禽网状内皮组织增生病病毒对雏鸡局部黏膜免疫的影响

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中图分类号学校代码１０２２４密级公开学号１５０６１０４７７ｉＡ乘嘩人聲硕士学位论文禽网状内皮组织增生病病毒对雏鸡局部黏膜免疫的影响作者刘晓静导师刘超男副教授学位类别农学硕士所在学院动物医学学院一级学科兽医学二级学科基础兽医学二〇一八年六月 ClassifiedIndex：Code：10224Confidential（yes/no）：noNo.150610477DissertationfortheMasterDegreeInfluenceofReticuloendotheliosisVirusonLocalMucosalImmunityinSPFChicksCandidate:LiuXiaojingSupervisor:A.P.LiuChaonanDegreeCategory:MasterofAgricultureCollege:CollegeofVeterinaryMedicineFirstleveldiscipline:VeterinaryMedicineSecondleveldiscipline:BasicVeterinaryMedicineHarbinChinaJune2018 独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证一书使用过的材料。与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。／分Ｚ学位论文作者签名：叫｜难名會曰期：＞年月碎曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以。采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：杏日期：年６月冲日导师签名揭果日期：年／月和） 目录摘要..............................................................................................................................................I英文摘要.....................................................................................................................................III1引言...........................................................................................................................................11.1禽网状内皮组织增生病及其研究进展..............................................................................11.1.1病原学.........................................................................................................................11.1.2流行病学.....................................................................................................................11.1.3临床症状和病理变化..................................................................................................21.1.4RE与免疫抑制.............................................................................................................21.1.5REV与其它病毒的混合感染.......................................................................................31.1.6REV的诊断..................................................................................................................41.1.7REV的防治..................................................................................................................41.2禽类黏膜免疫研究进展.....................................................................................................41.2.1禽类黏膜免疫系统组成...............................................................................................51.2.2禽类黏膜相关淋巴组织及其作用...............................................................................51.2.3禽类MIS的功能.........................................................................................................61.2.4禽类黏膜免疫细胞及其功能.......................................................................................61.3本项目研究的目的与意义..................................................................................................62材料与方法...............................................................................................................................82.1实验材料............................................................................................................................82.1.1实验动物.....................................................................................................................82.1.2REV毒株......................................................................................................................82.1.3主要生物制剂和化学制剂...........................................................................................82.1.4主要仪器与设备..........................................................................................................92.1.5常用溶液及其配制......................................................................................................92.2实验方法..........................................................................................................................112.2.1实验动物分组及其处理.............................................................................................112.2.2待检材料采取和处理................................................................................................112.2.3检测指标及方法........................................................................................................112.3数据处理..........................................................................................................................183结果与分析.............................................................................................................................193.1雏鸡在REV感染后十二指肠IEL数量变化...................................................................193.2雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织T淋巴细胞数量的变化............................203.3雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织抗体生成细胞数量变化.............................233.3.1雏鸡在REV感染后哈德尔腺抗体生成细胞数量变化..............................................233.3.2雏鸡在REV感染后派伊尔结抗体生成细胞数量变化.............................................253.3.3雏鸡在REV感染后盲肠扁桃体抗体生成细胞数量变化.........................................27I 3.4建立RT-PCR检测雏鸡IL-2、IFN-γ与TNF-αmRNA表达的方法...............................303.4.1总RNA提取检测结果..............................................................................................303.4.2雏鸡局部黏膜相关淋巴组织IL-2、IFN-γ、TNF-α和β-actinPCR扩增结果.........303.4.3重组质粒PCR鉴定...................................................................................................313.4.4测定IL-2、IFN-γ、TNF-α和β-actin扩增产物序列................................................323.4.5绘制标准曲线............................................................................................................323.5雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织IL-2、IFN-γ与TNF-αmRNA表达变化..333.5.1雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织IL-2mRNA表达量变化.....................333.5.2雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织IFN-γmRNA表达变化......................353.5.3雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织TNF-αmRNA表达变化.....................373.6雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织IL-2、IFN-γ与TNF-α蛋白含量变化......403.6.1雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织IL-2蛋白含量变化.............................403.6.2雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织IFN-γ蛋白含量变化..........................423.6.3雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织TNF-α蛋白含量变化.........................444讨论.........................................................................................................................................474.1REV感染对雏鸡十二指肠上皮内淋巴细胞数量的影响..................................................474.2REV感染对雏鸡局部黏膜相关淋巴组织细胞免疫的影响..............................................474.3REV感染对雏鸡局部黏膜相关淋巴组织体液免疫的影响..............................................484.4REV感染对雏鸡局部黏膜相关淋巴组织IL-2、IFN-γ和TNF-αmRNA表达和蛋白含量的影响...............................................................................................................................485结论........................................................................................................................................50致谢............................................................................................................................................51参考文献.....................................................................................................................................52附录............................................................................................................................................59攻读硕士学位期间发表的学术论文...........................................................................................62II CONTENTSAbstractinChinese......................................................................................................................IAbstractinEnglish....................................................................................................................III1Introduction..............................................................................................................................11.1ResearchprogressofReticuloendotheliosis..........................................................................11.1.1Etiology........................................................................................................................11.1.2Epidemiology................................................................................................................11.1.3Clinicalsymptomsandpathologicalchanges.................................................................21.1.4REandimmunosupression............................................................................................21.1.5MixedinfectionofREVwithotherviruses....................................................................31.1.6DiagnosisofREV..........................................................................................................41.1.7PreventionofREV........................................................................................................41.2ResearchProgressofMucosalImmunityinPoultry.............................................................51.2.1Poultrymucosalimmunesystemcomposition................................................................51.2.2Avianmucosa-associatedlymphoidtissueanditsfunction.............................................51.2.3FunctionofthemucosalimmunesysteminPoultry.......................................................61.2.4Poultrymucosalimmunecellsandtheirfunctions.........................................................61.3Thepurposeandsignificanceofthisprojectstudy...............................................................72MaterialsandMethods............................................................................................................82.1ExperimentalMaterials.......................................................................................................82.1.1Experimentalanimals....................................................................................................82.1.2REVstrain.....................................................................................................................82.1.3Primarybiologicalagentsandchemicalagents..............................................................82.1.4Majorinstrumentsandequipments................................................................................92.1.5Commonlyusedsolutionsandtheirpreparation.............................................................92.2Experimentalmethods........................................................................................................112.2.1Experimentalanimalgroupinganditsprocessing........................................................112.2.2Materialtobetestedandtreated..................................................................................112.2.3Indexandmethodofdetection.....................................................................................112.3Dataprocessing..................................................................................................................183ResultsandAnalysis...............................................................................................................193.1ChangesofthenumberofintraepitheliallymphocytesinduodenumofchickspostREVinfection............................................................................................................................193.2ChangesofthenumberofTlymphocytesinlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchickspostREVinfection..................................................................................................203.3ChangesofthenumberofIgs+producingcellsinlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchickspostREVinfection..............................................................................................23III 3.3.1ChangesofthenumberofIgs+producingcellsinglandofHarderofchickspostREVinfection......................................................................................................................233.3.2ChangesofthenumberofIgs+producingcellsinPeyer’spatchofchickspostREVinfection......................................................................................................................253.3.3ChangesofthenumberofIgs+producingcellsincaecaltonsilofchickspostREVinfection......................................................................................................................273.4EstablishmentofRT-PCRmethodfordetectionofIL-2,IFN-γandTNF-αmRNAexpressioninchicks...........................................................................................................................303.4.1TotalRNAextractiontestresults.................................................................................303.4.2TheresultsofPCRamplificationofIL-2,IFN-γ,TNF-αandβ-actininlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchicks............................................................313.4.3RecombinantplasmidPCRidentification....................................................................323.4.4DeterminationofIL-2,IFN-γ,TNF-αandβ-actinamplificationproductsequences.....333.4.5Drawastandardcurve.................................................................................................333.5ChangesofIL-2、IFN-γandTNF-αmRNAexpressioninlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchickspostREVinfection.................................................................................343.5.1ChangesofIL-2mRNAexpressioninlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchickspostREVinfection...........................................................................................343.5.2ChangesofIFN-γmRNAexpressioninlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchickspostREVinfection...........................................................................................373.5.3ChangesofTNF-αmRNAexpressioninlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchickspostREVinfection...........................................................................................393.6ChangesofIL-2、IFN-γandTNF-αproteincontentinlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchickspostREVinfection..................................................................................423.6.1ChangesofIL-2proteincontentinlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchickspostREVinfection.....................................................................................................423.6.2ChangesofIFN-γproteincontentinlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchickspostREVinfection......................................................................................................443.6.3ChangesofTNF-αproteincontentinlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchickspostREVinfection...........................................................................................464Discussion................................................................................................................................494.1InfluenceofthenumberofduodenumIELofchickspostREVinfection............................494.2Influenceofcellularimmunityinlocalmucosa-associatedlymphoidtissueofchickspostREVinfection....................................................................................................................494.3Influenceofhumoralimmunityinlocalmucosa-associatedlymphoidtissueofchickspostREVinfection....................................................................................................................504.4InfluenceofIL-2,IFN-γandTNF-αmRNAexpressionandproteincontentinlocalmucosa-associatedlymphoidtissueofchickspostREVinfection......................................505Conclusion...............................................................................................................................52IV Acknowledgement......................................................................................................................53References..................................................................................................................................54Appendix....................................................................................................................................61PaperpublishedintheperiodofPh.M.education...................................................................64V 摘要禽网状内皮组织增生病（reticuloendotheliosis，RE）是由禽网状内皮组织增生病病毒（reticuloendotheliosisvirus，REV）感染机体后引起的免疫抑制性和肿瘤性疾病。黏膜免疫系统是机体抵抗外界病原体进入机体的第一道防线，机体黏膜可通过多种途径识别入侵机体的抗原，发生免疫反应，消灭入侵的病原体。本研究以1日龄SPF雏鸡为研究对象，应用苏木素-伊红染色（hematoxylinandeosinstain，HE）、酸性α-醋酸萘酯酶染色法（acidnonspecifica-naphthylacetateesterase，ANAE）、免疫组织化学染色、荧光定量PCR和ELISA等方法对十二指肠上皮内淋巴细胞（intraepitheliallymphocyte，IEL）数量，哈德尔腺、派伊尔结和盲肠扁桃体中ANAE+T淋巴细胞数量，IgA、IgG、IgM抗体生成细胞数量，白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TumorNecrosisFactor-α，TNF-α）mRNA表达和蛋白含量进行检测。旨在通过本研究揭示REV感染对雏鸡局部黏膜免疫的影响，为REV的防治提供新思路。研究结果显示：（1）雏鸡在REV感染后3-35d，十二指肠IEL数量显著或极显著高于对照组（C组）雏鸡（P<0.05或P<0.01）。表明IEL介导的雏鸡抗REV感染免疫应答水平增强。（2）雏鸡在REV感染后，哈德尔腺、派伊尔结和盲肠扁桃体中ANAE+T淋巴细胞数量分别在感染后14-35d、7-35d和7-35d显著或极显著低于C组雏鸡（P<0.05或P<0.01）。表明REV感染可引起雏鸡局部黏膜相关淋巴组织的细胞免疫功能下降。（3）雏鸡在REV感染后，其哈德尔腺中IgA、IgM和盲肠扁桃体中IgG抗体生成细胞数量在REV感染后7-35d显著或极显著低于C组雏鸡（P<0.05或P<0.01）；派伊尔结中IgA和IgM抗体生成细胞数量以及盲肠扁桃体中IgA和IgM抗体生成细胞数量在REV感染后3-35d显著或极显著低于C组雏鸡（P<0.05或P<0.01）；哈德尔腺和派伊尔结中IgG抗体生成细胞数量在REV感染后14-35d显著或极显著低于C组雏鸡（P<0.05或P<0.01）。表明REV感染可引起雏鸡局部黏膜相关淋巴组织的体液免疫功能下降。（4）雏鸡在REV感染后，哈德尔腺、派伊尔结和盲肠扁桃体中IL-2、IFN-γ和TNF-αmRNA表达量和蛋白含量在REV感染后都不同程度的高于C组雏鸡。表明IL-2、IFN-γ和TNF-α参与REV感染所致的局部黏膜损伤。通过上述各项指标的检测，揭示了REV对雏鸡局部黏膜免疫的影响，为REV的防治提供新的思路。关键词：禽网状内皮组织增生病；雏鸡；局部黏膜免疫I InfluenceofReticuloendotheliosisVirusonLocalMucosalImmunityinSPFChicksAbstractReticuloendotheliosis(RE)isanimmunosuppressiveandneoplasticdiseasecausedbytheviralreticuloendotheliosisvirus(REV).REcancauseimmunosuppressionandtumorsintheaffectedpoultry.Themucosalimmunesystemisthebody'sfirstlineofdefenseagainstexternalpathogensenteringthebody.Thebody'smucousmembranescanrecognizethebody'sinvadingantigensinavarietyofways,occursimmuneresponseandeliminatetheinvadingpathogens.Inthisstudy,1-day-oldSPFchickenswereusedastheresearchobject.UsingdetectionmethodssuchasHE,ANAE,immunohistochemicalstaining,real-timefluorescencequantitativePCR,andELISAtodetectthenumberofintraepithelialintraepitheliallymphocytes,thenumberofANAE+Tlymphocytes,IgA,IgG,IgMproducingcellsandtheexpressionlevelsofIL-2,IFN-γandTNF-αmRNAandtheirproteincontentinglandofHarder,Peyer’spatchandcaecaltonsil.ThepurposeofthisstudywastorevealtheeffectofREVinfectiononlocalmucosalimmunityinchicksandprovidenewideasforthepreventionandtreatmentofREV.Theresultsofthestudyshowedthat:(1)ThenumberofchicksduodenumIELofSPFchickswassignificantlyorextremelysignificantlyhigherthanthoseofcontrolgroupat3-35daypostREVinfection(P<0.05orP<0.01).ItwasshownthatIELmediatedchicksimmuneresponseagainstREVinfectionwasenhanced.(2)ThenumberofANAE+TlymphocytesinglandofHarder,Peyer’spatchandcaecaltonsilweresignificantlyorextremelysignificantlylowerthanthoseofcontralgroupat14-35day,7-35dayand7-35daypostREVinfection(P<0.05orP<0.01).ItwasshownthatREVinfectioncanleadtodecreasedcellularimmunefunctioninlocalmucosa-associatedlymphoidtissueofchicks.(3)ThenumberofIgA,IgMantibody-producingcellsinglandofHarderandIgGproducingcellsincaecaltonsilweresignificantlyorextremelysignificantlylowerthanthoseofcontralgroupat7-35dayspostREVinfection(P<0.05orP<0.01);ThenumberofIgMandIgAproducingcellsinPeyer’spatchandcaecaltonsilweresignificantlyorextremelysignificantlylowerthanthoseofcontralgroupat3-35dayspostREVinfection(P<0.05orP<0.01);ThenumberofIgGproducingcellsinglandofHarderandPeyer’spatchwassignificantlyorextremelysignificantlylowerthanthoseofcontralgroupat14-35dayspostREVinfection(P<0.05orP<0.01).ItwasshownthatREVinfectioncanleadtodecreasedhumoralimmunefunctioninlocalmucosa-associatedlymphoidtissueofchicks.(4)TheexpressionofIL-2,IFN-γ,andTNF-αmRNAandproteincontentinglandofHarder,Peyer’spatch,andcaecaltonsilwereallsignificantlyorextremelysignificantlyhigherthanthoseIII ofcontralgrouppostREVinfection.ItwasshownthatIL-2,IFN-γ,andTNF-αwereinvolvedinlocalmucosaldamagecausedbyREVinfection.Throughthedetectionoftheaboveindicators,theeffectofREVonthelocalmucosalimmunityofchickswasrevealed,providingnewideasforthepreventionandtreatmentofREV.Keywords:ReticuloendotheliosisVirus;Chicks;LocalmucosalimmunityCandidate:LiuXiaojingSpeciality:BasicVeterinaryMedicineSupervisor:A.P.LiuChaonanIV 1引言1.1禽网状内皮组织增生病及其研究进展禽网状内皮组织增生病是由禽网状内皮组织增生病病毒引起的鸡、火鸡等禽类以网状细胞增生为特征的综合征，感染禽类可出现矮小综合征、组织肿瘤和急性网状细胞肿瘤以及免疫抑制等[1]。Robinson在1958年首次发现本病毒[2]，但直到Sevoian[3]和Theilen[4]等人将其接种鸡和火鸡后，引起鸡和火鸡发生肿瘤，并发现其肿瘤中有大量网状内皮细胞才得以命名为“网状内皮组织增生症”。1986年，我国也发现该病毒的存在，并以REV-C45株命名[5]。此后，该病在我国多个地区陆续被发现，我国将该病列为二类动物疫病。1.1.1病原学REV属于反转录病毒科禽类C型逆转录病毒属[6]，包括脾坏死病毒（SpleenNecrosisVirus，SNV）、鸭传染性贫血病毒（DuckInfectiousAnemiaVirus）、禽网状内皮组织增生病病毒A株（ReticuloendotheliosisVirusstrainA，REV-A）、鸡合胞体病毒（ChickenSyncytiaVirus，CSV）、禽网状内皮组织增生病病毒T株（ReticuloendotheliosisVirusstrainT，REV-T）[7]。REV只有一个血清型，病毒抗原性相似，但不同毒株的致病力存在差异[8]。REV病毒粒子呈圆球形，直径约100nm，囊膜外有约100个表面凸起，直径6-10nm[9]。REV的遗传物质是由含有两个30S-40SRNA亚单位的60S-70S复合体组成的单股RNA[10]。REV全基因组可以分别编码结构蛋白gag[11]，具有整合酶、聚合酶和反转录酶功能的pol以及囊膜蛋白env。缺陷型REV-T株基因组大小为5.7kb，而完全型REV-A株基因组大小为9.0kb，基因组分析结果显示，REV-T株env区基因存在小部分缺失，同时，也有大段基因缺失发生在gag-pol区[12]。1.1.2流行病学REV宿主范围较广，家禽和一些野生鸟类在自然状态下均可成为其宿主[13,14]。其中，火鸡易感性最高，实验常选鸡和火鸡作为实验动物[15]。本病在鸡群中普遍感染，不同品种、性别和年龄的鸡均可以被感染。但REV对低日龄的雏鸡，尤其是新生雏鸡感染性强，因为新生雏鸡的免疫系统发育不完善，对病毒的抵抗力相对较弱，REV感染会严重破坏雏鸡的免疫机能。而高日龄鸡因其免疫系统相对于低日龄雏鸡而言比较健全，感染后仅表现一过性毒血症，有些鸡在病毒感染后甚至不表现临床症状。除了感染动物机体外，REV也可感染鸡胚成纤维细胞（Chickenembryofibroblast，CEF），鸡肾细胞（Chickenkidneycell，CK）以及某些哺乳动物细胞[16]。REV可通过水平传播、垂直传播、虫媒传播以及污染的疫苗等方式传播。被感染鸡群的排泄物和垫料中均可检测到REV。排毒主要出现在急性病毒血症期间[17]。通过与血清阳性的1 鸡接触，健康鸡可被REV感染，但接触感染极少引起临床症状，只有火鸡可能在接触感染后出现淋巴瘤。REV的垂直传播在鸡和火鸡均有报道，但感染率较低。有报道称在耐受性感染母火鸡的鸡胚中，感染率为8%[18]。在耐受性感染公鸡的精液和母鸡的生殖道中也分离到病毒，将感染的精液通过人工注射的方式注射给血清学阴性的母鸡后可产生感染的后代。除了水平传播和垂直传播外，吸血昆虫在REV的传播中可能起到了媒介作用。Motha等发现REV可通过蚊子感染鸡[19]。REV污染常规疫苗也是其传播途径之一。REV污染的禽痘疫苗和马立克氏病疫苗接种健康鸡群后，可使鸡群被REV感染，导致疫苗免疫失效，同时，被感染雏鸡抵抗力下降，对其它疾病的易感性增加，其他病原体混合感染或继发感染可能造成鸡群大批死亡，造成极大的经济损失[20]。目前，REV呈世界性分布，美国、埃及和韩国等国家部分鸡群中REV阳性检出率超过50%。近年来，在我国山东、安徽、江苏、四川、北京等多个省市陆续检测到REV，且其在我国呈地方性流行[21]。秦立廷等采用PCR、病毒分离等技术方法，在7个省的39个蛋鸡群中检测到REV[22]。Jiang[23]等在我国黑龙江，吉林和辽宁585份野生鸟类样本中分离得到10株REV毒株。1.1.3临床症状和病理变化鸡只在REV感染后常出现精神萎靡，羽毛蓬乱无光泽，采食量下降，鸡只大小不一等现象。感染鸡只有时也会出现贫血、排白色稀便、产蛋量下降等症状。但因病毒毒株的不同和鸡只感染日龄的差异，鸡只在REV感染后表现出的症状和死亡率也不尽相同，低日龄鸡只在REV感染后临床症状更明显，甚至未表现出临床症状即死亡。REV感染鸡剖检可见肝脏和脾脏肿大，有时可见大小不一的灰白色肿瘤结节，胸腺和法氏囊萎缩[24]，有腺胃炎存在时腺胃肿胀，心脏、胰腺、肾脏、性腺、小肠、肌肉等偶尔可见肿瘤。组织学观察可见肝脏等实质器官发生变性坏死，并以原始间质细胞或网状内皮细胞增生或浸润为特征。胸腺小叶发育不良[25]，脾脏有时可见充血、出血，法氏囊内淋巴滤泡萎缩。当肝脏发生肿瘤时，肝索间出现空隙，幼稚淋巴细胞聚集成团。超微病理学变化为肝细胞坏死早期出现核浓缩，线粒体轻微肿胀，随后肿胀明显，细胞基本结构消失[26]。1.1.4RE与免疫抑制REV的靶细胞主要是网状内皮细胞和淋巴细胞，当REV感染机体后，可引起机体免疫抑制，降低机体抵抗力，增加其它病原体感染机体的风险。此外，REV感染机体后还会引起疫苗免疫失败，鸡群死亡率增高，给养禽业带来重大的经济损失。高浓度的TNF会对机体免疫器官造成损伤，雏鸡在REV感染后，脾细胞TNF诱生活性明显升高，加重机体的损伤，进而降低其免疫机能[27]。阿合买提·买买提等[28]研究发现，雏鸡在REV感染后，外周血液中T、B淋巴细胞数量明显减少。李广兴等[29]研究发现，雏鸡在REV感染后，外周血液中淋巴细胞对植物血凝素的反应能力降低，脾细胞有丝分裂能力明显受到抑制，使细胞数量减少，脾脏免疫功能受到明显抑制。此外，当REV感染DF1、HD11、MSB1及DT40细胞后，细胞均出现凋亡，免疫细胞活力显著降低。2 雏鸡在接种REV-T株转化细胞后，会在致瘤基因V-rel的作用下，形成B淋巴细胞瘤，阻碍B淋巴细胞的分化、成熟以及抗体的产生，抑制机体的体液免疫。REV-A株虽缺乏V-rel基因，但当病毒感染细胞后，其基因序列可以整合到被感染细胞C-myc基因附近，进而引起宿主肿瘤的发生[30]。总之，由于REV能够引起机体免疫器官以及免疫细胞的损伤，明显抑制机体的特异性免疫和非特异性免疫，严重的抑制了机体的免疫功能。1.1.5REV与其它病毒的混合感染REV感染雏鸡后，会引起机体免疫力下降，使雏鸡对其它病毒的易感性增加，引起RE与其它病毒共同感染。1.1.5.1REV与J亚群禽白血病病毒混合感染有报道显示，REV与J亚群禽白血病病毒（AvianLeukemiaVirus，ALV-J）混合感染后会引起感染鸡生长迟缓[31,32]，外周血液和脾脏T细胞增殖活性减弱，CTL功能受到抑制[33]，新城疫、禽流感等疫苗免疫效价明显降低，机体生长更加缓慢[34]。同时，也有研究发现，REV与ALV-J混合感染引起感染雏鸡的淋巴细胞凋亡和机体免疫抑制比二者单纯感染更严重[35]，发病率和死亡率也明显高于ALV-J或者REV单纯感染[36]。1.1.5.2REV与马立克氏病病毒混合感染REV和马立克氏病病毒（Marek’sDiseaseVirus，MDV）均能够引起雏鸡发生肿瘤，两种病毒混合感染在我国也被发现[37]，当两种病毒混合感染后不仅会引起患病禽免疫抑制增强，还能够引起肿瘤的发病率增加，同时还会降低疫苗的功效[38]。张志[39]等研究表明，当两种病毒同时感染雏鸡时，会引起脾脏等器官出现两种不同的肿瘤，且病毒致瘤性增强，患鸡死亡时间比两种病毒单独感染明显缩短，病毒血症时间也相对延长。刁秀国[40]等研究结果显示，REV与MDV共同感染雏鸡后，REV首先发挥致病作用，在感染早期和后期，机体在病毒的作用下处于炎症反应和体液免疫抑制状态。Sun[41]研究发现，REV病毒的LTR序列插入到MDV基因组中，可以增强MDV的致病性。1.1.5.3REV与禽痘病毒混合感染REV能够污染禽痘病毒（FowlpoxVirus，FPV）疫苗，雏鸡在疫苗免疫过程中被REV感染，导致疫苗免疫失败，没有产生抵抗FPV的抗体，使雏鸡被FPV感染的可能性增加，引起REV与FPV共感染。也有研究发现，在自然条件下，FPV基因组中发现部分或完全的REV前病毒序列整合到其中，导致REV和FPV双重感染[42]。1.1.5.4REV与禽波氏杆菌混合感染2010年，有学者对山东某三个大型肉种鸡场的鸡胚进行病原学检测，结果显示REV与禽波氏杆菌（Bordetellaaviun，B.avium）混合感染超过5%。REV和B.avium共感染使鸡胚致死时间较早，致死率增高，鸡胚孵化率降低，且REV和B.avium共感染对免疫系统的损伤更严重[43]。3 1.1.6REV的诊断由于RE的临床症状和病理变化不典型，不能够明确的与其它病毒引起的疾病区分，因此根据临床症状和病理变化并不能准确的诊断RE，需要进行实验室诊断确诊。目前，对于RE的诊断主要通过病毒分离培养，血清学和分子生物学等方面的检测来实现。1.1.6.1病毒分离与鉴定REV分离与鉴定是诊断RE的有效方法。有明显病变的患禽是病毒分离的最好来源，病禽的组织悬液、全血、血浆和肿瘤组织等都可用来进行病毒分离，血液中的白细胞、淋巴细胞也是较好的材料[44]。将病料接种到CEF或DF-1中，盲传2次7d，查看是否出现病毒蚀斑以及观察REV粒子形态鉴定该病是否为RE，也可用ELISA、补体结合试验、间接免疫荧光试验、免疫过氧化物酶染色法等多种方法检测病料中是否有REV存在。1.1.6.2血清学检测血清学检测是运用抗原抗体特异性结合原理从病鸡血清中检测抗体或抗原的方法，目前，RE血清学诊断最常用的方法是ELISA[45]，且主要是对REV的env、p30和gp90抗原成分进行检测[46]。1.1.6.3分子生物学检测随着人类对医学领域的不断探索，病毒的检测技术也在不断进步，对病毒核酸进行检测的方法也就应运而生。LTR，gag，pol和env基因为REV全基因组的部分片段，因REV不同毒株之间具有较高的同源性，所以，这4个基因均可作为普通PCR、实时荧光定量PCR、PCR结合斑点杂交检测技术和环介导等温扩增技术等检测方法的靶基因，可检测组织、器官、体液、肛拭子和疫苗中是否REV存在[47-49]。1.1.7REV的防治对于RE，目前没有行之有效的治疗方法，多采取对症治疗的措施，因此，对于该病主要运用预防为主，治疗为辅的综合防治措施。REV体外培养困难，培养周期长，病毒滴度低，不能够制作灭活疫苗。REV能够整合到宿主细胞中，所以不适合制备弱毒疫苗。虽然目前没有RE的商品化疫苗，但yuan[50]研究发现REVGp90重组蛋白联合CpG-ODN/Poly（I∶C）缓释佐剂对雏鸡具有完全的保护力，Li[51]等研究发现用pCAGgp90质粒接种雏鸡，之后再用重组gp90蛋白加强免疫一次，可以增强机体的体液和细胞免疫应答，孙淑红[34]研究发现，对种鸡进行免疫产生母源抗体，可以预防子代雏鸡早期感染REV。但是对于REV的有效防治措施主要是建立起健全的生物安全体系，加强饲养管理，定期消毒，严格隔离，及时淘汰阳性鸡，注意杀灭禽舍的蚊虫等方法阻断RE的传播。1.2禽类黏膜免疫研究进展黏膜是动物机体与外部环境进行物质交换的场所，与外部环境直接接触，是机体阻挡外4 界病原的首道屏障。发生在黏膜或由黏膜入侵机体的感染远远高于机体其它部位[52]，黏膜表面上皮细胞排列紧密，产生屏障作用，阻碍外界病原微生物进入机体。此外，病原微生物也会被黏膜上皮和一些腺体分泌的多种物质阻碍进入机体或者直接被清除[53]。1.2.1禽类黏膜免疫系统组成动物机体的黏膜免疫系统（mucosalimmunesystem，MIS）非常强大，含有机体最大的免疫细胞库[54]，约占机体淋巴组织的50%以上，MIS与全身免疫系统相对独立，作为一道屏障抵抗病原微生物从黏膜入侵机体[55]。禽类黏膜免疫系统由消化道、呼吸道、泌尿生殖道以及一些外分泌腺组成。依据禽类MIS的特点，主要是功能和分布方面，可以将其分成弥散型免疫细胞和黏膜相关淋巴组织（mucosa-associatedlymphoidtissue，MALT）两部分。弥散性免疫细胞包括肠上皮细胞（epithelialcell，IEC）、IEL、固有层淋巴细胞（laminaproprialymphocyte，LPL）等[56]。吞噬细胞系统和黏膜免疫系统，支气管相关淋巴组织（bronchus-associatedlymphoidtissue，BALT），肠相关淋巴组织（gut-associatedlynphoidtissue，GALT），鼻相关淋巴组织（nasal-associatedlymphoidtissue，NALT），眼相关淋巴组织（conjunctiva-associatedlymphoidtissue，CALT）[57]等构成了MALT。1.2.2禽类黏膜相关淋巴组织及其作用1.2.2.1眼内淋巴组织哈德尔腺，也被称作副泪腺，瞬膜腺或第三眼睑，是禽类眼眶中眼球腹侧或后内侧，疏松的附着于框周筋膜上的一种腺体，扁哑铃型，淡红色至褐色[58]。哈德尔腺为复管状分泌性腺体，主要由腺泡、腺泡腔、收集管和主导管组成。哈德尔腺具有很多B细胞和浆细胞[59]，在到抗原刺激后，可以分泌大量具有中和病毒作用的抗体汇入泪液，特异性的发挥免疫功能，同时，抗体还可以经鼻腔进入呼吸道，参与该部位的抗病毒免疫[60]。哈德尔腺分泌的黏液还可以润滑瞬膜，对眼球产生机械性保护作用。此外，哈德尔腺能够激发机体全身的免疫应答，与其协同抵抗病原体感染。1.2.2.2肠道淋巴组织肠道黏膜面积巨大，且可与外界接触，是发生感染的最主要部位，是机体抵抗病原感染的第一道防线。（1）派伊尔结又称派伊尔集合淋巴结，淋巴集结，派伊尔氏腺，由瑞士解剖学家JohannConrad发现。派伊尔结位于肠系膜缘对侧肠壁黏膜或黏膜下，在结构上为圆形或椭圆形的滤泡，从黏膜延伸到黏膜下层[61]，随着动物日龄的增加每个派伊尔结内滤泡数量也增加。派伊尔结主要由M细胞，圆顶区细胞和滤泡组成。间区以T淋巴细胞为主，滤泡区中心是大量B淋巴细胞组成的生发中心[62]。当小肠受到抗原刺激时，派伊尔结能够诱导产生局部免疫应答，对机体产生保护。（2）盲肠扁桃体位于回肠、盲肠和直肠交界处，稍膨大[63]。有很多弥散的淋巴组织分布在盲肠扁桃体的固有层和黏膜下层，其中B淋巴细胞占45-55%，T淋巴细胞占35%。盲肠5 扁桃体中还含有数量不等的生发中心，大多数生发中心位于黏膜层的中下部，且随着日龄的增长数目逐渐增多[64]，但其数量的多少还受到肠道正常菌群的量和是否发生感染的影响[65]。盲肠扁桃体对肠道内的抗原即可产生体液免疫，也可介导细胞免疫。1.2.3禽类MIS的功能禽类MIS的功能主要从两个方面体现：（1）协同某些非特异性条件防止病原体损伤机体[66]。包括：肠道中的正常菌群可以抑制病原微生物的生长，对维持机体平衡有重要作用；消化道的蠕动以及纤毛上皮的纤毛定向摆动，可减轻微生物对肠道黏膜的侵害；黏膜分泌物中含有溶菌酶和杀菌物质，可以在黏膜表面起到化学屏障作用，也可抑制病原菌的生长，对某些病菌也具有杀伤作用；黏膜部位吞噬细胞，可以吞噬黏膜附近的病原微生物；黏膜下层的淋巴网可以阻碍病原微生物的运动以及破坏病原微生物。（2）为防止过敏反应和自身免疫性疾病的的发生，MIS会对摄入的抗原和肠道菌群进行识别，如是非病原体，就会对其产生免疫耐受。黏膜在病毒侵入后，通过产生抗体和细胞因子等产生作用。同时，局部黏膜免疫产生的效应细胞可以通过黏膜免疫相关的细胞运输系统运输到机体弥散的淋巴组织中发挥作用[67]。1.2.4禽类黏膜免疫细胞及其功能黏膜免疫细胞主要分布在黏膜固有层和上皮内，是机体黏膜免疫应答中不可或缺的一部分。主要是由IEL、LPL以及具有抗原特异性黏膜效应细胞组成。Weber于1847年发现小肠上皮内有小圆形细胞，并发现其可能与营养吸收有关。Eberth于1864年首次发现这些细胞是白细胞。IEL是体内最大的淋巴细胞群，主要存在于家禽肠道中的盲肠扁桃体和十二指肠。位于十二指肠黏膜上皮细胞层中的上皮内淋巴细胞，主要由T淋巴细胞构成，是肠黏膜免疫系统中最先接触抗原的免疫活性细胞，是机体黏膜免疫反应过程中极为重要的抗原呈递细胞（APCs）[68]。IEL位于肠黏膜柱状上皮细胞间隙，其上方为两上皮细胞的紧密连接，下方为基底膜，IEL和上皮柱状细胞的比例约为1∶6。在黏膜免疫中，IEL与病原体接触的时间要早于其它免疫细胞。IEL在抵抗细菌和病毒感染、局部细胞发生癌变方面具有重要作用，该作用的发挥主要是通过分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等细胞因子来实现的[69]。此外，IEL具有穿孔素，颗粒酶和丝氨酸酶等胞内颗粒，可以发挥细胞杀伤作用[70]。1.3本项目研究的目的与意义自1958年REV被分离出之后，全世界许多国家和地区陆续分离到该病毒，在我国，该病的发病率也在逐年上升[71]。雏鸡在REV感染后会出现免疫抑制，生长发育缓慢以及形成肿瘤，因此，该病毒被兽医学者公认为是继马立克氏病病毒和禽白血病病毒后的又一大禽类致瘤性病毒[72]。综合国内外对REV的已有研究资料显示，目前对REV的研究主要集中在流行病学调查、病原分离鉴定、疾病的诊断技术和疫苗的开发等方面，并在有关方面取得了较6 大的研究进展，但关于REV感染对雏鸡黏膜免疫的影响的研究少有报道。黏膜组织是机体的第一道免疫防线，也是病原侵入机体的门户，黏膜免疫可以影响机体的体液和细胞免疫，在很大程度上影响着机体对病毒的抵抗能力。但禽类黏膜免疫在抗病毒过程中的作用少有报道。本实验对雏鸡在REV感染后不同时期哈德尔腺、派伊尔结和盲肠扁桃体中的IgA、IgG、IgM抗体生成细胞数量，T淋巴细胞的数量，IL-2、IFN-γ、TNF-αmRNA表达量以及蛋白含量进行检测，同时对十二指肠IEL数量进行检测，旨在从揭示REV感染对雏鸡局部黏膜免疫的影响，为REV的防治提供新的思路。7 2材料与方法2.1实验材料2.1.1实验动物120只1日龄SPF雏鸡，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心。2.1.2REV毒株禽网状内皮组织增生病病毒（REV-T株），购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCCNo.CACCAV107）。病毒TCID-4.6250为10/0.1mL。2.1.3主要生物制剂和化学制剂（1）SYBR®PremixExTaqTMII大连宝生物工程有限公司（2）TaqDNAPolymerase大连宝生物工程有限公司（3）pMD18-TVector大连宝生物工程有限公司（4）10×PCRBuffer大连宝生物工程有限公司（5）DNAMarkerDL2000大连宝生物工程有限公司（6）dNTPMixture大连宝生物工程有限公司（7）DMEMGibco公司（8）优质胎牛血清Gibco公司（9）胰蛋白酶美国Invitrogen公司（10）兔抗鸡IgA、IgG、IgM抗血清本实验室制备（11）质粒小提试剂盒天根生化科技有限公司（12）胶回收试剂盒天根生化科技有限公司（13）IL-2ELISA试剂盒北京诚林生物技术有限公司（14）IFN-γELISA试剂盒北京诚林生物技术有限公司（15）TNF-αELISA试剂盒北京诚林生物技术有限公司（16）DAB显色液万类生物（17）M-MULV大连宝生物工程有限公司（18）5×FirstStrandBuffer大连宝生物工程有限公司（19）Oligo(dT)15天根生化科技有限公司（20）辣根酶标记山羊抗兔IgG北京中杉金桥生物技术有限公司8 2.1.4主要仪器与设备（1）LightCycler2.0荧光定量PCR仪美国罗氏公司（3）GDS-800凝胶成像系统美国UVP公司（4）-80°C冰箱英国NewBrunswickScientific公司（5）PL4002电子天平上海梅特勒-托利多仪器有限公司（6）PB-10PH酸度计德国Sartorius公司（7）漩涡振荡器北京北德远大科技有限公司（8）生物安全柜美国ThermoFisherScientific有限公司（9）生化培养箱上海一恒科技有限公司（10）制冰机日本SNAYO公司（11）水浴锅上海博迅实业有限公司（12）二氧化碳培养箱德国Sigma公司（13）组织石蜡切片机HM340德国MICROM公司（14）KD-P摊片机浙江省金华市科迪仪器有限公司（15）H600L显微病理成像系统日本NIKON公司（16）CL-32L自动蒸汽灭菌器日本ALP公司（17）ELx808酶标仪美国伯腾仪器有限公司2.1.5常用溶液及其配制2.1.5.10.01mol/LPBS缓冲液（pH7.2-7.4）NaCl8.00gNa2HPO4·12H2O2.90gKCl0.20gKH2PO40.20g去离子水1000mL混匀，调pH值后备用。2.1.5.2LB液体培养基胰蛋白胨1.00g酵母提取物0.50gNaCl1.00g去离子水100.0mL混匀，120°C高压蒸汽灭菌，待培养基冷却至室温后，加入100μL氨苄（100mg/mL），混匀后4°C冰箱保存备用。2.1.5.3LB固体培养基胰蛋白胨1.00g9 酵母提取物0.50gNaCl1.00g琼脂1.50g去离子水100.0mL充分混匀后120°C高压蒸汽灭菌，待培养基冷却至55°C时，加入100μL氨苄（100mg/mL），混匀后倒入无菌培养皿中，凝固后封口膜封口，4°C冰箱保存备用。2.1.5.42.5%胰酶胰蛋白酶2.50gEDTANa20.20g0.01mol/LPBS100.0mL过滤后4°C冰箱保存备用。2.1.5.5抗原修复液（pH6.0）柠檬酸三钠3.0g柠檬酸0.4g蒸馏水1000.0mL2.1.5.63%甲醇-H2O2溶液30%H2O210mL甲醇90mL2.1.5.7DH5-α感受态细胞制备（1）将菌种接种于未添加氨苄青霉素的LB固体培养基中，于37°C恒温培养箱中过夜培养，挑取单个菌落放入10mL未添加氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C摇菌过夜。（2）取1mL摇菌过夜的菌液，接种于100mLLB液体培养基中，37°C摇菌3h，测定OD600值，当其值为0.5时，停止摇菌。（3）将OD600=0.5的菌液转移到提前预冷的50mL灭菌离心管中，冰浴10min。（4）4°C低温离心机上离心10min，转速为4000r/min，弃上清。（5）用10mL预冷的CaCl2缓冲液重悬，再冰浴10min。（6）同（4）。（7）同（5）。（8）冰浴30min。（9）同（4）。（10）每50mL初始培养物中加入2ml预冷的CaCl2缓冲液重悬，每100μL分装于1.5mLEP管中，-80°C低温冰箱保存备用。10 2.2实验方法2.2.1实验动物分组及其处理随机将120只1日龄SPF雏鸡分为两组：对照组（C组）和病毒感染组（I组）。其中，I组雏鸡60只，腹腔注射100个TCID50的病毒液；C组雏鸡60只，腹腔注射等剂量的灭菌生理盐水。两组雏鸡严格隔离，按照SPF雏鸡饲养标准饲养。2.2.2待检材料采取和处理C组和I组雏鸡分别于感染后1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d，每组随机抽取8只雏鸡，称重后心脏采血处死，并做如下处理：快速采取哈德尔腺、派伊尔结、盲肠扁桃体，称重后取部分组织，液氮速冻后-80°C冰箱保存。另取部分完整的组织和十二指肠放入提前配制好并4°C冰箱预冷的组织固定液中固定，固定24h。2.2.3检测指标及方法2.2.3.1HE染色检测十二指肠上皮内淋巴细胞数量（1）固定与水化取出中性福尔马林溶液中固定24h的十二指肠，修块，流水冲洗24h。（2）脱水与透明70%乙醇过夜80%乙醇60min90%乙醇60min95%乙醇I60min95%乙醇II40min无水乙醇I20min无水乙醇II15min二甲苯I3min二甲苯II3min（3）浸蜡58°C恒温蜡箱中浸蜡1h。（4）包埋向事先折叠好的纸盒中倒入已融化的石蜡，迅速夹取已经浸透石蜡的组织放入其中，待其凝固。（5）修块、切片和摊片修去组织周围多余的蜡，暴露出组织，设定切片厚度为5μm进行切片，将切片放入摊片机中摊片。11 （6）贴片与烘片将载玻片倾斜，使组织标本贴附于载玻片上，37°C恒温箱中过夜烘干。（7）石蜡切片脱蜡和水化二甲苯I5min二甲苯II5min无水乙醇I1min无水乙醇II1min95%乙醇1min80%乙醇1min70%乙醇1min蒸馏水2min（8）染色苏木素15min蒸馏水1min1%盐酸酒精分化液1min流水返蓝3h伊红15min水洗30sec（9）脱水与透明70%乙醇10sec80%乙醇20sec95%乙醇I30sec95%乙醇II30sec无水乙醇I2min无水乙醇II2min二甲苯I3min二甲苯II4min（10）封片，镜检在二甲苯未干透之前用中性树胶封片，待其晾干后镜检。在光镜下选5根最长且排列整齐的绒毛，计数每100个肠上皮细胞间IEL的数量，结果用均数表示[73]。2.2.3.2免疫组织化学检测局部黏膜相关淋巴组织中IgA、IgG、IgM抗体生成细胞数量（1）固定和水洗取中性福尔马林中固定24h的哈德尔腺、派伊尔结、盲肠扁桃体，修块，水洗24h。（2）脱水，浸蜡，包埋，脱蜡，水化步骤同HE染色。（3）PBS洗2次，5min/次。（4）灭活内源性酶：滴加新配制的3%H2O2，室温下避光湿盒中孵育20min。12 （5）PBS洗3次，3min/次。（6）抗原修复：将抗原修复液倒入修复盒中，量以盖过切片为宜，在微波炉中将抗原修复液加热至沸腾后将切片放入，静置5min，将微波炉调至解冻档，加热10min，自然冷却。（7）PBS洗3次，5min/次。（8）封闭：滴加封闭液，室温下湿盒中孵育20min。（9）一抗孵育：分别滴加1∶100稀释的IgA、IgG、IgM抗体，于湿盒中4°C过夜。（10）重复步骤（7）。（11）二抗孵育：滴加1∶250稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，于湿盒中37°C孵育30min。（12）重复步骤（7）。（13）DAB显色：取900μLPBS，加入50μLDAB显色液A和50μLDAB显色B，混合均匀，滴加到组织切片上，室温避光孵育5min。（14）蒸馏水洗2次，5min/次。（15）苏木素染色3min。（16）蒸馏水洗。（17）1%盐酸酒精分化数秒，水洗10min。（18）脱水、透明、封片同HE染色。（19）镜检：油镜下观察，选取5个视野，记录并计算哈德尔腺、派伊尔结和盲肠扁桃体中IgA、IgG、IgM阳性抗体生成细胞平均数，以个/视野表示。每次染色均分别设置抗体阴性对照[74]。2.2.3.3ANAE染色检测局部黏膜相关淋巴组织中T淋巴细胞数量（1）浸透：将组织放入pH为7.2-7.4的PBS洗5min，放入4°C预冷的浸透液中于4°C冰箱中浸透24h。（2）脱水，透明：4°C冰箱中脱水无水丙酮I40min无水丙酮II35min无水丙酮III30min二甲苯I5min二甲苯II5min（3）浸蜡，包埋：58°C浸蜡I（50min）→II（50min），在蜡槽中包埋组织。（4）修块，切片，摊片，烘片：将组织周围多余的石蜡切去，切片厚度为4μm，在37°C摊片，37°C恒温箱中过夜烘干。（5）脱蜡：二甲苯I、II各5min。（6）回水：100%丙酮→90%丙酮→80%丙酮→70%丙酮→蒸馏水，1-2min/次。（7）孵育染色：37°C恒温箱内孵育染色2h。（8）水洗：流水冲洗5-10min后蒸馏水洗2次，5min/次。PBS（pH5.8-6.0，4°C预冷10-30min）洗2次，5min/次。（9）复染：2%甲基绿15s。13 （10）水洗：蒸馏水洗2次，5min/次。（11）脱水：烘箱干燥8h以上。（12）透明：二甲苯I、II各6min。（13）封片：中性树胶封片。（14）镜检：油镜检查免疫组织，选取5个视野，对每个视野下哈德尔腺、派伊尔结、盲肠扁桃体T淋巴细胞数量进行计数，取平均值，以个/视野表示。2.2.3.4RT-PCR检测局部黏膜相关淋巴组织中IL-2、IFN-γ、TNF-αmRNA表达（1）引物设计设计鸡IL-2、IFN-γ、TNF-α及β-actin基因引物，由引物合成公司合成。引物见表2-1。表2-1PCR引物Table2-1PCRprimers引物名称序列（5’→3’）产物长度（bp）基因序列号NamesofprimersSequencesProductlengthNo.ofgenesIL-2（U）GACTACAGCTTATGGAGCATC186NM_204153.1IL-2（L）CAGAGTAACCACTTCTCCCAGIFN-γ（U）AGATGTAGCTGACGGTGGAC215NM_205149.1IFN-γ（L）CTTTCACCTTCTTCACGCCATTNF-α（U）TATCCTCACCCCTACCCTGTCC142NM_204267.1TNF-α（L）TCTGGTTACAGGAAGGGCAACβ-actin（U）CCACACTGTGCCCATCTATGA135NM_205518.1β-actin（L）GAAATCCAGTGCGACGTAGC（2）局部免疫组织总RNA的提取1）取50-100mg冻存组织，放入提前-20°C预冷的研钵中，倒入液氮和1mLTrizol后充分研磨，转移到离心管中，于室温静置5min。2）加入0.2mL氯仿，震荡混匀后室温静置5min。3）使用4°C低温离心机离心15min，转速为12000r/min，取上清加等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min。4）使用4°C低温离心机离心10min，转速为12000r/min，弃上清。5）加入75%DEPC乙醇1mL，于4°C低温离心机上离心5min，转速为7500r/min，弃上清。6）晾干后加入20μLDEPC处理水，取2μL用于琼脂糖凝胶电泳观察，其余低温冻存。（3）cDNA的合成建立25μL反应体系，具体操作如下：DEPC水3.5μLOligo（dT）152.5μL总RNA模板2.0μL混合均匀，70°C水浴5min，转到冰上冷却5min，短暂离心。14 DEPC水10.0μL5×FirstStrandBuffer5.0μLdNTPMixture1.0μLM-MLVReverseTranscriptase1.0μL水浴，37°C2h，70°C10min，冰上冷却后低温保存。（4）目的片段PCR扩增以cDNA为模版，用IL-2、IFN-γ、TNF-α、β-actin的上下游引物，建立50μLPCR反应体系，同时设阴性对照与无模板对照，反应体系如下：PCRForwardPrimer（10μmol/L）1.0μLPCRReversePrimer（10μmol/L）1.0μLcDNA1.0μL10×PCRBuffer5.0μLdNTPMixture（2.5mmol/L）5.0μLddH2O36.5μLrTaq（5U/μL）0.5μLIL-2、β-actin反应程序为：94°C5min；94°C30s，58°C30s，72°C30s，共35个循环；72°C10min。IFN-γ反应程序为：94°C5min；94°C30s，58.5°C30s，72°C30s，共35个循环；72°C10min。TNF-α反应程序为：94°C5min；94°C30s，55°C30s，72°C30s，共35个循环；72°C10min。（5）检测PCR产物将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外检测仪上观察结果。（6）目的片段胶回收纯化应用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对目的片段纯化回收，按说明书说明进行操作，具体步骤如下：1）柱平衡：将500μL平衡液BL加入到吸附柱中，离心1min，转速为12000r/min，弃掉收集管中的废液。2）将目的带切下放入离心管中称重。3）加入等体积的PN，50°C水浴溶解凝胶。4）将溶解的凝胶溶液转移到吸附柱中，静置2min，离心1min，转速为12000r/min，弃掉废液。5）加入600μLPW，离心1min，转速为12000r/min，倒掉废液。6）重复操作5）。7）将吸附柱12000r/min离心2min，室温静置数分钟，彻底晾干。8）将吸附柱放到一洁净离心管中，向吸附膜中央位置悬空滴加30μLEB，室温静置2min，12000r/min离心2min，收集DNA溶液，-20°C保存备用。9）用1%琼脂糖凝胶电泳检测回收的DNA样品。15 （7）纯化目的片段与pMD-18T载体连接取纯化的PCR产物1.0μL，分别加入3.0μL的灭菌ddH2O，5.0μLSolutionI和1.0μLpMD-18TVector建立10μL连接体系，轻轻混匀后，于16°C水浴连接4h。（8）转化1）在生物安全柜中将上述10μL连接产物加入到冰上融化的100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，混匀。2）冰浴30min，42°C水浴中热激90s，快速冰浴2min。3）无菌条件下加入800μLLB液体培养基，37°C恒温摇床摇菌（约180r/min）培养1h。4）取100μL菌液涂布于含有氨苄的LB固体培养基上，37°C生化培养箱中倒置过夜培养。（9）阳性克隆的鉴定1）菌落PCR鉴定在无菌操作台上，用灭菌10μL枪头挑取单个可疑白色菌落，放入10mL含有氨苄的LB液体培养基中，37°C恒温摇床（约180r/min）过夜培养。将过夜培养的菌液轻轻混匀，取1μL菌液作为模板，进行PCR鉴定，反应体系同前。取PCR产物，应用1%琼脂糖凝胶电泳对结果进行检测。2）质粒提取用质粒小提试剂盒提取质粒DNA，按说明书进行操作，具体操作步骤如下：①柱平衡：500μLBL加入到吸附柱中，12000r/min离心1min，倒掉废液。②取3mL菌液加入到EP管中，12000r/min离心1min，弃去上清液。③加入250μLP1，将沉淀悬起。④加入250μLP2，温和翻转6-8次。⑤加入350μLP3，温和翻转6-8次，12000r/min离心10min.⑥取上清，加到吸附柱中，12000r/min离心1min，倒掉废液。⑦加入600μLPW，12000r/min离心1min，倒掉废液。⑧重复操作步骤⑦。⑨吸附柱12000r/min离心2min，将吸附柱中残存的漂洗液除净。⑩吸附柱置于新的洁净的EP管中，向吸附膜中央悬空滴加60μLEB，放置2min，12000r/min离心2min，将质粒溶液收集到EP管中。3）重组质粒PCR扩增鉴定以提取的重组质粒为模板，体系和程序与菌液PCR鉴定相同。取PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外检测仪上检测电泳结果。4）基因序列测定及分析将经鉴定的重组质粒进行序列测定，结果用DNASTAR软件进行序列分析。（10）重组质粒浓度的测定以TE（pH=8.0）为空白对照，用紫外分光光度计测定波长为260nm和280nm的核酸溶液密度（OD）值。OD260=1相当于大约0.05g/L双链DNA。纯品OD260/OD280值为1.8，如果样品OD260/OD280值低于1.8，则可能有蛋白质或酚污染，如果样品OD260/OD280值高于16 1.8，则可能由RNA污染，均需进一步纯化。（11）RealTimePCR反应体系的优化在普通PCR扩增仪上，对引物的浓度、模版用量、退火温度及时间进行优化，确定最佳反应条件。1）标准曲线绘制将IL-2、IFN-γ、TNF-α及β-actin基因阳性重组质粒进行10倍梯度稀释：即10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，以此标准品为模板，对相应引物进行RealTimePCR扩增，并设阴性对照组，用于制作标准曲线。反应体系如下（20μL）SYBR®PremixExTaqTMII10.0μLPCR上游引物（10μmol/L）0.8μLPCR下游引物（10μmol/L）0.8μL阳性质粒2.0μL灭菌ddH2O6.4μLIL-2、β-actin反应程序为：95°C2min；95°C20s，58°C20s，72°C10s，共45个循环。IFN-γ反应程序为：95°C2min；95°C20s，58.5°C20s，72°C10s，共45个循环。TNF-α反应程序为：95°C2min；95°C20s，55°C20s，72°C10s，共45个循环。在每次退火之后采集荧光信号，反应结束后确认扩增曲线、溶解曲线并制作标准曲线，用自动分析软件进行数据分析。2）RT-PCR检测局部黏膜免疫组织IL-2、IFN-γ、TNF-α及β-actinmRNA表达取出保存的局部黏膜免疫组织cDNA，用32孔LightCycler2.0荧光定量PCR仪对IL-2、IFN-γ、TNF-α及β-actin基因扩增检测，每个样品做三个重复，并设阴性对照。反应体系与1）相同。在每次退火之后采集荧光信号，根据IL-2、IFN-γ、TNF-α及β-actin基因扩增效率，对RealTimePCR结果运用2-ΔΔCt法进行分析。本实验的Ct值由PCR仪自动给出。以β-actin为内参照，目的基因在处理组中相对于对照组的ΔΔCt值由以下的公式求出：ΔΔCt=待测组（Ct目的基因-Ct参照基因）-校正组（Ct校正基因-Ct参照基因）待测组中基因相对于校正组表达水平的变化由以下公式求出：目的基因表达水平差异倍数=2-ΔΔCt2.2.3.6ELISA检测局部黏膜相关淋巴组织中IL-2、IFN-γ、TNF-α蛋白含量事先将试剂盒从4°C冰箱中取出，室温下放置10-30min，取出酶标包被板，操作参照提供的试剂盒说明书进行，具体操作步骤如下：（1）标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，先将标准品做1∶2倍稀释两次，之后再做1∶1倍稀释3次，每个稀释倍数做两个重复。（2）加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品和酶标试剂，其余操作步骤相同）和待测17 样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中将待测样品和样品稀释液进行1∶4倍稀释。（3）温育：用封板膜封板后置37°C温育30min。（4）配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。（5）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。（6）加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。（7）温育：操作同（3）。（8）洗涤：操作同（5）。（9）显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻振荡混匀，37°C避光显色15min。（10）终止：每孔加终止液50μL，终止反应（此时蓝色立转黄色）。（11）测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15min内进行。2.3数据处理所有实验数据，均运用GraphpadPrism5.0软件处理，分析组间差异，并应用其作图。所有数据均以“平均值±标准差”表示。18 3结果与分析3.1雏鸡在REV感染后十二指肠IEL数量变化雏鸡在REV感染后，I组雏鸡十二指肠IEL数量在REV感染后3-35d显著或极显著高于C组雏鸡（P<0.05或P<0.01）。（表3-1，图3-1）表3-1雏鸡在REV感染后十二指肠IEL数量变化Table3-1ChangesofthenumberofintraepitheliallymphocytesinduodenumofchickspostREVinfection组别groupC组I组1d17.2±1.48317.6±1.1403d18.8±1.64321.6±1.517*7d19.0±1.00021.0±1.000*14d20.4±1.14022.8±1.483*21d20.0±1.22521.8±0.837*28d22.8±0.83725.8±1.304**35d24.2±1.30426.4±1.340*注：（1）C组和I组分别代表对照组和REV感染组（2）*和**分别表示差异显著和极显著，分别为P<0.05和P<0.01；P>0.05为差异无统计学意义，不用表述出来，下同。Note:(1)CGroupandIGrouprepresentcontrolgroupandREVinfectiongroup，respectively.(2)*and**indicatethatthedifferenceissignificantorextremelysignificant,P<0.05andP<0.01,respectively;P>0.05isnotstatisticallysignificant,don’texpressed.Thesamebelow.19 30***C组****I组2010十二指肠IEL细胞数量01d3d7d14d21d28d35d感染后天数（d）注：C组：对照组；I组：感染组（下同）Note:CGroup:controlgroup;IGroup:REVinfectiongroup(thesameblow)图3-1雏鸡在REV感染后十二指肠IEL数量变化Figure3-1ChangesofthenumberofIELinduodenumofchickspostREVinfection3.2雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织T淋巴细胞数量的变化雏鸡在REV感染后，I组雏鸡局部黏膜相关淋巴组织中ANAE+T淋巴细胞数量不同程度低于C组雏鸡。其中，哈德尔腺中ANAE+T淋巴细胞数量在REV感染后14-35d显著或极显著低于C组雏鸡（P<0.05或P<0.01）；派伊尔结和盲肠扁桃体中ANAE+T淋巴细胞数量分别在REV感染后7-35d显著或极显著低于C组雏鸡（P<0.05或P<0.01）。（表3-2，图3-2，3-3，3-4）表3-2雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织中T淋巴细胞数量变化（单位：个/视野）Table3-2ChangesofthenumberofTlymphocytesinlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchickspostREVinfection天数组别哈德尔腺派伊尔结盲肠扁桃体daygroupglandofHarderPeyer’spatchcaecaltonsilC4.2±0.8373.2±0.83712.8±0.8371dI3.4±0.5482.4±1.34210.6±1.140C5.6±0.8944.6±0.89422.8±1.4833dI4.8±0.8373.8±0.83720.4±2.408（转下页）20 （接上页）天数组别哈德尔腺派伊尔结盲肠扁桃体daygroupglandofHarderPeyer’spatchcaecaltonsilC6.6±0.5488.2±0.83728.2±2.2807dI5.6±1.1406.4±1.140*25.2±3.033*C8.0±1.00011.6±2.07431.8±2.28014dI6.8±0.837*7.0±1.000**28.2±1.643**C9.6±0.89414.0±1.22533.0±2.45021dI7.2±1.483**8.2±1.304**26.8±0.837**C10.4±0.89417.2±0.83734.0±1.58128dI7.4±0.894**12.4±1.517**28.4±3.362**C10.4±1.14017.0±1.00034.2±2.16835dI7.8±0.837**15.4±1.140*31.0±1.581*15C组I组10*******501d3d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-2雏鸡在REV感染后哈德尔腺中T淋巴细胞数量变化Figure3-2ChangesofthenumberofTlymphocytesinglandofHarderofchickspostREVinfection21 20C组*I组15****10***5派伊尔结T淋巴细胞数量01d3d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-3雏鸡在REV感染后派伊尔结中T淋巴细胞数量变化Figure3-3ChangesofthenumberofTlymphocytesinPeyer’spatchofchickspostREVinfection40*C组****I组***302010盲肠扁桃体T淋巴细胞数量01d3d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-4雏鸡在REV感染后盲肠扁桃体中T淋巴细胞数量变化Figure3-4ChangesofthenumberofTlymphocytesincaecaltonsilofchickspostREVinfection22 3.3雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织抗体生成细胞数量变化3.3.1雏鸡在REV感染后哈德尔腺抗体生成细胞数量变化I组雏鸡哈德尔腺中IgA、IgG、IgM抗体生成细胞数量在REV感染雏鸡后，出现不同程度的降低。其中，哈德尔腺中IgA生成细胞数量在REV感染后7-35d显著或极显著低于C组雏鸡（P<0.05或P<0.01）；哈德尔腺中IgG生成细胞数量在REV感染后14-35d显著或极显著低于C组雏鸡（P<0.05或P<0.01）；哈德尔腺中IgM生成细胞数量在REV感染后7-35d显著或极显著低于C组雏鸡（P<0.05或P<0.01）。（表3-3，图3-5，3-6，3-7）表3-3雏鸡在REV感染后哈德尔腺抗体生成细胞数量变化（单位：个/视野）Table3-3ChangesofthenumberofIgs+producingcellsinglandofHarderofchickspostREVinfection天数组别IgA+IgG+IgM+daygroupC3.8±0.4473.0±1.0004.6±0.5481dI3.6±0.5482.6±0.8943.8±0.447C5.8±0.8375.4±0.5486.8±0.8373dI5.4±0.5485.2±0.4476.0±0.707C6.8±0.8376.6±0.8947.4±1.1407dI5.6±0.894*5.8±0.8376.2±0.837*C8.0±1.0007.2±0.8378.0±0.70714dI6.2±0.837**6.0±1.000*6.4±1.140**C9.0±0.7078.6±1.1409.2±0.44721dI7.6±0.894**7.2±0.837*8.0±1.000*C9.6±1.1408.8±0.8379.4±0.54828dI8.4±0.548*6.8±0.707**8.2±0.447*C10.0±0.7079.2±0.44710.2±0.83735dI8.8±0.837*7.6±1.140**9.0±0.707*23 15C组I组*10******501d3d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-5雏鸡在REV感染后哈德尔腺中IgA+生成细胞数量变化Figure3-5ChangesofthenumberofIgA+producingcellsinglandofHarderofchickspostREVinfection15C组I组10******抗体生成细胞数量+50哈德尔腺IgG1d3d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-6雏鸡在REV感染后哈德尔腺中IgG+生成细胞数量变化Figure3-6ChangesofthenumberofIgG+producingcellsinglandofHarderofchickspostREVinfection24 15C组I组*10*****抗体生成细胞数量+50哈德尔腺IgM1d3d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-7雏鸡在REV感染后哈德尔腺中IgM+抗体生成细胞数量变化Figure3-7ChangesofthenumberofIgM+producingcellsinglandofHarderofchickspostREVinfection3.3.2雏鸡在REV感染后派伊尔结抗体生成细胞数量变化雏鸡在REV感染后，I组雏鸡派伊尔结中IgA、IgG、IgM抗体生成细胞数量均不同程度低于C组雏鸡。其中，派伊尔结中IgA和IgM生成细胞数量在REV感染后3-35d显著或极显著低于C组雏鸡（P<0.05或P<0.01）；派伊尔结中IgG生成细胞数量在REV感染后14-35d显著或极显著低于C组雏鸡（P<0.05或P<0.01）。（表3-4，图3-8，3-9，3-10）表3-4雏鸡在REV感染后派伊尔结抗体生成细胞数量变化（单位：个/视野）Table3-4ChangesofthenumberofIgs+producingcellsinPeyer’spatchofchickspostREVinfection天数组别IgA+IgG+IgM+daygroupC7.2±0.8373.8±0.8375.4±0.8941dI6.2±0.8373.4±0.5484.4±0.548C7.4±1.3425.2±0.4476.0±0.7073dI6.2±1.095*4.4±0.5484.8±0.837*C8.0±0.7075.2±0.8376.6±1.1407dI6.0±0.707**4.6±0.5485.0±0.707**C9.8±0.8375.6±0.8947.6±1.14014dI6.6±0.548**3.8±0.837**6.2±0.837**（转下页）25 （接上页）天数组别IgA+IgG+IgM+daygroupC11.8±0.8376.4±0.5487.6±0.89421dI8.8±0.837**5.4±0.548*5.0±0.707**C11.4±0.8946.6±0.5489.0±0.70728dI7.8±0.837**4.6±0.894**7.0±0.707**C12.2±1.3048.8±0.4479.4±0.89435dI9.2±1.095**5.2±0.837**6.2±0.447**15C组**I组10*********501d3d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-8雏鸡在REV感染后派伊尔结中IgA+抗体生成细胞数量变化Figure3-8ChangesofthenumberofIgA+producingcellsinPeyer’spatchofchickspostREVinfection26 10C组8I组*****6**4201d3d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-9雏鸡在REV感染后派伊尔结中IgG+抗体生成细胞数量变化Figure3-9ChangesofthenumberofIgG+producingcellsinPeyer’spatchofchickspostREVinfection15C组I组10******抗体生成细胞数量*****+50派伊尔结IgM1d3d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-10雏鸡在REV感染后派伊尔结中IgM+抗体生成细胞数量变化Figure3-10ChangesofthenumberofIgM+producingcellsinPeyer’spatchofchickspostREVinfection3.3.3雏鸡在REV感染后盲肠扁桃体抗体生成细胞数量变化雏鸡在REV感染后，I组雏鸡盲肠扁桃体中IgA、IgG、IgM抗体生成细胞数量均不同程度低于C组雏鸡。其中，盲肠扁桃体中IgA生成细胞数量在REV感染后3-35d显著或极显27 著低于C组雏鸡（P<0.05或P<0.01）；盲肠扁桃体中IgG生成细胞数量在REV感染后7-35d显著或极显著低于C组雏鸡（P<0.05或P<0.01）；盲肠扁桃体中IgM生成细胞数量在REV感染后3-35d显著或极显著低于C组雏鸡（P<0.05或P<0.01）。（表3-5，图3-11，3-12，3-13）表3-5雏鸡在REV感染后盲肠扁桃体抗体生成细胞数量变化（单位：个/视野）Table3-5ChangesofthenumberofIgs+producingcellsincaecaltonsilofchickspostREVinfection天数组别IgA+IgG+IgM+daygroupC7.4±1.1404.8±0.8375.2±0.8371dI6.0±1.0004.2±0.4474.4±0.894C6.2±1.3044.6±0.8945.8±0.4473dI4.2±0.837*4.2±1.0954.6±0.548*C7.6±1.1405.8±0.8376.0±0.7077dI4.8±1.304**4.6±0.894*4.8±0.837*C10.0±0.7077.2±0.8379.0±1.00014dI6.0±1.581**4.4±0.548**6.4±0.548**C13.0±1.2258.2±1.09513.0±1.00021dI8.2±1.483**5.2±0.837**7.0±1.225**C16.8±1.0959.0±0.70714.8±1.30428dI11.6±1.140**7.8±0.447*10.2±0.837**C15.0±1.7328.2±0.44712.8±1.09535dI12.8±1.643**7.0±1.000*10.0±1.000**20C组**I组15****抗体生成细胞数量10**+***50盲肠扁桃体IgA1d3d7d14d21d28d35d感染后天数（d）+图3-11雏鸡在REV感染后盲肠扁桃体中IgA抗体生成细胞数量变化Figure3-11ChangesofthenumberofIgA+producingcellsincaecaltonsilofchickspostREVinfection28 15C组I组10*******501d3d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-12雏鸡在REV感染后盲肠扁桃体中IgG+抗体生成细胞数量变化Figure3-12ChangesofthenumberofIgG+producingcellsincaecaltonsilofchickspostREVinfection20C组I组15****10******501d3d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-13雏鸡在REV感染后盲肠扁桃体中IgM+抗体生成细胞数量变化Figure3-13ChangesofthenumberofIgM+producingcellsincaecaltonsilofchickspostREVinfection29 3.4建立RT-PCR检测雏鸡IL-2、IFN-γ与TNF-αmRNA表达的方法3.4.1总RNA提取检测结果将提取的雏鸡局部黏膜相关淋巴组织总RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外线下可清晰显示28S、18S、5S三条条带，经核酸蛋白紫外分析仪检测，获得的总RNAOD260/OD280值在1.8-2.0之间，表明总RNA提取成功，可用于后续实验。（图3-14）注：1：分子质量标准；2：RNANotes:Lane1:Marker;Lane2:RNA图3-14雏鸡局部黏膜相关淋巴组织总RNA电泳图Figure3-14AgarosegelelectrophoresisoftotalRNAinlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchicks3.4.2雏鸡局部黏膜相关淋巴组织IL-2、IFN-γ、TNF-α和β-actinPCR扩增结果将雏鸡局部黏膜相关淋巴组织提取的总RNA反转录合成cDNA，对IL-2、IFN-γ、TNF-α和β-actin基因进行PCR扩增，并将扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳后观察，结果显示在186bp、215bp、142bp和135bp处分别呈现一条清晰的特异性条带。（图3-15为β-actin基因进行PCR扩增结果，IL-2、IFN-γ和TNF-α扩增结果略）30 注：1：分子质量标准；2：PCR产物；3：阴性对照Notes:Lane1:Marker;Lane2:PCRamplificationproduct;Lane3:Negativecontrol图3-15雏鸡局部黏膜相关淋巴组织β-actinPCR扩增结果Figure3-15β-actinPCRamplificationresultsofchickenlocalimmunetissue3.4.3重组质粒PCR鉴定将PCR产物胶回收，连接、转化并制备重组质粒，对IL-2、IFN-γ、TNF-α和β-actin重组质粒进行扩增，核酸电泳检测扩增结果，分别在186bp、215bp、142bp和135bp处观察到一条清晰的特异性条带，证明pMD18-T载体上已成功插入目的片段。（图3-16为β-actin重组质粒PCR鉴定结果，IL-2、IFN-γ和TNF-α重组质粒PCR鉴定结果略）注：1：分子质量标准；2：β-actin重组质粒PCR产物；3：阴性对照Notes:Lane1:Marker;Lane2:β-actinrecombinantplasmidPCRproduct;Lane3:Negativecontrol图3-16β-actin重组质粒PCR扩增结果Figure3-16Theresultofβ-actinrecombinantplasmidPCRamplification31 3.4.4测定IL-2、IFN-γ、TNF-α和β-actin扩增产物序列IL-2、IFN-γ、TNF-α和β-actin基因片段长度和对应的GenBank基因序列号见表2-1，比对测序结果和GenBank中的序列，发现两序列完全吻合，无突变和缺失现象。3.4.5绘制标准曲线10倍倍比稀释IL-2、IFN-γ、TNF-α和β-actin重组质粒，RT-PCR扩增，标准曲线的绘制要选合适的稀释倍数。IL-2、IFN-γ、TNF-α和β-actin重组质粒分别在80°C、81°C、84°C和85°C左右呈现单一峰值，表明引物特异性好，扩增产物单一。(图3-17为β-actin重组质粒的标准品扩增曲线，图3-18为β-actin重组质粒的标准品标准曲线，图3-19为β-actin重组质粒的标准品溶解曲线，IL-2、IFN-γ、TNF-α重组质粒图略）图3-17β-actin重组质粒标准品扩增曲线Figure3-17Amplificationcurveofβ-actinrecombinantplasmidstandard图3-18β-actin重组质粒标准品标准曲线Figure3-18Standardcurveofβ-actinrecombinantplasmidstandard32 图3-19β-actin重组质粒标准品溶解曲线Figure3-19Dissolutioncurveofβ-actinrecombinantplasmidstandard3.5雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织IL-2、IFN-γ与TNF-αmRNA表达变化由雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织IL-2、IFN-γ、TNF-α和β-actin基因的溶解曲线可知：IL-2、IFN-γ、TNF-α和β-actin的溶解曲线只有一个与重组质粒标准品溶解曲线相吻合的单一峰值，显示扩增特异性良好。（图3-20为β-actin基因的溶解曲线，IL-2、IFN-γ和TNF-α基因的溶解曲线略）图3-20雏鸡局部黏膜相关淋巴组织β-actin基因溶解曲线Figure3-20Theβ-actindissociationcurveinlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchicks3.5.1雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织IL-2mRNA表达量变化雏鸡在REV感染后，局部黏膜相关淋巴组织中IL-2mRNA表达量会不同程度的高于C组雏鸡。其中，哈德尔腺中IL-2mRNA表达量在REV感染后7-28d与C组差异显著或极显著（P<0.01或P<0.05）；派伊尔结中IL-2mRNA表达量在REV感染后21-28d高于C组雏鸡，差异显著或极显著（P<0.01或P<0.05）；盲肠扁桃体中IL-2mRNA表达量在REV感染33 后7-21d与C组差异极显著（P<0.01）。（表3-6，图3-21，3-22，3-23）表3-6雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织IL-2mRNA表达量变化Table3-6ChangesofIL-2mRNAexpressioninlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchickspostREVinfection天数组别哈德尔腺派伊尔结盲肠扁桃体daygroupglandofHarderPeyer’spatchcaecaltonsilC1.000±0.0001.000±0.0001.000±0.0007dI1.159±0.127*1.085±0.0611.315±0.043**C1.283±0.0361.351±0.1151.560±0.10914dI1.645±0.163**1.423±0.0851.756±0.084**C1.477±0.1011.731±0.0841.655±0.07821dI1.828±0.061**1.921±0.086*1.927±0.055**C1.641±0.1061.753±0.0971.853±0.09528dI1.834±0.061*2.047±0.059**1.862±0.052C1.942±0.0651.953±0.0491.930±0.06035dI1.968±0.0401.989±0.1402.006±0.0302.5C组2.0*****I组1.5*1.00.50.07d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-21雏鸡在REV感染后哈德尔腺中IL-2mRNA表达变化Figure3-21ChangesofIL-2mRNAexpressioninglandofHarderofchickspostREVinfection34 2.5**C组*2.0I组1.51.00.50.0派伊尔结IL-2mRNA相对表达量7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-22雏鸡在REV感染后派伊尔结中IL-2mRNA表达变化Figure3-22ChangesofIL-2mRNAexpressioninPeyer’spatchofchickspostREVinfection2.5C组**2.0**I组1.5**1.00.50.07d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-23雏鸡在REV感染后盲肠扁桃体中IL-2mRNA表达变化Figure3-23ChangesofIL-2mRNAexpressionincaecaltonsilofchickspostREVinfection3.5.2雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织IFN-γmRNA表达变化雏鸡在REV感染后，I组雏鸡哈德尔腺中IFN-γmRNA表达量在REV感染后14-28d高35 于C组雏鸡，差异显著或极显著（P<0.01或P<0.05）；派伊尔结中IFN-γmRNA表达量在REV感染后7-14d显著高于C组雏鸡（P<0.05）；盲肠扁桃体中IFN-γmRNA表达量在REV感染后7-28d显著或极显著高于C组雏鸡（P<0.05或P<0.01）。（表3-7，图3-24，3-25，3-26）表3-7雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织IFN-γmRNA表达变化Table3-7ChangesofIFN-γmRNAexpressioninlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchickspostREVinfection天数组别哈德尔腺派伊尔结盲肠扁桃体daygroupglandofHarderPeyer’spatchcaecaltonsilC1.000±0.0001.000±0.0001.000±0.0007dI1.037±0.0911.162±0.103*1.205±0.036**C1.369±0.1581.412±0.0751.529±0.08914dI1.628±0.093**1.610±0.082*1.682±0.074*C1.586±0.0491.706±0.0711.597±0.07021dI1.798±0.084*1.829±0.0941.774±0.076*C1.951±0.1001.621±0.0871.743±0.04428dI2.131±0.124*1.690±0.1061.875±0.047*C1.839±0.0821.824±0.0261.818±0.09635dI1.897±0.1061.845±0.0571.906±0.0862.5*C组2.0*I组**1.5mRNA相对表达量1.00.50.0哈德尔腺IFN-7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-24雏鸡在REV感染后哈德尔腺中IFN-γmRNA表达变化Figure3-24ChangesofIFN-γmRNAexpressioninglandofHarderofchickspostREVinfection36 2.5C组2.0I组*1.5*1.00.50.07d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-25雏鸡在REV感染后派伊尔结中IFN-γmRNA表达变化Figure3-25ChangesofIFN-γmRNAexpressioninPeyer’spatchofchickspostREVinfection2.5C组2.0***I组1.5**1.00.50.07d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-26雏鸡在REV感染后盲肠扁桃体中IFN-γmRNA表达变化Figure3-26ChangesofIFN-γmRNAexpressionincaecaltonsilofchickspostREVinfection3.5.3雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织TNF-αmRNA表达变化I组雏鸡局部黏膜相关淋巴组织哈德尔腺、派伊尔结和盲肠扁桃体中TNF-αmRNA表达量在REV感染后不同程度的高于C组雏鸡。其中，哈德尔腺和派伊尔结中TNF-αmRNA表37 达量在REV感染后14-35d与C组雏鸡差异极显著（P<0.01）；盲肠扁桃体中TNF-αmRNA表达量在感染后7-35d与C组雏鸡差异显著或极显著（P<0.01或P<0.05）。（表3-8，图3-27，3-28，3-29）表3-8雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织TNF-αmRNA表达变化Table3-8ChangesofTNF-αmRNAexpressioninlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchickspostREVinfection天数组别哈德尔腺派伊尔结盲肠扁桃体daygroupglandofHarderPeyer’spatchcaecaltonsilC1.000±0.0001.000±0.0001.000±0.0007dI1.020±0.0811.099±0.0741.527±0.138**C1.199±0.0561.124±0.0831.215±0.10814dI1.481±0.087**1.889±0.060**1.377±0.048*C1.213±0.0951.339±0.0551.216±0.11021dI1.558±0.108**1.533±0.103**1.530±0.070**（转下页）（接上页）天数组别哈德尔腺派伊尔结盲肠扁桃体daygroupglandofHarderPeyer’spatchcaecaltonsilC1.428±0.1041.340±0.0871.288±0.10328dI1.944±0.076**1.739±0.098**1.731±0.089**C1.511±0.1471.449±0.0821.437±0.09035dI1.849±0.076**1.970±0.122**2.059±0.067**2.5C组****2.0I组****1.51.00.50.07d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-27雏鸡在REV感染后哈德尔腺中TNF-αmRNA表达变化Figure3-27ChangesofTNF-αmRNAexpressioninglandofHarderofchickspostREVinfection38 2.5**C组2.0****I组**1.51.00.50.07d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-28雏鸡在REV感染后派伊尔结中TNF-αmRNA表达变化Figure3-28ChangesofTNF-αmRNAexpressioninPeyer’spatchofchickspostREVinfection2.5**C组2.0**I组*****1.51.00.50.07d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-29雏鸡在REV感染后盲肠扁桃体中TNF-αmRNA表达变化Figure3-29ChangesofTNF-αmRNAexpressionincaecaltonsilofchickspostREVinfection39 3.6雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织IL-2、IFN-γ与TNF-α蛋白含量变化3.6.1雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织IL-2蛋白含量变化雏鸡在REV感染后，局部黏膜相关淋巴组织IL-2蛋白含量出现不同程度升高。其中，哈德尔腺和派伊尔结中IL-2蛋白含量在REV感染后28-35d与C组相比均显著或极显著升高（P<0.01或P<0.05）；I组雏鸡盲肠扁桃体中IL-2蛋白含量在REV感染后14-28d显著或极显著高于C组雏鸡（P<0.01或P<0.05）。（表3-9，图3-30，3-31，3-32）表3-9雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织IL-2蛋白含量变化（单位：ng/L）Table3-9ChangesofIL-2proteincontentinlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchickspostREVinfection天数组别哈德尔腺派伊尔结盲肠扁桃体daygroupglandofHarderPeyer’spatchcaecaltonsilC124.767±4.365144.334±3.267156.259±3.9961dI133.499±3.253145.238±3.018157.163±6.036C153.586±3.097158.022±3.749166.577±4.1407dI160.587±5.124168.726±6.624168.184±3.846C163.041±4.705156.440±10.654147.044±7.27914dI169.001±2.090160.938±5.934161.318±13.114*C166.060±8.949174.125±2.925179.337±2.90321dI157.705±7.685179.842±4.316191.574±8.066*C168.166±5.871176.957±5.664191.131±8.22728dI179.748±4.677*194.203±11.705**214.620±1.878**C154.814±7.595201.383±4.502217.069±4.60735dI174.571±9.153**216.065±11.655*212.271±10.65440 200***C组I组1501005001d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-30雏鸡在REV感染后哈德尔腺中IL-2蛋白含量变化Figure3-30ChangesofIL-2proteincontentinglandofHarderofchickspostREVinfection250*C组**200I组1501005001d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-31雏鸡在REV感染后派伊尔结中IL-2蛋白含量变化Figure3-31ChangesofIL-2proteincontentinPeyer’spatchofchickspostREVinfection41 250**C组*200I组*15010050盲肠扁桃体IL-2含量（ng/L）01d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-32雏鸡在REV感染后盲肠扁桃体中IL-2蛋白含量变化Figure3-32ChangesofIL-2proteincontentincaecaltonsilofchickspostREVinfection3.6.2雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织IFN-γ蛋白含量变化雏鸡在REV感染后，哈德尔腺、派伊尔结和盲肠扁桃体中IFN-γ蛋白含量不同程度高于C组雏鸡。其中，哈德尔腺和派伊尔结中IFN-γ蛋白含量分别在REV感染后14-21d和21-28d显著高于C组雏鸡（P<0.05）；盲肠扁桃体中IFN-γ蛋白含量在REV感染后14-35d显著或极显著高于C组雏鸡（P<0.01或P<0.05）。（表3-10，图3-33，3-34，3-35）表3-10雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织IFN-γ蛋白含量变化（单位：ng/L）Table3-10ChangesofIFN-γproteincontentinlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchickspostREVinfection天数组别哈德尔腺派伊尔结盲肠扁桃体daygroupglandofHarderPeyer’spatchcaecaltonsilC22.610±1.57334.140±2.77133.161±3.2561dI26.040±2.72336.839±2.18234.023±0.319C33.448±1.82540.778±0.95540.347±2.7287dI36.851±1.68843.456±2.66743.129±1.277C37.215±1.58643.064±0.64842.788±1.50314dI41.975±1.640*45.945±3.28246.293±1.702*C38.265±1.62645.495±2.87841.005±0.70621dI42.072±1.679*49.372±1.399*44.230±0.594*（转下页）42 （接上页）天数组别哈德尔腺派伊尔结盲肠扁桃体daygroupglandofHarderPeyer’spatchcaecaltonsilC38.783±1.04243.162±0.55143.107±1.54328dI39.814±3.11646.937±1.684*48.945±2.271**C34.181±2.23749.184±1.38647.178±2.26535dI34.632±3.10050.788±0.99851.194±2.059*50**C组40I组30201001d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-33雏鸡在REV感染后哈德尔腺中IFN-γ蛋白含量变化Figure3-33ChangesofIFN-γproteincontentinglandofHarderofchickspostREVinfection60*C组*I组402001d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-34雏鸡在REV感染后派伊尔结中IFN-γ蛋白含量变化Figure3-34ChangesofIFN-γproteincontentinPeyer’spatchofchickspostREVinfection43 60***C组*I组*402001d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-35雏鸡在REV感染后盲肠扁桃体中IFN-γ蛋白含量变化Figure3-35ChangesofIFN-γproteincontentincaecaltonsilofchickspostREVinfection3.6.3雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织TNF-α蛋白含量变化雏鸡在REV感染后，局部黏膜相关淋巴组织TNF-α蛋白含量出现不同程度的升高。其中，I组雏鸡哈德尔腺中TNF-α蛋白含量在REV感染后21-35d与C组雏鸡差异显著或极显著（P<0.01或P<0.05）；I组雏鸡派伊尔结和盲肠扁桃体中TNF-α蛋白含量分别在REV感染后14-28d与C组雏鸡差异显著或极显著（P<0.01或P<0.05）。（表3-11，图3-36，3-37，3-38）表3-11雏鸡在REV感染后局部黏膜相关淋巴组织TNF-α蛋白含量变化（单位：ng/L）Table3-11ChangesofTNF-αproteincontentinlocalmucosa-associatedlymphoidtissuesofchickspostREVinfection天数组别哈德尔腺派伊尔结盲肠扁桃体daygroupglandofHarderPeyer’spatchcaecaltonsilC22.800±1.55528.170±0.82330.924±2.1371dI24.677±1.49027.083±3.55631.286±1.533C25.264±1.31830.714±0.83733.192±0.7847dI25.438±0.75731.917±0.84735.330±1.072C27.264±0.60529.924±1.41230.127±1.33214dI27.647±2.18033.642±2.131*37.773±1.521**21dC27.243±0.97929.873±1.22531.939±1.38844 I29.989±1.481*37.120±1.376**36.787±1.566**C25.685±1.31630.228±2.14032.953±2.73428dI29.163±0.416**35.700±1.367**36.635±1.407*C32.816±0.42443.962±1.80135.955±2.20635dI38.541±1.745**45.389±2.13237.904±1.16850C组**40I组***30201001d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-36雏鸡在REV感染后哈德尔腺中TNF-α蛋白含量变化Figure3-36ChangesofTNF-αproteincontentinglandofHarderofchickspostREVinfection50C组40*****I组30含量（ng/L）2010派伊尔结TNF-01d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-37雏鸡在REV感染后派伊尔结中TNF-α蛋白含量变化Figure3-37ChangesofTNF-αproteincontentinPeyer’spatchofchickspostREVinfection45 50C组40*****I组含量（ng/L）3020100盲肠扁桃体TNF-1d7d14d21d28d35d感染后天数（d）图3-38雏鸡在REV感染后盲肠扁桃体中TNF-α蛋白含量变化Figure3-38ChangesofTNF-αproteincontentincaecaltonsilofchickspostREVinfection46 4讨论家禽的黏膜表面直接与外界环境接触，是病原微生物入侵机体的主要门户，也是机体抵抗感染的第一道防线。黏膜免疫系统是由黏膜淋巴组织和相关腺体组成，其中，盲肠扁桃体、派伊尔结和哈德尔腺分别在在肠道黏膜免疫和呼吸道局部免疫反应中起到重要作用。盲肠扁桃体中含有大量的T、B淋巴细胞，当机体受到病原微生物侵害时，B淋巴细胞可以通过分泌抗体，参与局部体液免疫，同时，T淋巴细胞也会被激活，产生细胞免疫。派伊尔结中有一种特殊的抗原转运细胞——M细胞，当病原体进入肠腔后，M细胞会将其转运到上皮下淋巴组织，诱导机体的局部黏膜相关淋巴组织发生免疫反应。哈德尔腺中含有大量的B细胞和少量的T细胞，当其受到抗原刺激后会使B细胞大量分化成熟为IgA、IgG、IgM抗体生成细胞，产生特异性抗体，抗体进入呼吸道和泪液，抵抗病原微生物的感染[75]。上皮内淋巴细胞是体内最大的淋巴细胞群，位于黏膜上皮细胞之间，邻近基膜。IEL是黏膜免疫中最先与病原体抗原接触的免疫细胞。肠上皮内淋巴细胞与脾脏或外周淋巴结中的T细胞相比，存在着明显的差异。4.1REV感染对雏鸡十二指肠上皮内淋巴细胞数量的影响上皮内淋巴细胞（IEL）是位于肠绒毛上皮细胞之间的、数量众多的细胞群，其中CD8+T淋巴细胞占比重最高[76]。IEL表达CD69和αEβ7整合素是其与其它淋巴细胞最主要的区别[77]。因其处于肠绒毛上，因此，IEL是黏膜免疫中最早与病原体接触的细胞[78]，当机体受到侵害时，IEL可以通过分泌细胞因子发挥免疫作用，也可以通过其胞内颗粒，如穿孔素、颗粒酶等清除被感染的上皮细胞而发挥作用[73]，因此，IEL在肠道黏膜免疫中起到重要的作用。在本实验中，十二指肠IEL数量在REV感染雏鸡后3-35d不同程度高于C组雏鸡。Drechsler[79]等研究发现无论是在自然状态下还是实验条件下，REV感染会使松鸡CD8+T淋巴细胞数量升高。IEL主要为CD8+T淋巴细胞，当病毒攻击机体时，IEL数量增加，与上皮细胞一起形成一道保护屏障，防止病原体进入机体，同时，也可以分泌细胞因子，参与调节十二指肠黏膜抗病毒免疫，并增加对感染细胞的杀伤效果。因此，在REV感染后，十二指肠IEL数量会出现增加，参与机体的抗病毒感染免疫应答。4.2REV感染对雏鸡局部黏膜相关淋巴组织细胞免疫的影响动物机体的免疫功能与机体T、B淋巴细胞的数量多少存在着很大的联系。T淋巴细胞来源于骨髓干细胞，幼稚的前体T细胞经血液循环到达胸腺，并在胸腺中发育和分化成熟，成熟后再通过血液循环或者淋巴循环运送到全身各处，并发挥作用。T淋巴细胞的主要作用包括产生细胞免疫、杀伤被病毒感染或病变的细胞、清除肿瘤细胞、促进浆细胞产生抗体等。因此，机体T淋巴细胞的数量极大程度上体现了机体的免疫能力[80]。本研究发现，雏鸡在REV感染后，哈德尔腺、派伊尔结和盲肠扁桃体中ANAE+T淋巴细胞数量会有不同程度的降低。其中，哈德尔腺中ANAE+T淋巴细胞数量在REV感染后14-3547 d与C组差异显著或极显著（P<0.01或P<0.05）；盲肠扁桃体和派伊尔结在REV感染后7-35dANAE+T淋巴细胞数量明显低于C组雏鸡（P<0.01或P<0.05）。雏鸡在REV感染后哈德尔腺、派伊尔结和盲肠扁桃体中ANAE+T淋巴细胞数量均有所降低，局部黏膜相关淋巴组织的细胞免疫功能下降。4.3REV感染对雏鸡局部黏膜相关淋巴组织体液免疫的影响有研究表明，在健康雏鸡体内，哈德尔腺中IgM抗体生成细胞数量比其它类型细胞多，盲肠扁桃体中IgA抗体生成细胞数量最多，其次是IgM抗体生成细胞，IgG抗体生成细胞数量最少[81]。IgA是体液免疫中重要的免疫球蛋白，当局部黏膜受到病毒入侵时，可以中和病毒，减轻其对机体的损害。IgM产生时间早，具有调理、杀菌、凝集和激活补体途径等作用，因此其在抗感染早期具有重要的作用。IgG除具有IgM的调理、凝集等作用外还具有中和病毒和毒素、沉淀抗原的作用，同时其还可以通过胎盘，是一种重要的母源抗体[82]。免疫球蛋白是由B细胞在受到抗原刺激后分化为浆细胞而产生的，因此，检测IgA、IgG、IgM抗体生成细胞的数量能够反映出机体体液免疫功能状态。本实验的另一项研究发现，雏鸡在REV感染后，局部黏膜相关淋巴组织哈德尔腺、派伊尔结和盲肠扁桃体中IgA、IgG和IgM抗体生成细胞数量不同程度低于C组雏鸡。其中，哈德尔腺中IgA和IgM抗体生成细胞数量和盲肠扁桃体中IgG抗体生成细胞数量在REV感染后7-35d显著或极显著低于C组雏鸡，派伊尔结和盲肠扁桃体中IgA和IgM抗体生成细胞数量在REV感染后3-35d相对于C组雏鸡显著或极显著降低，哈德尔腺和派伊尔结中IgG抗体生成细胞数量在REV感染后14-35d相对于C组雏鸡显著或极显著降低。刘忠贵等[83]研究发现1日龄雏鸡在REV感染后法氏囊和脾脏IgA、IgG和IgM抗体生成细胞数量明显降低，证实REV感染会引起抗体生成细胞数量减少。特异性抗体在机体抗感染中有重要作用，其是通过B淋巴细胞分化成熟后分泌的[84]。因此，REV感染会引起雏鸡局部黏膜相关淋巴组织体液免疫功能下降。4.4REV感染对雏鸡局部黏膜相关淋巴组织IL-2、IFN-γ和TNF-αmRNA表达和蛋白含量的影响IL-2主要是由T淋巴细胞产生，其能够刺激和诱导T、B淋巴细胞增殖、分化，激活T淋巴细胞、NK细胞和巨噬细胞，促进IL-2、TNF等细胞因子和抗体的释放，具有显著的抗肿瘤、抗病毒作用，常被用做抗肿瘤药物[85]。但有学者在乳腺癌的研究中发现，乳腺癌患者的血清中IL-2含量升高[86]。干扰素是由英国科学家在1957年发现的，并发现其能够抗病毒、抗肿瘤、调节机体免疫和抑制细胞分裂[87]。IFN可以被分为三种亚型，分别为I型、II型和III型。其中I型干扰素具有抗病毒和抗肿瘤的作用，包括IFN-α、IFN-β等[88]，II型干扰素仅有IFN-γ一个成员，又称免疫干扰素。III型干扰素为IFN-λ[89]。IFN-γ具有很强的免疫调节作用，其免疫调节活性远远高于IFN-α和IFN-β。研究表明，当IBDV感染机体时，机体会产生IFN-γ抵抗病毒的感染[87]。IFN-γ可以诱导和促进某些基因的表达，其编码的蛋白质48 可以破坏病毒RNA，促进对病毒的杀伤作用[90]，此外，IFN-γ还能够诱导病毒感染的细胞表达抗原，提高机体的免疫识别能力，促进机体对被感染细胞的杀伤。在抗肿瘤方面，IFN-γ可以通过抑制肿瘤细胞生长来发挥作用，其次，IFN-γ还可以通过抑制癌基因的表达、激活巨噬细胞和NK细胞、诱导TNF等抑制肿瘤。也有研究发现IFN-γ对细胞增殖有双向作用，既可刺激细胞增殖，又可抑制细胞增殖，但以抑制为主[91]。有学者认为IFN-γ可以用作机体细胞介导免疫的指示器[92]，因此检测其在器官中的mRNA表达量和蛋白含量能反映除机体的免疫状况。TNF-α主要是由单核细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞产生，在细胞膜上以糖蛋白或跨膜蛋白的形式存在[93]，能够刺激巨噬细胞、上皮细胞和内皮细胞等分泌多种细胞因子，参与机体的免疫反应，还能够在机体的炎症和损伤中充当重要的介质[94]。有研究表明，作为内源性热源，TNF-α可诱导发热、恶病质和炎症[95,96]。当组织中TNF-α浓度较低时，其主要作用是抵御病原微生物的感染[97]，但当组织中TNF-α浓度过高时，会引起机体损耗增加，造成机体损伤[98]。医学研究发现，很多肿瘤和病毒性疾病，TNF-α的含量都会出现升高，且其含量与疾病的预后有重要的相关性，如弥漫大B细胞淋巴瘤[99]、肝癌[100]、和轮状病毒[101]，因此，检测组织中TNF-αmRNA表达量及其蛋白含量对研究机体的免疫状态至关重要。本研究发现，雏鸡在REV感染后，局部黏膜相关淋巴组织哈德尔腺、派伊尔结和盲肠扁桃体中IL-2、IFN-γ和TNF-αmRNA表达量和蛋白含量在REV感染后不同的时间出现了不同程度的升高。李恩扩等[102]研究发现，REV感染后，雏鸡胸腺、脾脏和法氏囊中IL-2mRNA表达量升高，李兵[103]的研究也发现在REV感染后血液中IL-2蛋白含量在病毒感染后的14-28d有所升高。Xu[104]等研究发现，miRNA-26a作为一种肿瘤的抑制物，在REV引起的肿瘤细胞系中下调表达，引起其靶基因IL-2的过表达，刺激瘤细胞的增殖。此外，IL-2可以调节CD8+CTL，上调穿孔素和颗粒酶等的表达，促进其它促炎因子的分泌，上调炎症反应。因此，REV感染后，雏鸡局部黏膜相关淋巴组织IL-2mRNA表达量和蛋白含量有所增加，可能会引起机体炎症反应加重，造成机体损伤，当机体免疫组织或器官受到损伤时，会影响机体的免疫状态。本研究中IFN-γmRNA表达和蛋白含量都出现了不同程度的升高，证实了REV能够诱导IFN-γmRNA的表达，进一步印证了郑玉姝[105]提出的REV是IFN-γ的强诱生剂。Liang[43]和陈雪峰[106]等实验也发现IFN-γ蛋白含量在病毒感染后升高，这与本实验的结果一致。有研究发现[107]，IFN-γ可以调节单核巨噬细胞产生超氧阴离子，如在短时间内IFN-γmRNA表达量和蛋白含量迅速增加，激活体内单核巨噬细胞，就会产生大量超氧阴离子，进而引起机体损伤。因此，IFN-γ虽然在机体抗病毒感染中具有重要作用，但是当其含量过多反而会对机体造成损伤。李广兴等[108]研究发现REV感染雏鸡后，会引起其脾脏白细胞TNF的诱生活性明显增强。Tripsianis等[109]研究发现，乳腺癌患者TNF-α水平升高，可能是因其诱导巨噬细胞分泌大量的TNF-α等炎性因子。李娜[110]的研究发现TNF-α和IFN-γ可以促进肿瘤细胞的免疫逃逸，且TNF-α可以促进IFN-γ信号通路的活化。此外，IFN-γ还可以促进炎性因子的产生，使炎症反应增强，加重机体的损伤情况，TNF-α为重要的促炎因子，因此TNF-αmRNA表达和TNF-α蛋白含量升高，促进机体炎症反应进程，引起机体损耗增加，对机体造成损伤。49 5结论（1）雏鸡在REV感染后，十二指肠IEL数量高于对照组雏鸡，表明IEL介导的雏鸡抗REV感染免疫应答水平增强。（2）雏鸡在REV感染后，哈德尔腺、派伊尔结和盲肠扁桃体中T淋巴细胞数量不同程度低于对照组雏鸡，表明REV感染可引起雏鸡局部黏膜相关淋巴组织的细胞免疫功能下降。（3）雏鸡在REV感染后，哈德尔腺、派伊尔结和盲肠扁桃体中IgA、IgG、IgM抗体生成细胞数量不同程度低于对照组雏鸡，表明REV感染可引起雏鸡局部黏膜相关淋巴组织的体液免疫功能下降。（4）雏鸡在REV感染后，哈德尔腺、派伊尔结和盲肠扁桃体中IL-2、IFN-γ和TNF-αmRNA表达量和蛋白含量均不同程度的高于对照组雏鸡，表明IL-2、IFN-γ和TNF-α参与REV感染所致的局部黏膜损伤。50 致谢时光荏苒，三年的研究生求学时光已经悄悄走过，在这三年中，我得到了很多人的关心和帮助，在这里我要向他们表达我最真挚的感谢。本研究的选题、设计和实施以及论文的撰写都得到了刘超男副教授和郑世民教授的细心指导和点播。感谢刘老师在这三年间对我的关心和照顾，他在工作中勤勤恳恳，态度严谨，是我学习的榜样，不断督促着我前进，在这短短的三年中我受益良多。感谢郑老师对我的耐心指导，老师渊博的学识总是能够在我困惑的时候为我指点迷津，让我少走弯路，同时，郑老师身上高尚的品格也在无时无刻不在影响着我。感谢高雪丽副教授和吕晓萍老师在我实验的设计和操作的过程中给我的建议和帮助。在此，我还要感谢齐伟、张美曦、白玉、于志强、翟杰等师兄师姐的帮助和指导，感谢王晓燕、付礼胜的通力合作，感谢赵晨辉、高畅、党盛源、葛依阳的帮助。感谢多年来支持和关爱我的父母，他们的无私奉献和殷勤期盼是我前进的动力。再一次向曾经帮助过我的亲人、老师、同学和朋友送上我诚挚的谢意，谢谢您们!51 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附录图1对照雏鸡十二指肠IEL数量图2REV感染雏鸡十二指肠IEL数量增多Figure1ThenumberofIELinduodenumofFigure2ThenumberofIELincreaseincontrolchicksduodenumofchickspostREVinfection图3对照雏鸡盲肠扁桃体中ANAE+T淋巴图4REV感染雏鸡盲肠扁桃体中ANAE+T细胞数量淋巴细胞数量减少Figure3ThenumberofANAE+TlymphocytesFigure4ThenumberofANAE+TlymphocytesinthececaltonsilsofcontrolchicksdecreaseinthececaltonsilsofchickspostREVinfection59 图5对照雏鸡哈德尔腺中IgA生成细胞数图6REV感染哈德尔腺中IgA生成细胞数量量减少Figure5ThenumberofIgAproducingcellsinFigure6ThenumberofIgAproducingcellsglandofHarderofcontrolchicksdecreaseinglandofHarderofchickspostREVinfection图7对照雏鸡哈德尔腺中IgG生成细胞数图8REV感染哈德尔腺中IgG生成细胞数量量减少Figure7ThenumberofIgGproducingcellsinFigure8ThenumberofIgGproducingcellsglandofHarderofcontrolchicksdecreaseinglandofHarderofchickspostREVinfection60 图9对照雏鸡哈德尔腺中IgM生成细胞数图10REV感染雏鸡哈德尔腺中IgM生成细量胞数量减少Figure9ThenumberofIgMproducingcellsinFigure10ThenumberofIgMproducingcellsdecreaseinglandofHarderofchickspostREVglandofHarderofcontrolchicksinfection61 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