表达量，与对照相比，其表达量的变化无统计学意义(t=0.57,p=0.57)D为ENST00000453732.1的相对表达量，与对照相比，其表达量的变化无统计学意义(t=0.55,p=0.58)E为ENST00000417786.1的相对表达量，与对照相比，其表达量的变化无统计学意义(t=1.27,p=0.21)F为ENST00000423523.1的相对表达量，与对照相比，其表达量的变化无统计学意义(t=1.80,p=0.08)***:P<0.0001-49- 第四军医大学博士学位论文图8mRNA在HSCR与对照中qRT-PCR验证结果（n=30）A为CXCL1在病变组织与对照组织中的相对表达量，与对照相比其表达量显著增加B为DGAT1在病变组织与对照组织中的相对表达量，与对照相比其表达量显著降低C为PTPRR在病变组织与对照组织中的相对表达量，与对照相比其表达量显著降低D为REG4在病变组织与对照组织中的相对表达量，其表达量的变化无统计学意(t=2.22,p=0.06)E为SLC6A19在病变组织与对照组织中的相对表达量，其表达量的变化无统计学意义(t=0.11,p=0.91)F为VIP在病变组织与对照组织中的相对表达量，其表达量的变化无统计学意义(t=2.10,p=0.06)G为AQP8在病变组织与对照组织中的相对表达量，其表达量的变化无统计学意(t=1.21,p=0.26)H为LOC647264在病变组织与对照组织中的相对表达量，其表达量的变化无统计学意义-50- 第四军医大学博士学位论文(t=1.28,p=0.24)I为ATP12A在病变组织与对照组织中的相对表达量，其表达量的变化无统计学意义(t=1.41,p=0.20)***:P<0.0001;**:P<0.0014讨论HSCR属于多因素遗传病，其中基因因素与疾病的发生、发展存在密切的联系。目前已知有14种突变基因与该病的发病有关[99]。对于散发性病例，其主要突变基51/51s-l/s-l-因是RET和EDNRB[100,101]。在动物水平，Ret和Ednrb基因突变小鼠在生后出现巨结肠样的表现及病理改变，提示基因因素在疾病发生中的重要作用[92,102]。近年来，在对HSCR患者和动物模型的基因筛查中，又有新的易感基因和修饰基因出现，如RELN，GAL，GAP43等[103]。由此可见，遗传因素在HSCR疾病的发生中起至关重要的作用。非编码RNAs（noncodingRNA，ncRNA）是指不具有蛋白质编码功能却是生物体生命活动中必不可少的RNA分子。根据其长度分为小于200nt的短链非编码RNAs，和大于200nt的长链非编码RNA（longnoncodingRNA，lncRNA）。近年研究表明，miRNA作为基因调控因子在介导细胞的增殖、迁移、分化、凋亡等生物过程中，对正常生长发育、生理功能以及多种肿瘤、先天性和神经系统等疾病的发生发展起关键作用[95]。而lncRNA作为非编码家族的重要成员，其与疾病的关系也逐渐成为研究的热点。研究发现lncRNA在一些疾病中表达异常，并显示出一定的组织特异性。它可以通过多种机制促进细胞的增殖、迁移，与多种疾病的发生、发展密切相关[104]。本研究在常规筛选差异mRNA的基础上，通过lncRNA芯片技术比较了HSCR患者与对照结肠组织中mRNA及lncRNA表达谱的差异，筛选并鉴定出一批与HSCR疾病状态相关的lncRNA和mRNA分子，为HSCR疾病发病机制中非编码基因调控领域提供了新的调控分子。本研究在对差异编码基因的富集分析中，疾病类型的富集最显著的是HSCR（P=0.00068），间接证实了筛选结果的可靠性。随后采用实时定量PCR检测技术作进一步验证，建立起HSCR的差异mRNA及lncRNA表达谱。研究发现，差异lncRNA中ENST00000552785.1，ENST00000434195.1和差异mRNA中CXCL1，DGAT1，-51- 第四军医大学博士学位论文PTPRR与疾病的状态密切相关，可作为疾病的特异基因差异表达分子，而其余基因与筛选结果不一致，这可能与基因芯片技术的假阳性有关，由于PCR验证的病例标本涉及的群体更为广泛，因此以PCR的结果为准。同时，生物信息学分析提示这些lncRNA主要参与RNA的剪接，结合，转运等过程；DGAT1主要与肠粘膜上皮细胞对营养物质的转运；CXCL1属于趋化因子家族，通过G蛋白偶联受体、2型趋化因子受体，参与炎症与中性粒细胞的募集过程中。PTPRR主要参与ERK信号通路可逆的蛋白磷酸化调节，与神经元的增殖分化密切相关。在中枢神经系统退行性疾病的研究中，酪氨酸磷酸化是研究中枢神经元增殖、分化及功能发挥的重要调控机制，这一过程由蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）与蛋白酪氨酸激酶的调控来实现。表达于人类中枢神经系统具有酪氨酸磷酸化功能的PTPs亚型主要由PTPRR基因编码，同啮齿类的Ptprr基因。该基因编码产物PTP-SL表达于新生期小鼠小脑蒲肯野细胞上，而该基因敲除小鼠脑组织中ERK1/2磷酸化水平显著上调，同时动物表现出运动协调障碍以及平衡失调等共济失调的症状[105]。提示该基因的调控参与了中枢神经系统功能的发挥。本研究通过基因芯片技术发现该基因在以肠神经系统中神经节细胞缺失为病理改变的组织中显著下调，提示PTPRR基因改变与HSCR密切相关，并且有可能参与肠神经系统发育障碍导致疾病发生的过程。因此，本研究下一步拟采用基因及蛋白相对定量检测技术从临床标本及细胞水平作进一步研究，为HSCR的发病机制提供新的探索。-52- 第四军医大学博士学位论文第二部分PTPRR在HSCR患者不同肠段结肠组织或神经前体细胞中的表达特点及意义前言有研究表明，在评估不同部位组织PTPRR基因表达水平中发现，该基因大量表达于脑组织以及下消化道，提示其表达的下调可能与这些部位疾病的发生有关。而关于该基因编码蛋白PTPRR的研究主要集中在中枢神经系统运动协调区域，如小脑、大脑皮层[106,107]，以及宫颈癌、前列腺癌等肿瘤性疾病中[108,109]。在结肠部位的研究，目前仅有少量结肠肿瘤相关研究进行报道[110]，这些研究主要关注肿瘤易感部位结肠粘膜中PTPRR的表达情况，对于维持肠道结构的重要成员的肌层组织却无相关报道。在前一部分的研究中我们发现，经基因芯片筛选出来的HSCR疾病相关基因PTPRR，其表达量经扩大样本人群进一步验证其差异的显著性，提示其可能参与疾病的发生发展过程。为明确该设想，本部分研究拟从不同肠段组织检查其编码蛋白PTPRR分布及表达量的情况，同时从细胞水平探索其可能发挥的功能及作用意义。1材料1.1实验对象1.1.1临床标本选择2015年1月至2016年1月于西安交通大学医学院第二附属医院小儿外科行根治手术的患儿，共30例。这些患儿均经术前钡灌肠和术后病理切片诊断HSCR。HSCR患儿的无神经节细胞肠道组织标本和正常结肠标本于术中切除后立即收集，用于免疫组织化学实验的标本放入预冷的4%多聚甲醛固定，余标本置于液氮冻存，过夜后存放于-80℃冰箱长期保存。本研究获得医院伦理委员会批准，标本采集均经患儿家长签属知情同意书。-53- 第四军医大学博士学位论文1.1.2实验动物7-8周龄雌性C57/BL6小鼠20只，雄性小鼠10只，购买并饲养于第四军医大学o实验动物中心。动物自由进食进水，被饲养在温度恒定（24±2C）、湿度恒定（50-60%）以及光照强度固定（5lx）的SPF环境中，黑白循环时间从早上8点到下午6点。所有的动物实验均符合第四军医大学动物伦理委员会的要求。为获得有明确胎龄的胎鼠，采用交配后雌鼠阴道见栓的方法：前一天下午17:00雌雄小鼠按2:1比例合笼，第二天早8：00检查雌鼠阴道，有明确阴栓即为受精成功，标记为E0.5（Embryonic0.5day），分笼喂养。1.1.3细胞1.1.3.1原代培养：肠神经嵴细胞（ENCCs）1.1.3.2细胞株：SH-SY5Y（上海交通大学纳米生物医学工程研究所馈赠）1.2主要试剂及耗材RecombinantMurinebFGFInvitrogenRecombinantMurineEGFInvitrogenB27-supplementInvitrogenN2-supplementInvitrogenChickEmbryoExtractLyophilizedSeraLaboratoriesInternationalPenicillin-StreptomycinInvitrogenRetinoicacidSigmaβ-mercaptoethanolSigmaL15(LEIBOVITZ’S)InvitrogenDMEM,HighGlucoseInvitrogenFibronectinHumanProteinInvitrogenDispaseSigmaCollagenaseSigmaRecombinantHumanHeregulinβ-1PeprotechRecombinantHuman/Murine/RatBMP-2PeprotechRecombinantHumanGDNFPeprotech-54- 第四军医大学博士学位论文Rabbitanti-PTPRRantibodyProteintechGroupGoatanti-PTPRRantibodySantacruz,Rabbitanti-neuronalclassIIIβ-tubulinAbcamIncRabbitanti-GFAPantibodyAbcamIncRabbitanti-RETantibodyPromegamouseanti-Sox10antibodySantacruzAlexaFluor®488Goat-anti-rabbitIgGInvitrogenAlexaFluor®594Goat-anti-rabbitIgGInvitrogenAlexaFluor®488Goat-anti-mouseIgGInvitrogenAlexaFluor®594Goat-anti-mouseIgGInvitrogenAlexaFluor®488Donkey-anti-goatIgGInvitrogenGoat-anti-rabbitHRPInvitrogenRecombinantHumanGDNFpeprotechRecombinantHuman/Murine/RatBMP-2peprotechRecombinantHumanHeregulinβ-1peprotech6wellpermanoxslidecorningCellstrainer(0.45um)BDFalconMicroforcepsRWDLifeScience1.3主要仪器解剖显微镜Olympus光学显微镜Olympus激光共聚焦成像仪OlympusCO2恒温细胞培养箱Thermo超净工作台Thermo低温高速离心机Eppendoff垂直电泳仪BIO-RADWesternblot转印仪BIO-RAD凝胶成像系统UVPNanoDrop2000超微量分光光度计Thermo-55- 第四军医大学博士学位论文PCR扩增仪ABI9700实时定量PCR仪ABI7500FAST1.4溶液和试剂配制1)L15medium:将L15粉末加入950ml蒸馏水中，室温下轻柔搅拌溶解，调整PH至7.6，补充加入蒸馏水至终体积1L,用0.22微米虑孔过滤。2)collagenase/dispase(0.2mg/mLeach):用不含钙镁离子的PBS将100mg冻干粉溶解至100mg/ml，0.22微米滤膜过滤后再稀释成1mg/ml的母液（1:99），分装于-20℃保存，使用时1ml母液加入4ml不含钙镁离子的PBS，稀释成0.2mg/mL的工作液。3)chickenembryoextract:用10毫升蒸馏水将冻干粉溶解，0.22微米滤膜过滤后分装，保存于-20℃。4)fibroblastgrowthfactor(20ng/mL):用灭菌蒸馏水250μl将25μg冻干粉溶解至0.1mg/ml,分装后-20℃保存，使用时将储存液20μl加入培养基100ml中，稀释成终浓度20ng/mL。5)epidermalgrowthfactor(20ng/Ml):用灭菌PBS1000μl将100μg冻干粉溶解至0.1mg/ml，分装后分装后-20℃保存，使用时将储存液20μl加入培养基100ml中，稀释成终浓度20ng/mL。6)β-mercaptoethanol(50mM):使用时将350μl原液加入100ml培养液中，即为所需浓度。7)retinoicacid(35ng/mL):在避光条件下，将50mg粉末溶于14.3mlDMSO中稀释成浓度为3.5mg/ml的储存液，20℃避光保存，可保存2周，使用时将储存液1μl加入培养基100ml中，稀释成终浓度35ng/mL8)fibronectin(20μg/mL):用50mLDPBS将1.0mg/1.0mL的原液稀释成20μg/mL的2工作液，分装后-20℃保存。使用时按100μl/cm的浓度铺板，37℃1-2小时后吸净备用（注意保持板底表面湿润）9)完全培养基(neuralcrestmedium)：如下表，可4℃避光保存1周试剂用量(总量100ml)DMEMmedium85mlN2-supplement(1%)1mlB27-supplement(2%)2mlRecombinantMurinebFGF20μl-56- 第四军医大学博士学位论文RecombinantMurineEGF20μlPenicillin-Streptomycin(1%)1mlChickenEmbryoExtractLyophilized(CEE)10mlRetinoicacid1μlβ-mercaptoethanol350μl10)ENCCs诱导分化培养基：将10%CEE换成10%FBS11)BMP2(1nM):将10μgBMP2冻干粉溶于100μl灭菌蒸馏水中，即0.1μg/μl的储存液，分装后-20℃保存，使用时将储存液0.26μl加入培养基2ml中，稀释成终浓度1nM。12)GDNF(50ng/ml):将10μgGDNF冻干粉溶于100μl灭菌蒸馏水中，即0.1μg/μl的储存液，分装后-20℃保存，使用时将储存液1μl加入培养基2ml中，稀释成终浓度50ng/ml13)NRG1(1nM):将10μgBMP2冻干粉溶于100μl灭菌蒸馏水中，即0.1μg/μl的储存液，分装后-20℃保存，使用时将储存液0.42μl加入培养基2ml中，稀释成终浓度1nM。2方法2.1组织标本免疫荧光染色2.1.1标本固定、石蜡包埋、切片1)将术中所取标本用0.9%生理盐水冲洗后，置于预冷的4%多聚甲醛中固定2)取出4%多聚甲醛固定的肠道组织，沿纵轴修剪至1×0.2cm大小组织条后放入包埋盒中，进行脱水处理；3)用石蜡固定包埋肠道组织；4)以5μm厚度对标本进行连续切片，贴于多聚赖氨酸处理的防脱载玻片上；5)将切片置于60℃烤箱烤片2小时，室温下保存待用。2.1.2石蜡切片免疫荧光染色1)脱蜡：将烤片后的肠道组织切片置于二甲苯脱蜡，10minx2次；2)水化：将切片分别置于100%、90%、80%、75%梯度酒精进行组织水化，各5min，蒸馏水清洗，5minx2次；3)微波法修复抗原：将肠道组织切片置于预先加热至沸腾的枸橼酸盐缓冲液中，在微-57- 第四军医大学博士学位论文波炉用高档加热至沸腾后调至低档，继续加热8min，断电后补充枸橼酸盐缓冲液至容器适当容积，低档条件下加热8min，断电取出玻片，自然冷却至室温；4)PBS液清洗，3minx3次；5)滴加3%的过氧化氢溶液以灭活内源性过氧化酶的活性，水平摇床上避光条件下室温孵育10min，PBS液清洗，5minx3次；6)滴加正常山羊血清封闭液，37℃封闭1h；7)第一个一抗杂交：滴加Sox10(鼠抗，1:50)，4°C过夜(用PBS代替—抗作为阴性对照)。8)次日取出组织切片，室温下复温30min，PBST冲洗5min，x4次，之后PBS冲洗5min；9)第一个荧光二抗杂交：滴加二抗(山羊抗鼠，1:100)37°C避光孵育60min；10)PBST冲洗5min，x4次，之后PBS冲洗5min。以下步骤均在避光条件下操作；11)第二个一抗杂交：滴加第二个一抗PTPRR(兔抗，1:50)，避光下37°C孵育3h；12)PBST冲洗5min，x4次，之后PBS冲洗5min；13)滴加第二个荧光二抗(山羊抗兔，cy3标记)(1:100)，室温孵育1h；14)PBST冲洗5min，x4次，之后PBS冲洗5min；15)滴加DAPI(1:100)，室温孵育5min，PBS冲洗5min，x3次；16)滴加防淬灭封片剂于组织切片上，盖玻片盖于封片剂处；17)使用激光共聚焦观察拍照，采集数据2.2ENCCs原代培养及鉴定2.2.1ENCCs原代培养及传代1)C57/BL6小鼠雌雄合笼，根据见栓时间获得孕14.5天的C57/BL6孕鼠；2)断颈处死孕鼠，无菌条件下分离胚胎至预冷L15培养液的玻璃皿中；3)解剖显微镜下机械分离胃泡至结肠末端肠道组织；34)在60cm皿中将其剪碎至1×1mm，5)将混悬液移入15mL离心管中用20ng/ml纤连蛋白/中性蛋白酶37℃消化15min；6)1500rpm离心5min，弃上清，PBS重悬，用玻璃滴管缓慢轻柔吹打10min；7)再次1500rpm离心5min后弃上清，用完全的ENCC培养基重悬。-58- 第四军医大学博士学位论文8)重悬液依次过200目、100目筛网，收集细胞滤液后进行细胞计数，调整细胞浓度55至8x10每孔，接种在低粘附6孔板中（每孔细胞数约8×10）。于37℃，CO2恒温细胞培养箱中培养。9)观察ENCCs生长情况,培养第3天每孔加入400μl完全培养基（5×）。10)培养约7天待神经球生长至平均直径大约100μm时，可进行传代。11)传代时收集培养液于15ml离心管中，100g离心5min；12)弃上清，加入5mlPBS清洗1次，100g离心5min；13)弃上清，加入500μl重悬细胞，37℃消化5min；14)加入完全培养基1ml，中和消化液，并用玻璃管轻轻吹打分散细胞，按1:2比例进行传代。15)第3代细胞可用于实验。2.2.2ENCCs干性及分化能力的鉴定1)传代培养ENCCs细胞球生长至适合直径大小后，将悬浮分布神经球的培养液完全吸出，置于预先包被fibronectin玻片的6孔板中，培养过夜，待神经球粘附于玻片后，吸出培养基，PBS冲洗每孔2次；2)加入甲醇2ml，4℃固定10min，吸去甲醇，PBS冲洗2次；3)加入0.02%Triton，室温下穿孔10min，吸去Triton，PBS冲洗2次；4)将爬有神经球的玻片从6孔板取出，细胞爬片面向上，粘附于载玻片上，爬片四周划圈定孵育液体体积（大约200μl/片）；5)加入5%正常山羊血清封闭液或10%驴血清200μl，37℃封闭1h；6)滴加双染第一个一抗GFAP(鸡抗，1:500)，或Sox10(鼠抗，1:50)，4°C过夜；7)次日取出孔板，37℃复温30min，PBST冲洗5min，x5次；8)滴加F488标记的山羊抗鸡IgG(1:500)或cy3标记的山羊抗鼠IgG(1:1000)，避光条件下室温孵育1h；9)PBST冲洗5minx4次，之后PBS冲洗5min；10)滴加第二个一抗兔抗TUJ1(1:200)或RET(1:100)，避光条件下37°C孵育3h；11)PBST冲洗5minx4次，之后PBS冲洗5min；12)滴加第二个荧光二抗(山羊抗兔，cy3标记)(1:100)，室温孵育1h；-59- 第四军医大学博士学位论文13)PBST冲洗5minx4次，之后PBS冲洗5min；14)滴加DAPI(1:100)，室温下孵育5min；15)PBS清洗5minx3次；16)滴加防荧光淬灭封片剂于细胞爬片上，盖玻片盖于封片剂处；17)使用激光共聚焦观察拍照，采集数据；2.3PTPRR在ENCCs中的表达2.3.1ENCCs的诱导分化及鉴定将传代至第3代的ENCCs，在铺板时将完全培养基换为诱导分化培养基，置于预先包被fibronectin玻片的6孔板中，培养过夜，待细胞分化并粘附于玻片后，吸出培养基，PBS冲洗每孔2次；余步骤同2.2.2.2.3.2PTPRR在诱导分化前后ENCCs中的表达变化2.3.2.1免疫荧光染色检测PTPRR的分布及表达同2.2.22.3.2.2RT-qPCR半定量检测PTPRR的表达传代培养ENCCs细胞球生长至适合直径大小后，收集悬浮分布神经球的培养液，1500rpm离心5min，弃上清。样本totalRNA的提取，RNA质量检测，反转录及Real-timePCR步骤同第一部分实验。小鼠PTPRRmRNA引物由上海海宁公司设计合成，引物序列及参数：F:5’-GAAACAGCACCTCCACCTCTGTC-3’；R:5’-ACACTGCCCAGGCTACTCATGTC-3’，反应条件同第一部分实验2.3.2.3免疫印迹法检测PTPRR的表达情况1)传代培养ENCCs细胞球生长至适合直径大小后，收集悬浮分布神经球的培养液，1500rpm离心5min,弃上清，加入合适体积的完全细胞裂解液（RIPA裂解液+蛋白酶o抑制剂+PMSF），水平摇床上冰浴中裂解过夜，4C条件下以12000rpm的转速离心15min，收集上清，一部分采用BCA法进行蛋白定量，另一部分照上清液/上样缓冲液比例4/1的量在各组上清液中加入对应体积的5×loadingbuffer，恒温水浴锅煮沸o10min，使蛋白充分变性，接着以12000r/min的转速，4C离心10min，保存备用。-60- 第四军医大学博士学位论文2）SDS-PAGE凝胶电泳：将规格1.0mm的两块玻璃板清洗干净组装好后按下表2配方进行配胶，下层分离胶配好混匀后迅速灌注至合适位置，上层用去离子水填充压实，室温聚合30min，待分离胶凝聚后将上层的水倒掉并用滤纸吸干残余，将浓缩胶灌至刚好溢出，插入梳子，室温凝聚20min。垂直拔出梳子，在电泳槽中加入新鲜配制的电泳缓冲液，在相应的样品孔内依次加入各样本，接通电源，80V恒压电泳至溴酚蓝跑出浓缩胶至分离胶层面时，调电压至120V，根据目的蛋白分子量大小适时停止电泳。表3电泳分离胶和浓缩胶配方配方12％分离胶3％浓缩胶去离子水3.3mL2.6mL4×lowerbuffer2.5mL—30％AB4.0mL0.4mL4×upperbuffer—1.0mL10％SDS90μL40μL10％AP90μL40μLTEMED10μL6μL3）转膜：在转膜用的夹子的黑面海绵垫上平整地放五层滤纸，用转膜液浸透后赶出层与层之间的气泡，小心剥下分离胶后平整铺在滤纸上，调整位置使其与滤纸对齐，用玻璃棒赶尽胶与滤纸之间的气泡。将甲醇充分浸泡过的PVDF膜平铺在胶上，去除气泡，在膜上盖五层滤纸，最后盖上另一个海绵垫，合上夹子后放入电转槽内，接通电源，冰上100V恒压转膜100min。4）封闭：染色和封闭：将膜放入0.2%的丽春红染液中染色5min，用去离子水洗去多余的染料，根据目标蛋白的分子量将膜裁开后放入5%的脱脂奶粉中，脱色摇床上缓慢摇动，室温封闭1.5h。5）免疫杂交：向膜上加入用一抗稀释液稀释后的β-actin(1:10000)及相应抗体，赶尽气泡后封口机封口，室温孵育2h或4℃孵育过夜，回收一抗，将膜放入TBST中漂洗2次，每次10min，尔后转移至TBS中漂洗10min，同样的方法加入相应的二抗后室温孵育1.5h，用TBST在室温下脱色摇床上洗膜两次，每次10min，接着再用TBS漂洗10min。6）凝胶成像：将化学发光液A和B以1:1的比例等量混合均匀后涂于膜的表面，用-61- 第四军医大学博士学位论文Bio-Rad凝胶成像仪显影成像。7）灰度分析：用软件QuantityOne对蛋白电泳条带进行灰度分析，以β-actin为内参，将对照组灰度设为100%，其余各组条带灰度以对照组的百分比表示。2.4PTPRR在BMP2、GDNF及NRG1干预后ENCCs中的表达变化情况2.4.1BMP2、GDNF及NRG1干预ENCCs的方法及检测将传代至第3代的ENCCs，接种后48小时，将细胞及培养液移入预先放置无菌盖玻片的6孔板中，同时在培养液中分别加入BMP21nM、GDNF50ng/ml、NRG11nM，37℃培养24小时，待细胞分化并粘附于玻片后，吸出培养基，PBS冲洗每孔2次；余步骤同2.2.2.采用免疫荧光染色检测TUJ1与GDNF的表达。染色方法同2.2.2。2.4.2PTPRR表达变化的检测2.4.2.1免疫荧光染色检测PTPRR的分布及表达以未干预组为对照，检测PTPRR在干预组ENCCs中的表达情况。染色方法同2.2.2。2.4.2.2RT-qPCR半定量检测PTPRR的表达以未干预组为对照，检测PTPRR在干预组ENCCs中的表达情况。步骤方法同2.3.2.22.5统计学方法实验组及对照组数据采用独立样本t检验及独立样本Wilcoxon秩和检验。应用SPSS19.0软件进行统计学分析，符合正态分布的定量资料以表示，P<0.05为差异有统计学意义。3结果3.1PTPRR与Sox10在患者不同肠段的免疫荧光表达情况本研究选取正常结肠为对照，检测PTPRR在病变不同肠段的表达情况。在正常结肠，PTPRR蛋白主要表达于粘膜下和肌间神经丛内，以神经节细胞胞质为主；扩张段PTPRR的表达较正常段减少；狭窄段未见阳性染色（见图9D,G,J）。选取Sox10标记神经前体细胞，与PTPRR共染，进一步明确PTPRR的细胞表达定位。在HSCR正常段和正常结肠，Sox10主要表达于肌间神经丛内神经节细胞胞核内，与PTPRR呈现细胞共表达；扩张段Sox10的表达同PTPRR一致较正常段减少；-62- 第四军医大学博士学位论文狭窄段未见阳性染色（见图9D-L）。由于Sox10也可表达于分化后的神经胶质细胞，因此为明确PTPRR表达的细胞类型，本研究将PTPRR与胶质细胞特异标记物GFAP共染，观察两者细胞定位情况。染色结果表明，在正常结肠组织中，GFAP主要表达于肌间神经丛内的神经胶质细胞胞质中，与PTPRR无共表达情况。再一次证明两者细胞定位的区别（见图9A,B,C）。图9不同肠段组织PTPRR、GFAP、Sox10免疫荧光染色情况-63- 第四军医大学博士学位论文A,B,C:PTPRR与GFAP在正常肠段组织中的免疫荧光双染情况D,E,F:PTPRR与Sox10在正常肠段组织中的免疫荧光双染情况G,H,I:PTPRR与Sox10在HSCR扩张段肠组织中的免疫荧光双染情况J,K,L:PTPRR与Sox10在HSCR狭窄段段肠组织中的免疫荧光双染情况标尺代表50μm.3.2原代培养ENCCs的形态学特点接种24小时后，可见大量散在悬浮细胞成簇生长，无明显球样形态（见图10A）；培养大约7天左右，可见大量悬浮神经球生长，主球体周围可见子代神经球生长，主球体直径约100微米，边缘透亮球体中央灰暗，适宜传代，如图10B。传代后第二代细胞培养3天后可见大量球样细胞团生长，直径大约80微米，神经球周围其他细胞生长明显减少，球体形态更突出（图10C），可用于进一步实验。图10ENCCs培养不同阶段光镜结果A:ENCCs原代细胞接种24小时镜检结果B:ENCCs原代细胞接种第7天镜检结果C:ENCCs第2代细胞接种第3天镜检结果标尺代表100μm.3.3原代培养ENCCs的生物学特性3.3.1ENCCs的干性鉴定Sox10是神经前体细胞ENCCs的特异性转录因子标记物，RET是原癌基因RET基因编码产物，主要表达于胶质与神经元前体细胞，通过检测Sox10与RET的表达对原代培养细胞的干性进行鉴定。染色结果表明，神经球中大部分细胞呈双阳性表达++（图11），有大约68.2%±5.6（n=10）细胞为Sox10RET细胞，提示经过传代后的原-64- 第四军医大学博士学位论文代培养神经球绝大部分为ENCCs。图11Sox10与RET免疫荧光双染标记ENCCsA:RET在ENCCs中的阳性表达B:Sox10在ENCCs中的阳性表达C:Sox10与RET在ENCCs中的阳性表达标尺代表50μm.3.3.2ENCCs多向分化能力的鉴定在明确原代培养获得的ENCCs神经嵴干细胞特性后，为进一步鉴定ENCCs的多向分化能力，采用免疫荧光双染技术检测神经元特异性标记物TUJ1与神经胶质细胞特异性标记物GFAP在诱导分化前后ENCCs中的表达情况。染色结果表明，在未分化ENCCs神经球中TUJ1标记的神经元主要分布于球体表层，而GFAP标记的神经胶质细胞主要分布于神经元以内的球体细胞胞质内（图12A,B,C）；经胎牛血清诱导分化培养后，TUJ1与GFAP各自表达于不同类型分化细胞胞质中，并且细胞出现明显的分化形态（如图12D,E,F）-65- 第四军医大学博士学位论文图12TUJ1与GFAP免疫荧光双染标记分化前后ENCCsA:GFAP在未分化ENCCs中的阳性表达B:TUJ1在未分化ENCCs中的阳性表达C:TUJ1与GFAP在未分化ENCCs中的阳性表达D:GFAP在诱导分化后ENCCs中的阳性表达E:TUJ1在诱导分化后ENCCs中的阳性表达F:TUJ1与GFAP在分化后ENCCs中的阳性表达标尺代表50μm.3.4PTPRR在分化前后ENCCs中的表达情况3.4.1免疫荧光染色检测PTPRR的分布及表达情况临床标本免疫荧光染色提示，PTPRR主要表达于肠肌间神经丛内，Sox10阳性的神经前体细胞胞质内。在未诱导分化ENCCs球体内，PTPRR表达于50%左右ENCCs细胞胞体内，与Sox10核染阳性的细胞有共表达表现（图13A,B,C）。ENCCs神经嵴干细胞经胎牛血清诱导分化后，通过免疫荧光染色发现，伴随神经球内细胞的分化迁移，Sox10阳性的神经前体细胞形态发生改变，且诱导分化后前体细胞数量明显减少，而PTPRR仍然在前体细胞胞质内呈现阳性表达，并且伴随前体细胞数量的减少呈现阳性表达率的下降（图13D,E,F）-66- 第四军医大学博士学位论文图13PTPRR与Sox10免疫荧光双染标记分化前后ENCCsA:PTPRR在未分化ENCCs中的阳性表达B:Sox10在未分化ENCCs中的阳性表达C:Sox10与PTPRR在未分化ENCCs中的阳性表达D:PTPRR在诱导分化后ENCCs中的阳性表达E:Sox10在诱导分化后ENCCs中的阳性表达F:Sox10与PTPRR在分化后ENCCs中阳性表达标尺代表50μm.3.4.2RT-qPCR半定量检测PTPRR的表达情况为进一步明确PTPRR表达的变化情况，本研究选取传至第3代正常培养条件下ENCCs为对照，检测相同数量前体细胞在诱导分化后神经细胞中PTPRR的相对表达量。结果表明，诱导分化后细胞中PTPRR的相对表达量显著低于正常培养条件下的ENCCs（平均约32.5±8.9倍），差异具有统计学意义(t=519.8，P<0.0001，图14A)。同时，具有神经嵴干细胞特性的神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y，其PTPRR的相对表达量也远远高于无神经嵴干细胞特性的子宫颈癌细胞系Hela（平均约162.3±16.8倍），差异具有统计学意义（t=519.8，P<0.0001，图14B）-67- 第四军医大学博士学位论文3.4.3免疫印迹法检测PTPRR的表达情况同时，采用免疫印迹法检测分化前后细胞中PTPRR蛋白的表达，与基因水平检测结果一致，诱导分化后细胞中PTPRR蛋白的相对表达量显著低于正常培养条件下的ENCCs，差异具有统计学意义(t=16.35，P<0.01，图14C,D)图14PTPRRmRNA与蛋白在分化前后ENCCs或SH-SY5Y中的表达A:PTPRRmRNA在分化前后ENCCs中的表达B:PTPRRmRNA在SH-SY5Y中的表达C:PTPRR蛋白在分化前后ENCCs中的表达条带图D:PTPRR蛋白在分化前后ENCCs中的表达统计图**:P<0.01;***:P<0.0013.5PTPRR在神经营养因子干预多向分化能力后ENCCs中的表达情况3.5.1免疫荧光检测BMP2，GDNF，NRG1干预后ENCCs的变化研究表明，BMP2能诱导外周神经嵴细胞向神经元细胞分化，而抑制向胶质细胞的分化，从而干预神经前体细胞的多向分化能力。因此本研究采用免疫荧光双染的方法检测ENCCs在BMP2干预后神经元及胶质细胞的表达变化，以此来研究ENCCs对BMP2干预的反应性。光镜下观察发现，与未干预组相比，BMP2干预组ENCCs球体数量无明显变化，但平均直径显著减小（85.6±13.1μmvs136.7±23.2μm，P=0.0078，-68- 第四军医大学博士学位论文图15J），并且球体中TUJ1阳性表达明显增多，同时出现明显的分化形态；而球体中GFAP的阳性表达明显减少甚至缺失，与文献报道基本一致（图15D,E,F）。同样具有神经元谱系诱导作用的细胞因子GDNF在干预ENCCs24小时后，光镜下观察，与未干预组相比GDNF干预组ENCCs球体数量及直径无明显变化（148.2±18.0μmvs156.9±16.12μm，P=0.218，图15K）。荧光染色结果类似于BMP2干预组，球体中TUJ1阳性表达显著增加；而球体中GFAP的阳性表达明显减少，同时出现明显的分化形态（图15G,H,I），表明GDNF诱导ENCCs向神经元谱系分化成功。NRG1具有诱导外周神经嵴细胞向胶质细胞分化，而抑制向神经元分化的作用，为进一步研究分化前后ENCCs的变化，本研究采用免疫荧光双染的方法检测ENCCs在NRG1干预后神经元及胶质细胞的表达变化。光镜下观察，与未干预组相比，NRG1干预组ENCCs球体数量无明显变化，平均直径有所减小，但差异无统计学意义（98.1±25.1μmvs135.6±35.76μm，P=0.061，图16G）。荧光染色见球体中TUJ1阳性表达显著减少；而球体中GFAP的阳性表达明显增加，同时出现明显的分化形态（图16D,E,F），表明NRG1诱导ENCCs向胶质谱系分化成功。-69- 第四军医大学博士学位论文图15TUJ1与GFAP免疫荧光双染标记BMP2/GDNF干预前后ENCCsA:GFAP在未干预ENCCs中的阳性表达B:TUJ1在未干预ENCCs中的阳性表达C:TUJ1与GFAP在未干预ENCCs中的阳性表达D:GFAP在BMP2干预后ENCCs中的阳性表达-70- 第四军医大学博士学位论文E:TUJ1在BMP2干预后ENCCs中的阳性表达F:TUJ1与GFAP在BMP2干预后ENCCs中阳性表达G:GFAP在GDNF干预后ENCCs中的阳性表达H:TUJ1在GDNF干预后ENCCs中的阳性表达I:TUJ1与GFAP在GDNF干预后ENCCs中阳性表达J:BMP2干预前后ENCCs球体直径统计图K:GDNF干预前后ENCCs球体直径统计图标尺代表50μm.**:P<0.01;图16TUJ1与GFAP免疫荧光双染标记NRG2干预前后ENCCs-71- 第四军医大学博士学位论文A:GFAP在未干预ENCCs中的阳性表达B:TUJ1在未干预ENCCs中的阳性表达C:TUJ1与GFAP在未干预ENCCs中的阳性表达D:GFAP在NRG2干预后ENCCs中的阳性表达E:TUJ1在NRG2干预后ENCCs中的阳性表达F:TUJ1与GFAP在NRGP2干预后ENCCs中阳性表达G:NRG2干预前后ENCCs球体直径统计图标尺代表50μm.3.5.2免疫荧光检测PTPRR的表达变化另一方面检测PTPRR在三种细胞因子干预后ENCCs中的表达发现，与未干预组相比，BMP2干预组ENCCs中PTPRR阳性表达明显减少。由干预前的大约50%的阳性率下降到干预后大约10%的阳性率，同时Sox10的阳性表达率也出现相应减少（见图17D,E,F）。同时GDNF干预组ENCCs中PTPRR阳性表达也显著减少，甚至未见阳性表达，Sox10的阳性表达率也出现相应减少（见图17G,H,I），提示BMP2及GDNF诱导的ENCCs向神经元谱系的分化可导致具有多向分化能力的神经前体细胞减少进而伴随细胞中PTPRR表达的减少NRG1干预组ENCCs中PTPRR阳性表达出现显著减少。由干预前的大约40%的阳性率下降到干预后大约10%的阳性率，同时Sox10的阳性表达率也出现相应减少，提示NRG1诱导的ENCCs向神经胶质谱系的分化同样可导致神经前体细胞减少以及细胞中PTPRR的减少（见图17J,K,L）。-72- 第四军医大学博士学位论文图17PTPRR与Sox10免疫荧光双染标记BMP2/GDNF/NRG2干预前后ENCCsA:PTPRR在未干预ENCCs中的阳性表达B:Sox10在未干预ENCCs中的阳性表达C:PTPRR与Sox10在未干预ENCCs中的阳性表达D:PTPRR在BMP2干预后ENCCs中的阳性表达E:Sox10在BMP2干预后ENCCs中的阳性表达F:PTPRR与Sox10在BMP2干预后ENCCs中阳性表达-73- 第四军医大学博士学位论文G:PTPRR在GDNF干预后ENCCs中的阳性表达H:Sox10在GDNF干预后ENCCs中的阳性表达I:PTPRR与Sox10在GDNF干预后ENCCs中阳性表达J:PTPRR在NRG2干预后ENCCs中的阳性表达K:Sox10在NRG2干预后ENCCs中的阳性表达L:PTPRR与Sox10在NRG2干预后ENCCs中阳性表达标尺代表50μm.3.5.3RT-qPCR半定量及免疫印迹法检测PTPRR的表达进一步的检测表明，与未干预组相比，BMP2、GDNF干预组ENCCs中PTPRRmRNA的相对表达量均明显减少，平均约为37.3±3.5%及24.6±3.2%，且差异具有统计学意义(t=403.8vs83.62，P<0.0001，图18A)。同时，免疫印迹检测结果显示，BMP2、GDNF干预后ENCCs中PTPRR的表达受到明显抑制（53.4±4.4%vs36.3±2.7%图18B,C），与基因水平变化一致，再一次提示特定谱系诱导分化后的ENCCs中PTPRR的表达显著减少，即PTPRR可能与维持ENCCs的细胞多能性有关RT-qPCR及免疫印迹法检测结果表明，PTPRRmRNA及蛋白在NRG1干预组ENCCs中的表达量均明显减少（分别约为38.5±2.4%与49.3±3.9%），且差异具有统计学意义(t=350.5，P<0.0001，图18A,B,C)。又一次证明特定谱系诱导分化后的ENCCs中PTPRR的表达显著减少，即PTPRR可能与维持ENCCs的细胞多能性有关。-74- 第四军医大学博士学位论文图18PTPRRmRNA与蛋白在神经营养因子干预后ENCCs中的表达A:PTPRRmRNA在神经营养因子干预后ENCCs中的表达B:PTPRR蛋白在神经营养因子干预后ENCCs中的表达条带图C:PTPRR蛋白在神经营养因子干预后ENCCs中的表达统计图NC:negativecontrol;NGF+:neuralgrowthfactor;**:P<0.01;4讨论肠道神经系统（ENS）又称为人的―第二大脑‖，由成千上万的肠神经节相互连接组成，包含15种神经元类型及数种胶质类型细胞[111]，这些细胞高度协调调控肠道发挥物质吸收转运、肠道动力及免疫和内分泌功能[47]。而ENS的发育是一项复杂且非同步的生物学事件，涉及神经嵴来源的肠神经嵴细胞在胚肠中的正确迁移、增殖及分化。小鼠肠神经系统发育的关键时期在胚胎期(E)9.0-14.5，相当于人类胚胎期第4周至第14周[62,112]，在此期间肠神经嵴细胞进入前肠间质，由头向尾端迁移，直至定植于整个肠道末端，迁移过程中神经嵴细胞伴随发生增殖与分化行为。同时，神经前体细胞在这些过程中受一系列周围微环境中神经营养因子及趋化因子的影响，包括从E10.5开始表达于小鼠肠粘膜下层的骨形态发生蛋白（BMP2/4），神经嵴细胞进入前肠间质沿肠道迁移至后肠末端整个过程中持续表达的胶质细胞营养因子（GDNF）[59]、成纤维生长因子（FGF）、胶质细胞生长因子（NRG1）等，这些细胞因子及其介导的信号分子通路参与了神经前体细胞的增殖、迁移以及分化，满足神经前体细胞的营养需求并为其提供趋化诱导。ENS发育的复杂性决定了HSCR病因学的复杂性及多因素性，疾病类型及严重程度的差异由多种遗传因素及环境因子共同引起。为了更好地理解该疾病，大量研究致力于疾病易感基因及相关细胞及分子机制的探索中。基于遗传学的筛查，目前已发现数个与疾病相关的基因，并且在动物水平，已明确其在ENS发育中的作用。但是，鉴于ENCCs介导的ENS发生发育的复杂性，疾病病理机制研究还需要更为广泛及全面的研究，将ENS形成过程中ENCCs的生物学行为影响机制作为研究的基础，是寻找HSCR病因的根本内容。人源PTPRR基因又称PTPRQ，EC-PTP，PCPTP1，PTP-SL，PTPBR7，位于12q15，其编码的基因产物属于经典的跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）家族，即蛋白酪氨酸-75- 第四军医大学博士学位论文磷酸化酶R受体型。在评估不同部位组织PTPRR基因表达水平中发现，该基因大量表达于脑组织以及下消化道，提示其表达的下调可能与这些部位疾病的发生有关。本研究通过基因芯片筛选技术，获得疾病相关差异表达基因的线索，通过大样本验证及生物信息学分析，发现PTPRR基因可能参与了肠神经系统的发育生物学过程，因此，为明确该基因的生物学行为，首先检测了临床标本中其编码蛋白PTPRR的表达定位及病变与对照组之间表达量的差异。结果发现，在正常结肠标本，PTPRR主要表达于肌间神经丛的神经嵴细胞胞质内以及部分粘膜上皮细胞胞质内（结果未展示），同时，在肌间神经丛内的表达与神经前体细胞标志物Sox10有共定位现象，而与胶质细胞标志物GFAP无共表达，提示PTPRR在神经丛内表达的细胞类型可能为神经前体细胞。在神经节细胞缺失的HSCR病变段，PTPRR表达减少甚至缺如，这可能与神经前体细胞的减少有关。肠神经前体细胞是指一群具有自我更新及分化成为ENS的多向分化能力的干细胞，目前用于研究或临床治疗目的的细胞来源有小鼠胚胎期或新生期肠道神经前体细胞，新生期或婴儿期人肠道神经前体细胞，HSCR患者肠道神经前体细胞，人或小鼠胚胎干细胞等[74]，这些不同来源的神经前体细胞在群体数量及分化能力方面各异，但在基因功能研究及细胞水平分子生物学研究中发挥巨大作用，是研究ENS形成过程中ENCCs生物学行为的基础。为进一步研究PTPRR的生物学特点及功能，本研究采用原代培养小鼠肠神经前体细胞（ENCCs）作为实验对象，首先采用免疫荧光染色技术检测TUJ1与GFAP标记的神经元与胶质细胞在血清诱导分化后原代培养ENCCs中的表达，对ENCCs多向分化能力进行鉴定。接着以具有神经嵴干细胞特性的神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y为对照，通过免疫荧光、实时荧光定量PCR技术（RT-qPCR）及和免疫印迹技术检测PTPRR在ENCCs分化前后细胞中的定位及表达量的变化情+况。结果发现，PTPRR阳性荧光染色表达于约50%左右，Sox10ENCCs细胞中，而+诱导分化后PTPRR与Sox10ENCCs均减少，直观地提示PTPRR表达于分化前肠神经前体细胞中。同时PTPRR的mRNA与蛋白表达在分化后显著低于未诱导分化的ENCCs细胞中，并且在具有神经嵴细胞干性的SH-SY5Y中高表达，提示PTPRR与肠神经前体细胞的干性维持有关。为进一步证实该观点，本研究选用已明确的具有促进肠神经前体细胞向神经元谱系分化的细胞因子BMP2[67]、GDNF[84]以及具有促进肠神经前体细胞向胶质细胞-76- 第四军医大学博士学位论文谱系分化的细胞因子NRG1[91]，作为诱导ENCCs定向分化的因素，检测特定分化状态下PTPRR的表达变化情况。在预实验中，检测了不同浓度BMP2(0.1nM，1nM，10nM)，GDNF(5ng/ml，50ng/ml，500ng/ml)与NRG1(0.1nM，1nM，10nM)条件下ENCCs的分化情况，以BMP21nM，GDNF50ng/ml，NRG11nM的浓度下的ENCCs的分化效果最显著（结果未展示），故将此选为干预实验的最佳条件。本部分研究发现，不同细胞因子干预24小时后，ENCCs出现明显的分化形态，经免疫荧光染色标记神经元标志物TUJ1与胶质细胞标志物GFAP后发现，BMP2与GDNF干预后ENCCs分化细胞中TUJ1的阳性表达率显著增加，而GFAP的表达率显著减少甚至缺如，NRG1干预后ENCCs中两类标志物的表达情况完全相反，表明三种细胞因子干预后确实诱导ENCCs出现了相应谱系的分化。另外BMP2干预后ENCCs球体直径显著减小，差异具有统计学意义，而NRG1与GDNF干预后球体减小并不显著，提示BMP2可能对ENCCs的增殖能力产生影响。随后本研究检测了PTPRR在特定谱系诱导条件下的表达变化情况，结果显示，在3种细胞因子诱导分化后，伴随Sox10阳性标记细胞数量的减少，ENCCs中PTPRR的表达均出现不同程度的下调，以GDNF的作用最显著。表明具有定向诱导ENCCs分化的神经营养因子可以导致PTPRR表达的减少，即PTPRR可能与维持肠神经前体细胞多向分化能力有关。以上结果提示，PTPRR特异地表达于Sox10阳性的肠神经前体细胞与其功能的发挥密切相关，PTPRR可能参与了肠神经前体细胞未分化状态即细胞干性的维持。而具有特定谱系诱导分化作用的GDNF诱导ENCCs定向分化后伴随出现PTPRR的显著下调，可能与PTPRR发挥的维持神经前体细胞多能性的功能有关。为更全面地研究PTPRR在ENCCs中发挥的功能及相关作用机制，本研究拟在基因干预调控下，进一步研究ENCCs的生物学特性及相关通路分子的表达变化情况。-77- 第四军医大学博士学位论文第三部分PTPRR对肠神经前体细胞生物学行为调控的作用及机制前言肠神经嵴细胞的定植障碍是引起HSCR肠神经系统发育缺陷的根本原因，胚胎期这种定植需要足够数量的前体细胞在适当的遗传及环境因素干预下，完成ENS不同功能种类细胞的分化；另一方面这种定植也可发生在移植后的病变肠组织中，只要保证有充足多向分化能力的前体细胞来源就可以分化出有功能的肠神经细胞，提示肠神经前体细胞在正常ENS发育及疾病修复中的关键作用。肠神经前体细胞是一组具有自我更新能力及多向分化能力的干细胞，这种干细胞特性主要体现在三种方面：一是抑制细胞过度分化；二是维持细胞增殖能力；三是维持细胞的多向分化能力[113]。本研究前期工作中已证实PTPRR与肠神经前体细胞干性及多能性的维持有关，而对于这种干性维持的具体作用还不明确，除了维持细胞多向分化能力，是否还与维持细胞增殖能力有关，有待进一步证实。同时，PTPRR的编码蛋白作为蛋白酪氨酸磷酸酶家族成员，其发挥作用的机制是否与MAPK通路的调控有关，也需要进一步研究证实。综上，本研究拟采用基因干预技术，从细胞水平研究干扰或过表达PTPRR基因后肠神经前体细胞ENCCs在增殖、分化能力方面的变化，同时在基因调控的前提下激活MAPK通路后相应关键信号分子的表达情况，从而为PTPRR影响ENCCs生物学行为的作用机制作出初步探索。1材料1.1实验对象1.1.1实验动物7-8周龄雌性C57/BL6小鼠20只，雄性小鼠10只，购买并饲养于第四军医大学o实验动物中心。动物自由进食进水，被饲养在温度恒定（24±2C）、湿度恒定（50-60%）以及光照强度固定（5lx）的SPF环境中，黑白循环时间从早上8点到下午6点。所-78- 第四军医大学博士学位论文有的动物实验均符合第四军医大学动物伦理委员会的要求。为获得有明确胎龄的胎鼠，采用交配后雌鼠阴道见栓的方法：前一天下午17:00雌雄小鼠按2:1比例合笼，第二天早8：00检查雌鼠阴道，有明确阴栓即为受精成功，标记为E0.5（Embryonic0.5day），分笼喂养。1.1.2细胞1.1.2.1原代培养：肠神经嵴细胞（ENCCs）1.1.2.2细胞株：SH-SY5Y（上海交通大学纳米生物医学工程研究所馈赠）1.1.3质粒重组穿梭质粒为pAV[shRNA]-EGFP-U6（简称AVS1，为PTPRRshRNA重组穿梭质粒；可表达绿色荧光蛋白，由赛业公司制备）、AVS2(为PTPRR过表达基因重组穿梭质粒；可表达绿色荧光蛋白；由赛业公司制备)1.1.4PTPRR基因干预腺病毒包括基因下调重组腺病毒（PTPRR-shRNA#3/PTPRR-shRNA#5/PTPRR-shRNA#6）、基因过表达组腺病毒（PTPRR-ExpRNA）空白质粒重组腺病毒（blank-shRNA/blank-ExpRNA）1.2主要试剂及耗材RecombinantMurinebFGFInvitrogenRecombinantMurineEGFInvitrogenB27-supplementInvitrogenN2-supplementInvitrogenChickEmbryoExtractLyophilizedSeraLaboratoriesInternationalPenicillin-StreptomycinInvitrogenRetinoicacidSigmaβ-mercaptoethanolSigmaL15(LEIBOVITZ’S)InvitrogenDMEM,HighGlucoseInvitrogenFibronectinHumanProteinInvitrogen-79- 第四军医大学博士学位论文DispaseSigmaCollagenaseSigmaRabbitanti-PTPRRantibodyProteintechGroupGoatanti-PTPRRantibodySantacruz,Rabbitanti-neuronalclassIIIβ-tubulinAbcamIncRabbitanti-GFAPantibodyAbcamIncRabbitanti-RETantibodyPromegamouseanti-Sox10antibodySantacruzAlexaFluor®488Goat-anti-rabbitIgGInvitrogenAlexaFluor®594Goat-anti-rabbitIgGInvitrogenAlexaFluor®488Goat-anti-mouseIgGInvitrogenAlexaFluor®594Goat-anti-mouseIgGInvitrogenAlexaFluor®488Donkey-anti-goatIgGInvitrogenGoat-anti-rabbitHRPInvitrogenRecombinantHumanGDNFpeprotech6wellpermanoxslidecorningCellstrainer(0.45um)BDFalconMicroforcepsRWDlifescience1.3主要仪器解剖显微镜Olympus光学显微镜Olympus激光共聚焦成像仪OlympusCO2恒温细胞培养箱Thermo超净工作台Thermo低温高速离心机Eppendoff垂直电泳仪BIO-RADWesternblot转印仪BIO-RAD凝胶成像系统UVP-80- 第四军医大学博士学位论文NanoDrop2000超微量分光光度计ThermoPCR扩增仪ABI9700实时定量PCR仪ABI7500FAST1.4溶液和试剂配制同第二部分实验2方法2.1重组腺病毒过表达PTPRR-ExpRNA及下调PTPRR-shRNA的构建腺病毒载体构建及病毒包装由赛业（广州）生物科技有限公司负责制备，其简要操作步骤如下：2.1.1包装载体的构建1)根据PTPRR基因（Genebank#NM_011217.2）设计shRNA序列，本实验设计了3段干扰载体目的基因片段，分别为shRNA#3、shRNA#5、shRNA#6，pAV-NC为空载体阴性对照片段，将目的基因片段克隆入重组质粒载体中构建过表达载体。病毒载体构建及测序由赛业公司协助完成。2)全基因合成PTPRR基因（Genebank#NM_002849.3）的CDS区，AVS-NC为过表达基因空白载体阴性对照，并克隆入AVS1/AVS2包装载体中。病毒载体构建及测序由赛业公司协助完成。2.1.2病毒包装采用脂质体法转染293A细胞，成功后进行重组腺病毒的大量扩增。本部分实验由赛业公司协助完成。2.2干预PTPRR表达对ENCCs的影响2.2.1重组腺病毒过表达pAV[Exp]-Ptprr及下调pAV[shRNA]-Ptprr转染目标细胞2.2.1.2腺病毒感染目的细胞预实验51)收集处于对数生长期，生长状态良好的ENCCs，用完全培养基稀释至1×10cells/mL，4接种于96孔板（至少接种15个孔的量），每孔接种100μL上述细胞悬液（即1×10-81- 第四军医大学博士学位论文cells/well）。于5%CO2、37℃二氧化碳孵箱内培养过夜。2)准备12个无菌的1.5mLEP管，分别加入180μL的完全培养基。-1-123)采用有限稀释法稀释腺病毒，从10~10：取20μL腺病毒原液加入到有180μL-1完全培养基的第一个EP管中做1:10稀释（10）；然后以此为起点，从第一个EP管-2-12取20μL稀释液到第二管再做1:10稀释（10），直至稀释到10。4)从孵箱取出接种ENCCs后过夜培养的96孔板，显微镜下观察确定细胞良好的生-1-12长状态。吸掉孔内旧的培养基，依次加入按10~10的浓度梯度稀释的病毒液100μL到96孔板中，每种浓度接种一孔，以等体积完全培养基替代病毒液作为对照组。37℃,5%CO2孵箱内培养。5)6-12h后显微镜下观察细胞状态。细胞实验组与空白组无明显差异，表明腺病毒对细胞无明显毒性反应，不用换液，继续培养。6)分别在感染后的24、48h观察细胞中的荧光表达情况。综合细胞生长状态以及荧光表达情况来判断具有最佳感染效果的病毒稀释度，并以此稀释度作为后续感染试验的依据。2.2.1.3腺病毒感染目的细胞51)用完全培养基将生长状态良好的ENCCs稀释至1×10cells/mL，接种于6孔板，每5孔接种2mL上述细胞悬液（即2×10cells/well）。5%CO2、37℃二氧化碳孵箱内培养过夜。652)根据预实验结果，在ENCCs中加入病毒量1.19×10/1×10cells/well，设阴性对照及空白质粒组为空白对照3)病毒感染后48hENCCs中加入200μL（10×）诱导分化培养基,置37°C，5%C02孵箱中孵育；培养24小时后收集细胞进行下一步实验。2.2.2腺病毒转染效率的检测2.2.2.1RT-qPCR与免疫印迹法方法检测PTPRRmRNA、蛋白的表达收集转染后目的细胞，样本总RNA的提取，RNA质量检测，反转录及Real-timePCR步骤同第一部分实验。小鼠PTPRRmRNA引物由上海海宁公司设计合成，引物序列及参数：收集病毒转染组、阴性对照及空白质粒组ENCCs细胞，提取总蛋白后进行凝胶电-82- 第四军医大学博士学位论文泳，具体步骤同第二部分2.3.2.32.2.2.2免疫荧光法检测PTPRR的表达以阴性对照及空白质粒组ENCCs细胞为对照，检测PTPRR在干预组ENCCs中的表达情况。2.2.3PTPRR基因表达调控后影响ENCCs生物学行为的情况2.2.3.1免疫荧光化学法检测PTPRR基因表达调控后ENCCs多向分化情况以未加病毒组为阴性对照，空白质粒组为空白对照，检测TUJ1与GFAP在干预组ENCCs中的表达情况。染色方法同第二部分2.2.22.2.3.2EdU免疫化学法检测PTPRR基因表达调控后ENCCs增殖能力情况本实验采用EdU核染法来检测细胞DNA复制活性，以未加病毒组为阴性对照，空白质粒组为空白对照，检测各组ENCCs的增殖情况，具体步骤如下：51)取对数生长期ENCCs细胞，以每孔1×10细胞接种于6孔板中，37℃,5%CO2孵箱内孵育12h.2)根据分组情况用相应的PBS、下调或过表达腺病毒转染ENCCs细胞48h3)将含有悬浮细胞球的培养液移入预先放置有无菌玻片的6孔板中，在各孔中加入200μl含20μMEdU的ENCCs完全培养基，37℃,5%CO2孵箱内孵育24h.4)吸弃培养液，每孔加入1ml甲醇固定10min，PBS清洗3min×2次5)每孔加入1ml0.2%TritonX-100穿透细胞膜10min，PBS清洗3min×2次6)每孔加入1ml的1×Apollo®染色反应液，在避光条件下室温孵育30分钟后，弃染色反应液；7)每孔加入1ml含0.2%TritonX-100的PBS，脱色摇床清洗10min×2次8)每孔加入1ml1×Apollo®567反应液，在避光条件下室温孵育30分钟9)每孔加入1mlPBS清洗1~3次；10)每孔加入1mlDAPI(1:100)进行染核5min，PBS冲洗两遍；10)取出爬有细胞的盖玻片，滴加防淬灭封片剂以后，4℃湿润保存待测。2.2.4腺病毒干预前后GDNF诱导ENCCs定向分化的变化2.2.4.1干预方法在病毒转染ENCCs48小时后，更换含病毒培养液时，在每孔的完全培养基中加入-83- 第四军医大学博士学位论文GDNF50ng/ml，并将培养基移入预先放置有无菌盖玻片的6孔板内，继续培养24小时，待神经球粘附于盖玻片后收集盖玻片进行细胞免疫荧光，以未干预组为对照，检测神经元特异性标记物TUJ1与神经胶质细胞特异性标记物GFAP在干预组ENCCs中的表达情况。2.2.4.2免疫荧光法检测干预前后ENCCs分化的变化实验分为GDNF+空白质粒、GDNF+过表达、GDNF+下调组与GDNF+阴性对照与GDNF（-）+阴性对照，染色方法同第二部分2.2.22.2.4.3免疫荧光染色及免疫印迹检测干预前后ENCCs中pERK1/2表达的变化实验分为GDNF+空白质粒、GDNF+过表达、GDNF+下调组与GDNF+阴性对照组，染色方法同第二部分2.2.2。各组细胞提取总蛋白后进行凝胶电泳，具体步骤同第二部分2.3.2.33结果3.1腺病毒转染目的细胞情况65将预实验筛选出的最佳转染腺病毒滴度1.19×10/1×10cells/well转染ENCCs48小时后，荧光显微镜下观察，该转染条件下空白质粒对照组荧光阳性表达率大约在68%，细胞死亡比例约为32%，最大球体平均直径112±2.2μm；过表达组荧光阳性表达率大约在63%左右，细胞死亡比例约为24%，最大球体平均直径175.7±3.4μm；表达下调组荧光阳性表达率大约在65%左右，细胞死亡比例约为43%，最大球体平均直径69.4±1.8μm，且三组直径之间差异均具有统计学意义（见图19）。-84- 第四军医大学博士学位论文图19不同腺病毒转染组ENCCs镜检结果A:空白质粒组ENCCs光镜下观察结果B:过表达腺病毒组ENCCs光镜下观察结果C:下调表达腺病毒组ENCCs光镜下观察结果D:空白质粒组ENCCs荧光显微镜下观察结果E:过表达腺病毒组ENCCs荧光显微镜检结果F:下调基因表达组ENCCs荧光显微镜检结果-85- 第四军医大学博士学位论文G:腺病毒干预组与对照组GFP阳性细胞比率统计图H:腺病毒干预组与对照组细胞死亡比率统计图I:腺病毒干预组ENCCs球体直径统计图**:P<0.01;***:P<0.001.标尺代表100μm.3.2RT-qPCR及免疫印迹检测腺病毒对PTPRR的干扰效率转染24小时后RT-qPCR结果显示，空白对照与阴性对照组细胞中PTPRRmRNA表达无明显差异，表明腺病毒转染技术本身对PTPRR基因表达无明显影响。而下调腺病毒组PTPRRmRNA的相对表达量与空白对照组及阴性对照组相比有所下降，平均约46%左右，差异具有统计学意义（见图20）。转染48小时后，PTPRRmRNA的相对表达量显著下降，低至82%左右，差异具有统计学意义（t=36.3，P<0.01）。而过表达组在转染后24小时，PTPRRmRNA的相对表达量有所上升，平均约38%左右，差异具有统计学意义（t=59.2，P<0.01）。转染48小时后，PTPRRmRNA的相对表达量显著上调，至185%左右，差异具有统计学意义（t=48.4，P<0.01）。证实了在mRNA水平，下调或过表达腺病毒，能显著干预PTPRR的表达。转染48小时后免疫印迹检测结果显示，下调腺病毒组PTPRR蛋白的表达量较空白对照组及阴性对照组显著下降，平均约55%左右，差异具有统计学意义。而过表达组在转染48小时后，PTPRR蛋白的表达量显著上调，大约198%左右，差异具有统计学意义（如图20）。-86- 第四军医大学博士学位论文图20PTPRRmRNA与蛋白在腺病毒干预后ENCCs中的表达A:PTPRR蛋白在腺病毒干预后ENCCs中的表达条带图B:PTPRR蛋白在腺病毒干预后ENCCs中的表达统计图C:PTPRRmRNA在空白质粒组ENCCs中的相对表达D:PTPRRmRNA在不同时段腺病毒干预后ENCCs中的相对表达NC:negativecontrol;**:P<0.01;3.3免疫荧光染色法检测PTPRR的表达转染48小时后免疫荧光检测结果显示，下调腺病毒组PTPRR阳性荧光染色较空白对照组及阴性对照组显著下降，甚至缺失（图21J）。而过表达组在转染48小时后，PTPRR阳性荧光的表达显著增加（如图21G）。同时，为了观察神经前体细胞的数量变化，同时检测了各组细胞中Sox10的表达情况。与空白对照与阴性对照组细胞相比，过表达组ENCCs中Sox10阳性标记细胞数量显著增加，达70%左右，而下调组ENCCs中Sox10阳性标记细胞数量显著减少，至大约20%左右，差异均具有统计-87- 第四军医大学博士学位论文学意义（图21H,K）图21PTPRR与Sox10免疫荧光双染标记重组腺病毒干预前后ENCCsA:PTPRR在阴性对照ENCCs中的阳性表达B:Sox10在阴性对照ENCCs中的阳性表达C:PTPRR与Sox10在阴性对照ENCCs中的阳性表达D:PTPRR在空白质粒干预后ENCCs中的阳性表达E:Sox10在空白质粒干预后ENCCs中的阳性表达-88- 第四军医大学博士学位论文F:PTPRR与Sox10在空白质粒干预后ENCCs中阳性表达G:PTPRR在过表达腺病毒干预后ENCCs中的阳性表达H:Sox10在过表达腺病毒干预后ENCCs中的阳性表达I:PTPRR与Sox10在过表达腺病毒干预后ENCCs中阳性表达J:PTPRR在基因下调腺病毒干预后ENCCs中的阳性表达K:Sox10在基因下调腺病毒干预后ENCCs中的阳性表达L:PTPRR与Sox10在基因下调腺病毒干预后ENCCs中阳性表达NC:阴性对照;blank:空白质粒;Exp-RNA:过表达腺病毒;sh-RNA:基因下调腺病毒;标尺代表50μm.3.4免疫荧光化学法检测转染前后ENCCs多向分化情况为明确干预PTPRR后ENCCs的多向分化情况，本研究采用免疫荧光染色法检测TUJ1与GFAP在干预组ENCCs中的表达情况，以未加病毒组为阴性对照，空白质粒组为空白对照。染色结果显示，与空白对照与阴性对照组细胞相比，过表达组ENCCs中无明显分化形态细胞，TUJ1与GFAP的阳性表达与对照组相比显著减少；而下调组ENCCs出现大量分化细胞，TUJ1与GFAP表达于这些分化细胞胞质中，其中以TUJ1阳性表达的增加更显著。结合PTPRR与Sox10染色结果提示，PTPRR可能参与调控了ENCCs的多向分化行为，与肠神经前体细胞干性的维持直接相关（图22）。-89- 第四军医大学博士学位论文图22TUJ1与GFAP免疫荧光双染标记重组腺病毒干预前后ENCCsA:GFAP在阴性对照ENCCs中的阳性表达B:TUJ1在阴性对照ENCCs中的阳性表达C:GFAP与TUJ1在阴性对照ENCCs中的阳性表达D:GFAP在空白质粒干预后ENCCs中的阳性表达E:TUJ1在空白质粒干预后ENCCs中的阳性表达F:GFAP与TUJ1在空白质粒干预后ENCCs中阳性表达-90- 第四军医大学博士学位论文G:GFAP在过表达腺病毒干预后ENCCs中的阳性表达H:TUJ1在过表达腺病毒干预后ENCCs中的阳性表达I:GFAP与TUJ1在过表达腺病毒干预后ENCCs中阳性表达J:GFAP在基因下调腺病毒干预后ENCCs中的阳性表达K:TUJ1在基因下调腺病毒干预后ENCCs中的阳性表达L:GFAP与TUJ1在基因下调腺病毒干预后ENCCs中阳性表达NC:阴性对照;blank:空白质粒;Exp-RNA:过表达腺病毒;sh-RNA:基因下调腺病毒;标尺代表50μm.3.5EdU荧光化学染核法检测PTPRR基因表达调控后ENCCs增殖能力情况本研究采用胸腺嘧啶核苷类似物EdU，分析PTPRR表达下调或过表达后ENCCs增殖能力情况。结果显示，EdU阳性荧光染色表达于细胞核内，与DAPI呈现共表达现象，空白质粒对照组与阴性对照组EdU阳性荧光染色无明显区别，有大约50%的阳性表达率，提示该浓度下的腺病毒转染对细胞增殖能力无显著影响。PTPRR表达下调组EdU阳性荧光染色较对照组显著减少，大约20%左右的阳性表达率，而PTPRR过表达组EdU阳性荧光染色显著增加，有大约70%左右的阳性表达率。该结果表明，不同PTPRR基因的表达量与ENCCs细胞的增殖能力密切相关，呈现正相关关系（如图23）。-91- 第四军医大学博士学位论文图23EdU标记增殖状态下的ENCCsA:EdU在阴性对照组ENCCs中的阳性表达B:DAPI标记未阴性对照组ENCCsC:EdU与DAPI标记阴性对照组ENCCsD:EdU在空白质粒干预后ENCCs中的阳性表达E:DAPI在空白质粒干预后ENCCs中的阳性表达F:EdU与DAPI在空白质粒干预后ENCCs中阳性表达-92- 第四军医大学博士学位论文G:EdU在过表达腺病毒干预后ENCCs中的阳性表达H:DAPI在过表达腺病毒干预后ENCCs中的阳性表达I:EdU与DAPI在过表达腺病毒干预后ENCCs中阳性表达J:EdU在基因下调腺病毒干预后ENCCs中的阳性表达K:DAPI在基因下调腺病毒干预后ENCCs中的阳性表达L:EdU与DAPI在基因下调腺病毒干预后ENCCs中阳性表达NC:阴性对照;blank:空白质粒;Exp-RNA:过表达腺病毒;sh-RNA:基因下调腺病毒;标尺代表50μm.3.6免疫荧光检测基因表达调控下GDNF干预后ENCCs定向分化的变化第二部分实验结果中采用GDNF诱导ENCCs定向分化行为对PTPRR蛋白表达的显著影响，提示PTPRR蛋白可能参与了GDNF诱导的ENCCs定向分化。本部分研究在基因调控的前提下观察GDNF诱导ENCCs定向分化的情况来证明该过程是否受PTPRR表达的影响。染色结果显示，与阴性对照和空白对照相比，PTPRR过表达组GDNF诱导ENCCs后，球体仍保持未分化状态，TUJ1及GFAP阳性染色明显减少，未表现出向神经元谱系分化的状态；PTPRR下调组GDNF诱导ENCCs后，球体表现出明显分化状态，经免疫标记后，这些分化细胞呈TUJ1阳性，同时GFAP阳性染色显著减少甚至缺失（图24）。该结果表明，对PTPRR基因表达的调控影响了GDNF诱导的ENCCs定向分化效应，从而发挥维持神经前体细胞未分化状态及多向分化潜能。-93- 第四军医大学博士学位论文图24GDNF干预后TUJ1与GFAP免疫荧光双染标记ENCCsA:GFAP在阴性对照组ENCCs中的阳性表达B:TUJ1在阴性对照组ENCCs中的阳性表达C:GFAP与TUJ1在阴性对照组ENCCs中的阳性表达D:GFAP在空白质粒组ENCCs中的阳性表达E:TUJ1在空白质粒组ENCCs中的阳性表达F:GFAP与TUJ1在空白质粒组ENCCs中阳性表达-94- 第四军医大学博士学位论文G:GFAP在过表达腺病毒组ENCCs中的阳性表达H:TUJ1在过表达腺病毒组ENCCs中的阳性表达I:GFAP与TUJ1在过表达腺病毒组ENCCs中阳性表达J:GFAP在基因下调腺病毒组ENCCs中的阳性表达K:TUJ1在基因下调腺病毒组ENCCs中的阳性表达L:GFAP与TUJ1在基因下调腺病毒组ENCCs中阳性表达NC:阴性对照;blank:空白质粒;Exp-RNA:过表达腺病毒;sh-RNA:基因下调腺病毒;标尺代表50μm.3.8免疫荧光染色及免疫印迹检测基因表达调控下GDNF干预后ENCCs中pERK1/2表达的变化研究已证实PTPRR编码蛋白PTPRR负性调控了影响中枢神经细胞生长、增殖以及分化的MAPK/ERK1/2通路的磷酸化，同时，在外周肠神经系统MAPK通路是GDNF介导的ENCCs定向分化效应中关键信号通路。为进一步明确PTPRR维持神经前体细胞多能性作用的可能机制，本研究检测了PTPRR基因干预前提下，GDNF介导的MAPK通路活化中关键信号分子ERK1/2的磷酸化水平，以此对PTPRR参与神经前体细胞多能性维持的可能机制作初步探索。通过免疫荧光染色（图25）及免疫印迹（图26）检测发现，空白质粒腺病毒转染组与阴性对照组之间磷酸化ERK1/2（pERK1/2）的表达无明显差异，表明腺病毒转染技术不会对MAPK通路的活化产生影响。而PTPRR基因过表达组，pERK1/2在细胞中的阳性荧光染色及蛋白水平均显著减少，与PTPRR基因下调组中pERK1/2的阳性荧光染色及蛋白水平均显著增加结果相反，两组差异均具有统计学意义（图25,26）。该结果提示，PTPRR可能通过去磷酸化作用负性调控MAPK通路的激活而发挥神经前体细胞多能性维持的作用。-95- 第四军医大学博士学位论文图25GDNF干预后pERK1/2免疫荧光标记ENCCsA:pERK1/2在阴性对照组ENCCs中的阳性表达B:DAPI核染阴性对照组ENCCsC:pERK1/2与DAPI在阴性对照组ENCCs中的阳性表达D:pERK1/2在空白质粒组ENCCs中的阳性表达E:DAPI核染空白质粒组ENCCsF:pERK1/2与DAPI在空白质粒组ENCCs中的阳性表达-96- 第四军医大学博士学位论文G:pERK1/2在过表达腺病毒组ENCCs中的阳性表达H:DAPI核染过表达腺病毒组ENCCsI:pERK1/2与DAPI在过表达腺病毒组ENCCs中的阳性表达J:pERK1/2在基因下调腺病毒组ENCCs中的阳性表达K:DAPI核染基因下调腺病毒组ENCCsL:pERK1/2与DAPI在基因下调腺病毒组ENCCs中的阳性表达NC:阴性对照;blank:空白质粒;Exp-RNA:过表达腺病毒;sh-RNA:基因下调腺病毒;白色标尺代表50μm；黄色标尺代表25μm图26GDNF干预后pERK1/2蛋白在ENCCs中的表达A:pERK1/2蛋白在腺病毒干预后ENCCs中的表达条带图B:pERK1/2蛋白在腺病毒干预后ENCCs中的表达统计图NC:阴性对照;blank:空白质粒;exp-RNA:过表达腺病毒;sh-RNA:基因下调腺病毒;**:P<0.01;4讨论在遗传学研究领域，RNA干扰技术（RNAinterfering，简称RNAi）是一种通过小干扰RNA(SmallinterferingRNA,siRNA)抑制基因表达具有高度保守特性的生物学过程，已成为探索目的基因功能、遗传性疾病的基因调控机制、恶性肿瘤的基因治疗等方面有力的研究手段。miRNA(microRNA)和siRNA(smallinterferingRNA)两类小分子RNA是RNAi现象的中心环节，这两种小分子RNA可以靶向结合到特定mRNA，干扰特定mRNA的表达，从而发挥抑制或者增加目的基因的功能[114,115]；而筛选有效的RNA干扰功能的siRNA和将siRNA成功导入靶细胞或器官组织，并使其持-97- 第四军医大学博士学位论文续发挥RNA干扰效应是RNAi技术的关键步骤。目前常用的siRNA表达载体传递系统主要包括三类，分别是：质粒载体、噬菌体载体和病毒载体。其中以病毒载体传递系统最为有且效率最高。慢病毒和腺病毒载体是最常见的病毒载体传递系统，两种传递体系各有利弊，但是腺病毒仍然是目前技术最为成熟、转染效率较高、使用广泛的基因传递系统[116]。为实现最优干扰效应，本研究根据siRNA设计原则针对PTPRR特异性靶点设计了三对特异性短发卡RNA（shorthairpinRNA，shRNA），同时合成了PTPRR基因序列，并对病毒载体进行包装。在预实验部分，分别检测了三对特异性shRNA干扰目的基因PTPRR的表达效率，其中携带三种干扰片段的腺病毒均可与目的细胞迅速整合并持续稳定表达，通过RT-qPCR技术证实转染24小时后，腺病毒可以在细胞内保持稳定过表达和沉默水平至少5天（结果未展示），其中shRNA#3病毒可使PTPRRmRNA表达水平降低至80%以上，对PTPRR蛋白表达水平的抑制也能达到50%左右，因此被选为进一步实验研究的最佳shRNA，为PTPRR基因功能研究及作用机制提供了有力的研究基础。如前所述，肠神经前体细胞的干性主要体现在能够维持一定数量具有未分化状态及多向分化潜能方面。为了明确PTPRR参与ENCCs干性维持的具体作用，本研究在成功实施基因干预的基础上，评估了不同PTPRR表达条件下，ENCCs的细胞增殖能力与多向分化情况，结果发现，实施基因调控后ENCCs球体直径与细胞增殖能力出现显著变化，两者与PTPRR基因表达量呈正相关。同时，PTPRR过表达可抑制ENCCs向分化细胞的过渡。该部分结果提示PTPRR与ENCCs总体数量密切相关，即PTPRR的正常表达能维持一定数量的具有多向分化潜能的ENS前体细胞，而该作用正好解释在PTPRR表达减少的HSCR病变组织中Sox10标记的肠神经前体细胞数量减少的现象，进一步证明了PTPRR与HSCR疾病的相关性。丝裂原激活的蛋白激酶家族（Mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs）能够被一系列胞外刺激激活，从而在多种胞内事件如胚胎发生、增殖、分化、转化、凋亡等过程中产生作用，这些胞外刺激包括生长因子、血清素、内分泌激素、细胞因子以及能诱发应激相关反应的刺激[117,118]。哺乳动物的MAPK家族由胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedkinase，ERK)，p38以及c-JunNH2末端激酶(JNK；也叫应激激活的蛋白激酶stress-activatedproteinkinase，SAPK)组成，每种酶又包含多种亚型：ERK1到ERK8；p38-α，-β，-γ，-δ；JNK1到JNK3[119,120]。MAPK-98- 第四军医大学博士学位论文可被一过性或持续性地激活，这主要取决于细胞类型以及刺激的区别。JNK与p38信号通路主要由促炎因子如肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β，以及诱发应激相关反应的刺激如遗传毒性、渗透压、缺氧或氧化应激等激活。而ERK通路主要由生长因子相关肽类激活[121]。在胚胎发育时期，胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESCs)分化出所有胚层以及所有器官组织，在这过程中MAPKs参与了ESCs向特定谱系直至成熟期细胞的分化，神经系统的发生发育也不例外[122]。在中枢神经系统，神经嵴干细胞(Neuralstemcells，NSCs)的存活、增殖以及向特定神经谱系的分化由特异的外在及内在因素调控，这些因素包括神经营养因子、细胞因子、转录因子以及相关的信号通路等，而MAPKs可被外在因素激活的同时去激活内在因素故在CNS的发生发育中发挥重要作用。成纤维生长因子(FGF)-2属于强有力的促胚胎、胎儿及成人神经嵴干细胞有丝分裂及存活的因子，并且在体内体外发挥调控神经发生的作用，大多数观点认为，这种促增殖效应依赖于ERK1/2的激活[123]。而FGF-2并不仅仅是促增殖因子，还在神经发生中发挥促分化作用[124]。在这过程中，FGF-2诱导ERK1/2激活，导致转录因子CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)的磷酸化而使其激活，随后导致神经元特异基因的转录从而诱导出神经元的表型。内源性神经营养素（neurotrophins，NTs）可促进皮层神经元的发生，这一功能也是通过ERK1/2的激活。另一种环境营养因子脑源性神经营养素(brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF)在海马神经元的发生中发挥重要作用，它可以独自或协同转化生长因子β2(transforminggrowthfactorβ2，TGFβ2)通过ERK1/2与SMAD的调控来发挥作用[125]。肠神经系统是仅次于中枢神经系统的外周神经系统，在神经前体细胞沿头向尾端迁移过程中，来自中胚层的神经营养因子胶质细胞起源的神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor，GDNF)，在肠神经嵴干细胞的存活、增殖、迁移和分化中发挥重要作用。研究表明，GDNF是ENS前体细胞的化学趋化剂，指导其在胚胎发育期头向尾端的迁移[126,127]，而对于完成迁移后的ENS前体细胞，GDNF发挥促神经元前体细胞增殖的作用[68,128]同时参与神经元的分化过程，在这过程中ERK/MAPK信号级联的激活是必要条件，而未成熟的神经前体细胞在迁移和定植中持续保持ERK的低水平激活状态。由此可见，ERK1/2通路是营养因子介导神经系统发生的重要信号途径。MAPK/ERK1/2的激活及维持可促进神经前体细胞的增殖与迁移，而该信号通路的低水平激活或失活，是ENS前体细胞保持未分化状态的必要-99- 第四军医大学博士学位论文条件。Uesaka等人提出，ERK处于低水平激活的可能性是GDNF信号途径被负性调控因素抑制[84]，这种负性调控因素可能是在体外水平已经证实的Sprouty(Spry)分子，随后他们研究了Spry2基因敲除小鼠ENS前体细胞中ERK的激活水平，结果却出人意料地发现，基因敲除后的ENS前体细胞中ERK仍处于低水平激活状态，由此得出结论，在ENS前体细胞中对GDNF信号途径的负性调控并不是由Spry2介导。本研究前两部分工作发现了一种编码MAPK负性调控分子属于酪氨酸磷酸酶家族的基因PTPRR，该基因与神经前体细胞的多向分化潜能的维持密切相关。本部分研究通过基因调控技术，过表达或干预其表达后进一步证实该基因能够抑制GDNF诱导的肠神经前体细胞的定向分化，一方面提示该基因发挥保持ENCCs未分化状态的功能，另一方面证明该基因参与GDNF诱导前体细胞分化的过程。结合PTPs对MAPK通路的负性调控作用及Uesaka等人的研究，本实验探索了PTPRR维持ENS前体细胞多能性的机制，在基因调控的前体下，检测GDNF诱导MAPK通路激活的关键信号分子pERK1/2的表达水平。结果发现，上调PTPRR的表达后，ENS前体细胞中pERK1/2的表达水平显著降低，而下调PTPRR的表达后，ENS前体细胞中pERK1/2的表达水平出现显著增加，而MAPK通路的另外两信号分子JNK与p38的表达并无显著变化（结果未展示）。该结果表明，PTPRR可能通过负性调控MAPK/ERK1/2通路发挥维持ENS前体细胞多能性的作用。综上，PTPRR基因及其编码蛋白具有维持肠神经前体细胞增殖能力及多向分化潜能的作用，并可能通过负性调节MAPK/ERK1/2通路发挥抑制肠神经前体细胞定向分化的功能。这些功能与HSCR病变段肠神经前体细胞及后续分化后的神经节细胞的减少或缺失密切相关。-100- 第四军医大学博士学位论文小结1.结论本课题以HSCR为研究对象，采用基因芯片技术对临床标本的差异表达基因进行筛选，经过扩大样本人群验证目的基因差异表达后从临床标本检测、肠神经嵴干细胞实验、RNA干扰实验等多层次研究手段,通过分析人体肠道组织PTPRR的表达模式和分布特点，然后从分子水平、细胞水平观察干预PTPRR基因表达对神经嵴干细胞生物学行为的影响，证实PTPRR基因在ENS发生中发挥的重要作用，探究PTPRR影响ENCCs生物学行为的相关机制，主要发现如下：1.1筛选出HSCR疾病相关的差异基因表达谱通过基因芯片技术筛选获得HSCR相关lncRNA与mRNA表达谱，经进一步扩大样本验证，总共获得2个lncRNA和3个mRNA，其表达量的差异与疾病显著相关。1.2PTPRR与HSCR疾病状态密切相关通过对临床标本及ENCCs表达模式及表达量的检测，PTPTRR主要表达于肌间神经丛及原代培养神经前体细胞胞质部位，与疾病状态及神经前体细胞有关。1.3PTPRR与维持ENCCs的未分化状态（即多能性）有关将具有诱导ENCCs向特定谱系分化的神经营养因子干预细胞后，PTPRR表达显著减少，其中以GDNF的作用最显著，提示PTPRR与维持神经前体细胞的干性有关。并可能参与了GDNF诱导的神经前体细胞的分化过程。1.4PTPRR参与维持ENCCs多能性，通过负性调控MAPK/pERK1/2通路发挥作用采用基因调控技术，对PTPRR基因表达量进行干预后，检测ENCCs的干性及分化情况，以及对GDNF诱导分化的反应，证实PTPRR的表达是维持ENCCs多能性的必要条件，同时这种功能的发挥，与其介导的MAPK/pERK1/2通路的负性调控作用有关。2本研究的创新性从临床标本筛选并验证出与HSCR疾病相关的新的基因，从临床标本及细胞水平发现其参与维持神经前体细胞干性的作用，并通过基因调控技术证实该基因参与维持ENCCs多能性，通过发挥去磷酸化作用负性调控MAPK/pERK1/2通路，来影响神经-101- 第四军医大学博士学位论文前体细胞的干性。3本研究的局限性本研究尚未对MAPK/pERK1/2通路激活后的其他信号分子进行检测，具体作用机制研究还欠深入，同时还需从整体水平进一步完善PTPRR基因对ENS系统发育的调控作用。-102- 第四军医大学博士学位论文参考文献1.Swenson,O.,H.F.Rheinlander,andI.Diamond,Hirschsprung'sdisease;anewconceptoftheetiology;operativeresultsin34patients.NEnglJMed,1949.241(15):p.551-6.2.Lin,Y.C.,NationwidePopulation-BasedEpidemiologicStudyofHirschsprung'sDiseaseinTaiwan.PediatrNeonatol,2016.57(3):p.165-6.3.Emison,E.S.,etal.,Acommonsex-dependentmutationinaRETenhancerunderliesHirschsprungdiseaserisk.Nature,2005.434(7035):p.857-63.4.Badner,J.A.,etal.,AgeneticstudyofHirschsprungdisease.AmJHumGenet,1990.46(3):p.568-80.5.Moore,S.W.,ChromosomalandrelatedMendeliansyndromesassociatedwithHirschsprung'sdisease.PediatrSurgInt,2012.28(11):p.1045-58.6.Goldberg,E.L.,AnepidemiologicalstudyofHirschsprung'sdisease.IntJEpidemiol,1984.13(4):p.479-85.7.Block,S.R.,etal.,Maternalpre-pregnancybodymassindexandriskofselectedbirthdefects:evidenceofadose-responserelationship.PaediatrPerinatEpidemiol,2013.27(6):p.521-31.8.Stothard,K.J.,etal.,Maternaloverweightandobesityandtheriskofcongenitalanomalies:asystematicreviewandmeta-analysis.JAMA,2009.301(6):p.636-50.9.LofGranstrom,A.,etal.,MaternalRiskFactorsandPerinatalCharacteristicsforHirschsprungDisease.Pediatrics,2016.138(1).10.Duess,J.W.,A.D.Hofmann,andP.Puri,PrevalenceofHirschsprung'sdiseaseinprematureinfants:asystematicreview.PediatrSurgInt,2014.30(8):p.791-5.11.Puri,P.,K.Ohshiro,andT.Wester,Hirschsprung'sdisease:asearchforetiology.SeminPediatrSurg,1998.7(3):p.140-7.12.Engum,S.A.,etal.,FamilialHirschsprung'sdisease:20casesin12kindreds.JPediatrSurg,1993.28(10):p.1286-90.13.Amiel,J.,etal.,Hirschsprungdisease,associatedsyndromesandgenetics:areview.JMed-103- 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第四军医大学博士学位论文个人简历和研究成果个人简况：姓名：田姣性别：女籍贯：四川省乐山市出生年月：1986年11月10日入学日期：2014年8月毕业院校：第四军医大学2005年7月-2010年7月：泸州医学院临床医学专业2010年8月-2013年7月：第四军医大学唐都医院儿科硕士2014年8月至今：第四军医大学唐都医院儿科博士参与课题项目：1.国家自然科学基金面上项目，81170331，SCF/c-kit信号通路对先天性巨结肠ICC功能的影响及机制研究，2012/01-2015/12，50万，已结题，参加。2.国家自然科学基金面上项目，81370490，ICC胃动素受体在红霉素促胃肠动力中的作用及机制研究，2014/01-2017/12,70万，在研，参加。负责课题项目：1.2014年度唐都医院创新发展基金基础研究项目，2014JCYJ008，T型钙离子通道α1亚基H亚型（Cav3.2）与先天性巨结肠的相关性研究，2014/01-2015/12，已结题，负责。2.2017年度陕西省科技计划项目面上项目，产丁酸盐菌在儿童IBD中的作用及机制研究，2017/01-2018/12，在研，负责。研究成果：1.田姣，郝丽军，王娅，陈鹏德，张薇，林燕，王宝西，江逊。先天性巨结肠长链非编码RNA的差异表达谱。中国实用儿科杂志，2017，32[6]:442-446.2.GuoHL,TianJ,WangXS,TianZ,LiXB,YangL,ZhaoMG,LiuSB.Neuroprotection-113- 第四军医大学博士学位论文ofSesaminagainstCerebralIschemiaIn-VivoandN-Methyl-D-Aspartate-InducedApoptosisIn-Vitro.BiochemPharmacol(LosAngel).2015,4(5):185.（共同第一）3.TianZ,WangDS,WangXS,TianJ,HanJ,GuoYY,FengB,ZhangN,ZhaoMG,LiuSB.AnalgesiceffectsofNB001onmousemodelsofarthralgia.MolBrain.2015,8(1):60.4.JiaoTian,ZhenTian,LeiShang,etal.Down-regulationofc-KitandstemcellfactorexpressionisassociatedwithHirschsprung'sdisease.JournalofNeurogastroenterologyandMotility.(revision)-114- 第四军医大学博士学位论文致谢即将迎来人生的又一次毕业，在这个特别的时候，我要感谢我的导师江逊副教授对我的悉心指导和大力帮助。三年来，老师严谨的治学态度、孜孜不倦的工作作风、平易近人的性格特点为我的工作和学习提供了有力的帮助，在此，我以崇高的敬意和最诚挚的感谢向我的老师致敬。在此，我要衷心感谢上海交通大学纳米生物医学工程研究所金卫林教授对实验细胞SH-SY5Y的馈赠，西安交通大学医学院第二附属医院小儿外科黄强副教授对本实验临床标本收集的帮助。再次感谢儿科王宝西主任对课题无私的指导，本课题从构想到实施，论文的撰写到发表，都得到了王主任的悉心指导和帮助；感谢仝海霞、周毅先、谢小闵三位护士长对我的关心和指导；同时，还要感谢儿科全体工作人员对我的关心。感谢药学系生物制药中心张英启主任，张伟教授，统计学教研室尚磊教授，实验动物中心施长宏主任的指导与帮助，正是他们提供的无私帮助，本课题才得以顺利开展。特别感谢生物制药中心舒震博士后对本课题的指导与帮助，他求实的科学态度和丰富的实践经验一直鼓励和督促着我，让我能及时发现实验过程中的不足并指导我做出适当的改正；同时，还要感谢实验室研究生在实验过程中给予我的帮助。最后，我要感谢一直支持、鼓励、关心我的家人和朋友，在困难时候给予我的理解、信任与支持，让我有信心去面对和克服每一次的失败与挫折，在生活和学习的道路上勇往直前、乐观向上。-115-
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